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Método AOAC-IUPAC
(Aplicable a la determinación de aflatoxinas B1, B2, G1, G2 con un contenido total de aflatoxinas de ≥ 10 ng/g en maíz, maní
crudo, y mantequilla de maní.)
Ver en la Tabla 991.31A los resultados de los estudios interlaboratoriales que apoyan la aceptación del método.
A. Principio
La porción de ensayo se extrae con CH3OH + H2O (7 + 3). El extracto se filtra, se diluye con agua, y se aplica a la columna de
afinidad que contiene un anticuerpo monoclonal específico para las aflatoxinas B 1, B2, G1, y G2. Las aflatoxinas son aisladas,
purificadas, y concentradas en la columna y son removidas de los anticuerpos con CH3OH. Las aflatoxinas totales se cuantifican
mediante la medición de la fluorescencia después de la reacción con una solución de bromo (método SFB). Las aflatoxinas
individuales se cuantifican por HPLC con un detector de fluorescencia mediante una derivatización postcolumna con yodo
(método PCD)
C. Aparatos
(a) Licuadora – de alta velocidad. Con jarra de licuado para 500 mL, con su tapa.
(c) Papel Filtro de microfibra de vidrio – de 11 cm (Whatman 934AH. Con funcionamiento eficiente).
(d) Columna de afinidad – ver párrafo B. Columnas Aflatest P Vicam (Vicam, 313 Pleasant St, Watertown, MA 02472,
EE.UU.; www.vicam.com. Con eficiencia aprobada).
(f) Bomba manual – preparada con una Jeringa con cilindro y émbolo para 20 mL, con un tapón de polietileno conectado a la
salida.
(h) Fluorómetro – con filtro de excitación para 360 nm.-360 y filtro de emisión 450 nm (Sequoia Turner Modelo 450
[Mountain View, CA 94043, EE.UU.] Con desempeño satisfactorio).
(i) Dispensador automático – botella ámbar de 2 onzas con dispensador automático de 1,0 mL (Tri-Continent Scientific, Inc.
[Grass Valley, CA 95945, EE.UU.; www.tricontinent.com] Con desempeño satisfactorio).
(l) Sistema de inyección – con válvula cargada por jeringa con bucle (loop) de 50 µL de o equivalente.
(n) Sistema de derivatización de postcolumna – una segunda bomba HPLC sin pulso, volumen cero-muerto. Pieza T, de 610
cm (L) x 0,5 mm (DI) tubing de Teflon®, y baño calentador o reactor de postcolumna [Cat. Nos. F1A920 and F1A910
(Rainin)]. Con desempeño satisfactorio.
(o) Detector de fluorescencia – con filtro de excitación de 360 nm y con filtro de corte de emisiones > 420 nm (Kratos Modelo
950 [Ramsey, NJ 07446, USA.] Con desempeño satisfactorio).
D. Reactivos
(a) Solventes – metanol, acetonitrilo, y agua [todos grado HPLC: destilados–en–vidrio].
(c) Solución reveladora de bromuro – 0,002% bromuro en agua. Preparar una solución fresca cada día de trabajo, mezclando
10 mL de la solución reveladora 0.01% (Vicam Aflatest revelador concentrado) con 40 mL de H2O. mantener la solución
(2) Solución estándar de trabajo –Transferir cada cantidad indicada en la Tabla 991.31B, de la Solución estándar madre
de mezcla de aflatoxinas [descrita en D(g)(1)] en series de tres frascos volumétricos de 2 mL. Evaporar las soluciones
justo a sequedad bajo una corriente de Nitrógeno a temperatura ambiente. A cada frasco agregar 1 mL de CH3OH,
mezclar bien, diluir a 2 mL con agua, y mezclar. Preparar diario.
(a) Pesar 25 g de la porción de muestra para ensayo en una jarra de licuadora [C (a)]. Agregar 5 g de NaCl y 125 mL de
Solvente de Extracción [D (b)].
(d) Pipetear 15 mL del filtrado en un frasco Erlenmeyer de 125 mL con tapón de vidrio.
(f) Filtrar el extracto diluido con Papel filtro de microfibra de vidrio de 11 cm [C (c)], pasando toda la solución en menos de
30 minutos antes de pasarla por la columna cromatográfica de afinidad. El filtrado debe ser claro. Si no es así, refiltrar.
(c) Cortar la punta y utilizar la tapa como conector entre la columna y el cilindro de la jeringa
(d) Pipetear 15 mL del segundo filtrado [E (f)] (equivalente a 1 g de la porción de ensayo) en el cilindro de la jeringa.
(g) Empujar el extracto a través de la columna de afinidad a un flujo cerca de 2 gotas/s (6 mL/minuto)
(h) Desconectar bomba manual del cilindro de la jeringa y llenarla con aire.
(j) Desconectar la bomba manual y agregar 10 mL de H2O al depósito de la jeringa. Llenar la bomba manual con aire y
reconectar.
(k) Empujar el agua a través de la columna a un flujo de 6 mL/minuto. Repetir con otros 10 mL de H2O. Descartar los
enjuagues de agua.
(l) Desconectar la bomba manual y llenarla con aire. Reconectarla y pasar de 2 a 3 mL de aire a través de la columna.
(m) Desconectar la bomba manual y agregar 1,0 mL CH3OH grado HPLC al cilindro de la jeringa. Colectar el eluato de la
columna en un contenedor apropiado (vial con tapa de rosca).
(n) Desconectar la bomba manual y llenarla con aire. Reconectarla y asegurar pasar todo el CH3OH a través de la columna.
Pasar de 2 a 3 mL de aire adicionales a través de la columna.
Nota: Realizar las determinaciones cromatográfica en la columna de afinidad, con alícuotas duplicadas de un segundo filtrado y determinar
la lectura de ambos en el fluorómetro.
(p) Para cuantificar las aflatoxinas por el método PCD, colectar el eluato de CH3OH en frascos volumétricos de 2 mL. Diluir
al volumen con agua grado HPLC, mezclar, y proceder con la cuantificación con HPLC.
G. Fluorometría de la solución
(a) Calibración del fluorómetro – dejar calendar el fluorómetro por 20 minutos. Insertar el blanco, D (d), y usar el botón Zero
para ajustar la lectura del instrumento a cero (0). Insertar el estándar de 20 ng/g de Aflatoxina, D (d), y usar el botón Span
para ajustar la lectura del instrumento a 20. Usar el ajuste del Gain apropiado para que el blanco produzca lecturas de 0 y
el estándar produzca lecturas de 20. Calibrar el fluorómetro justamente de hacer las lecturas de los eluatos de la columna
de afinidad para evitar posibles derivas de las lecturas en el instrumento.
(b) Cuantificación – Agregar 1,0 mL de revelador diluido al eluato, F(a), en tubo de ensayo limpio, C (g). Mezclar en una
mezcladora Vortex por 5 s. Si las burbujas se adhieren a la pared del tubo de ensayo, golpee ligeramente para desalojar.
Inserte el tubo en el fluorómetro, C (h), y espere 60 s. Registre la lectura, que es equivalente a los ng/g, de la porción de
ensayo de aflatoxinas totales.
Usando horno o baño de temperatura constante, mantenga la temperatura de la espiral de reacción a 70 °C. Configure los
siguientes caudales:
El volumen de la espiral de reacción es de aproximadamente 1.2 cm3, de modo que, con una velocidad de flujo total de 1.3
mL/min, el tiempo de reacción posterior a la columna es de aproximadamente 55 s. Deje que todo el sistema funcione 10-20
minutos para estabilizarse. Si se utiliza el integrador, ajuste los controles de sensibilidad del detector de fluorescencia, C(o) o
integrador para dar una respuesta razonable (señal:ruido = 5:1) para 0.125 ng de aflatoxina G2/50 µL. Si se usa un registrador
de gráficos de bandas, ajuste el detector de fluorescencia, C(o), y contrólelo para dar una desviación de escala del 30-40% con
0.125 ng de aflatoxina G2/50 µL.
Inyecte 50 µL de mezcla estándar de trabajo en el inyector, usando un exceso de 20-30 µL para asegurar que el loop (lazo) de
50 µL esté completamente lleno. Las aflatoxinas eluyen en el orden siguiente: G2, G1, B2 y B1 con tiempos de retención de
aproximadamente 6, 8, 9 y 11 min., respectivamente, y deben resolverse en la línea base. Si es necesario, ajuste los tiempos de
retención cambiando la concentración de CH3OH del solvente de la fase móvil. Inyecte 50 µL de las soluciones estándar de
trabajo 1, 2 y 3, D(g)(2), diariamente y prepare curvas estándar para las aflatoxinas
Inyecte 50 µL de solución de ensayo de F(p) en el inyector. Identifique cada pico de aflatoxina en el cromatograma del análisis
de la solución de ensayo comparando los tiempos de retención con los de los estándares de referencia correspondientes.
Determine la cantidad de cada aflatoxina en el eluato inyectado de las curvas estándar correspondientes. Calcule la concentración
de cada aflatoxina en la porción de ensayo, usando las siguientes fórmulas:
Sumar las concentraciones individuales de las 4 aflatoxinas, para obtener la concentración total de aflatoxinas
[Nota: Ponga en remojo toda la cristalería de laboratorio en una solución de lejía doméstica al 10%, que generalmente contiene
hipoclorito de sodio (NaClO al 5,25%), antes de volver a usarla o desecharla. Ver 990.32J (ver 49.2.16) para más detalles sobre
descontaminación.]