Facultad de Ciencias Biológicas UNMSM

Cuantificación de la extracción de ADN de tejido animal y vegetal mediante las

técnicas de electroforesis y PCR
Quantification of DNA extraction from animal and plant tissue using
electrophoresis and PCR techniques
L. Cáceres, D. Estrada, P. Gambini, A. Guillén, M. Inga, K. Villanera y E. Valverde

Resumen
Universidad Nacional Mayor
de San Marcos, Facultad
de Ciencias Biológicas, El presente trabajo detalla los distintos procesos que se siguieron en la extracción y
Apartado 110058, Lima 07, caracterización de DNA animal y vegetal para una siguiente aplicación de la técnica de
Perú.
PCR (Reacción en cadena de la polimerasa). El entendimiento de las nociones de estas
técnicas es importante pues son básicas en el estudio de la Biología Molecular. El DNA
que se utilizó, fue extraído de una muestra de tejido animal (Argopectum purpuratus) y
de tejido vegetal (Pisum sativum) mediante el método orgánico de extracción, el cual
posibilitó su desprendimiento de los demás componentes celulares. Luego de la
extracción, se cuantificó y examinó la calidad de las moléculas obtenidas utilizando
técnicas espectrofotométricas que posibilitaron determinar el estado del ADN, su
concentración y pureza. Posteriormente, se ejecutó una electroforesis en gel agarosa.
Palabras clave: Reacción en cadena de la Polimerasa. Electroforesis. Ladder ADN
lambda. Taq Polimerasa. Primer 16S.
Abstract
The present work details the different processes that were followed in the extraction and
characterization of animal and vegetable DNA for a following application of the PCR
technique (Polymerase chain reaction). The understanding of the notions of these
techniques is important because they are basic in the study of Molecular Biology. The
DNA that was used was extracted from a sample of animal tissue (Argopectum
purpuratus) and from vegetable tissue (Pisum sativum) by means of the organic
extraction method, which enabled its detachment from the other cellular components.
After the extraction, the quality of the molecules obtained was quantified and examined
using spectrophotometric techniques that made it possible to determine the DNA status,
its concentration and purity. Subsequently, an agarose gel electrophoresis was
performed.
Key words: Polymerase Chain Reaction. Electrophoresis. Lambda DNA/HindIII Marker.
Taq Polymerase. 16S primer.
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Introducción
El descubrimiento del ADN fue un hito
que marcó la historia de la Biología
molecular y de las ciencias en general,
creándose numerosas técnicas y secuencia de la evaluación de la
procedimientos de laboratorio que se
aplican para extraer ADN y analizar
mejor su composición. Una de estas
herramientas utiliza un grupo de enzimas
especializadas, denominadas "enzimas
de restricción", que se usan como tijeras
moleculares para cortar los enlaces
fosfato de la molécula de ADN y llevar a
cabo la tecnología de la ingeniería
genética.
Otras técnicas muy útiles para trabajar
con ADN son la extracción de ADN y la
Reacción en Cadena de la Polimerasa
(PCR). La extracción del ADN consiste
en el aislamiento de esta molécula y su
purificación a partir de cualquier tejido.
Se basa en una serie de lavados de la
muestra y agregado de proteinasas que
eliminan las proteínas del medio,
detergentes para eliminar las
membranas plasmáticas y luego ir
purificando el ADN de esa mezcla de
ARN proteínas y restos celulares.
Por otro lado, la PCR utiliza una enzima
denominada DNA polimerasa que copia
las cadenas de ADN a partir de
desoxirribonucleótidos y un molde de
DNA. Consiste en la amplificación in vitro
de un fragmento de ADN específico,
utilizando una enzima termoestable,
llamada la Taq Polimerasa.
Este proceso, que ha revolucionado
todos los campos de la biología, permite
a los científicos obtener gran número de
copias a partir de un segmento
determinado de ADN. La tecnología
denominada huella de ADN (DNA
fingerprinting) permite comparar
muestras de ADN de diversos orígenes,
de manera análoga a la comparación de
huellas dactilares.
Metodología
Análisis electroforético del DNA
El análisis electroforético se realizó como
eficiencia de la extracción de ADN. Para
la preparación del gel se usó agarosa
diluída en el buffer TBE 0.5X, se disolvió
la agarosa y una vez que alcanzó
aproximadamente 60ºC, se agregó el
compuesto para tinción de ácidos
nucleicos, GelRed. Luego, se vertió en
una bandeja de corrida, se colocó los
peines, para formar los pocillos y se
esperó hasta que gelifique; mientras para
preparar la cámara electroforética, se
colocó buffer TBE 0,5X, se removió los
peines con cuidado y se colocó el gel en
la cámara electroforética verificando que
el gel quede sumergido en el buffer.
Para la preparación de la muestra, se
colocó en parafilm 1µl de buffer de carga,
que contiene buffer, colorantes (xilen-
cyanol, azul de bromofenol y orange gel),
bajo contenido de EDTA y glicerol; y 3-4
µl de DNA a evaluar y se cargó la
muestra en uno de los pocillos de gel, se
reservó el pocillo lateral para colocar 0.5
µl del marcador de tamaño molecular
(ladder, ADN con fragmentos de
tamaños conocidos). Para poder iniciar la
corrida electroforética, se conectó los
electrodos a la fuente de poder y a la
cámara electroforética. Se realizó la
corrida a 95 V por unos 30 minutos. Al
cumplirse el tiempo se apagó la fuente
de poder, se retiró el gel y se llevó al gel
al transiluminador para poder observar el
desplazamiento de las bandas.
Amplificación del DNA por PCR
La reacción en cadena de la polimerasa
necesita como primer paso la
preparación del master mix, el cual está
compuesto por 7.5 μl de buffer PCR,
0.75 μl de 16S ar- Primer Forward, 0.75
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μl de 16S br- Primer Reverse, 1.5 μl de ADN es monocatenario (una sola hebra)
dNTPs, 58.75 μl de agua y 0.75 μl de o persiste RNA en la solución. Además,
Taq pol, siendo el volumen de reacción tenían cierto grado de contaminación,
total 70 μl. Se rotularon los 3 tubos de principalmente, en las muestras de tejido
PCR, uno ADN animal, el otro ADN animal (Tabla 2). Sin embargo, a pesar
vegetal y un tercero control negativo. Se de estos detalles las muestras de las tres
agregó 14 μl de Master Mix a cada uno, mesas, especialmente mesa 1 y 2,
luego se añadió 1 μl de la muestra molde presentaron un buen grado de pureza y
que en estos casos serían los ADN de rendimiento.
vegetal y animal que se obtuvieron en la
En cuanto a la muestra de tejido animal
extracción, en los dos primeros tubos;
(Tabla 1) y vegetal (Tabla 2) de la mesa
mientras que al tercero solo se le agregó
3 se encontró que en este último el ADN
1 μl de agua destilada. Esta solución se
estaba en estado nativo, es decir que es
centrifugó por unos segundos en modo
bicatenario (doble hélice) y tuvieron un
touch, luego se los llevó al termociclador
alto grado de pureza. Por otro lado,
y se seleccionó las temperaturas para
también presentó un grado de
que se pueda realizar la PCR durante
contaminación.
una hora y media. Luego, se realizó un
análisis electroforético de lo obtenido en Tabla 1. Datos obtenidos por análisis
la PCR. espectrofométrico de Argopecten
purpuratus
Muestra CC A A
ng/mL 260/280 260/230 TEJIDO ANIMAL
1 Animal 349.9 1.8 0.9 Conc
Muestr A
Vegetal 327.9 1.7 0.7 (ng / Estado
a 260/280
2 Animal 1438.9 1.8 4.5 l)
Vegetal 525.5 1.7 0.6 Mesa 1 154.5 1.84 Denaturado
3 Animal 150.6 1.8 0.6
Mesa 2 137 1.72 Denaturado
Vegetal 158.8 1.6 0.5
Mesa 3 115 1,86 Denaturado
Resultados
Caracterización espectrofotométrica Tabla 2. Datos obtenidos por análisis
del ADN espectrofométrico de Pisum sativum.

La eficacia de la extracción de ADN de TEJIDO VEGETAL

ambos tejidos fue evaluada mediante
tres parámetros: el efecto del ADN, Conc A
Muestra Estado
concentración de la muestra y el grado (ng / l) 260/280
de pureza, obteniendo mejores Mesa 1 310 1.80 Denaturado
resultados en las mesas 1 y 2 tanto para
ADN de tejido animal (Tabla 1) como Mesa 2 220 2.77 Denaturado
para ADN de tejido vegetal (Tabla 2). Mesa 3 82 1.7 Nativo
Las muestras examinadas de la mesa 1
y 2 (Tabla 1), se encontraron en estado
denaturado, dicho de otra manera, el
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Análisis electroforético del DNA
Para comprobar que los resultados
obtenidos en la extracción de ADN
fueron los óptimos se hace uso de la
técnica de la electroforesis, ya que de
esta manera se determina el tamaño de
la muestra y su estado (si se presenta
degradación o no).
Los pocillos 1, 7 y 13 representan a las
muestras de ADN animal en cada mesa
mientras que los pocillos 2, 8 y 14, a las
de ADN vegetal. Además, las muestras
de 16s eucariótico animal y vegetal están
representadas en los pocillos 3, 9, 15, y
4, 10 y 16 respectivamente. Finalmente,
los pocillos 5, 11, 17, y 6, 12 y 18
representan al 16s eucariótico animal y
vegetal respectivamente.
Se analizó pocillo por pocillo para
determinar cuál de las muestras era la
mejor para así pasar a la última fase que
es la amplificación por PCR de un
fragmento determinado.
Las mejores muestras de tejido animal y
vegetal fueron las de los pocillos 7 y 2,
respectivamente. Ambas tuvieron un
buen grado de p1ureza (Tabla 1 y 2).
En los pocillos 1,7 y 13 hubo
degradación de ADN, pero su pureza fue
Mesa 1
1 2 3 4 5 6 7 8
Figura 1 Migración de DNA y RNA (procarionte y eucarionte) en geles de agarosa al 1%-
Buffer TBE 1X- 95 V – 30min
más alta, por lo tanto, fue una extracción
regularmente buena.
En los pocillos 2,8 y 1 hubo degradación
del ADN vegetal pero aún mantiene
algunos fragmentos grandes; sin
embargo, el pocillo 14 tuvo un mal grado
de pureza.
En los pocillos de ARN16s eucariótico
animal (3,9 y 15) se obtuvo un buen
grado de pureza bajo y con presencia de
contaminantes de aproximadamente 500
pb y 900 pb en las tres mesas.
En los pocillos de ARN16s eucariótico
vegetal (4 y 10) se obtuvo buen grado de
pureza y con presencia de
contaminantes de aproximadamente 500
pb. En el pocillo 16 hubo poca presencia
de ARN eucariótico extraído
Finalmente, las mesas 1 y 3 no muestra
contaminación bacteriana en tejido
animal (pocillo 5 y 17); pero si en la del
tejido vegetal (pocillo 6 y 18). Por lo
contrario, la mesa 2 tiene un agente
contaminante de más de 1000 pb en la
muestra extraída de tejido animal; mas
no presenta algún agente en la muestra
de tejido vegetal.
Mesa 2 Mesa 3
9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
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Amplificación del DNA por PCR Tabla 4: Pares de bases que posee el
ADN Y ARN, determinados con la
En la figura 1 se puede observar los
comparación del ladder.
resultados obtenidos de la electroforesis
de la región de ADN para el gen ARNr
PARES
16S que ha sido amplificado PROCEDENCIA
POCILLO DE
anteriormente por PCR basándose en un DE TEJIDO
BASES
control negativo. Los resultados de las ANIMAL 1 23130
muestras del DNA animal fueron exitosos VEGETAL 2 9416
al obtenerse fragmentos amplios de ADN
ARN eucariota
y con tamaños de pares mayores a 2000. 3 600
animal
Por el lado de la muestra vegetal, se MESA
ARN eucariota
1 4 600
llega a visualizar una porción pequeña vegetal
de DNA o en caso y con poquísima ARN procariota
5 -
cantidad replicada. animal
ARN procariota
6 2000
En el ARNr 16s, ya sea procariótico vegetal
como eucariótico, se observan bandas ANIMAL 7 23130
intensas, con una apariencia de tener el VEGETAL 8 2027
mismo tamaño en pares de bases de ARN eucariota
apróximadamente 700. En este 9 600
animal
MESA
experimento se basó en un control ARN eucariota
2 10 700
positivo que contenía ADN vegetal
correspondiente a la región que codifica ARN procariota
11 2000
animal
el ARNr 16S.
ARN procariota
12 -
Tabla 3: Cuantificación de ADN con vegetal
nanodrop (Espectrofotometría de ANIMAL 13 23130
microvolúmenes VEGETAL 14 4361
ARN eucariota
15 600
animal
Conc A A ARN eucariota
Muestra MESA3
(ng / l) 260/280 260/230 vegetal
16 600

349.9 1,80 0.90 ARN procariota

17 600
Mesa 1 animal
321.9 1,70 0.70 ARN procariota
18 -
vegetal
1438.9 1,80 1.50
Mesa 2
525.5 1,70 0.60 Discusión de resultados
Las fallas en la extracción del ADN, la
150.6 1,80 0.60
Mesa 3 contaminación con proteínas o
158.8 1,60 0.50 sustancias ajenas pueden interferir en la
reacción del PCR.
Las técnicas de extracción del ADN,
tienen principios básicos como romper
los tejidos, como membranas celulares y
nucleares. Siendo necesario de la
eliminación de los componentes que
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dichas técnicas liberan y dejar el ADN
puro para amplificarlo.
Al término de la PCR, obtuvimos
resultados desfavorables. en el caso de
las tres mesas con respecto al ADN
animal (1,7 y 13) y ADN vegetal (2,8 y
14) se observó que las bandas corrieron
debido a la degradación del ADN. El
ADN se degrada en fragmentos por la
acción de endonucleasas dependientes
de Mg+2, por tal motivo catalizo la
ruptura de los enlaces fosfodiéster y la
electroforesis en gel muestra una
distribución del ADN en un extendido
continuo.
En los pocillos 3,4,9,10,15 y 16 que se
utilizaron los primers 16Sar-L y 16Sbr-H
para el gen de la subunidad 16S del
ribosoma mitocondrial (16S rARN) los
resultados fueron favorables y no
favorables.
En caso de los pocillos 3 y 10 se
obtuvieron resultados no favorables ya
que se observa más de una banda lo
cual pudo haberse dado por que la
temperatura de hibridación que
utilizamos no es tan específica y
obtuvimos poca reproducibilidad, ya que
el oligonucleótido se une en cualquier
parte al azar y no solamente en los sitios
que son complementarios, lo que hará
que se amplifiquen zonas distintas en un
PCR y otro. Es importante elegir una
temperatura de hibridación que sea la
correcta y que nos asegure que el gen
que amplificamos es realmente el que
queremos.
En el caso de los pocillos 4,9 y 15 se
obtuvieron resultados favorables ya que
se observa una banda lineal y se dio
gracias a la especificidad de los primers,
las correctas temperaturas en cada ciclo
del PCR o la correcta cantidad de
Magnesio para que la ADN polimerasa
cumpla eficientemente su labor
enzimática.
En caso del pocillo 16 se observa una
banda muy tenue lo cual pudo haberse
dado por diversas causas: el ADN puede
estar contaminado con proteínas o
alguna sustancia que inhibe la reacción
de PCR pues todas las técnicas de
extracción tiene principios básicos
comunes: primero romper el tejido y las
membranas celulares y nucleares, casi
siempre con algún tipo de detergente y si
quedan restos puede inhibir la reacción
de PCR, después es necesario
deshacerse de todos los componentes
celulares que se liberan y dejar al ADN
limpio para poder amplificarlo, para esto
se usan sales que precipitan las
proteínas pero no el ADN o cloroformo y
fenol que “atrapan” los lípidos y proteínas
y dejan al ADN disuelto en agua, los
cuales también inhiben la reacción de
PCR; la concentración de dNTPs, pues
pequeños incrementos en la
concentración de dNTPs pueden inhibir
la reacción porque atraparán el
magnesio necesario para que la
polimerasa trabaje; la cantidad de
oligonucleótidos, pues si se agregó
mucha cantidad aumenta el rendimiento
del PCR, pero se pudieron formar
productos inespecíficos, y si se agregó
aún una mayor cantidad pudieron formar
dímeros, en vez de unirse al ADN, y eso
impide la amplificación del producto, por
el contrario, si utilizo muy poco se
obtendría mayor especificidad en el
producto, pero puede suceder que no
veremos el amplificado (pues baja el
rendimiento). Si se cambia la
concentración de dinucleótidos es
importante tener en cuenta que existe
una relación entre las cantidades de
magnesio y las de dinucleótidos en la
reacción. También es necesario saber
que los dNTPs son muy inestables.
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En los pocillos 5,6,11,12,17 y 18 se
utilizaron los primers 27F y 1492R para
el gen de la subunidad 16S procariota no
se observó en los pocillos 5, 12 y 17; en
cambio en el de ADN vegetal se observó
bandas en los pocillos 6 y 18, lo que nos
indica que las muestra estuvieron
contaminadas por bacterias las cuales se
lisaron con los reactivos que se le agregó
para la extracción de ADN, lo mismo
paso pero en el caso del pocillo 11 para
ADN animal que se presenta una banda
indicando fragmentos de ADN. Otro
motivo de contaminación es el mal
manejo al añadir las alícuotas
Para obtener una buena amplificación se
pueden usar programas que permitan
diseñar los primers de acuerdo con los
requerimientos del estudio ya que estos
podrían estar degradados, defectuosos,
mal diseñados o incluso que la cantidad
utilizada no sea la correcta. Si hay
mucha cantidad aumenta el rendimiento
del PCR, se produce inespecificidad o la
dimerización de primers.
Además, para que la especificidad sea
máxima, se debe evitar que la
polimerasa y el resto de las
componentes estén a temperatura
ambiente antes de iniciar el primer ciclo.
La temperatura de extensión ocurre a
72°C y es cuando se da la máxima
eficiencia de la enzima y el tiempo de la
extensión dependerá de la distancia de
los partidores entre sí. En general se ha
calculado que la la Taq polimerasa actúa
sobre el complejo templado-primers y
empieza su función catalítica a una
velocidad muy rápida; agrega dNTP’s
complementarios para crear las cadenas
completas de ADN. La extensión de las
cadenas es en dirección de la síntesis
del ADN, es decir, de 5’ a 3’. Además, es
capaz de incorporar 60 nucleótidos por
segundo a 70°C, por lo que un minuto es
tiempo suficiente para incorporar
alrededor de 1.000 pares de bases. Ya
que se ocupan dos partidores en la
reacción, uno para cada hebra, y que
estos quedan a una distancia de
entrecruzamiento durante la síntesis de
ADN, el segmento definido será
amplificado en forma exponencial Esto
significa que en cada ciclo de
amplificación se producirá un número de
copias equivalente al exponente del
número de hebras de ADN templado.
Sugerencias
En otros estudios usaron otras
polimerasas como la obtenida de
Pyrococcus furiosus (Pfu) o la aislada de
la bacteria Thermococcus litoralis (Vent),
que incorporaron errores con una
frecuencia mucho más baja y pudieron
copiar fragmentos de mayor longitud que
la Taq.
La contaminación es otro factor común
de fallas en los PCRs. Para monitorearlo,
siempre hay que trabajar con un control
negativo: un tubo extra al que se le
agreguen todos los reactivos utilizados
en el PCR, excepto ADN, por lo tanto, no
se tiene que amplificar, es decir, no
obtener ningún amplicón. Además del
control negativo es recomendable incluir
un control positivo. Este es un tubo que
contiene ADN de una muestra que haya
amplificado adecuadamente y cuyo
patrón de bandas es conocido. De esta
manera, puede esperarse que, si la
reacción se llevó a cabo correctamente,
esta muestra siempre salga. En caso
contrario, si nuestro PCR no generó
bandas en ninguna de las muestras, ni
siquiera en el control positivo, puede
suponerse que el error radica en que se
nos olvidó agregar algún ingrediente o
bien que los ciclos de temperatura no se
llevaron a cabo adecuadamente, ya sea
por problemas de la máquina o bien por
error al elegir el programa de
amplificación.
En general cada polimerasa viene con un
buffer ya preparado con los reactivos
necesarios para que funcione de forma
adecuada, en caso se tenga un buffer sin
magnesio se debe ajustar la
concentración de magnesio a 1.5 mM
(más común), mucho magnesio inhibe a
la polimerasa, y poco puede generar
productos inespecíficos.
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Otro error común es el de ejecutar http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones2

demasiados ciclos, ya que esto puede /libros/530/cap17.pdf
incrementar la cantidad y complejidad de  Reacción en cadena de la polimerasa
productos no específicos. (PCR). (2016). Retrieved from
Otra modificación del procedimiento para https://es.khanacademy.org/science/biolo
obtener mejores resultados es cambiar gy/biotech-dna-technology/dna-
las temperaturas estándares del PCR. sequencing-pcr-
Para tener una idea de la temperatura de electrophoresis/a/polymerase-chain-
alineamiento que podría ser la mejor, se reaction-pcr
puede calcular la Tm de cada primer que  Resolución de problemas encontrados
utilizamos. Este proceso dependerá durante la separación de DNA en geles
principalmente del tipo de uniones de agarosa. Retrieved from
(dobles o triples enlaces de hidrógeno) http://biomodel.uah.es/an/plasmido/0/pro
que formarán sus bases, y por eso la bl.htm
secuencia de cada primer es la que se
toma en cuenta para conocer cuál es la
 Roque Cortez, C., & Ticliahuanca Labán,
temperatura óptima para el alineamiento.
A. (2012). DIVERSIDAD Y
ESTRUCTURA GENÉTICA
POBLACIONAL DE Crassostrea
iridescens UTILIZANDO COMO
PASOS T° TIEMPO # DE MARCADORES LOS GENES COI Y 16S
CICLOS rARN EN TUMBES EL AÑO 2012.
Tumbes, Perú. Retrieved from
Denaturación 94° 3min 1 http://repositorio.untumbes.edu.pe/bitstre
inicial am/handle/UNITUMBES/175/TESIS%20-
%20ROQUE%20Y%20TICLIAHUANCA.
Denaturación 94° 45s
pdf?sequence=1&isAllowed=y
35
 Solano Chávez, C. (2013).
Hibridación 52° 40s IMPLEMENTACIÓN DE PROTOCOLOS
DE PCR Y q-PCR PARA LA
DETECCIÓN DE HERPESVIRUS EN
Polimerización 72° 45s Crassostrea gigas y Argopecten
purpuratus. Tumbes, Perú. Retrieved
from
Polimerización 72° 5 min 1 http://repositorio.untumbes.edu.pe/bitstre
final am/handle/UNITUMBES/138/TESIS%20-
%20SOLANO%20CHAVEZ.pdf?sequenc
e=1&isAllowed=y

Bibliografía
 Electroforesis en gel. (2016). Retrieved
from
https://es.khanacademy.org/science/biolo
gy/biotech-dna-technology/dna-
sequencing-pcr-electrophoresis/a/gel-
electrophoresis
 Espinosa Asuar, L. Guía práctica sobre
la técnica de PCR. Retrieved from
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Anexo adecuadamente y cuyo patrón de bandas

es conocido. De esta manera, puede
1.-Completar las tablas 1 y 3 y justificar
esperarse que, si la reacción se llevó a
los parámetros considerados
cabo correctamente, esta muestra
Pasos Tempe- Tiempo # de siempre salga. En caso contrario, si
ratura ciclos nuestro PCR no generó bandas en
Denaturacion 94 – 96 3 min 1 vez ninguna de las muestras, ni siquiera en
inicial el control positivo, puede suponerse que
Denaturacion 94° 45s el error radica en que se nos olvidó
agregar algún ingrediente o bien que los
Annealing 50° 40s
ciclos de temperatura no se llevaron a
30 cabo adecuadamente, ya sea por
veces problemas de la máquina o bien por error
Extensión 72° 45s
al elegir el programa de amplificación.
Extensión 72° 4 min 1 vez Control negativo:
final
Éste es un tubo extra al que se le
agreguen todos los reactivos utilizados
en el PCR, excepto ADN. Si en esta
muestra hay amplificación significa que
Compo CCI CCF Vol x 1 Vol x 5
n. rx rx
en algún reactivo hay restos de ADN o
Buffer 10X uM 1x 1.5 uL 7.5 de producto de PCR que está
PCR contaminando el experimento. Si esto
dNTPS 10 mM 200uM 0.3 1.5 sucede, consideramos que lo más fácil
Primer 10 uM 0.1 u M 0.15 0.75 es deshacerse de todas las alícuotas
F 16 sospechosas (por eso es importante
Sar
Primer 10 uM 0.1 uM 0.15 0.75
preparar alícuotas de todos los reactivos)
16 Sbr y tomar alícuotas nuevas. Para
Mg Cl2 ----------- ---------- ---------- ----------- prevenirlo sugerimos algunas medidas
- -- -- que podrían ser de utilidad: los productos
Taq Pol 10 0.15uL 0.75 de PCR son frecuentemente los que
DNA 50mg/m 7.2 1 uL ----------- contaminan, al ser moléculas de tamaño
(No se L 7.8 --
muy pequeño y al estar tan concentradas
agrega
en el es fácil que una gotita de producto quede
MM) en una pipeta (las pipetas absorben el
H2O 11.75 58.75 líquido por aspersión y las gotitas
uL uL quedan regadas como si fueran spray);
Volume Volume Volume 15 uL 70 al preparar una mezcla posteriormente,
n de rx n de rx n de Rx
esto contamina alguno de los reactivos
que se utilizan
2.- ¿Cuál es la utilidad de considerar un
3.- ¿Qué factores influyen en la
control positivo y negativo en la reacción
corrección del cálculo de la temperatura
de PCR?
de melting y la temperatura de annealing
Control positivo: de la PCR?

Éste es un tubo que contiene ADN de Temperatura de Melting:

una muestra que haya amplificado
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Se refiere a la temperatura a la que se
hibridan o se pegan los oligonucleótidos
en los sitios que son complementarios.
Este proceso dependerá principalmente
del tipo de uniones (dobles o triples
enlaces de hidrógeno) que formarán sus
bases, y por eso la secuencia de cada
oligo es la que se toma en cuenta para
conocer cuál es la temperatura óptima
para su alineamiento.
Los principales factores que afectan este
valor son: concentración de sales,
concentranción de ADN, presencia de
agentes desnaturalizantes (DMSO o
formamida), secuencia, longitud y
condiciones de hidridización.
Temperatura de Annealing:
La fase de anillado (annealing) se refiere
a la unión de los primers (que se
encuentran en muy altas
concentraciones) a la hebra del ADN
monocatenario, al momento de
descender la temperatura del ciclador.
Depende de la longitud y la composición
del primer, así como de la Temperatura
de Melting de los primers.
4. Explicar la función de los diferentes
compuestos utilizados en la
electroforesis de DNA. Aplicaciones de
geles de agarosa para la caracterización
de muestras.
Marcadores moleculares basados en el
DNA: consiguen estabilidad en la
identificación de especies y variedades.
EDTA: Acrónimo de EthyleneDiamine
TetraAcetic acid, ácido etilendiamino
tetraacético (a veces AEDT en español).
En sus formas desprotonadas (2− y 4−),
es un conocido agente quelante de
cationes divalentes, en especial Ca2+ y
Mg2+.
Dado que el Mg2+ es un cofactor
requerido por la mayoría de las
nucleasas, su secuestro por el EDTA
evita la degradación del DNA durante la
preparación y la electroforesis.
Azul de bromofenol: En la electroforesis,
por su menor tamaño, se mueve más
rápido que la mayoría de moléculas de
DNA (siempre que éstas sean superiores
a 300 pb), es decir, marca el "frente de
avance". Puesto que su color azul-violeta
es bien visible, permite detener la
electroforesis con la confianza de que las
moléculas de DNA no se hayan salido
del gel.
GelRed™: En la electroforesis, se utiliza
para "teñir" el DNA, para revelar su
posición en el gel. Se puede bañar el gel
tras la electroforesis en una disolución de
GelRed™, o bien incorporar éste a la
disolución de agarosa con la que se
prepara el gel.
Tampón TAE: En la electroforesis,
permite mantener las moléculas de DNA
con una carga negativa uniforme y
constante. Es, por ello, componente del
gel y del tampón de electroforesis, o
tampón de cubeta.
Tris: En la electroforesis, es el agente
tamponante que mantiene el pH.
Xileno-cianol: En la electroforesis se
mueve aproximadamente como las
moléculas de DNA de 9000 pb. Puesto
que su color azul es bien visible, permite
detener la electroforesis con la confianza
de que las moléculas grandes de DNA
no se hayan salido del gel.
Bromuro de etidio: En la electroforesis,
se utiliza para "teñir" el DNA, para revelar
su posición en el gel. Se puede bañar el
gel tras la electroforesis en una
disolución de bromuro de etidio, o bien
incorporar éste a la disolución de
agarosa con la que se prepara el gel.
5. Si necesito correr RNA en un gel de
agarosa, ¿qué consideraciones o
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variaciones cree ud. que debo tener en El termociclador es diferente si se realiza

cuenta? una PCR de punto final o una PCR de
tiempo real.
Área limpia: Espacio físico libre de
amplicones (estas son un conjunto de Recomendaciones para disminuir la
moléculas de ADN idénticas, producto de contaminación:
la PCR), templados de ADN y de
5.1.- No deben almacenarse en un
muestras biológicas que pudieran
mismo refrigerador/ congelador,
contaminar futuras PCR. Corresponde al
reactivos libres de templado junto con
área de preparación de reactivos,
ácidos nucleicos purificados y/o con
también llamada Pre-PCR.
muestras biológicas.
Área sucia: Espacio físico donde existe
5.2.- Si se detecta contaminación en
presencia y manipulación de amplicones,
algún reactivo, partidor, sonda, agua,
ADN/ARN y/o muestras biológicas.
enzima, etc, éste debe ser eliminado.
Comprende las áreas de Extracción del
Para evitar pérdidas de los stocks de
templado, área de Carga ó dispensación
reactivos por contaminación, se
del templado, área de Amplificación
recomienda preparar alícuotas previo a
(donde están los termocicladores) y, para
su uso, de manera de sólo eliminar la
el caso de PCR de punto final, el área de
alícuota en uso si se detecta
Electroforesis.
contaminación.
Mezcla de PCR: Preparación y mezcla
5.3.- Centrifugar brevemente (spin) los
de los componentes necesarios para que
tubos que contengan ácidos nucleicos y
ocurra una reacción de PCR tales como
luego abrirlos cuidadosamente para
agua libre de nucleasas, Mg+2, dNTPs,
evitar contaminar los guantes y las
partidores y enzima polimerasa
superficies.
termoestable (Taq polimerasa).
5.4.- La superficie utilizada para preparar
PCR de punto final: También conocido
las reacciones de PCR debe ser
como PCR convencional permite
descontaminada con radiación
visualizar, mediante una electroforesis, la
ultravioleta antes y después de la
acumulación de amplicones generados al
preparación (15 a 30 min). Si se
final de un número predeterminado de
sospecha contaminación,
ciclos.
adicionalmente, una vez terminado el
PCR de tiempo real: Permite detectar la trabajo, pueden limpiarse las superficies
cinética de la acumulación de con una solución de 0,5- 1,0 % de
amplicones durante cada ciclo hipoclorito de sodio, que luego debe ser
inmediatamente, sin necesidad de una removido con etanol 70%. También es
electroforesis posterior. Templado: Ácido posible utilizar soluciones comerciales
nucleico (ADN o ARN) utilizado como para este fin: DNAZap ® (Invitrogen),
molde para la PCR, es decir, a partir de DNA Away ® (VWR), DNA Remover®
aquella molécula serán sintetizadas las (Minerva Biolabs), entre otras.
copias idénticas conocidas como
5.5.- Es recomendable incorporar los
amplicones.
siguientes controles negativos, para
Termociclador: Equipo que permite tener un mejor manejo de las
realizar de forma automática los ciclos de contaminaciones:
temperatura necesarios para una PCR.
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a.- Control de extracción: Utilizar un
reactivo, por ejemplo, agua estéril libre
de nucleasas, y manipularlo como una
muestra biológica más durante el
proceso de extracción de ácidos
nucleicos.
b.- Control de reactivos: Preparar el
reactivo en el área limpia y mantener el
tubo cerrado durante el resto del
proceso. Luego incubarlo en el
termociclador y realizar la electroforesis.
Permite chequear los reactivos que se
están utilizando para la preparación de
las mezclas de PCR.
c.- Control de manipulación: Agregar
agua en un microtubo en lugar de
templado, cada 3-4 muestras
dispensadas, durante el proceso de
carga en la preparación de la PCR.
Permite chequear la manipulación, por
parte del operador, de las muestras con
templados.
d.- Control de réplica: Para todo
laboratorio que trabaje con PCR en
tiempo real, además de utilizar los
controles antes mencionados, es
necesario trabajar cada muestra
utilizando réplicas (al menos en
duplicado) para descartar posibles falsos
positivos, dada la alta sensibilidad de la
técnica.
5.6.- Cada vez que un operador ingrese
a un área diferente debe ponerse
guantes y delantal nuevos, y utilizar sólo
los equipos y materiales disponibles en
esa área. Los delantales en cada área
son exclusivos y no son intercambiables,
es decir, el delantal utilizado para
trabajar en un área sucia debe ser
distinto al utilizado en un área limpia (lo
mismo ocurre con los guantes). Para
esto, es necesario disponer de percheros
ubicados en las distintas áreas:
- Área limpia: una vez que se ha
ingresado a esta área, el operador debe
vestir inmediatamente un delantal
exclusivo. Antes de retirarse, el delantal
utilizado debe ser colgado en un
perchero para que permanezca en esta
área.
- Área sucia: siempre que el operador
trabaje en un área sucia debe vestir un
delantal exclusivo.
- Área de carga o dispensación de
muestras: una vez que se ha ingresado a
esta área, el operador debe vestir
inmediatamente un delantal exclusivo.
Antes de retirarse, el delantal utilizado
debe ser colgado en un perchero para
que permanezca en esta área y los
guantes deben ser eliminados. Antes de
salir del área limpia, área de carga o salir
del laboratorio, el delantal utilizado debe
ser colgado en un perchero para que
permanezca en esta área y los guantes
deben ser eliminados. Los delantales
deben ser renovados permanentemente
para asegurar la eliminación de
contaminantes (delantales área sucia) y
mantención de la limpieza (delantales
área limpia). Por esta razón, es
altamente recomendable el uso de
delantales desechables. 7.- La adición de
Uracil-N-Glicosilasa (UNG) en conjunto
con dUTP (en lugar de dTTP) a la
mezcla de PCR, permite inactivar
enzimáticamente los amplicones para
evitar que sean futuras fuentes de
contaminación. Durante la PCR, los
amplicones serán sintetizados utilizando
dUTP en vez de dTTP; para una próxima
PCR, en caso de haber contaminación
por amplicones (contaminación carry-
over), la previa incubación con enzima
UNG degradará los productos que
contengan dUTP, inactivándolos como
templado.