Aislamiento de ARN de una muestra de sangre por el método

cloroformo-alcohol isoamílico de un estudiante de Medicina Humana

de la Universidad Católica de Santa María. Arequipa, Perú (2019)
Calderón P, Gabriel (1); Medina S, Joshua (1); Sirlupu Z, Rogger (1)

(1) Facultad de Medicina de Humana, Universidad Católica de Santa María,

Arequipa, Perú

Cloroformo – Alcohol Isoamílico para la

Abstract
Introduction: For the following research
work, the Chloroform - Isoamyl Alcohol
method was tested for the extraction of
RNA in blood samples of the students of
the second year of Human Medicine.
Materials and Methods: This protocol
was used Trizol reagent or TRI REAGENT
to allow complete lysis and
homogenization of DNA, RNA and
proteins. When the chloroform was
added, the mixture was separated into
three phases where the aqueous
contained the RNA. Which ended up being
precipitated by cold isopropanol and
washed with ethanol. Results: When
performing the electrophoresis,
unfortunately, the RNA could not be seen
and the results were not what we
expected, we assume due to an oversight
in the quantities and times that we use.
Conclusions: This method must be carried
out with great care to obtain satisfactory
results.
Key Words: RNA, RNA Isolation,
Chloroform, Isoamyl Alcohol.
Resumen
Introducción: Para el siguiente trabajo de
investigación se puso a prueba el método
extracción de RNA en muestras de sangre
de los alumnos del segundo año de
Medicina Humana. Materiales y
Métodos: Este protocolo se utilizó el
reactivo Trizol o TRI REAGENT para
permitir la lisis completa y
homogenización del ADN, ARN y
proteínas. Al agregar el cloroformo la
mezcla se separó en tres fases donde la
acuosa contenía el ARN. El cual terminó
siendo precipitando por isopropanol frio y
lavado con etanol. Resultados: Al realizar
la electroforesis desafortunadamente no
se pudo apreciar el RNA y los resultados
no fueron lo que esperábamos,
suponemos por por un descuido en las
cantidades y tiempos que utilizamos.
Conclusiones: Se debe realizar este
método con mucho cuidado para obtener
resultados satisfactorios.
Palabras Claves: ARN, Aislamiento del
ARN, Cloroformo, Alcohol Isoamílico
Introducción
El ARN, así como el ADN, realiza un papel
clave en el proceso de transcripción por lo
que su extracción y secuenciación pueden
brindar información importante para ser
estudiada. Durante el pasar de los años se
ha descubierto más el comportamiento
de los ribosomas y su interacción con el
ARN y la síntesis de importantes proteínas
codificadas en los genes de diferentes
especies. En medicina genética cobra una
gran importancia su estudio para el
respectivo diagnóstico oportuno de
enfermedades provenientes de diversas
fuentes microbiológicas, familiares o
autoinmunes.
A partir de las técnicas moleculares
empleadas por la genética moderna se ha
podido establecer que cada individuo
posee diferencias en su material genético,
o lo que es lo mismo, diferencias en su
ADN. El ADN puede aislarse a partir de casi
todas las células del organismo humano y
mediante distintos procesos por los
cuales puede ser estudiado para mayores
estudios.
Para este estudio se debe llevar a cabo un
proceso de extracción de ARN. Para dicho
proceso necesitamos seguir tres pasos
fundamentales.
Primero la Obtención de una muestra
biológica, microorganismos o fluidos;
seguida de la destrucción de la membrana
nuclear y celular mediante un proceso de
lisis, el cual se puede dar por un buffer o
una solución que contenga componentes
que harán que la membrana se rompa, sin
embargo, en bacterias y plantas no va a
ser suficiente tener un buffer porque
tienen pared celular. En las muestras de
sangre se hace este proceso y se obtiene
el ARN de los leucocitos ya que los
glóbulos rojos son anucleados.
Finalmente, separar el ARN de todo
despojo o material que no sirva. Y esto se
puede lograr mediante procesos de
purificación
Dos procesos muy conocidos para la
extracción del ADN son: El Método de
Extracción Líquido - Líquido (L-L) y El
Método de Extracción Líquido - Sólido(L-
S). Para cada método existen diversas
técnicas que pueden ser preferidas según
su facilidad de realización, acceso a los
reactivos o simplemente preferencia del
investigador. Existen métodos más
complejos como por ejemplo el que se
lleva acabo mediante Perlas Magnéticas.
El método de extracción usando columnas
de silica ha demostrado también tener
buenos resultados ya que permite una
rápida purificación de los ácidos nucleicos
y su alta especificidad. A continuación
presentamos la realización de este
método en un laboratorio de biología
molecular universitario.
Materiales y Métodos
El protocolo usado para la extracción de
RNA fue el método cloroformo - alcohol
isoamilico. Para este experimento fue
necesario el uso de guantes. Barbijos y las
medidas de seguridad respectivas antes
de iniciar.
Para la obtención de sangre se recolecto
1ml por alumno en cada grupo,
mezclándolo bien con el anticoagulante se
le agrego 4ml de buffer. Después se
necesitó realizar la lisis de los eritrocitos,
para esto medimos 6ml de buffer de lisis
de eritrocitos en un tubo de ensayo de
20ml agregándole después 2ml de sangre
diluida. Las muestras se incubaron sobre
hielo durante 5min para después ser
centrifugadas a 7000 rpm durante 1min.
Seguido a esto se descartó el
sobrenadante, cuidando rigurosamente
de no eliminar el pellet que contiene a los
leucocitos. El pellet se tuvo que lavar con
1ml de suero fisiológico antes de volverlo
a centrifugar. Verificamos que el pellet no
siga contaminado con eritrocitos para
proseguir con el experimento. Una vez
eliminados todos los eritrocitos
agregamos el buffer de lisis RNA (TRYZOL)
al pellet para lisar las células y luego
ponerlo a incubar por 5min.
Para la extracción de RNA se agregó
0,2,ml de cloroformo por cada ml de
Tryzol añadido y seguido a esto se agito
vigorosamente por 15 seg. Después de
colocar las muestras al hielo por 5min se
llevó a centrifugar a 12000 rpm durante
15 min, a 4°C. Finalizando esta parte se
transfirió la fase acuosa a un tubo
eppendorf.
Para realizar la precipitación y lavado del
RNA se agregó 0,5ml de isopropanol frio
por cada ml de Tryzol añadido y se mezcló
por inversión para después dejar
precipitando el RNA a -20°C por 10 min.
Para recuperar el RNA se puso a
centrifugar a 12000 rpm durante 15min a
4°C. Se eliminó el sobrenadante, se lavó el
pellet y se añadió 1ml de etanol 75% por
cada ml de Tryzol añadido. Después de
centrifugar a 7500rpm se descartó el
etanol y se dejó secar el pellet por 5 min.
Para luego resuspender el RNA en 20ul de
agua destilada.
Para determinar su pureza y calidad se
tuvo que leer las muestras de RNA en el
espectrofotómetro UV visible a 260nm,
280nm y 230nm.
Resultados y Discusión
Para extraer el ARN de una persona, se
utilizó una muestra de sangre. La
extracción del ARN se pudo realizar con
éxito mediante el método de Tiocionato
de guanidina – fenol cloroformo con el
cual se pudo visualizar por electroforesis
el RNA. Este método utilizo el reactivo
Trizol que es una mezcla de tiocionato de
guadinidina y fenol. El trizol permite la lisis
completa y homogenización del ADN, ARN
y proteínas y mediante el cloroformo la
mezcla se separa en tres fases donde la
fase acuosa (Fase clara) contiene el RNA,
luego el RNA es precipitado por
isopropanol frio y lavado con etanol.
1 Lectura de muestras en espectrofotóetro UV
visible a 260nm, 280nm y 230nm. La décimo
primera columna corresponde a la muestra extraida
del presente proyecto de investigación con casi nula
apreciación de ARN.
Conclusión
Se ha demostrado por la investigación y
método científico que es posible realizar
una extracción de una muestra de ARN de
una manera rápida y segura con métodos
más modernos. El método cloroformo-
alcohol isoamílico es un método delicado 4. InnuPREP Blood DNA Mini Kit User
y requiere bastante destreza y Manual. Analitik Jena. Germany
entrenamiento. Se debe tener un cuidado (2017)
extremo para no perder el ARN
purificado. A pesar de los incidentes
ocurridos en el laboratorio, de otras
muestras se puede concluir la efectividad
del método por los resultados observados
en la electroforesis. El uso de los
resultados de este método no provee
diagnósticos por sí solo y deben ser
complementados con estudios in-vitro u
otros acompañados de criterios
diagnósticos clínicos y otros exámenes
laboratoriales.

Referencias Bibliográficas
Las referencias que utilizamos para este
articulo científico se basan en las
diapositivas otorgadas por la Dra Johany
Sanchez (Biologia Genetica y Molecular), y
el protocolo otorgado con el título
“Protocolo para la extracción de RNA
utilizando el método Cloroformo –
Alcohol Isoamílico”
1. Alberts, B. Biologia Molecular de la
Célula. 5ta Edición, Omega. 2005
2. M. Wink, An Introduction to
Molecular Biotechnology: Molecular
Fundamentals, Methods and
Application in Modern
Biotechnology, Wiley-VCH,
Weinheim, Germany, 2006.
3. L. J. Cseke, P. B. Kaufman, G. K. Podila,
and C.-J. Tsai, Handbook of Molecular
and Cellular Methods in Biology and
Medicine, CRC Press, Boca Raton, Fla,
USA, 2nd edition, 2004.
 Anexos

Centrifugación para la seapración de elementos y

aislamiento del ARN

Lisis de las células encontradas en la muestra

de sangre

Placa de glóbulos blancos obtenidos por

centrifugación
Etanol usado en el aislamiento de ARN
Es necesario un control de la temperatura
de los reactivos y muestras en este método