INFORME PRACTICA N°2

EXTRACCION DE ADN (E COLI)

Sharik Vanessa Quimbayo Murillo, Paubla Andrea Calderón Ramírez,
Resumen
El presente artículo describe la práctica del laboratorio del curso biotecnología alimentaria de
la Universidad Nacional abierta y a Distancia UNAD, con relación a la extracción de ADN de
un microorganismo, en este caso se utilizó la Escherichia coli, se sabe que en los ácidos
nucleicos se encuentra la información genética de todos los seres vivos, por lo cual se hace
importante determinar el ADN (Ácido Desoxiribo Nucleico) bacteriano, teniendo en cuenta que
esta es una molécula de gran importancia en las diferentes industrias para identificar el tipo
de características y los sustrato que desarrolla la Escherichia coli.
Introducción
La extracción del ADN Bacteriano está basado en el rompimiento químico celular, con el
objetivo de mejorar el control microbiológico en la industria de alimentos exige métodos
rápidos y los métodos moleculares ofrecen grandes resultados en el control microbiológico el
ADN es afectado en menor medida por los cambios ambientales y permite la detección de este
tipo de microorganismos de manera más precisa este método detecta cantidades mínimas de
ácidos nucleicos de manera rápida y sensible.
La extracción de ADN Bacteriano ha demostrado ser una técnica poderosa para detectar rápida
específica y sensible de microorganismos patógenos en alimentos.
Marco teórico
ADN: Es la abreviatura del ácido desoxirribonucleico. Constituye el principal componente
del material genético de la inmensa mayoría de los organismos, junto con el ARN (ácido
ribonucleico). Es el componente químico primario de los cromosomas y el material en el
que los genes están codificados.

Las bacterias son microorganismos con una capacidad extraordinaria de adaptación a

diferentes condiciones ambientales. Para comprender la esencia de esta capacidad es
importante conocer sus bases genéticas, es decir cómo está organizada la información
genética, como realizan y regulan su expresión y que mecanismos de variación génica
poseen.
E coli, esta bacteria de gran importancia en la industria por su funcionalidad y aporte de enzimas
y sustratos, en procesos industriales que se sintetizan para su aprovechamiento, por lo cual se
emplean métodos de cuantificación como la absorbancia y la electroforesis, para su
identificación, con el rompimiento químico celular o lisis y posteriormente degradando la
fracción proteica asociada al ADN.

- Materiales
Materiales Cantidad
Reactivos
Sódiododecilo sulfato (SDS) al 10% 5 ml
Solución salina EDTA (SSE) 100 ml
Etanol 70% 10 ml
Alcohol isoamílico (grado analítico, 99.5%) 5 ml
Medio de cultivo: caldo LB (Luria Bertani)1 100 ml
Solución de NaCl al 4M 50 ml

Material microbiológico
Cepa de Escherichiacoli cultivo ONb 1

Equipos
Incubadora 1
Autoclave 1
Centrifuga y microcentrifuga 1
Espectrofotómetro (λ : 600 nm) 1
Baño termostatado o Shaker con agitación 1
Balanza analítica 1
Mechero bunsen 1
Vortex 1
Baño de agua a 60 oC
Micropipetas 200 μl y 1000 μl
Puntas para micropipetas

Material de vidrio
Espátula 1
Gradillas para tubos de ensayo 1
Pipetas estériles (5 y 10 ml) 2
Pipeteador 1
Tubos de ensayo cónicos para centrifuga de 20 ml 4
Tubos de ensayo ( 10 ml) 12
Erlenmeyer (250 ml) 14
Capilares de vidrio
Vaso de precipitado (250 ml) 2
Métodos de Extracción
- Absorbancia
Aislamiento y purificación de ADN bacteriano: de una muestra de 50 ml de E. coli, se tomaron
15 ml; esta muestra se introdujo en un tubo de centrifuga y se llevó a centrifugar por 8 minutos
a 3000 rpm, el sobrenadante se eliminó en solución de hipoclorito concentrado ya que este es
procedente de un microorganismo patógeno., después se agregaron 5 ml de solución SSE
(solución salina con EDTA), se centrifugó a 3000 RPM por 8 minutos, se eliminó el
sobrenadante, seguido de este proceso se adicionaron 1200 μl de solución SSE; agitando
homogéneamente, para ser separado en dos micro tubos para centrifuga en un microcentrifuga.
A continuación, se adicionaron 300 μl de solución SDS (solución detergente) al 10%,
agitándolos en vortex para luego ser llevados a 60°C en baño termostatado por 10 minutos.
Pasado este tiempo se dejaron enfriar a temperatura ambiente para luego agregar 600 μL de
isopropanol llevándolo a la microcentrifuga por 10 minutos; se separó el sobrenadante y se
agregó etanol al 70%, agitando varias veces para lavar el pallet de ADN, se llevó a centrifugar
por 8 minutos a 3000 rpm, se sacó cuidadosamente el sobrenadante y se colocó boca acabo el
microtubo durante unos minutos para que secara. Después de este tiempo se agregaron 700 μL
de buffer TE pasándolo a un tubo de ensayo para agitarlo suavemente, se midió la concentración
de ADN de los dos tubos a 1:20 (180 μl de muestra por 3420 de agua destilada) con una longitud
de onda de 260 nm y 280 nm; tomando las lecturas en el espectrofotómetro por duplicado
respectivamente. Primero medió la concentración del blanco (buffer TE) y luego las muestras;
para realizar análisis.
Diagrama de Flujo – procedimiento

Métodos de cuantificación
 Electroforesis: este método es muy utilizado para separar, cuantificar y ´purificar
Fragmentos de ADN.
Reactivos
 Tampón electroforesis  EDTA
 TBE  Bromuro de etidio/ colorante
 TNS base  Buffer de carga pH 8.0
 Ácido bórico

Metodología
Preparación del gel: Se midieron 80 mL buffer TBE Y 1% de sacarosa (0.8g), se calentaron a
90 °C; dejando enfriar a 60 °C para servir. Del ADN crudo se mezclaron 200 μL con 10 μL de
bromuro de etidio (colorante-cancerígeno), se realizó la siembra con micro pipeta en el gel
preparado que tiene pequeños orificios (pocillos), dos muestras y un marcador; que está dentro
de la peseta donde hay buffer para que circule el gel con ayuda del voltímetro a 70 voltios por
una hora, se verificó que hubiese generación de burbujas.
Pasado este tiempo se hace la lectura por medio de una cámara UV donde se ven las bandas del
ADN que tienen el colorante intercalado.
Reactivos: Agarosa 1%, Tampón TBE, Tris base 10.8g, Ácido Bórico 5.5g, 4ml EDTA, tampón
de carga, Buffer de carga 6X, Glicerol 30%; EDTA 1mM, Ph 8.0, Bromuro de etidio 10mg/ml.
- Resultados

Tabla 1. Datos de absorbancia para extracción de ADN X Duplicado

No. λ 260 Valor λ 280 Valor

Tubo nm Medio nm Medio
1 0,238 0,2605 0,059 0,096
1 0,283 0,133

Tabla 2. Determinación de Pureza del ADN/ Relación 260/280

No. *260/280
Tubo
1 2.71
 Valores indicativos de pureza en muestras de ADN

RADIO VALOR PUREZA

260 / 1,8 - 2 ADN de pureza optima
280 1,6- 1,8 ADN pureza aceptable
<1,6 Presencia de compuestos
aromáticos
>2,1 Contaminación con ARN
260 / <1,5 Contaminación con sales,
230 carbohidratos, fenoles

Diagrama de flujo- Procedimiento

- Análisis y resultados

Evidencia de la extracción de ADN

La aparición de la capa blancuzca fue produjo por la reacción provocada por el isopropanol
precipitando el ADN debido a que este es insoluble en él, cuando se utiliza etanol y
soluciones con altas concentraciones de iones de sodio o amonio que se unen a los grupos
fosfatos, esta mezcla reduce las fuerzas repulsivas entre las cadenas y permite que el ADN
se pliegue sobre sí mismo haciéndolo insoluble.

El bromuro de etidio es el reactivo fundamental para la detección por tinción de

fluorescencia y observación bajo luz ultravioleta para ADN, Se trata de un compuesto
intercalante, es decir, que tiene afinidad para unirse al ADN, pues se introduce entre sus
bases apiladas. Esto se debe a su geometría plana y su estructura aromática, que
interacciona favorablemente con el interior hidrófobo de la doble hélice. En menor medida,
interacciona también con ADN.

Su utilidad deriva asimismo de su fluorescencia, exaltada al encontrarse en un entorno

hidrófobo, es decir, al estar unido al ADN. Se excita con luz ultravioleta de onda corta, 254
nm, y emite su fluorescencia como luz visible, de color rosado-anaranjado.
Adicional a la práctica, se realizó el electroforesis en gel de agarosa técnica que es de las
más utilizadas para analizar y caracterizar ácidos nucleicos que consiste en el movimiento
de partículas eléctricamente cargadas a través de un gel de agarosa como resultado de
un campo eléctrico formado entre unos electrodos sumergidos en el medio.
Este procedimiento permite la separación de moléculas como consecuencia de su diferente
movilidad en un campo eléctrico. En la práctica se pudo evidenciar en la luz ultravioleta la
presencia de bandas, hubo un desplazamiento del ADN ya que este presenta una carga
negativa y emigro hacia la parte positiva, las marcaciones más cercanas al lado negativo me
indican que estas moléculas son más pesadas y las más livianas se van desplazando hacia el
lado positivo con más facilidad debido a su tamaño y peso molecular.

Conclusiones
La práctica realizada nos proporcionó los conocimientos necesarios para realizar un aislamiento
y posterior extracción de ADN obteniendo resultados positivos como la presencia del
precipitado de los ácidos nucleicos, pudiendo ser observados bajo la luz ultra violeta y la
importancia de la adición del bromuro de etidio para permitir la fluorescencia, adicional a esto
se pudo evidenciar cómo funciona la técnica de electroforesis dejando a la vista las bandas
generadas por el desplazamiento del ADN sobre el gel de agarosa.