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Titelei 5_02 16.10.

2002 8:11 Uhr Seite 1

Mitteilungen aus
Lebensmitteluntersuchung
und Hygiene

Travaux de chimie
alimentaire et d’hygiène

Band/Volume 93 · 5/2002

Redaktionskommission Redaktionssekretariat
Comité de rédaction Secrétariat de rédaction

Dr. Jacques Olivier Bosset, Bern Helene Griessen


Dr. Claude Giddey, Genève Bundesamt für Gesundheit
Dr. Bernard Klein, Epalinges Facheinheit Lebensmittelsicherheit
PD Dr. Jürg Lüthy, Bern Schwarzenburgstrasse 165
Dr. Claudia Hischenhuber, Vers-chez-les Blanc 3003 Bern
Prof. Dr. Michael Teuber, Zürich Telefon 031 322 95 62
E-Mail: helene.griessen@bag.admin.ch

Offizielles Organ der Schweizerischen Gesellschaft für Lebensmittel- und Umweltchemie


und der Schweizerischen Gesellschaft für Lebensmittelhygiene
Organe officiel de la Société suisse de chimie alimentaire et environnementale et de la Société
suisse d’hygiène des denrées alimentaires
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Richtlinien für die Autoren


Zur Publikation werden nur bisher unveröffentlichte Originalarbeiten angenommen. Die
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Band, Seite, Verlag, Erscheinungsort und Erscheinungsjahr.
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plaires au secrétariat de rédaction, accompagnés d’une disquette. Le titre sera aussi succinct
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comme figures. Les tableaux comporteront des légendes, alors que les légendes des figures ap-
paraîtront sur une feuille distincte. L’auteur joindra à son manuscrit une traduction anglaise
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encore 5 mots clés en anglais pour situer le travail.
La bibliographie figurera en fin d’article. Les ouvrages et les articles seront cités in extenso et
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de livres ou d’ouvrages, on mentionnera successivement l’auteur, le titre de l’ouvrage,
l’édition, le volume, la page correspondante, l’éditeur, le lieu et l’année d’édition indiquée sans
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charge. L’auteur recevra gratuitement 30 tirés à part.
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Inhalt – Sommaire Seite – Page

Originalarbeiten – Travaux originaux


Ania Noti, Sandra Biedermann-Brem, Maurus Biedermann and Koni Grob:
Determination of central nervous and organ tissue in meat products
through GC-MS analysis of marker fatty acids from sphingolipids and
phospholipids 387
Maurus Biedermann, Koni Grob and Vincent Dudler: Comprehensive
analysis of migrates from can coatings: Chemically inert solvent
substitute for simulant D 402
Dominik Guggisberg, Andre E. Moser und Herbert Koch: Quantitativer
Nachweis von mehreren Makrolid-Antibiotika in Fleisch, Leber und
Niere mit LC-MS/MS nach einer teilweisen automatisierten Aufreinigung 420
Kurt Seiler und Anton Kaufmann: Kontamination von Honig mit
Sulfathiazol durch Räuberei unter Bienen 437
Urs Hauri, Beat Lütolf, Michael Wagmann and Christopher Hohl:
Determination of preservatives in finger paints with HPLC 447
Marius Collomb, Patrick Malke, Monika Spahni, Ueli Bütikofer et Robert
Sieber : Dosage des acides gras trans et linoléique conjugés dans la
matière grasse du lait par chromatographie gaz-liquide : Comparaison
des méthodes et étude de la variation des teneurs en fonction des
saisons et de l’altitude 459

Reviews
Gérard Gremaud, Stéphane Karlen and Karin Hulliger: Analytical methods
for the authentication of meat and meat products: Recent developments 481
Dino Isolini und Urs Spahr: Bakteriozine und bakteriozinähnliche
Substanzen von milchwirtschaftlich relevanten Mikroorganismen
und ihre Anwendung in der Lebensmitteltechnologie und in
probiotischen Erzeugnissen 502

Informationen – Informations
Veranstaltungshinweise 528
Schweizerische Gesellschaft für Lebensmittelhygiene (SGLH) 529
Société suisse d’hygiène des denrées alimentaires (SSHDA) 530
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Contents Page

Original Papers
Anja Noti, Sandra Biedermann-Brem, Maurus Biedermann and Koni Grob:
Determination of central nervous and organ tissue in meat products
through GC-MS analysis of marker fatty acids from sphingolipids and
phospholipids 387
Maurus Biedermann, Koni Grob and Vincent Dudler: Comprehensive
analysis of migrates from can coatings: Chemically inert solvent
substitute for simulant D 402
Dominik Guggisberg, André E. Moser and Herbert Koch: Quantitative
Determination of several macrolide antibiotics in meat, liver and kidney
by LC-MS/MS after a partly automated clean up 420
Kurt Seiler and Anton Kaufmann: Contamination of honey with
sulfathiazole by robbing of bees 437
Urs Hauri, Beat Lütolf, Michael Wagmann and Christopher Hohl:
Determination of preservatives in finger paints with HPLC 447
Marius Collomb, Patrick Malke, Monika Spahm, Ueli Bütikofer and Robert
Sieber: Analysis of trans and conjugated linoleic acids (CLA) in milk
fat using different gas-liquid chromatographic methods: Comparison of
the methods and study of the variation of the levels as a function of the
season and of the altitude 459

Reviews
Gérard Gremaud, Stéphane Karlen and Karin Hulliger: Analytical methods
for the authentication of meat and meat products: Recent developments 481
Dino Isolini und Urs Spahr: Bacteriocins and bacteriocin-like substances
of lactic acid bacteria and their use in food technology 502

Information
Coming events 528
Swiss Society of Food Hygiene 529
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Original Papers

Determination of Central Nervous


and Organ Tissue in Meat Products
through GC-MS Analysis of Marker
Fatty Acids from Sphingolipids
and Phospholipids
Anja Noti, Sandra Biedermann-Brem, Maurus Biedermann and Koni Grob,
Official Food Control Authority of the Canton of Zurich (Kantonales Labor),
Zurich

Received 27 May 2002, accepted 27 August 2002

Introduction
To protect consumers of meat products from material potentially infected by
bovine spongiform encephalopathy (BSE), Swiss legislation (1) prohibits the use of
specified bovine risk material for the production of meat products for human con-
sumption, principally tissue of the central nervous system (CNS), i.e. brain and
spinal cord. These risk materials have to be removed during slaughtering.
Various methods were developed for the enforcement of this regulation. Lücker
et al. described two approaches, one based on the determination of cholesterol, the
other on neuron-specific enolase (2–4). The detection limit obtained through the
immunochemical determination of neuron-specific enolase was specified as 0.01 %
CNS tissue in a meat product. Cholesterol only enabled the detection of 0.5 % CNS
tissue, but this method has the advantage of not being hampered by intensive heat
treatment of the product. As also certain other tissues have a high cholesterol con-
tent, this latter method was only recognized as screening procedure (5).
Niederer and Bollhalder (6) determined CNS tissue in meat products and cos-
metics through the analysis of brain-specific fatty acids. Using the ratios of the
cis/trans isomers of nervonic acid (C24: 1), they were able to distinguish between
CNS tissue from cow, sheep and pig. In spiked sausages, species identification of
brain was possible down to a content of 0.05 %, and CNS material was detectable
down to 0.01 %. Two sample preparation procedures were used:

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1. The sphingolipids and other fatty-acid-containing polar components were isola-


ted from the lipids of low polarity, transesterified with hydrochloric acid, and
the resulting fatty acid methyl esters (FAME) analyzed by GC-MS.
2. Raw extracts were transesterified; the FAMEs of interest were isolated by rever-
sed phase HPLC and analyzed by GC-MS.
Barcarolo et al. (7) refined the determination of nervonic acid and its isomers by
an on-line LC-GC-FID method enabling the accurate determination at concentra-
tions of 0.1–10 mg/kg of meat product. A similar method was described by Hell-
gren for the analysis of bioactive sphingolipids in meat and fish products (8). Intact
sphingolipids were determined in plant material by HPLC-MS/MS by Humpf and
Seefelder (9).
The work described in this paper is based on a method derived from that of
Niederer and Bollhalder, following their first strategy of initially isolating the fatty
acids bonded to polar moieties, then formation of methyl esters, and GC-MS analy-
sis. Among some 60 samples of meat products tested for CNS material, one seemed
positive. Interrogation of the producer revealed, however, that the product (a “mor-
tadella” sausage) contained no CNS material. The fatty acids originated from pork
stomach, which was not on the list of the ingredients. As the detection of organ tis-
sue is another subject of interest, the method was re-optimized to include a broader
range of fatty acids. Two fractions of lipids were analyzed in order to separately
determine the fatty acids from different polar lipids, enriching the data material
serving as finger print.
According Swiss legislation, most organs may be used to prepare meat products
(except of, e.g., eyes). They must be listed in the ingredients, with the exception of
heart and tong, which belong to muscle meat (10). The European Union introduces
similar legislation in 2003.

Experimental
Meat products as well as test samples of meat for sausages and organs were
homogenized. 2 g of the homogenate was mixed with 10 ml acetone and kept in an
oven at 60°C for 1 h in order to open the cell structures. 40 ml of water was added
and the sample extracted with 20 ml, then 10 ml of methyl tert. butyl ether (MTBE).
10 ml of the combined MTBE extract was diluted with 10 ml of hexane and
transferred onto a cartridge containing 500 mg silica gel (J.T. Baker 7086-03), previ-
ously rinsed with about 5 ml MTBE/hexane 1+1. The triglycerides and other mate-
rials of low polarity were removed from the cartridge with two 10 ml portions of
MTBE/hexane 1+1. Then fraction A was eluted with 10 ml of methanol/MTBE
1+3 and fraction B with 10 ml methanol.
Fraction A was evaporated to dryness in a stream of nitrogen and re-dissolved in
10 ml methanol. Then the fatty acids bonded in sphingo- and phospholipids (esters
and amides) were converted to FAMEs adding 1 ml of concentrated hydrochloric
acid and heating in an oven at 75°C for 3 h. After addition of 5 ml of water, the

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FAMEs were extracted with 4 ml hexane containing the internal standard (1 µg/ml
methylhexacosanoate, FAME-26). Fraction B was treated in the same way, but
without the initial solvent evaporation step.
1 ml of the FAME solution was evaporated to dryness in a stream of nitrogen
and silylated by addition of 30 µl N,O-bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide/1 %
trimethylchlorosilane and 30 µl pyridine. The mixture was warmed on a heating
plate thermostated at 60°C, diluted with 1 ml of hexane, and injected into GC.
GC analysis involved 15 µl injections either by the on-column or by concurrent
solvent recondensation (CSR) large volume (LV) splitless injection (11). A GC 8000
equipped with on-column and vaporizing injector, a vapor exit, and an autosampler
AS800 with a 50 µl syringe was connected to a mass spectrometer MD800, both
from ThermoFinnigan (Milano, Italy).
For CSR-LV splitless injection, a 3 m  0.32 mm i.d. precolumn was used, for on-
column injection a 0.5 m  0.53 mm i.d. precolumn, both coated with a thin film
(some 3 nm) of OV-1701-OH (prepared in the laboratory according to ref. (12)).
The precolumns was connected by a press-fit connector to a 30 m  0.25 mm i.d.
separation column, coated in the laboratory with an 0.15 µm film of PS-255
(a methylpolysiloxane, Fluka, Buchs, Switzerland). Helium was the carrier gas at
40 kPa inlet pressure. The oven temperature was programmed from 60°C (2 min) at
20°/min to 230°C and at 4°/min to 320°C (2 min).
On-column injection was performed at a rate of 3 µl/s, resulting in concurrent
solvent evaporation. The vapor exit was closed 10 s after starting injection. CSR-LV-
splitless injection involved a 105  5 mm i.d. injector liner, with a constriction at the
bottom and a 1 cm plug of deactivated glass wool above the constriction. The inlet
of the precolumn was installed at the orifice of the constriction, i.e. just below the
glass wool. The sample was injected at maximum speed (about 100 µl/s), inserting
the needle into the injector by merely 15 mm (band formation (13)). The injector
was thermostated at 330°C; the splitless period lasted 3 min, during which the sep-
tum purge was also closed (auto pressure pulse (11)).
Quantitative determination involved MS in the electron impact (EI)-selected ion
monitoring (SIM) mode, using the following masses (fatty acid:number of double
bonds, m/z): 26 : 0 (internal standard), 87; 22 : 0 OH, 383; 23 : 0 OH, 397; 24 : 0, 382;
24: 1, 348; 24: 0 OH, 455; 24: 1 OH cis/trans, 409; 25 : 0 OH, 425; 25 : 1 OH cis/trans,
423; 26 : 1 OH, 437; 26 : 0 OH, 439.
As no standards were available for a majority of the FAMEs analyzed, quantita-
tive data was based on uncorrected peak areas obtained by MS-SIM normalized on
the internal standard FAME-26: 0. No absolute concentrations were needed,
because the detection of CNS or organ tissue was based on the comparison of the
FAME concentrations with reference materials. Peak areas of the FAMEs of interest
were divided by the area of FAME-26: 0 and multiplied by 1000 in order to obtain
suitable formats.

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Results

Confirmation of the method


The steps of the method are summarized in figure 1. They were checked through
the following experiments:
1. Extraction of the sphingo- and phospholipids from the homogenated sample
was checked for brain tissue as well as for an experimental sausage prepared
from typical sausage meat and 1% brain tissue (produced by the Ausbildungs-
zentrum für die Schweizer Fleischwirtschaft, Spiez, Switzerland in behalf of the
Swiss Federal Office of Public Health, SFOPH). In the third extract, at most
3% of the fatty acids of interest were found, indicating that a double extraction
is sufficient.
2. Transfer of the extract onto the SPE cartridge with MTBE resulted in some 10%
breakthrough of FAMEs from brain tissue (experiment with sausage homogena-
ted with 10% brain; MTBE collected after passage of the SPE re-analyzed pas-
sing it through another cartridge). Transfer with hexane (turbid solution) resul-
ted in apparently low capacity and substantial initial breakthrough, suggesting
that the components of interest were not dissolved and passed the SPE cartridge
adsorbed to particles. With MTBE/hexane 1+1, breakthrough remained below
4% for all components of interest, i.e. this solvent mixture dissolved the lipids
to be analyzed and was sufficiently weak an eluent to prevent elution from the
silica gel.

Figure 1 Steps of the analytical procedure

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3. Capacity of the SPE cartridge: loading the extract from 2 g spiked sausage onto
the cartridge showed breakthrough below 3 %. The method involves the trans-
fer of the extract from some 0.7 g meat product.
4. The cartridge must be rinsed with a solvent removing the glycerides (the mono-
glycerides having the highest retention) and cholesterol. MTBE/hexane 1+1
removed these components with a breakthrough of the compounds of interest
of less than 1%.
5. Elution from the cartridge was performed in two steps in order to obtain addi-
tional information about the type of compound the fatty acids are bonded to.
For an extract of sausage fortified with brain tissue, the best cut was determined
collecting and analyzing 5 ml portions of methanol/MTBE 1+3 and then metha-
nol. Elution profiles of the fatty acids were plotted against the fraction and the
cut positioned such as to result in a maximum difference in the fatty acid com-
position of the two fractions.
6. Completion of the extraction was tested by collecting and analyzing additional
5 ml fractions of methanol. With 10 ml methanol (after 10 ml methanol/MTBE
1+3), most of the fatty acids were eluted to more than 95 %, but 24 : 1 probably
to less than 90%.
7. Transformation to FAME: to control the formation of FAME from the phos-
pho- and sphingolipids, the SPE eluate from a sausage fortified with 1 % brain
tissue was heated with hydrochloric acid for a varied duration. After 2 h, the
FAME reached at least 90% and after 3 h more than 97 % of the amounts obtai-
ned after reaction overnight.
8. Extraction of the FAME from the reaction medium diluted with water: a second
extract with 2 ml hexane yielded 10–15% of the FAMEs of interest. The proce-
dure was left with a single extraction step, but using 4 ml hexane.
9. There was no significant difference between the results obtained with on-
column and splitless injection. The precolumn had to be replaced after some
40 analyses with on-column injection.
Repeatability of quantitative results was largely determined by the performance
of the GC-MS analysis. When disregarding small components and some first results
in a series of analyses, relative standard deviations of data obtained over several
weeks remained below 15%. Linearity was tested for two types of experimental
sausages (with and without liver) spiked with 0, 0.1, 0.5, and 1 % of pork brain.

Chromatograms
The bottom GC-MS-TIC chromatogram in figure 2 shows the silylated FAMEs
of interest from a “mortadella” (an Italian sausage) assumed to be free of organ and
CNS tissue. The center chromatogram is from a similar mortadella containing some
10% pork stomach (according to a traditional recipe, as confirmed by the pro-
ducer). The top chromatogram was obtained from an experimental sausage pre-
pared with 1 % brain tissue (pork).

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Figure 2 GC-MS-TIC chromatograms of two mortadellas, one with and the other
without pork stomach, as well as of a sausage spiked with 1 % brain
tissue during its preparation

The analysis was focused on the C22 – C26 fatty acids, since the C16 – C20 acids did
not show interesting selectivity for CNS or organ tissue. Most of the relevant fatty
acids are hydroxylated. Some of them also contain a double bond and co-exist as cis
and trans isomers. The chromatograms readily show the potential of the method for
the determination of small amounts of CNS or organ tissue, but also that separation
would need substantial improvement to be complete and sufficiently reliable with-
out selective detection.
Figure 3 shows the GC-MS chromatograms of the relevant silylated FAMEs as
detected by the most selective ions (EI-SIM). Mostly the fragment resulting from
loss of 59 amu (methylated carboxyl group) was used, as typical for beta-hydroxy
FAMEs. For 24:0 OH, M+-15 was preferred in order to achieve reliable separation
from 26:0, the internal standard. 26:0 was monitored at m/z 87, since 24:0 OH
forms a negligibly small signal at this mass.

Calibration of FAME contents


Numerous samples of brain and organ tissue obtained from the slaughter-house
of Zürich were analyzed to calibrate the fatty acid contents in comparison with
meat samples typically used for the production of sausages and other meat products.

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Figure 3 GC-MS/SIM chromatograms of the silylated FAMEs analyzed: extract


from pork brain

Values shown in table 1 and 2 are averages of usually some five samples. They rep-
resent SIM peak areas normalized on the internal standard without application of
response factors, i.e. they do not indicate absolute concentrations. Table 1 lists the
data from fraction A (eluted from the SPE cartridge with methanol/MTBE 1+3),
table 2 those from fraction B (methanol).
In fraction A, the fatty acids analyzed are present at massively higher concentra-
tions in the CNS material than in organ tissue and meat (up to a factor of 10000). In
fraction B, values for the organ tissue are in the same range as those for CNS mate-
rial and easily 100 times higher than in meat, suggesting that minor additions of the
following organ tissue can clearly be distinguished from meat: liver, spleen, kidney,
and stomach.

Mitt. Lebensm. Hyg. 93 (2002) 393


387-401

394
Table 1
Normalized peak areas of fatty acids in lipids of fraction A from the SPE column: known CNS and organ tissue c, cis; t, trans
Fraction A: normalized peak areas
22OH 23OH 24 :1OHc 24 :1OHt 25 : 1OHc 25:OH 26 :1OHc 26 :1OHt 26OH 24OH 24 :1 24 :0
CNS material
16.10.2002

Spinal cord cow 14000 8 000 3 200 380 140 7 500 350 180 1 600 25 000 4 000 3 500
pig 20000 2 200 1 400 800 30 550 90 170 310 12 300 1 900 2 500
Brain calf 28 298 6531 3 870 730 175 172 323 374 1 364 29 184 7 428 8 188
pig 47337 8 320 5 236 2 778 163 2178 261 708 962 31 460 4 116 4 094
8:12 Uhr

cow 59762 10 846 5 580 3 133 225 2 580 294 875 1 168 29 289 5 563 8 195
Organ tissue
Eye pig 8.0 45 0.7 0.25 0.04 1.5 0.1 0.1 0.4 6.0 0.6 1.2
Heart pig 46 4.8 1.8 0.04 <0.05 0.5 <0.05 <0.05 0.5 5.8 49 62
Liver calf 194 198 8.9 0.00 <0.05 7.3 <0.05 <0.05 1.3 106 34 171
Seite 394

cow 250 400 25 1.5 3.0 20 0.1 <0.05 9.0 200 8.0 80
pig 60 8.0 6.0 0.1 0.1 0.9 0.1 <0.05 0.3 10 35 75
Lung pig 3.7 0.1 0.3 0.0 0.1 0.3 <0.05 <0.05 0.3 1.0 3.7 5.7
Spleen calf 140 14 4.3 0.6 <0.05 3.0 <0.05 <0.05 1.1 20 280 160
Kidney cow 700 280 2.3 0.9 0.6 3.1 <0.05 <0.05 0.8 80 9 40
pig 250 120 19 2.2 0.7 11 0.1 <0.05 1.0 97 35 50
Diaphragm pig 35 6.6 1.3 0.3 <0.05 1.1 <0.05 <0.05 0.6 20 9 20
Stomach pig 350 310 30 0.7 2.8 50 0.5 0.2 3.8 340 30 80
Sausage meat
calf 40 9.0 2.0 0.6 0.3 2.0 0.1 <0.05 1.0 35 9.0 24
cow 20 6.0 1.0 1.0 0.2 1.0 <0.05 <0.05 1.0 15 6.0 10
pig 40 7.0 2.0 0.5 0.2 1.0 0.1 0.1 1.0 20 8.0 15
Rind pig 8 1.5 0.2 0.10 0.10 0.3 <0.05 <0.05 0.2 2.0 4.0 4.0
Bacon pig 20 8.0 2.0 0.3 0.10 2.0 0.3 <0.05 0.5 8.0 8.0 5.0
turkey 11 2.3 0.5 0.0 0.08 0.8 <0.05 <0.05 0.3 8.6 2.3 5.4
hen 45 16 2.0 0.3 0.07 5.5 <0.05 <0.05 1.1 31 11 34

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Table 2
Fatty acids in lipids of fraction B (methanol) in the same reference materials as in
table 1
Fraction B: normalized peak areas
22OH 23OH 24 :1OHc 25 : OH 26OH 24OH
CNS material
Spinal cord cow 490 120 25 40 20 130
pig 240 26 9.0 7.4 6.6 55
Brain calf 233 23 11 <0.1 2.3 39
pig 91 18 12 4.3 1.7 36
cow 3818 73 <0.1 <0.1 4.1 7.0
Organ tissue
Eye pig 0.4 0.1 <0.03 <0.03 <0.03 0.1
Heart pig 180 3.6 0.4 1.9
Liver calf 1250 150 4.0 0.5 0.8 65
cow 120 100 3.0 3.0 1.5 25
pig 230 4 0.8 <0.03 <0.03 2
Lung pig 1.4 0.2 0.08 0.1 0.2 0.3
Spleen calf 90 2.3 0.5
Kidney cow 30 2.6 1.0
pig 155 30 1.9 3.5 0.3 30
Diaphragm pig 15 0.4 <0.03 0.07 0 0.5
Stomach pig 220 150 18 16 0.8 90
Sausage meat
calf 30 1 <0.03 <0.03 <0.03 0.2
cow 20 0.6 <0.03 <0.03 <0.03 0.2
pig 20 0.7 0.1 <0.03 <0.03 0.4
Rind pig 6 0.1 <0.03 <0.03 <0.03 0.1
Bacon pig 10 0.5 <0.03 <0.03 <0.03 0.3
turkey 15 0.5 <0.03 <0.03 <0.03 <0.03
hen 50 2.4 0.3

Table 3 lists the mean values for the sausage meat samples of calf, cow and pig
from tables 1 and 2 as well as results from 42 meat products from the market for
which it was assumed that they contained neither CNS nor organ tissue. The aver-
age values for the meat products well agreed with the averages for the sausage meat
samples, confirming the absence of additions. The maximum values for the meat
products in the third line were used as threshold for the detection of admixed organ
or CNS materials.

Pork stomach in mortadella


Among the about 120 meat products analyzed, none contained CNS material.
One contained soybean components, which increased the concentration of some of
the relevant fatty acids. 12 samples of mortadella contained pork stomach.

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387-401

396
Table 3
Mean values for the samples of sausage meat from tables 1 and 2 and of 42 meat products assumed to contain meat only, as
well as the maximum values for the meat products used as threshold for suspecting the addition of organ or CNS material
Fraction A 22OH 23OH 24 :1OHc 24 :1OHt 25 :1OHc 25 :OH 26 :1OHc 26 :1OHt 26OH 24OH 24 :1 24 :0
16.10.2002

Mean sausage meat 23 6 1.3 0.4 0.16 1.2 0.08 0.02 0.7 15 6 10
Meat products: mean 33 6 1 0.2 0.2 2 0.1 0.1 1 19 6 12
maximum 90 17 4 0.9 0.4 7 0.2 0.2 2 52 13 29
Fraction B
Mean sausage meat 17 0.6 0.02 <0.1 <0.1 0.20
8:12 Uhr

Meat products: mean 15 0.7 0.0 0.1 0.1 0.4


maximum 30 1.8 0.2 0.5 0.3 1.8
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Mitt. Lebensm. Hyg. 93 (2002)


387-401

Table 4
Mortadella with and without pork stomach. At bottom: values used as threshold and for stomach
Fraction A Fraction B
16.10.2002

Sample 22OH 23OH 24:1OHc 25:1OHc 25:OH 24OH 24:0 22OH 23OH 24:1OHc 25:OH 24OH
Mortadella containing stomach
1 268 120 12.4 0.6 21.2 158 82 121 24 2.5 2.7 17
2 85 60 5.8 0.5 10.7 72 22 59 36 4.2 5.1 24

Mitt. Lebensm. Hyg. 93 (2002)


3 74 46 5.3 0.4 8.1 56 19 32 18 2.1 2.4 11
8:12 Uhr

4 74 35 4.0 0.5 8.3 68 16 19 11 1.0 2.5 13


5 136 52 7.0 0.6 8. 90 23 28 13 1.4 1.8 8.0
7 90 29 4.0 0.2 6.3 58 28 23 7.5 0.8 1.4 5.3
8 76 25 3.8 0.3 5.2 50 20 21 6.8 0.8 1.5 6.0
9 69 25 3.6 0.2 4.9 46 18 20 7.5 0.9 1.3 5.3
10 98 35 5.4 0.3 7.1 70 24 22 11 1.4 1.9 8.6
Seite 397

11 90 64 7.2 0.8 13.2 79 25 37 22 3.0 3.0 14


12 89 30 4.4 0.3 5.7 58 22 19 8.3 0.9 1.4 5.6
Mortadella without stomach
13 50 6.0 1.6 0.17 0.1 20 18 11.5 0.3 <0.05 0.14 0.7
14 33 4.3 1.1 0.11 0.9 15 12 13.4 0.6 0.05 0.18 0.7
15 25 6.7 1.4 0.13 2.4 12 11 10.9 0.7 0.18 0.11 0.4
16 23 5.7 1.1 0.14 1.9 15 10 11.0 0.7 0.08 0.08 0.3
17 36 7.1 1.6 0.18 2.3 23 16 9.7 0.7 0.13 0.11 0.4
18 46 5.6 1.5 0.14 1.1 22 13 9.3 0.6 <0.05 0.16 0.7
Comparison
Threshold 90 17 4 0.4 7 52 29 30 1.8 0.2 0.5 1.8
Stomach 350 310 30 3 50 340 80 220 150 18 16 90

397
387-401

398
Table 5
Percent pork stomach in the mortadella as calculated from data in table 4
% Stomach in the mortadella Mean
Sample 22OH 23OH 24 :1OHc 25 :1OHc 25 :OH 24OH 24 : 0 22OH 23OH 24 :1OHc 25 :OH 24OH (%)
16.10.2002

1 56 37 37 18 40 41 79 50 15 13 16 18 34
2 14 17 15 14 18 16 10 22 24 23 31 26 19
3 11 13 13 9 13 11 7 9 11 11 14 11 11
4 11 9 9 12 14 15 3 4 7 5 15 14 10
5 29 15 19 16 14 21 12 8 8 7 10 8 14
7 16 7 9 3 10 12 18 6 5 4 8 5 8
8:12 Uhr

8 12 6 8 4 8 9 8 4 4 4 8 6 7
9 10 6 7 2 7 8 6 4 5 4 7 5 6
10 18 9 13 7 11 15 14 5 7 7 11 9 11
11 16 19 19 22 24 18 15 12 14 16 18 15 17
12 15 8 10 5 8 12 10 4 5 4 8 6 8
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Traditionally mortadella is produced with 10 – 25 % pork stomach. In Switzer-


land, stomach must be listed in the ingredients, but the producers obviously hesitate
to write this information on a label. Some producers eliminated the stomach from
the recipe, others simply did not declare it. The distinction of mortadella samples
with or without stomach was based on whether several fatty acids exceeded the
threshold values repeated at the bottom of table 4. For the samples listed as “with-
out stomach”, none of the values reached the threshold, while for those in the upper
part of the table, listed as “containing stomach”, many exceeded it. This distinction
turned out to be correct, either confirmed by the declaration or by inquiries of the
producer.
The amount of stomach tissue added to the sausage was estimated by subtrac-
tion of the medium values of the given acid in a mortadella without stomach and
division by the value for the stomach (table 5). The resulting percentages were aver-
aged in the column at the right. The mean percentage of stomach varied between
6 and 34%. For about a third of these samples, this estimation could be confirmed
by information from the producers.

Conclusion
The analysis of the C22 – C26 fatty acids from phospho- and sphingolipids in meat
products enables the sensitive detection not only of CNS material, but also of
organs, such as liver, stomach, kidney, and spleen. The detection of organ tissue is
primarily of interest to check the declaration of ingredients of meat products. For
the detection and possibly specification of organs it is useful to subdivide the lipids
of which the fatty acids are analyzed, since this enriches the data material. The
detection limit for stomach is around 3%. No attempt was made to determine ani-
mal species, but according to Niederer and Bollhalder (6) this should be possible
through the cis/trans ratio of the 24: 1 fatty acids.
No meat product contained CNS material, and no non-declared organ tissue
was detected except pork stomach in 6 samples of mortadella. The common suspi-
cion that sausages and other meat products frequently contain dubious by-products
of slaughtering could not be confirmed.

Summary
C22 –C26 fatty acids from sphingo- and phospholipids were used for the determi-
nation of CNS material (BSE) and organ tissue (declaration) in meat products. The
lipids of interest were isolated from the bulk lipids using a silica gel cartridge, the
fatty acids converted to methyl esters, silylated, and analyzed by GC-MS. Two frac-
tions of lipids were analyzed separately, as this enhanced the selectivity of the
method. No CNS material was detected in about 120 samples. Only in six of some
60 samples non-declared organ tissue was found – all mortadella, which is tradition-
ally prepared with pork stomach (declaration required in Switzerland). The detec-

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tion limit for stomach is around 3%. Other organ tissues shown to be detectable by
the method are liver, kidney, and spleen.

Zusammenfassung
C22 –C26 Fettsäuren aus Sphingo- und Phospholipiden wurden zum Nachweis
von ZNS-Material (Hirn, Rückenmark; BSE-Problematik) und Innereien (Deklara-
tion) in Fleischprodukten verwendet. Diese Lipide wurden mittels einer Kieselgel-
Kartusche aus den übrigen Lipiden isoliert, die Fettsäuren sauer zu Methylestern
umgewandelt, silyliert und mit GC-MS analysiert. Zwei Lipidfraktionen wurden
getrennt analysiert, weil damit die Selektivität der Methode erhöht werden konnte.
In ca. 120 Proben von Fleischprodukten wurde kein ZNS-Material nachgewiesen.
Unter ca. 60 Proben befand sich nur ein Produkt (6 Proben) mit nicht deklarierten
Innereien: Mortadella, der traditionell mit Schweinemagen hergestellt wird (Dekla-
ration in der Schweiz vorgeschrieben). Schweinemagen war ab einem Zusatz von
ca. 3% nachweisbar. Folgende andere Innereien erwiesen sich als nachweisbar:
Leber, Milz und Niere.

Résumé
La fraction C22 –C26 d’acides gras provenants de sphingo- et phospholipides a été
utilisée pour déterminer la présence de cervelle, de moelle épinière (problème ESB)
ainsi que de tissu d’organes (soumis à déclaration) dans les produits carnés. Les
sphingo- et phospholipides ont été isolés des lipides principaux à l’aide d’une car-
touche de silice, dérivatisés en esters méthylique, silylés et finalement analysés par
GC-MS. Deux fractions ont été analysées séparément afin d’augmenter la sélectivité
de la méthode. Aucun matériel de tissu nerveux central n’a été décelé dans la cen-
taine d’échantillons de produits carnés analysée. Six produits seulement sur
quelques 60 échantillons renfermaient du tissu d’organes non déclaré: des saucisses
mortadelle, traditionnellement fabriquées avec l’estomac de porc (déclaration obli-
gatoire en Suisse). Le tissu d’estomac est détectable à partir d’une teneur d’environ
3%. Le foie, la rate et le rein sont d’autres organes dont la présence peut être déce-
lée par cette méthode.

Key words
Fatty acids from sphingo- and phospholipids, Hydroxy fatty acids, Determination
of CNS material, Organ tissue, Sausages

References
1 Tierseuchenverordnung SR 916.401, Bern, 1995.
2 Lücker, E., Eigenbrodt, E., Wenisch, S., Failing, K., Leiser, R. and Bülte, M.: Development of
an integrated procedure for the detection of central nervous tissue in meat products using
cholesterol and neuron-specific enolase as markers. J. Food Protection 62, 268 – 276 (1999).
3 Lücker, E., Eigenbrodt, E., Wenisch, S., Leiser, R. and Bülte, M.: Identification of central nerv-
ous system tissue in retail meat products. J. Food Protection 63, 258 – 263 (2000).

400 Mitt. Lebensm. Hyg. 93 (2002)


387-401 16.10.2002 8:12 Uhr Seite 401

4 Lücker, E., Horlacher, S., Eigenbrodt, E. und Bülte, M.: Verfahren zum Nachweis von im
Hinblick auf BSE unerwünschten Zutaten in Fleischerzeugnissen. Fleischwirtschaft 5, 74 –77
(2000).
5 Horlacher, S., Lücker, E. und Bülte, M.: Nachweis von Risikomaterial in Fleischerzeugnissen.
Lebensmittelchemie 55, 121–122 (2001).
6 Niederer, M. and Bollhalder, R.: Identification of species specific central nervous tissue by
GC-MS – a possible method for supervision of meat products and cosmetics. Mitt. Lebensm.
Hyg. 92, 133 –144 (2001).
7 Barcarolo, R., Bau, A., Moreno, J.B., Dimitrova, B. and Anklam, E.: Method development for
the analysis of nervonic acid in meat-derived food using on-line LC-GC technique. 25th Int.
Symp. on Capillary Chromatography, Riva del Garda 2002.
8 Hellgren, L.I.: Occurrence of bioactive sphingolipids in meat and fish products. Eur. J. Lipid
Sci. Technol. 103, 661– 667 (2001).
9 Humpf, H.-U. und Seefelder, W.: Identifizierung und Charakterisierung von komplexer
Sphingolipiden in pflanzlichen Lebensmitteln. Lebensmittelchemie 55, 141 (2000).
10 Swiss «Lebensmittelverordnung» Art. 124, Bundeskanzlei Berne, 2000.
11 Magni, P. and Porzano, Th.: Large sample volume splitless injection. Proceedings 25th Int.
Symp. on Capillary Chromatography, Riva del Garda 2002.
12 van der Hoff, G.R., van Zoonen, P. and Grob, K.: Deactivation of precolumns for capillary
GC by a thin layer of OV-1701. J. High Resol. Chromatogr. 17, 37–42 (1994).
13 Grob, K. and Biedermann, M.: The two options for sample evaporation in hot GC injectors:
thermospray and band formation. Optimization of conditions and injector design. Anal.
Chem. 74, 10 –16 (2002).

Corresponding author: Koni Grob, Official Food Control Authority of the Canton
of Zurich, P.O. Box, CH-8030 Zurich

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Original Papers

Comprehensive Analysis of Migrates


from Can Coatings: Chemically Inert
Solvent Substitute for Simulant D
Maurus Biedermann1, Koni Grob1 and Vincent Dudler2

1 Official Food Control Authority of the Canton of Zurich (Kantonales Labor),


Zurich
2 Swiss Federal Office of Public Health, Berne

Received 14 May 2002, accepted 14 June 2002

Scope: method for comprehensive analysis of migrates from food contact


materials
The “Committee of Experts on Materials coming into Contact with Food” of
the Council of Europe is presently revising the Resolution AP (96)5 on surface
coatings (1). Different new legislative concepts to better ensure the safety of the
migrates from can coatings are discussed. It is assumed that a future legislation will
ask the producers to identify the components migrating from the coatings into the
packed food and check their toxicity (2). This presupposes a simple method for
compositional migrate analysis. The range of components to be identified is
restricted to those with a molecular mass below 1000 Dalton and migrating in
amounts exceeding a threshold which still needs to be defined.
In a first step (3), a method was defined for the isolation of the migrants
<1000 D from coating extracts. It involves size exclusion chromatography (SEC)
and calibration of the retention time corresponding to 1000 D with triarachin, the
component found to have shortest retention time per unit molecular weight.
This paper describes the search for a solvent or solvent mixture extracting coat-
ings in a manner, firstly, simulating edible oil or oily foods and, secondly, avoiding
chemical alteration (e.g. hydrolysis) of reactive migrants in order to enable the iden-
tification of their structure as they are released by the coating. Legislation, such as
EU Directive 82/711/EEC, requires edible oil or oily foods to be simulated with
olive oil (simulant D). For our purpose, olive oil is not suitable, however, because
interferences by the components in olive oil render comprehensive analysis of the
migrates excessively difficult and there is no control on the reaction of migrants

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with the more polar or reactive constituents present in edible oils. The second
amendment of Directive 82/711/EEC, Directive 97/48/EC, specifies solvent substi-
tutes for simulant D, i.e. isooctane or 95% ethanol, as well as the conditions to be
applied. For the most important use of coated cans, involving sterilization at
121°C for 30 min, it suggests the application of iso-octane at 60°C for 1.5 h. Faster
extraction into iso-octane than into oil should be compensated by a lower tempera-
ture. The lower temperature is also favored to improve safety of the testing proce-
dure.
De Kruijf and Rijk (4) suggested the use of iso-octane as a simulant D substitute
for overall migration. In 1994, the same authors (5) compared overall migration into
iso-octane and olive oil at various conditions for a broad range of packaging materi-
als, among which were a coated steel and a coated aluminium (without indication of
the type of coating). Data was provided to support that “overall migration into iso-
octane during 30 min, 1, 2, or 3 h at 60°C is a suitable alternative to determinations
using exposure to olive oil at test temperatures ranging from 100 to 175°C”. The
data for the two coated metals was not really conclusive: iso-octane 1 h/60°C deliv-
ered 2.8 and 3.8 mg/dm2 overall migrate, while olive oil 30 min/120°C resulted in
overall migration of –0.2 and 1.3 mg/dm2, respectively, with a measuring uncer-
tainty of 3 mg/dm2. In 1997, the authors included alternative solvent substitutes, i.e.
isopropanol as well as 50 and 95% ethanol into a broad comparison (6). Again little
data refers to metal coatings and agreement between olive oil and solvent substitutes
was still not convincing.
Riquet and Feigenbaum (7) searched for more adequate solvent substitutes,
since iso-octane strongly interacts with polyolefins, but rather little with more polar
polymers, whereas the opposite is true for polar solvents, such as aqueous ethanol.
The same considerations apply to interactions with the solutes (solubility). They
studied the penetration of simulant D substitutes (iso-octane and aqueous ethanol)
in PVC, using electron spin resonance (ESR) with a paramagnetic probe. In conclu-
sion, they suggested the use of tert. butyl acetate as swelling solvent, mimicking the
ester function of triglycerides. The aggressivity of the medium was adjusted to that
of olive oil by adding iso-octane. The composition of this mixture must be tailored
to the type of polymer to be tested.
In 1999, Riquet, Bosc and Feigenbaum again pointed out the different selectivity
of 95% ethanol and iso-octane compared to olive oil (8). “If by pure chance overall
migration figures similar to those of olive oil are found, the same substances or the
same proportion of substances are probably not being extracted.” In fact, a reason-
able correlation between overall migration into olive oil and iso-octane does not
necessarily indicate a satisfactory match for specific migration of individual compo-
nents. The authors again concluded that solvent substitutes should have properties
adjusted to olive oil.
For the identification of migrate components, food-simulating extraction of
coatings brings up an additional potential problem: modification of migrants by

Mitt. Lebensm. Hyg. 93 (2002) 403


402-419 16.10.2002 8:13 Uhr Seite 404

chemical reaction with the simulant, simulant substitute, or with minor components
(e.g. mono- and diglycerides in olive oil) and impurities (e.g. humidity or acetic acid
in butyl acetate) contained in these. The hydrolysis of epoxy functions was dis-
cussed by Paseiro et al. (9) as well as by Philo et al. (10).
Temperature is another important parameter to be studied. Since a majority of
the canned foods is sterilized, migration into edible oil was tested at 125°C for
30 min. In the sterilization process, can coatings are rapidly heated to the tempera-
ture of the heating medium, which may be substantially above the temperature to be
reached in the center of the can. On the other hand, the highest temperatures are
applied for sterilization in a short time. It was concluded that 125°C for 30 min
(including the heating up time) would be adequate.
Simulants for aqueous foods and the problems related to chemical reactions
interfering with migration will be subject of a further paper. Since migration into
polar (water-containing) simulants cannot rule out chemical reactions, testing with
the more inert solvents to be specified here will also be necessary for cans intended
to be used for aqueous foods. The identity of the original migrants must be known
because hydrolysis, the most probable reaction in water-containing simulants, is not
the only possible reaction in foods, since many other reactive compounds are con-
tained in these (see aromatic amines or the “disappearing” BADGE (11)).

Experimental

Instruments
Accelerated solvent extractor ASE 200 (Dionex, Sunnyvale, USA). Liquid
chromatograph, Dualchrom 3000 (Fisons, Milan, Italy), and SpectraSystem
P4000 (Thermo Separation Products, San Jose, USA); fluorescence detectors,
Merck/Hitachi F1050 (Darmstadt, Germany), Jasco FP-920 (Tokyo, Japan); GC-
MS, MD-800 coupled to a GC Top equipped for large volume on-column injection
(ThermoFinnigan, Milano, Italy).

Samples
Four commercially applied coatings on steel sheets were obtained from
Schekolin AG, Bendern (Lichtenstein): two classical epoxy/phenol coatings (epoxy
resins hardened by phenolics, EP1 and EP2), an epoxy/anhydride optimized for
low migration (epoxy resin hardened with trimellitic anhydride, EA), and a classical
organosol stabilized with BADGE (Org). Empty, unused cans with epoxy/phenolic
coatings were from the Japanese market.

Migration into oil


Coated metal was cut to pieces of 27.5 cm (15 cm2), folded, and immersed in
15 g vegetable oil in a 25 ml beaker glass (30 mm diameter). Samples were heated in
a GC oven which was pre-heated to the temperature of interest (between 115 and

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402-419 16.10.2002 8:13 Uhr Seite 405

145°C). The heating time of 30 min corresponded to the time in the GC oven, i.e.
included the heating, but excluded the cooling time. Temperature increase in the
center of the oil was monitored by a thermocouple: for a set temperature of 140°C,
after 5 min 95°C was reached, after 10 min 130°C, and 140°C was reached after
about 20 min. Cooling in a current of ambient air (in a fume hood) for 5 min
brought the temperature back to 75°C. After complete cooling, the sample was
homogenized by a magnetic stirrer for 15 min, using the sample of metal sheet as a
stir bar.

Extraction by accelerated solvent extraction (ASE)


Pieces of metal sheet were cut to 27.5 cm and folded to a right angle in the
long axis. Two of them, positioned back to back, were placed in an extraction cell of
22 ml internal volume. To avoid corrosion initiated by direct contact with the
extraction cell, the samples were supported by a small plug of glass wool. The dura-
tion of the extraction (15 or 30 min) included the heating time (6 –7 min according
to the instrument manual). The volume of the extract obtained over the whole
procedure was 30 ml.

Analysis by normal phase HPLC (NPLC)


The method for NPLC analysis with fluorescence detection (FD) was similar to
that described in (12). A 25 cm2 mm i.d. column packed with Grom-Sil 100
Cyano-2 PR, 5 µm, was used with the following gradient (400 µl/min): solvent A,
pentane (redistilled)/1% 1-propanol; solvent B, 1-propanol/dichloromethane 1: 1;
100% A (0 min), 1%/min to 15% B, 2%/min to 40 % B, 5 %/min to 60 % B
(3 min). Reconditioning with 100% A lasted 10 min. 100 µl of a 20 % solution of
edible oil in 15% dichloromethane/hexane was injected. Coating extracts with iso-
octane were injected directly or after dilution with 15 % dichloromethane/hexane;
other extracts were evaporated to dryness and picked up in dichloromethane.

Identification by GC-MS
For peak identification, fractions from NPLC corresponding to one or more
peaks were collected at the detector outlet and introduced by large volume (100 µl)
on-column injection into GC-MS, using concurrent solvent evaporation as
described in (13).

Migration into edible oil


As a basis for comparison, migration into edible oil was determined at condi-
tions simulating sterilization, i.e. at 125°C for 30 min. Substitute solvent mixtures
and conditions should be adjusted to approach this migration as closely as possible.
Components having the fluorescing chromophore of bisphenols (225/275 nm) were
used as test migrants, since this enabled to assess the migration of a rather wide
spectrum of components directly in the oil using NPLC-FD.

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Test compounds
Figure 1 shows the NPLC-FD chromatograms of the vegetable oil in contact
with the four coatings. The components quantitatively determined and used for
testing migration into simulant D substitutes are labeled and listed in table 1. At the
left, a chromatogram of the edible oil alone is inserted to show the signals originat-
ing from the oil (“oil (blank)”). The epoxy/phenol coating EP1 contained an epoxy
resin apparently manufactured by the Taffy process, as shown by the large peak of
the dimer (36 µg/dm2). BADGE.HCl migrated at 4 µg/dm2; in cans of a size typi-
cally used for tuna or sardines it would have reached a concentration of around
50 µg/kg. The epoxy/anhydride coating primarily released cyclo-diBA and an
unidentified component termed P15 (as well as a number of important components
not observed by fluorescence detection). The chromatogram showing the migrate
from the organosol coating was three times more attenuated. BADGE.HCl
migrated at 50 µg/dm2, BADGE.2HCl at 540 µg/dm2.

Figure 1 NPLC-FD chromatograms showing the migration into edible oil (125° C,
30 min) for the four coatings involved in the experiments. The compo-
nents used for quantitating specific migration are assigned and listed
in table 1. EP1 and EP2 = epoxy/phenol coatings; EA = epoxy/anhydride;
Org = organosol

Dependence on temperature
Figure 2 shows the migration of the test components from the four coatings into
vegetable oil at 115, 125, 135, and 145°C during 30 min (including the heating time
of approximately 15 min). The data was normalized on the migration into the same

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Table 1
Migrate components used in the tests and shown in figure 1
Abbreviation Compound
BADGE bisphenol A diglycidyl ether
BADGE.tBuPhe BADGE reacted with tert.butyl phenol
BADGE.HCl BADGE monochlorohydrin
BAMGE bisphenol A monoglycidyl ether
Cyclo-diBA cyclo di(bisphenol A monoglycidyl ether)
Dimer reaction product of BADGE with BAMGE
Trimer reaction product of bisphenol A with 2 mols of BADGE
BADGE.BuOH BADGE reacted with butanol
BADGE.BuEtOH BADGE reacted with butoxyethanol
BADGE.PrOH BADGE reacted with propanol
BADGE.2tBuPhe BADGE reacted with 2 mols of tert.butyl phenol
BADGE.tBuPhe.HCl BADGE reacted with tert.butyl phenol and HCl
BAMGE.tBuPhe BAMGE reacted with tert.butyl phenol
BADGE.2HCl BADGE dichlorohydrin
BAMGE.HCl BAMGE chlorohdrin
BADGE.2HCl* unknown, with mass spectrum like BADGE dichlorohydrin

Figure 2 Migration into vegetable oil at the temperatures indicated, determined


for the four coatings and the components shown in the chromatograms
of figure 1 and listed in table 1

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oil at 185°C, assuming that this would correspond to virtually complete extraction.
In fact, migration into refluxing dioxane (1 h) was approximately the same. The
results shown for EP1 indicate that at 115°C between 2% (trimer) and 16%
(BADGE) of the components of a molecular weight below 1000 Dalton were
extracted into the oil. At 125°C, migration was several times higher, i.e. 10% for the
trimer and 53% for BADGE. With further temperature increase, the larger molecu-
lar weight components caught up. The trend towards higher migration of the
smaller molecular weight components is also visible for the other test components:
BAMGE and BADGE.tBuPhe migrated to a larger proportion than the dimer and
cyclo-diBA. The coating EP2 shows similar characteristics, perhaps with the strong
increase in migration being shifted to a range of somewhat higher temperatures
(125 to 135°C).
Migration from the organosol was almost complete already at 115°C, i.e. in con-
trast to the others, it did no longer significantly depend on temperature.

Dependence on duration of heating


Figure 3 shows the dependence of migration into vegetable oil at 125°C on the
duration of heating. To the samples of coated metal, preheated oil was added, i.e. the
duration indicated corresponded to that of heating at 125°C, but did not include
cooling. Peak areas were normalized on the migration observed during 30 min. For
EP1, exposure for 30 min was in the middle of a phase of approximately linear
increase (after 1 h, values were well doubled). The various components, in particular
BADGE, its dimer, and trimer, did not differ significantly. Migration from the
organosol, however, was complete in less than 30 min.
These results indicate that the influence of temperature and duration of heating
on migration differs for different coatings. When migration into solvent substitutes

Figure 3 Dependence of migration into vegetable oil at 125° C on the duration of


heating for the epoxy/phenol coating 1 (EP1) and the organosol (Org)

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is adjusted to that into oil by changing temperature or the duration of heating,


also the aggressiveness of the solvent substitutes is likely to be modified differently
for different coatings. For this reason it cannot be expected that a set of solvent(s)
and testing conditions will result in accurate simulation for a broad range of
coatings.

Simulation of oil by solvent substitutes


The solvent substitute should imitate the swelling of the coating by edible oil
and the solubilization of the migrants. Furthermore, migration should be deter-
mined at 125°C in order to adequately consider the physical state of the coating.
Migration into low molecular weight solvents is, however, much faster than that
into edible oil. Theoretically this could be taken into account by a correspondingly
shorter exposure time, but this would presuppose heating and cooling in probably
less than a minute, which is not reasonably feasible. For this reasons, simulation of
simulant D by solvents has to accept compromises, sacrificing the simulation of one
parameter at least.
Three options were tested: migration at 125°C into a weaker solvent, migration
at substantially lower temperature with a solvent mixture of a polarity similar to
that of edible oil, and an intermediate solution compromising between the two.
Each was optimized in order to facilitate the choice of the most suitable approach.

Migration at 125 °C
Figure 4 summarizes results on solvent substitute tests at the simulant D testing
temperature, i.e. 125°C. Since even iso-octane resulted in higher migration than oil,
no room was left for choosing the solvent. Migration of the various test components
was expressed in percent of what was assumed to be complete extraction, i.e. reflux-
ing in dioxane during 1 h. The points at the left in each graphic show the reference,
i.e. the migration into oil at 125°C/30 min.
For the expoxy/phenol coating EP1 it was observed that at 125°C/30 min iso-
octane extracted well twice as much as oil, approaching complete extraction for the
low molecular weight components, such as BAMGE and BADGE. Dependence of
migration on temperature was relatively weak: clearly weaker than for oil and still
somewhat weaker than for EP2. This confirms that the reduction of migration
speeds by lowering temperature neglects important properties of a coating and will
be a makeshift. Exposure shortened to 15 min (of which more than half was the
heating period) brought the results fairly close to the reference (points at the right in
the graphic).
EP2 showed similar migration, but shortening the heating time to 15 min had
little effect. This unexpected result is based on data points averaging seven experi-
ments performed with 30 min exposure and four with 15 min, i.e. cannot be attrib-
uted to uncertainty. Migration into iso-octane at 125°C/15 min remained substan-
tially above that into oil.

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Figure 4 Migration into iso-octane. Points at the left: migration into oil (result to
meet). Points at the right: iso-octane at 125° C with a migration time
shortened to 15 min

Migration from the epoxy/anhydride coating (EA) into iso-octane more


strongly increased with temperature than that from the other coatings. At
125°C/15 min it was again considerably higher than that into oil. In addition, strong
differences in selectivity were observed: the well integrated peak P15 (see
fig. 1) showed the highest migration into oil, but the lowest into iso-octane.
The organosol again behaved differently: since migration into oil and iso-octane
was quite complete, there were no significant discrepancies between these two
media, nor relevant dependencies on conditions.
In conclusion, migration at 125°C into a solvent substitute as weak as iso-octane
is still substantially higher than that into oil (factor of 2–3 for the epoxy coatings).
Shortening of the exposure time to 15 min has an effect which depends on the coat-
ing, but clearly improves the results (reduced overestimation, still no underestima-
tion). Less than 15 min might still be preferable, but presupposes faster heating than
can be achieved using the ASE apparatus (the sample was really at the 125°C for
about 5 min only).

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Adjusted solvent polarity


The second approach was aiming at a solvent substitute imitating the swelling
and solvation properties of oil, compensating for the faster migration by a lower
temperature. Instead of the tert.-butyl acetate introduced by Riquet et al. (7),
n-butyl acetate was used because of higher purity and lower price. Optimization
concerned two parameters: the proportion of butyl acetate in iso-octane and tem-
perature. As 60°C for 1 h, widely applied in migration testing, appeared to be suit-
able, fine tuning was performed by the concentration of butyl acetate in iso-octane.
Figure 5 shows the migration at 60°C/1 h into butyl acetate/iso-octane mixtures
of varying composition (90 min for iso-octane alone in order to match EU Directive
97/48/EC). Results are again expressed as percents of the migration into dioxane
(1 h reflux), with the migration into edible oil (125°C/30 min) shown at the left.
The EU Directive 97/48/EC mentions iso-octane at 60°C/90 min as solvent
substitute for simulant D at sterilizing conditions. However, for BADGE and its
derivatives migration from EP1 was well 100 times lower than into edible oil; for
the trimer it was some 400 times lower. This indicates that for such coatings the

Figure 5 Migration into iso-octane containing various concentrations (v/v) of


n-butyl acetate; points at left: migration into oil for comparison

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official substitute conditions result in serious underestimation of migration into


simulant D.
With butyl acetate concentrations in the range of 20 to 30% (v/v), migration
strongly increased. It approached complete extraction with 50% butyl acetate. With
30% butyl acetate, overestimation of migration was modest for EP1, but reached
a factor of about two for EP2. The epoxy/anhydride coating better resisted the
solvent mixture: for some components 30% butyl acetate resulted in a slight under-
estimation of migration into simulant D. For the organosol, a 20% concentration
resulted in virtually complete extraction. The values for BAMGE and BADGE.HCl
in edible oil were below 100% (the extraction into dioxane) presumably because
these two epoxy compounds reacted with components in the oil.
30% butyl acetate in iso-octane was considered most adequate for substituting
simulant D. It compromises between a clear overestimation of migration for
the epoxy/phenol coatings and some cases of slight underestimation for the
epoxy/anhydride.
Figure 6 shows the kinetics of the migration into 30% butyl acetate/iso-octane
for EP1. Data are normalized to the 60 min migration time. For the low molecular
weight components (BAMGE, BADGE) the concentration reached a plateau after
some 2 h, while migration continued for the dimer, the cyclo-diBA, and the trimer.

Figure 6 Migration into 30 % butyl acetate/iso-octane for EP1: influence of migra-


tion time

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Intermediate conditions
Instead of strictly optimizing the solvent polarity or temperature, a compromise
was investigated. It is technically easy to determine migration at boiling conditions.
The boiling point of n-butyl acetate/iso-octane mixtures is near 100°C.
Figure 7 shows the migration into refluxing iso-octane containing 0, 2, or 5%
n-butyl acetate (1 h) in comparison with oil at sterilizing conditions. As observed
for the 30% butyl acetate mixture at 60°C, the solvent more easily penetrates the
epoxy/phenol coatings than the epoxy anhydride. For EP1 and EP2, 2% butyl
acetate resulted in modest overestimation of migration, whereas for EA slight
underestimation and overestimation are balanced (differing selectivity). For the
organosol, extraction was again complete and simulation correspondingly uncritical.

Figure 7 Migration into oil at 125° C/60 min (left) and into refluxing n-butyl ace-
tate/iso-octane mixtures (v/v) (1 h)

Discussion
The solvent substitutes for simulant D (olive oil) specified in Directive
97/48/EC are not applicable to determine the composition of the material migrating
from can coatings into oily foods. Migration into iso-octane at 60°C during 90 min
easily underestimates migration by a factor of 100, whereas 95% ethanol reacts with
some migrate components.

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The main problems in searching for a more suitable solvent substitute originate
from the fact that migration into solvents is many times faster than into oil. Since
technical reasons do not allow a corresponding shortening of the exposure to hot
solvent, migration must be slowed either by a weaker solvent or by a lower testing
temperature (or a compromise re-adjusting both). Such correcting measures are
makeshifts: dependence of migration on temperature differs for different coatings,
as do the aggressivity of solvent mixtures and the effect of changing duration. Hence
the extent of slowing obtained by a weaker solvent, a lower temperature, or an
adjusted time varies from one coating to another.
The best simulation of simulant D would be obtained by adjustment of the sol-
vent mixture to given types of polymers or coatings, as suggested by Riquet et al.
(7). However, this is hardly practical, since the kind of coating is often unknown to
the testing person, and often cans are composed of parts coated by different types of
lacquer. Hence, a compromise must be found even if no accurate matching can be
expected.

Comparison of the options tested


Table 2 summarizes the precision in matching migration into simulant D at
125°C during 30 min as it was achieved at the optimized conditions for the three
strategies outlined above. It lists the percentages of migration of the test compo-
nents into the solvent substitutes as compared to the migration into oil.
1. Iso-octane applied during 15 min at 125°C (heating up time of about 10 min in-
cluded) often resulted in severe overestimation of migration except for the large
molecular weight components. The values for the organosol coating did not sig-
nificantly deviate from 100% as extraction was more or less complete for the oil
as well as for the solvents.
2. The solvent mixture mimicking triglycerides had to be adjusted such that severe
underestimation of the migration from the epoxy/anhydride coating could be
avoided. Using 30% (v/v) n-butyl acetate/iso-octane at 60°C for 1 h, the over-
estimation for the epoxy/phenol coatings reached a factor of two, while migra-
tion from the epoxy/anhydride coating was underestimated by up to 20 –25 %.
3. The intermediate strategy, involving 2% butyl acetate in iso-octane at refluxing
conditions (about 100°C) for 1 h, resulted in somewhat reduced overestimation,
but also increased underestimation, particularly of the high molecular mass
compounds.

Imprecision in selectivity
As suggested by the data in table 2, precision of matching the migration by the
substitute solvents depends on the component, i.e. the selectivity of the solvent dif-
fers from that of simulant D. For the strategy of adjusted solvent, this is also con-
cluded from figure 8, showing NPLC-FD chromatograms of the migrate from a
Japanese can with epoxy/phenol coatings. Migration into edible oil at 121°C during

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Table 2
Migration into solvent substitutes as percent of the migration into oil at 125° C/
30 min. Results listed for the three strategies evaluated: test at sterilizing tempera-
ture (125° C); test using a solvent mixture adjusted to oil (Solvent); test at 100° C
with somewhat adjusted solvent (Intermediate)
Migration relative to oil (%)
Test compound 125° C Solvent Intermediate
EP1 BADGE 110 200 150
BADGE.tBuPhe 140 150 100
BAMGE 130 160 120
cyclo-diBA 120 130 70
Dimer 140 140 80
Trimer 90 110 45
EP2 BADGE 180 180 110
BAMGE 230 169 120
cyclo-diBA 250 220 120
EA BADGE.2tBuPhe 270 150 120
BADGE.tBuPhe.HCl 190 75 80
cyclo-diBA 180 80 80
P15 80 80 40
Org BADGE.HCl 110 120 130
BAMGE 110 90 120
BADGE.2HCl 90 95 110
BAMGE.HCl 85 80 110
BADGE.HCl2* 90 85 120

30 min is compared to migration into mixtures of iso-octane containing 20– 33 %


n-butyl acetate (60°C/60 min).
For the migration of BADGE, 25% butyl acetate/iso-octane matches the oil
quite exactly (in the oil, BADGE is partially coeluted with an oil constituent: see
two chromatograms at bottom right). The dependence of migration on the concen-
tration of butyl acetate in iso-octane is steep: with 20 % butyl acetate, BADGE
migration is reduced to less than half, whereas with 33 % it corresponds to about
twice the migration into oil.
Other components behave differently: the triple peak between BADGE and
cyclo-diBA (unidentified components, probably largely BADGE reaction prod-
ucts) seem to migrate to an extent which is independent of the concentration of
butyl acetate; their migration exceeds that into oil by almost a factor of two even
with 20% butyl acetate. For cyclo-diBA, 20 % butyl acetate results in some 30 %
overestimation. In contrast to this, 25% butyl acetate underestimates the migration
of the dimer into oil by a factor of at least two. The later eluted components confirm
these findings: some are substantially overestimated even with 20 % butyl acetate,
while for some others 33% butyl acetate is needed.

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Figure 8 Migration from an epoxy/phenolic coating into oil and iso-octane contai-
ning 20 – 33 % n-butyl acetate (60° C/60 min): selectivity of oil and solvent
substitutes is different (Y. Uematsu, unpublished results)

If migration testing must prevent serious underestimation, for this example a


mixture containing close to 33% butyl acetate is appropriate, at the price of an
overestimation of some components by up to a factor of 2.4 (BADGE, 33% butyl
acetate). It should be kept in mind that migration from epoxy/phenolics was higher
than for epoxy anhydride coatings.

Practical aspects
For the selection of the best option, also some practical aspects should be taken
into consideration.
1. Solvent extraction at 125°C with iso-octane must occur under pressure. The
ASE instrument renders this easy and reliable, but the instrument is expensive
and not available in all laboratories. Furthermore extraction in the cells renders
single sided extraction difficult. Heating to 60°C is technically easier, as it may
occur in a closed vial in an oven or water bath and is readily feasible in a partially
opened can or a migration cell.
2. Heating to 125°C for a period as short as 15 min is prone to result in imprecise
data unless the profile of the temperature increase is well under control.
3. Solubility in iso-octane is a problem, particularly for high molecular weight
material: during or after cooling to ambient temperature there tends to be
uncontrolled precipitation.

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4. Extraction conditions should avoid chemical modification of labile migrants.


Iso-octane is the most inert solvent, but must be used at higher temperature
than mixtures with butyl acetate. It is difficult to weigh these factors, also
because much depends on the purity of the butyl acetate (presence of some
acetic acid or humidity might have a serious effect). In this respect, the butyl
acetate/iso-octane mixtures are clearly superior to simulant D applied at
sterilizing conditions.

Conclusion
For comprehensive migrate analysis, solvent substitutes for simulant D (olive
oil) must be used. Those proposed in literature and listed in regulations were largely
optimized for overall migration (although not specifically for can coatings) and are
not appropriate. For specific migration, simulation of olive oil is even more difficult
than for overall migration, as not only the sum of the migrating material must be
matched, but also the migration of the individual components. Furthermore, chem-
ical reactions must be ruled out.
As matching is not precise, it must be decided whether the substitute should be
designed to account for a kind of average migration or rule out significant underes-
timation by taking into account worst cases.
For the substitution of simulant D at 125°C/30 min (sterilization) we gave pref-
erence to 30% n-butyl acetate in iso-octane (v/v) applied at 60°C for 1h. No serious
underestimation of migration into oil has been noted, but overestimation by up to a
factor of two.

Acknowledgement
This study is part of a project financed by the Swiss Federal Office of Public
Health, Division of food science. We also thank H.R. Widmer and S. Kurz,
Schekolin AG, for providing the coatings.

Summary
Compositional analysis of the migrate from can coatings presupposes an extrac-
tion with solvent. For oily foods this solvent should substitute simulant D, com-
monly for sterilizing conditions (125°C for 30 min). Further it should be suffi-
ciently inert to prevent chemical modification of the migrants, which renders this
extraction relevant also for cans used for aqueous foodstuffs. Substitution of simu-
lant D was optimized for three strategies. (i) Maintaining the temperature of 125°C:
in 15 min (including the heating time), iso-octane tended to extract more than simu-
lant D. (ii) Use of a solvent mixture mimicking triglycerides: the best results were
obtained with 30% (v/v) n-butyl acetate in iso-octane at 60°C for 1 h. (iii) Interme-
diate solution: refluxing (100°C) in 2% n-butyl acetate/iso-octane for 1 h yielded
similar results as (ii). Extraction at 60°C was given preference because of practical
reasons.

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Zusammenfassung
Die Analytik der Migratzusammensetzung von Dosenlacken setzt eine Extrak-
tion mit einem geeigneten Lösungsmittel voraus. Für fettige oder ölige Lebensmittel
muss dieses das Simulans D ersetzen, normalerweise für Sterilisierungsbedingun-
gen. Gleichzeitig sollte es chemisch genügend inert sein, um eine Veränderung reak-
tiver Migratkomponenten zu vermeiden. Damit wird diese Extraktion auch für
Dosen wichtig, die nur für wässerige Lebensmittel eingesetzt werden. Die Substitu-
tion von Simulans D wurde für drei Strategien optimiert. (i) Extraktion bei 125°C:
Die Anwendung von Iso-Oktan während 15 min (einschliesslich die Aufheiz-
zeit) ergab meistens höhere Migration als Öl. (ii) Lösungsmittelgemisch mit ähn-
licher Polarität wie Speiseöl: Die besten Resultate wurden mit 30 % (v/v)
n-Butylacetat/iso-Oktan bei 60°C während 1 h erhalten. (iii) Kompromisslösung:
Rückflussieren in 2% Butylacetat/iso-Oktan (100°C) während 1 h ergab ähnliche
Resultate wie (ii). Aus praktischen Gründen wurde der Extraktion bei 60°C der
Vorzug gegeben.

Résumé
L’analyse de la composition des migrats des vernis de boîtes de conserve néces-
site une extraction préalable par un solvant approprié. Dans le cas d’aliments gras,
celui-ci doit remplacer le simulant D, même aux conditions de stérilisation. En
même temps il doit être suffisamment inerte pour éviter une modification chimique
des migrants réactifs. Ainsi cette extraction est importante aussi pour des boîtes uti-
lisées uniquement pour des aliments aqueux. Trois stratégies ont été suivies pour
optimiser la substitution du simulant D. (i) Une extraction à 125°C: la migration
dans l’iso-octane d’une durée de 15 min (temps de mise en température inclu) est
normalement plus importante que dans l’huile. (ii) Un mélange de solvants de pola-
rité similaire aux triglycerides: les meilleurs résultats ont été obtenu avec un mélange
30% (v/v) acétate de n-butyle/iso-octane à 60°C pendant 1 h. (iii) Stratégie inter-
médiare: un reflux (ca. 100°C) dans iso-octane/2 % d’acétate de n-butyle pendant
1 h fournit des résultats similaires. La préférence s’est portée sur l’extraction à
60°C pour des raisons de simplicité expérimentale.

Key words
Migration from food packaging, Can coatings, Solvent substitute for simulant D,
Simulant D, Comprehensive migrate analysis from coatings

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can coatings; analysis by gradient NPLC. Food Addit. Contam. 15, 609 – 618 (1998).
13 Biedermann, M., Grob, K., Böhler, P. and Widmer, H.R.: Identification of migrants from
coatings of food cans and tubes: reaction products of BADGE with phenols and solvents.
Mitt. Gebiete Lebensm. Hyg. 89, 529 – 547 (1998).

Corresponding author: Koni Grob, Official Food Control Authority of the Canton
of Zurich, P.O. Box, CH-8030 Zurich

Mitt. Lebensm. Hyg. 93 (2002) 419


420-436 16.10.2002 8:15 Uhr Seite 420

Originalarbeiten

Quantitativer Nachweis von mehreren


Makrolid-Antibiotika in Fleisch,
Leber und Niere mit LC-MS/MS nach
einer teilweisen automatisierten
Aufreinigung
Dominik Guggisberg, André E. Mooser und Herbert Koch,
Bundesamt für Veterinärwesen, Liebefeld-Bern

Eingegangen 10. Juli 2002, angenommen 27. August 2002

Einleitung
Makrolid-Antibiotika (MA), mit Erythromycin und Spiramycin als wichtigste
Vertreter (Abb. 1), haben in den letzten Jahren für die Behandlung von Atemwegs-
erkrankungen und Infektionen im HNO-Bereich als Alternative zu den Penicilli-
nen deutlich an Bedeutung zugenommen. Die seit 1952 bekannten von Streptomy-
ces-Arten produzierten Antibiotika vom Strukturtyp der makrocyclischen Lactone
mit meist 14-, 15- oder 16-gliedrigem Lactonring werden sowohl in der Human- als

O
H3C CH3 CH3
O N CH
HO OH O 3
OH CH3 CH3
H 3C OH CH3 CH3 H
H3C N CH3 CH3
H 3C O
O O O
N CH3
CH3 CH3 HO
H3C O O
O O O O
CH3 O CH3
CH3 O OH
O OH
CH3 R1 O CH3
H3C O O
H 3C OH

Abbildung 1 Chemische Strukturen von Erythromycin (links) und Spiramycin


(rechts)

420 Mitt. Lebensm. Hyg. 93, 420–436 (2002)


420-436 16.10.2002 8:15 Uhr Seite 421

auch in der Veterinärmedizin häufig gegen Bakterien eingesetzt. Grössere Lacton-


ringe (26–40 Ringglieder) wirken praktisch ausschliesslich gegen Pilze und Hefen
(1).
Kennzeichnend für die Struktur ist das ringförmige Grundgerüst mit 10 bis über
40 Ringgliedern und mindestens einem inneren Ester (Lacton). Häufig enthält der
Ring auch Doppelbindungen und Epoxidgruppen. Stark variieren die Substituenten
am Ring, die neben Resten wie Hydroxylgruppen auch aus glykosidisch verknüpf-
ten Zuckern bzw. Aminozuckern oder aromatischen Substituenten bestehen kön-
nen.
Am 1. Januar 1999 wurden sämtliche Antibiotika als antimikrobielle Leistungs-
förderer in der Tiermast verboten (2). Der Einsatz als Tierarzneimittel zu therapeu-
tischen Zwecken ist meldepflichtig und mit einem Behandlungsjournal zu belegen
(2). Heute sind drei Makrolide als Tierarzneimittel in der Schweiz registriert, wobei
folgende vier Grenzwerte gelten (Tabelle 1).

Tabelle 1
Grenzwerte nach FIV (3) der registrierten MA
Makrolid-Antibiotika Grenzwert Typische Produkte (Auswahl)
(MA) Fleisch/Muskelfleisch (FIV)
Erythromycin 0,40 mg/kg z.Z. kein Produkt im Handel
Spiramycin 0,30 mg/kg B-SU, Spiramastin, Suanovil 20
Tilmicosin 0,05 mg/kg Micotil 300, Pulmotil Prämix
Tylosin 0,10 mg/kg Meliovet 3 wl, ufamed-S-202, Tylan
soluble, Vetmix Chlor-Tetra Plus S

Für folgende MA, die möglicherweise in der Veterinärmedizin im Ausland ein-


gesetzt werden, sind keine Grenzwerte in der FIV (3) festgelegt:
Oleandomycin, Josamycin, Kitasamycin, Roxithromycin und Troleandomycin.
Rückstände dieser Arzneimittel im Fleisch und in der Milch können für den
Konsumenten eine potentielle gesundheitliche Gefahr darstellen (Resistenzbildung
und Allergien).
Für «Micotil 300» gilt beispielsweise eine generelle Wartezeit von 28 Tagen für
essbares Gewebe.
Damit eine möglichst grosse Anzahl von tierischen Gewebeproben auf Makro-
lid-Rückstände in Fleisch und Innereien überprüfbar ist, benötigten wir eine Analy-
senmethode mit genügender Empfindlichkeit und hohem Durchsatz.
Die Analyse von MA in Lebensmitteln tierischer Herkunft ist durch zwei
Umstände erschwert:
– die Wirkstoffe sind weder flüchtig noch lassen sie sich zu stabilen Derivaten für
GC umsetzen;
– für den empfindlichen Nachweis nach der Auftrennung durch HPLC fehlen
UV- oder Fluoreszenzabsorption. Deshalb werden MA häufig zwecks Nach-

Mitt. Lebensm. Hyg. 93 (2002) 421


420-436 16.10.2002 8:15 Uhr Seite 422

weis im UV- oder Fluoreszenzdetektor vorsäulen- oder nachsäulenderivatisiert


oder im Massenspektrometer detektiert.
Bisher sind einige Arbeiten erschienen, die aufzeigen, wie MA in Milch, Fleisch
und Innereien bestimmt werden können.
I. Kanfer et al. (4) geben in einem Review-Artikel einen guten Überblick, wie
Makrolide grundsätzlich aus biologischen Proben, Fermentationsmedien und phar-
mazeutischen Produkten extrahiert und analysiert werden können. B. Shaikh et al.
(5) zeigen generell, wie Antibiotika, unter anderen auch MA, aus Blut, Gewebe und
Milch extrahiert und analysiert werden.
Die von uns durchgesehenen Arbeiten wurden in sechs Kategorien unterteilt
(Tabelle 2).

Tabelle 2
Nachweismethoden von MA und weiterführende Literatur
Kategorie Analysenmethode Literatur
1 Analyse mit UV, ohne Derivatisation (6–18)
2 Analyse mit elektrochemischer Detektion (19–23)
3 Analyse mit Vorsäulenderivatisation (24–27)
4 Analyse mit Nachsäulenderivatisation (28–29)
5 Analyse mit LC-MS (30–37)
6 Analyse mit ELISA (38–40)

Nachdem in unserem Laboratorium diverse Versuche unternommen wurden,


möglichst viele MA durch Vorsäulen- bzw. auch Nachsäulenderivatisation quantita-
tiv nachzuweisen und diese «Multi»-Methoden zu keinem akzeptablen Resultat
geführt haben, hat man sich auf den Nachweis der wichtigsten Makrolide mit LC-
MS/MS konzentriert.
Wir berichten in der folgenden Arbeit von einer LC-MS/MS-Methode für sie-
ben Makrolide in Fleisch, Leber und Niere vom Rind, Kalb, Pferd, Schaf, Huhn und
vom Schwein mit internem Standard. Es geht in der Methode darum, die Makrolide
mit Ionenaustausch auf einer starken Kationentauscher-Säule (SCX) möglichst rein
und quantitativ anzureichern, sie dann mit HPLC möglichst vollständig von der
Fleischmatrix abzutrennen und durch Massenspektrometrie sehr selektiv nachzu-
weisen. Die Probenvorbereitung wurde auf einen hohen Probendurchsatz optimiert
und weitgehend automatisiert. Zudem wurden weitere Fragmentierungsionen zur
Bestätigung überprüft. Die Methode kann auch als Bestätigungsmethode nach
ELISA-Tests (38–40) dienen.

Kurzbeschreibung der Methode


Rind-, Kalb-, Pferde-, Schaf-, Poulet- und Schweinefleisch: Die Probe wird
homogenisiert (5 g), mit wässeriger Perchlorsäurelösung (20 ml) mittels Polytron
behandelt und zentrifugiert. Der Überstand wird eingeengt und über SPE (SCX)

422 Mitt. Lebensm. Hyg. 93 (2002)


420-436 16.10.2002 8:15 Uhr Seite 423

aufgereinigt. Die Analyse erfolgt mit LC-MS/MS. Die Quantifizierung wird mit
dem internen Standard Roxithromycin durchgeführt.

Material und Methode

Standardsubstanzen und Bezugsquellen


Tylosin, Roxithromycin, Oleandomycin Sigma-Aldrich
Spiramycin, Erythromycin, Josamycin Fluka
Kitasamycin ICN
Tilmicosin Eli Lilly
Herstellung der Stammlösung und der Verdünnungslösungen gemäss Tabelle 3.
(Die Wirkstoffkonzentration kann je nach Charge geringfügig schwanken, deshalb
ist die Gehaltsangabe des Lieferanten wenn möglich zu beachten!)

Tabelle 3
Herstellung der Stamm- und Verdünnungslösungen
Stammlösung
Spiramycin 12 mg Spiramycin einwägen und in 10 ml MeOH lösen
Tylosin 12,8 mg Tylosin einwägen und in 10 ml MeOH lösen
Roxithromycin 11 mg Roxithromycin einwägen und in 10 ml MeOH lösen
Oleandomycin 12 mg Oleandomycin einwägen und in 10 ml MeOH lösen
Erythromycin 10,2 mg Erythromycin einwägen und in 10 ml MeOH lösen
Josamycin 10 mg Josamycin einwägen und in 10 ml MeOH lösen
Kitasamycin 10 mg Kitasamycin einwägen und in 10 ml MeOH lösen
Tilmicosin 10 mg Tilmicosin einwägen und in 10 ml MeOH lösen
Standard I je 100 µl der Stammlösungen werden mit Milli-Q-Wasser auf 10 ml
aufgefüllt (=je 10 ng/µl)
Standard II 1000 µl des Standards I werden mit Milli-Q-Wasser auf 10 ml aufgefüllt
(=je 1 ng/µl)
Standard III 100 µl des Standards II mit Milli-Q-Wasser auf 1 ml aufgefüllt
(LC-MS) (=je 0,1 ng/µl)

Chemikalien und Material für die Probenvorbereitung


– Milli-Q-Wasser
– Perchlorsäure (Merck z. A. 518, 60%), c(Perchlorsäure)=0,01 mol/l: 1+899 mit
Wasser verdünnt
– NH3 (Merck, z. A., 25%)
– NaOH (Merck, z. A.)
– Zitronensäure (Fluka, 27490); c(Zitronensäure)=0,1 mol/l; 21 g/l, mit 30 %
NaOH auf pH=4 stellen
– Methanol (Merck z. A.)
– Ameisensäure (z. A. Merck 1.00264)
– SPE SCX-500 mg, 3 ml (IST)

Mitt. Lebensm. Hyg. 93 (2002) 423


420-436 16.10.2002 8:15 Uhr Seite 424

Reagenzien LC-MS
Mobile Phase: Acetonitril/Ameisensäure (0,1 %)=20/80 (Gradient bis 70 %
Acetonitril)
– Acetonitril (LiChrosolv, Merck)
– Milli-Q-Wasser mit 0,1% Ameisensäure

Geräte und Hilfsmittel


– Analysenwaage (0,1 mg, Mettler)
– Probenzerkleinerungsgerät Moulinette (Moulinex)
– Glaszentrifugengläser (90 ml, mit Deckel)
– Zentrifugengläser (50 ml, Polycarbonat, Nalgene)
– Laborschnellwaage (Mettler)
– Polytron-Homogenisiergerät mit 12-mm-Mixstab
– Laborzentrifuge (Heraeus, Hettich bis 4000 U/min)
– Vakuumeinheit für spe-Trennsäulen oder Gilson ASPEC XL
– Spitzkolben (100 ml)
– Vortex
– 100-, 250-, 1000-µl-Spritzen (Hamilton)
– 10-ml-Reagenzglas
– 1,5-ml-Autosampler-Vials mit Insert
– Turbovap
– HPLC-Apparatur, z.B. Waters 2690
– Massenspektrometer, z.B. Micromass

Probenaufbereitung

Extraktion der Probe


Die Probe wird wenn möglich ohne Fett mit der Moulinette homogenisiert.
5 g der aufgetauten und homogenen Muskelprobe werden im Zentrifugenglas mit
internem Standard (25 µl  10 ng/µl), 14 ml c(HClO4)=0,01 mol/l und mit 6 ml
Methanol versetzt und polytronisiert. Nach 15 min Zentrifugieren (4000 U/min;
2950 g) wird in einen Spitzkolben dekantiert und 15 min bei 45°C und 115 mbar
(±15 mbar) eingeengt. Es wird mit Wasser auf 20 ml aufgefüllt, nochmals 10 min zentri-
fugiert (4000 U/min; 2950 g) oder falls möglich ultrazentrifugiert (18 000 U/min;
37600 g) und über SCX-SPE gereinigt.

Reinigung der Probe1


Eine IST-SPE SCX (500 mg) wird mit 5 ml Methanol, 5 ml H2O und 5 ml
c(Zitronensäure)=0,1 mol/l konditioniert. Die Probe wird appliziert und wenn
möglich ohne Vakuum durchgesaugt. Nachgewaschen wird mit 5 ml H2O und 1 ml
1 Dieser Teil der Methode wird im BVET mit einem Gilson Aspec XL komplett automatisch
durchgeführt. Detaillierte Angaben sind beim Autor auf Anfrage erhältlich.

424 Mitt. Lebensm. Hyg. 93 (2002)


420-436 16.10.2002 8:15 Uhr Seite 425

Methanol. Es wird mit 5 ml 5% NH3 in Methanol eluiert2. Am Turbovap wird bei


40°C eingeengt, mit 0,5 ml Methanol/H2O (1:1) aufgenommen, gut aufgerührt,
5 min bei 1000 U/min zentrifugiert und in ein Insert Vial abgefüllt. Davon werden
5 µl in das LC-MS/MS injektiert.

Analyse mit HPLC: Bedingungen, Vorgehen und Auswertung

Bedingungen, Parameter LC-MS/MS


Gerät: Waters 2690 gekoppelt mit einem QuattroLC (Micromass)
Vorsäule: XTerra MS C18, 3  20 mm (Waters, Part. Nr. 186000656)
Säule: Stahlkartusche, 150 mm  3 mm
(Waters, Part. Nr. 186000562)
Stationäre Phase: XTerra, MS C18, 3,5 µm
Mobile Phase: A: 20% Acetonitril,
B: 80% 0,1% Ameisensäure, Gradient
Flussrate: 0,4 ml/min
Maximaldruck: 300 bar
Ofentemperatur: 25°C
Einspritzvolumen: 5 µl
Elutionsdauer gesamt: 22 min (Peaks ab ca. 5 min)
Detektor: QuattroLC Massenspektrometer, MRM-Mode3
Auswertesoftware: MassLynx
Die Parameter für die HPLC und die Massenspektrometrie sind in den Tabel-
len 4 bis 6 zusammengefasst.
Die Gasflüsse (Stickstoff und Argon) sind jeweils auf den MRM-Mode opti-
miert.
Die «Dwell-time» wurde auf 0,5 Sekunden gesetzt. Das erstgenannte Tochterion
ist jeweils das intensivere Fragment und wird für die Quantifizierung verwendet.
Für Kitasamycin, Spiramycin II und III werden je nur ein Tochterion aufgezeichnet
(Tabelle 6).

Tabelle 4
Gradient des HPLC
Zeit (min) % Acetonitril Ameisensäure (0,1%)
0–1 20 80
1–4 45 55
4–7 70 30
7–11 70 30
11–22 20 80

2 Immer frisch herstellen.


3 MRM-Mode bedeutet «Multiple Reaction Monitoring» und entspricht dem MS-MS-Modus, bei
dem die beiden Quadrupole MS1 und MS2 statisch betrieben werden.

Mitt. Lebensm. Hyg. 93 (2002) 425


420-436 16.10.2002 8:15 Uhr Seite 426

Tabelle 5
Die Tune-Parameter des LC-MS
Parameter Wert Parameter Wert
Capillary 3,25 kV Extractor 3V
RF-Lens 0,20 V Source Block Temp. 135°C
Desolv. Temp. 350°C LM Res1 12
HM Res1 12 I Energy1 0,5
Entrance 0 Exit 0
LM Res2 12 HM Res2 12
I Energy2 2 Multiplier 650

Tabelle 6
Mutterionen, Tochterionen
Macrolid Mutterionen Tochterionen Cone (V) Kollisions- Bemerkung:
energie (Ladungszustand)
Spiramycin I 422,5 174, 540,5 32 16 (M+2H)2+
Spiramycin II 443,6 174 30 16 (M+2H)2+
Spiramycin III 450,6 174 25 16 (M+2H)2+
Tilmicosin 869,7 174, 696 70 41 (M+H)+
Tilmicosin 435,6 174, 696 35 19 (M+2H)2+
Tylosin 916,6 174,2, 772,5 70 38 (M+H)+
Roxithromycin 837,5 679,5, 158,1 45 24 (M+H)+
Josamycin 828,5 174, 229 65 32 (M+H)+
Kitasamycin 772,5 174,2 70 35 (M+H)+
Erythromycin 734,5 158,2, 576,5 40 26 (M+H)+
Oleandomycin 688,4 544,3, 158,1 38 18 (M+H)+

Validierung der Methode


Die Methode wurde für 25, 50 und 100 ppb validiert. Die Resultate können der
Tabelle 7 entnommen werden.
Zu beachten ist der «positive» Matrixeffekt bei doppelt geladenen «Parent»-
Ionen von Spiramycin und Tilmicosin. Die Methode ist wegen des Matrixeffektes
empfindlicher, allerdings ist das gefundene Resultat durch den entsprechenden Fak-
tor (2,3 für Spiramycin und 3 für Tilmicosin) zu dividieren.
Aus der Abbildung 2 geht die Linearität der Standards hervor.

426 Mitt. Lebensm. Hyg. 93 (2002)


420-436 16.10.2002 8:15 Uhr Seite 427

Tabelle 7
Wiederfindungen bei dotiertem Rindfleisch
Rindfleisch: Anzahl Mittelwert Standard- Relative Mittlere
Dotierter (ppb) abweichung Standard- Wiederfindung
Gehalt (ppb) 4 (ppb) abweichung (%)
100 pbb 5 83,7 3,8 4,51 83,7
Roxithromycin
100 pbb 5 234 51 25,3 2345
Spiramycin
100 pbb 5 307 19,6 6,4 3076
Tilmicosin
100 pbb 5 83,2 2,26 2,7 83,2
Oleandomycin
100 pbb 5 61,4 4,5 7,4 61,4
Erythromycin
100 pbb 5 105,4 4,4 4,2 105,4
Tylosin
100 pbb 5 96,4 4,8 5,0 96,4
Josamycin
100 pbb 5 106,7 4,6 4,3 106,7
Kitasamycin

Substanzname: Roxithromycin
Korr. Koeffizient: r = 0.999714, r^2 = 0.999428
Kalibrationskurve: 762.6 * x + -1065.6

7.52e4

Response

-1.07e3 ppb
0,0 20,0 40,0 60,0 80,0 100,0

Abbildung 2 Kalibrierkurve von Roxithromycin zur Auswertung über internen


Standard

4
Die Validierung wurde auch bei 25 und 50 ppb wiederholt (n=5). Die Regressionskoeffizienten
sind alle >0,99 für alle MA, ausgenommen für Spiramycin mit einem Wert von 0,92.
5
Infolge der Messung von (M+2H)2+ werden zu hohe Wiederfindungen festgestellt (positiver
Matrixeffekt!). Das Resultat ist durch den Faktor 2,3 zu dividieren.
6
Infolge der Messung von (M+2H)2+ werden zu hohe Wiederfindungen festgestellt (positiver
Matrixeffekt!). Das Resultat ist durch den Faktor 3,0 zu dividieren.

Mitt. Lebensm. Hyg. 93 (2002) 427


420-436 16.10.2002 8:15 Uhr Seite 428

Nachweisgrenze/Bestimmungsgrenze/Auswertung
Die probenbezogene Bestimmungsgrenze für Spiramycin beträgt 5 ppb. Ange-
sichts des hohen Grenzwertes von 300 ppb für Spiramycin ist die Methode völlig
ausreichend. Für sämtliche anderen MA ist die Bestimmungsgrenze noch kleiner als
5 ppb.
Die Auswertung der Resultate erfolgt über den internen Standard Roxithromy-
cin. Dabei entsprechen 5 µl  0,1 ng/µl (Standard III) genau 10 ppb des entsprechen-
den MA bei 100 % Wiederfindung.7

Diskussion
Erythromycin ist ein Gemisch von verschiedenen Derivaten. Die Hauptkompo-
nente wird als Erythromycin A bezeichnet. Die Stabilität von Erythromycin
(pKS =8,8 (1)) ist vom pH-Wert und von der Temperatur abhängig (Stabilitätsopti-
mum bei pH 8,5 (1)). Im schwach sauren Bereich tritt innerhalb von Stunden Wirk-
verlust auf. Deshalb ist darauf zu achten, dass die Extraktion in verdünnter Per-
chlorsäure zügig vorangeht und die Proben nicht über Nacht stehen gelassen
werden.
Wie in (1) beschrieben, werden z. T. Salze oder Ester von Erythromycin herge-
stellt und eingesetzt, die einerseits stabiler sind und andererseits eine höhere Biover-
fügbarkeit haben. Offensichtlich hat Erythromycin eine kurze Plasmahalbwertszeit
(2 h) und es wird überwiegend in Form von Metaboliten mit der Galle ausgeschie-
den. Die vorliegende Methode kann nur Erythromycin A ohne Metaboliten nach-
weisen. (Die Metaboliten von Erythromycin sind uns z. Z. nicht zugänglich.)
Im Gegensatz zu Erythromycin ist Tilmicosin ein neueres Antibiotikum, das
hauptsächlich unverändert über die Galle und die Nieren ausgeschieden wird. Tylo-
sin wird zwar wenig metabolisiert, es sind dennoch vier verschiedene Metaboliten
bekannt. Beim Schwein wird Tylosin hauptsächlich im Kot ausgeschieden.
Spiramycin ist ein Gemisch von Spiramycin I, II und III. Gemäss Pharmakopöe
(41) sollte in jedem Tierarzneimittelprodukt mit Spiramycin mind. 80 % Spiramycin
I enthalten sein. Spiramycin wird hauptsächlich durch den Speichel und die Galle
ausgeschieden. Es reichert sich ebenfalls in der Milch an und wirkt so auf die Masti-
tiserreger.
Die MA werden wegen des apolaren Charakters mit einem Gemisch von ver-
dünnter Säure und Methanol extrahiert. Die Anreicherung erfolgt in saurem Milieu
auf einer Kationentauschersäule. Anschliessend werden die MA mit alkalischem
Methanol eluiert.

7 Umrechnungsbeispiel:
100 ppb entsprechen 100 ng Spiramycin pro Gramm Fleisch oder 500 ng Spiramycin pro
5 Gramm Fleisch. Dies entspricht nach der Aufarbeitung von 5 Gramm Fleisch einer gesamten
Flüssigkeitsmenge von 500 µl. Davon werden 5 µl direkt ins HPLC-System eingespritzt.

428 Mitt. Lebensm. Hyg. 93 (2002)


420-436 17.10.2002 11:16 Uhr Seite 429

Schaf9940Muskel1 Schaf9940Muskel1
7.24 7.56 916.6 > 174.2 6.82 869.7 > 174
100 100 176345 6.13e5
6.76
% Area
%
0
7.729.59 0
100 916.6 > 772.5
% 100 6.82 869.7 > 696
73664 3.14e5
0 Area
%
8.20 837.5 > 158.1
100 20097 0
7.05e4
% Area
0 100 6.82 435.6 > 696
1063043 4.47e6
8.20 837.5 > 679.5 Area
100 28661
%
9.01e4
% Area 0
0
100 6.82 435.6 > 174
8.52 828.5 > 229 341324
100 1.60e6
% % Area
0
0
100
8.52 828.5 > 174
11.06 100 3.88 422.5 > 540.5
% 3.19 7.62
5.38 8.42
0 %

100 7.24 772.5 > 174.2 0


%
100 422.5 > 174
0
2.56 7.62
7.56 734.5 > 158.2 %
100 8.04
% 0
0 422.5 > 522.5
100 8.42
10.38 688.4 > 544.3 3.07
100
7.56 9.79 %
% 5.16
0 Zeit 0 Zeit
0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 0,00 5,00 10,00 15,00 20,00

Abbildung 3 Positive Schafsprobe mit ca. 2000 ppb Tilmicosin


Legende:
(Bezeichnung von oben nach unten):
Tylosin, Tylosin, Roxithromycin, Tilmicosin, Tilmicosin, Tilmicosin,
Roxithromycin, Josamycin, Josamycin, Tilmicosin, Spiramycin, Spiramycin,
Kitasamycin, Erythromycin, Oleandomycin Spiramycin

Die Messung und Quantifizierung in dieser Methode geschieht über den inter-
nen Standard Roxithromycin, der bereits vor der Extraktion zugegeben wird.
Infolge des «positiven» Matrixeffektes bei doppelt geladenen Mutterionen von Spi-
ramycin und Tilmicosin sind die gefundenen Resultate mit dem jeweiligen Faktor
(2,3 bzw. 3) zu dividieren. Dieser Matrixeffekt kommt offenbar dadurch zustande,
dass doppelt geladene Mutterionen gemessen werden. Die fünf anderen MA erzie-
len eine sehr gute Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit. Einzig Troleandomy-
cin, ein weiteres MA, das in der Studie verwendet wurde, konnte aus Stabilitäts-
gründen nicht in die Methode einbezogen werden. Bereits die Standardlösung von

Mitt. Lebensm. Hyg. 93 (2002) 429


420-436 16.10.2002 8:15 Uhr Seite 430

Kalb755Muskel_2 Kalb755Muskel_2
7.36 916.6 > 174.2 869.7 > 174
100 164379 100
3.83e5 3.14 7.44
% Area %
0
0
7.53 916.6 > 772.5
100 13272 6.59 869.7 > 696
3.22e4 100 1.07 3.21 7.44
% Area
0 %
0
8.04 837.5 > 158.1
100 24467 9.18e4 3.21 7.61 450.6 > 174
% Area 100
8.62
0 %
8.04 837.5 > 679.5 0
100 39045 1.54e5
% Area 100
7.10 443.6 > 174
0
% 3.28
100 828.5 > 229 0
11.12 13.66
5.16
%
6.59 435.6 > 696
0 100
3.21
%
7.36 828.5 > 174
100 6.69 11.41 12.59
0
%
0 100 3.85 7.10 435.6 > 174
3.14
100 7.53 772.5 > 174.2 %
40273 1.32e5
% Area 0
0 5.91 422.5 > 540.5
100
6.52 8.89 734.5 > 158.2 4.35 4.85 6.59
100 %
5.84 13.86
%
0
0
100 6.93 422.5 > 174
100 688.4 > 544.3
6.69 7.77
% 4.49
%
0 Zeit 0 Zeit
0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 0,00 5,00 10,00 15,00 20,00

Abbildung 4 Positive Kalbsprobe mit 258 ppb Tylosin


Legende:
(Bezeichnung von oben nach unten):
Tylosin, Tylosin, Roxithromycin, Tilmicosin, Tilmicosin, Spiramycin III,
Roxithromycin, Josamycin, Josamycin, Spiramycin II, Tilmicosin, Tilmicosin,
Kitasamycin, Erythromycin, Oleandomycin Spiramycin, Spiramycin

Troleandomycin war bei 20°C nicht genügend stabil. Diese Instabilität (Hydrolyse)
in wässeriger Lösung wurde bereits von Chepkwony et al. beobachtet (42).
Zur zusätzlichen Bestätigung der MA (ausgenommen Kitasamycin8) wird ein
zweites Tochterion aufgenommen und die Verhältnisse in Standardlösungen ver-
glichen. Zur Überprüfung der Methode konnten zwei positive Proben analysiert

8 Kitasamycin enthält übrigens ein Fragmention von Tylosin. Dies führt im Chromatogramm zu
einem Doppelpeak. Die Unterscheidung von Kitasamycin und Tylosin ist aber problemlos über
die Retentionszeit möglich.

430 Mitt. Lebensm. Hyg. 93 (2002)


420-436 16.10.2002 8:15 Uhr Seite 431

Val1_7 Val1_7
100 7.56 916.6 > 174.2 100 6.82 869.7 > 174
46859 1.39e5 4907 1.95e4
% Area Area
%
0
0
100 7.56 916.6 > 772.5
2996 8.74e3 869.7 > 696
% 100 6.82
Area 1771 6.61e3
0 Area
%
100 8.37 837.5 > 158.1
22109 6.20e4 0
% Area
0 100 6.82 435.6 > 696
31551 1.37e5
8.37 837.5 > 679.5 Area
100 %
28744 8.85e4
% Area 0
0
6.82 435.6 > 174
100 8.53 828.5 > 229 100 10816 4.75e4
11366 3.96e4 Area
% Area %
0
0
100 8.53 828.5 > 174
60910 1.69e5 100 5.38 422.5 > 540.5
% Area 3087 6.07e3
0 Area
%

100 8.04 772.5 > 174.2 0


20617 4.24e4
% Area 5.38 422.5 > 174
100
0 5844 1.16e4
Area
7.56 734.5 > 158.2 %
100
25286 1.18e5
% Area 0
0 422.5 > 522.5
100 5.38
1115 2.04e3
100 7.40 688.4 > 544.3
14123 3.52e4 Area
%
% Area
0 Zeit 0 Zeit
0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 0,00 5,00 10,00 15,00 20,00

Abbildung 5 «Gespikte» Probe mit 50 ppb


Legende:
(Bezeichnung von oben nach unten):
Tylosin, Tylosin, Roxithromycin, Tilmicosin, Tilmicosin, Tilmicosin,
Roxithromycin, Josamycin, Josamycin, Tilmicosin, Spiramycin, Spiramycin
Kitasamycin, Erythromycin, Oleandomycin Spiramycin

werden, die zu je einem positiven Resultat führten und in der Abbildung 3 (Tilmi-
cosin) bzw. in der Abbildung 4 (Tylosin) dargestellt sind. In der Abbildung 5 ist eine
«gespikte» Probe mit 50 ppb der MA dargestellt. Die Abbildung 6 zeigt eine nega-
tive Probe mit internem Standard Roxithromycin.

Mitt. Lebensm. Hyg. 93 (2002) 431


420-436 16.10.2002 8:15 Uhr Seite 432

2002-1172 2002-1172
100 7.02 12.00 916.6 > 174.2 6.76 869.7 > 174
100 7.60
5.33 13.67 3.57
% %
0
0
100 7.53 916.6 > 772.5
10.73 7.77 869.7 > 696
%
100 3.575.40
0 %
0
100 8.21 837.5 > 158.1
18470 7.08e4 450.6 > 174
% Area 100 4.78 7.77
3.14
0 %

100 8.21 837.5 > 679.5 0


23855 9.46e4
% Area 7.43 443.6 > 174
100
0 4.78
%
100 6.35 8.89 828.5 > 229
0
%
100 6.76 435.6 > 696
0 8.11
% 8.45
100 6.85 9.84 828.5 > 174
5.33 0
%
0 5.06 435.6 > 174
100
7.09
100 772.5 > 174.2 %
7.02 8.72
% 0
0
100 4.146.08 422.5 > 540.5
8.62
100 12.20 13.87 734.5 > 158.2
8.21 %
%
0
0
422.5 > 174
7.369.25 9.75 688.4 > 544.3 100 3.36 4.21 4.71
100 5.67 12.89
% %
0 Zeit 0 Zeit
0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 0,00 5,00 10,00 15,00 20,00

Abbildung 6 Negative Schweinefleischprobe mit Int. Standard Roxithromycin


Legende:
(Bezeichnung von oben nach unten):
Tylosin, Tylosin, Roxithromycin, Tilmicosin, Tilmicosin, Spiramycin III,
Roxithromycin, Josamycin, Josamycin, Spiramycin II, Tilmicosin, Tilmicosin,
Kitasamycin, Erythromycin, Oleandomycin Spiramycin, Spiramycin

Vorläufige Resultate 2001/2002


Im Zeitraum von Oktober 2001 bis Juli 2002 wurden diverse Sendungen von
Importfleisch auf MA beprobt. Ausser einer Kalbfleischprobe mit ca. 139 ppb Spi-
ramycin III und einer Kaninchenprobe mit Spuren von Tilmicosin wurden bisher
keine Grenzwertüberschreitungen festgestellt (Tabelle 8).

432 Mitt. Lebensm. Hyg. 93 (2002)


420-436 21.10.2002 14:33 Uhr Seite 433

Tabelle 8
Importsendungen, die auf MA beprobt wurden
Proben Anzahl Proben Anzahl
Proben Proben
Schaffleisch 34 Proben Rindfleisch 38 Proben
Pferdefleisch 16 Proben Schweinefleisch 52 Proben
Kalbfleisch 6 Proben Schweineniere 19 Proben
Kaninchenfleisch 10 Proben Bisonfleisch 2 Proben
Truthahn/Ente/Huhn/Wachtel 77 Proben Gesamte Probenanzahl 254 Proben

Zusammenfassung
Es wird eine Methode zur quantitativen Bestimmung von sieben Macrolid-
Antibiotika in Fleisch, Leber und Niere von Schweinen, Rindern, Kälbern und
Hühnern beschrieben. Die Rückstände werden mit verdünnter Perchlorsäure und
Methanol aus der Matrix extrahiert und an einer starken Kationentauschersäule auf-
gereinigt. Die Analyse erfolgt mit HPLC an einer Spezialsäule (XTerra von Waters)
und mit Massenspektrometrie, Roxithromycin dient als interner Standard. Die vor-
läufigen Resultate von ca. 250 Proben aus Importsendungen werden erläutert.

Résumé
Une méthode LC-MS est présentée pour la détermination des résidus de sept
antibiotiques macrolides dans le muscle, le foie et dans le rein de porcs, de bœufs et
de poulets. Les résidus sont extraits en milieu perchlorique (dilué) et avec du métha-
nol. L’extrait est purifié sur une cartouche échangeuse de cations (SPE). L’analyse est
effectuée par LC-MS à l’aide d’une colonne spéciale (XTerra de Waters) et avec un
détecteur de spectrométrie de masse. La roxithromycine est utilisée comme stan-
dard interne. Les premiers résultats d’environ 250 échantillons sont présentés.

Summary “Quantitative Determination of Several Macrolide Antibiotics in


Meat, Liver and Kidney by LC-MS/MS after a partly Automated Clean up”
A method is presented for the quantitative determination of seven macrolide
antibiotics in meat, liver and kidney from swine, beef and chicken. Residues are
extracted from the matrix with diluted perchloric acid and methanol. Further clean
up was achieved by solid-phase extraction on a strong cation-exchanger column.
The macrolide antibiotics are analysed by LC-MS on a special column (XTerra from
Waters). Roxithromycin was used as an internal standard. The first results of about
250 imported meat samples are presented.

Key words
Macrolide antibiotics, Tylosin, Erythromycin, Spiramycin, Meat, LC-MS/MS

Mitt. Lebensm. Hyg. 93 (2002) 433


420-436 16.10.2002 8:15 Uhr Seite 434

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Korrespondenzadresse (ab 1.9.02): Dr. Dominik Guggisberg, Eidg. Forschungs-


anstalt für Milchwirtschaft, Liebefeld, CH-3003 Bern

436 Mitt. Lebensm. Hyg. 93 (2002)


437-446 21.10.2002 14:32 Uhr Seite 437

Originalarbeiten

Kontamination von Honig


mit Sulfathiazol durch Räuberei
unter Bienen
Kurt Seiler1 und Anton Kaufmann2

1 Amt für Lebensmittelkontrolle der Kantone AR, AI, GL und SH, Schaffhausen
2 Kantonales Laboratorium Zürich, Zürich

Eingegangen 23. Juli 2002, angenommen 17. September 2002

Einleitung

Sulfonamide in der Schweiz


Bis 1974 war in der Schweiz die Anwendung von antimikrobiell wirksamen
Substanzen im Kampf gegen die amerikanische Faulbrut, eine äusserst gefährliche
Bienenkrankheit, sehr liberal geregelt (1). Erreger dieser gefürchteten Bienenkrank-
heit ist das Sporen bildende Paenibacillus larvae larvae (2). Mit dem weit verbreite-
ten Einsatz antibiotisch wirksamer Substanzen, wie beispielsweise Sulfonamiden,
wurde erkannt, dass sich das unerwünschte Bakterium nicht vollständig beseitigen
lässt. Durch solche Stoffe wird nur die vegetative Form des Bakteriums abgetötet.
Sobald diese Wirkstoffe abgesetzt werden, verursachen die widerstandsfähigen Spo-
ren neue Krankheitsausbrüche (1). Nicht zuletzt aus diesem Grund sind in der EU
und in der Schweiz antimikrobiell wirksame Substanzen bei der Bekämpfung der
Faulbrut verboten. Da der Einsatz solcher Substanzen in anderen Ländern, bei-
spielsweise Amerika, nach wie vor legal blieb und Verschleppungen des Wirkstoffes
über Produkte aus dem Ausland nicht ausgeschlossen werden können, hielt das
Bundesamt für Gesundheit (BAG) eine Nulltoleranz für Schweizer Honig für nicht
realistisch und legte einen Toleranzwert für Verunreinigungen durch Sulfonamide
bei 50 µg/kg fest (3).
In der Schweiz treten heute pro Jahr ungefähr 100 Fälle von Faulbrut befallenen
Bienenvölkern auf (1). Im Seuchenfall ordnet der Kantonstierarzt die notwendigen
Massnahmen an: Befallene Völker müssen verbrannt und das verseuchte Material
muss desinfiziert oder vernichtet werden. Gleichzeitig werden die im Umkreis von

Mitt. Lebensm. Hyg. 93, 437– 446 (2002) 437


437-446 17.10.2002 8:59 Uhr Seite 438

zwei Kilometern gelegenen Bienenstände kontrolliert und überwacht (Bienen-


sperre).

Schweizweite Untersuchungskampagne
Da die Behandlung von Bienenvölkern mit antimikrobiellen Wirkstoffen verbo-
ten ist, dürften im Schweizer Honig eigentlich keine solchen Substanzen zu finden
sein. Konsumentinnen und Konsumenten stellen hohe Anforderungen an den
Schweizer Honig, den sie als reines und gesundes Naturprodukt betrachten. Ent-
sprechend vehement fallen die Reaktionen aus, wenn diese Erwartungen nicht
erfüllt werden. So wurden Konsumentinnen und Konsumenten im Jahr 2000 durch
Meldungen aufgeschreckt, wonach auch in Schweizer Honig antimikrobielle Wirk-
stoffe nachgewiesen werden konnten. In der Folge untersuchten die verschiedenen
kantonalen Laboratorien in einer koordinierten Aktion über 800 Proben Schweizer
Honig. In 6% der untersuchten Proben konnten Spuren antimikrobiell wirksamer
Stoffe, insbesondere verschiedene Verbindungen aus der Gruppe der Sulfonamide,
nachgewiesen werden (4). Bei 2,5% der untersuchten Proben wurde der durch das
BAG festgelegte Toleranzwert überschritten.
Als mögliche Gründe für die Verunreinigungen wurde die Vermischung mit aus-
ländischen Produkten sowie die illegale Behandlung der Bienen mit Antibiotika
enthaltenden Präparaten in Erwägung gezogen. Die tatsächliche Ursache der festge-
stellten Verunreinigungen dürfte in den überwiegenden Fällen in der unerlaubten
Behandlung von Bienen zu finden sein. Selbst in der jüngeren Fachliteratur findet
man Empfehlungen zum Einsatz von Sulfathiazol, wie beispielsweise in einem pra-
xisorientierten Lehrbuch aus dem Jahre 1998 (5).

Übertragung von Verunreinigungen durch Futterraub


In der vorliegenden Arbeit zeigen wir auf, dass auch ein Eintrag durch Räuberei
bei behandelten Bienenvölkern zu unbeabsichtigten und grossen Verunreinigungen
führen kann. Mittels Räuberei versuchen die Bienen nicht nur die Nektarquellen
der Natur, sondern auch Honig- oder weitere Futtervorräte von anderen Bienenvöl-
kern als Nahrungsquelle zu nutzen. Nebst der leicht erkennbaren intensiven Räu-
berei existiert eine ständige stille Räuberei, die der Aufmerksamkeit der Imker in
aller Regel entgeht (6). Bis vor 20 Jahren war man der Auffassung, dass die Wäch-
terbienen fremde Artgenossen nicht in den Bienenstock lassen. Mit dem Ausbruch
der Varroatose und deren schnellen Ausbreitung in Europa erkannte man, dass Bie-
nen einen regen Kontakt untereinander haben (6, 7). K. Wallner von der Universität
Hohenheim in Stuttgart konnte mittels Fütterungsversuchen mit gefärbtem Zucker-
wasser einen solchen Austausch nachweisen (6). Obwohl Räuberei unter Bienen in
vielen Lehrbüchern erwähnt wird, sind in der Literatur keine detaillierten Studien
beschrieben. In der vorliegenden Arbeit berichten wir über eine Verfrachtung des
Sulfonamids Sulfathiazol, die am besten mit Räuberei unter den Bienenvölkern
erklärt werden kann.

438 Mitt. Lebensm. Hyg. 93 (2002)


437-446 17.10.2002 8:59 Uhr Seite 439

Untersuchungen

Entdeckung einer Kontamination bei Imker A


Zusammen mit anderen kantonalen Laboratorien hat das Amt für Lebensmittel-
kontrolle der Kantone AR, AI, GL und SH im Sommer 2000 in seinem Vollzugs-
gebiet stichprobenweise Honigproben erhoben und vom Kantonalen Laboratorium
Zürich auf Rückstände von antimikrobiell wirksamen Substanzen untersuchen las-
sen. Bei einem Total von 25 Honigproben konnte einzig in einer Probe des Imkers
A eine solche Verunreinigung festgestellt werden. Es handelte sich dabei um das
bereits erwähnte Chemotherapeutikum Sulfathiazol. Seine Konzentration lag mit
130 µg/kg deutlich über dem Toleranzwert von 50 µg/kg. Zur Abklärung der Ursa-
che dieser Verunreinigung wurde eine Inspektion vor Ort durchgeführt, bei welcher
weitere drei Honigproben erhoben und untersucht wurden. Auch in diesen Proben
konnten Spuren von Sulfathiazol gefunden werden. Während die Werte für den
Honig der 1999er Ernte 130 und 44 µg/kg betrugen, lagen sie für die beiden Proben
der 2000er Ernte mit 25 und 6 µg/kg klar unterhalb des Toleranzwertes. Diese
Ergebnisse wiesen somit auf eine deutliche Verbesserung der Situation hin. Bei den
vier untersuchten Honigen handelte es sich um Mischproben der beiden Stände A-1
und A-2 (siehe Abb. 1). Um die Quelle des Sulfathiazols näher eingrenzen zu kön-
nen, wurden zusätzlich die Futterwaben der beiden Stände untersucht. Gemäss
Aussage des Imkers A wurden die Waben zwischen den Bienenständen nie ausge-
tauscht. Während im Honig aus dem Bienenstand A-2 eine hohe Sulfathiazolkon-
zentration (2100 µg/kg) nachgewiesen werden konnte, war der Honig des Bienen-
standes A-1 praktisch frei von solchen Verunreinigungen. Der Eintrag der
unerwünschten Komponente musste demnach über den Bienenstand A-2 erfolgt
sein. Trotz Inspektion und trotz den chemischen Analysen konnte die eigentliche
Ursache für die Verunreinigungen nicht gefunden werden und dem Imker A konnte
keine illegale Bienenbehandlung nachgewiesen werden. Hätte der Imker A tatsäch-
lich Sufathiazol eingesetzt, beispielsweise prophylaktisch zum Schutz seiner Bie-
nen, dann hätte er dies wohl am ehesten im Bienenstand A-1 getan. Denn im Jahre
1999 wurde im Bienenstand des Imkers I Faulbrut festgestellt und der Bienenstand
A-1 liegt näher bei diesem als der Stand A-2. Weitere Faulbrutfälle waren in den
letzten Jahren in dieser Region nicht zu verzeichnen.

Entdeckung einer Kontamination bei Imker B


Einige Monate später, im Herbst 2000, erhielt das Amt für Lebensmittelkon-
trolle der Kantone AR, AI, GL und SH Kenntnis von einer weiteren Honigkonta-
mination in dieser Region. Wiederum handelte es sich um Sulfathiazol, doch dies-
mal war der Imker B betroffen (siehe Abb. 1). Die gefundene Konzentration lag mit
5330 µg/kg um mehr als den Faktor 100 über dem Toleranzwert von 50 µg/kg.
Umgehend wurde der sich noch an Lager befindliche Honig beschlagnahmt und
weitere Proben von verschiedenen Chargen erhoben. In allen Honigproben konn-

Mitt. Lebensm. Hyg. 93 (2002) 439


437-446 17.10.2002 8:59 Uhr Seite 440

1 km

B-1

B-2 C

H F

A-1
I

D B-3
A-2
E

Abbildung 1 Standorte der 20 beprobten Bienenstände in der beschriebenen


Region. Die Entfernung der Bienenstände C, D und A-2 von den
Bienenständen B-2 und B-3 des Imkers B beträgt weniger als 400 m
(Kreise mit Radius von 400 m sind eingezeichnet)
Bienenstände: Quellen der Verunreinigungen Mit verunrei-
nigtem Honig Ohne nachweisbare Verunreinigungen im Honig

ten grosse Mengen von Sulfathiazol nachgewiesen werden. Die Konzentrationen


lagen im Bereich von 1750 bis 22000 µg/kg. Auch im Honig aus den Futterwaben
der Bienenstände B-1, B-2 und B-3 konnten grosse Mengen von Sulfathiazol festge-
stellt werden. Die höchste nachgewiesene Konzentration lag bei 45 000 µg/kg, was
einer 900fachen Überschreitung des Toleranzwerts entspricht. Dieser Wert liegt
zudem deutlich über den höchsten bisher gefundenen Werten (1,6).

440 Mitt. Lebensm. Hyg. 93 (2002)


437-446 17.10.2002 8:59 Uhr Seite 441

Flächendeckende Probenahmen
Aufgrund der positiven Befunde bei zwei Imkern aus derselben Region wurde
vermutet, dass noch mehr Honig kontaminiert sein könnte. Um das Ausmass der
Kontaminationen abzuklären, wurden auch die restlichen 15 Bienenstände dieser
Region beprobt. Sofern vorhanden, wurde Honig nicht nur der Ernte 2000, sondern
auch der Ernte 1999 analysiert. Tatsächlich konnten in Honigproben aus fünf weite-
ren Bienenständen Spuren von Sulfathiazol nachgewiesen werden und somit waren
10 der total 20 Stände von Verunreinigungen betroffen. In Honigproben aus sechs
Bienenständen der Imker A, B, C und D lagen die Konzentrationen über dem
Toleranzwert von 50 µg/kg. Im Honig der Imker E und F lagen die höchsten gemes-
senen Konzentrationen oberhalb von 10 und im Honig der Imker G und H zwi-
schen 5 und 10 µg/kg. Im Honig der übrigen Imker waren keine Verunreinigungen
über 5 µg/kg nachweisbar (siehe Tabelle 1).
Anhand der Abbildung 1 ist die geographische Verteilung der Sulfathiazol-
verunreinigungen auf die verschiedenen Bienenstände erkennbar. Die Kontamina-
tionsschwerpunkte liegen um die Stände B-1, B-2 und B-3. Mit zunehmendem
Abstand von diesen drei Bienenständen nehmen die gefundenen Sulfathiazolkon-
zentrationen deutlich ab. Hohe Konzentrationen waren im Honig der Stände A-2,
C und D nachweisbar, die alle weniger als 400 m von den Bienenständen des Imkers
B enfernt liegen. Im Honig aus entfernteren Bienenständen (über 1,5 km) konnte
kein Sulfathiazol mehr nachgewiesen werden.
Für diese flächendeckende Erfassung der Bienenstände wurden rund 50 Honig-
proben untersucht. Die aussagekräftige Gesamtdarstellung darf allerdings nicht
darüber hinwegtäuschen, dass die gemessenen Sulfathiazolkonzentrationen für die

Tabelle 1
Höchste gemessene Sulfathiazolrückstände in Honig für die 20 beprobten Bienen-
stände
Höchste gemessene Bienenstände Bemerkungen
Konzentrationen
in µg/kg
45000 B-1, B-2, B-3 Quellen der Sulfathiazol-
Verunreinigungen
2100 A-2 Die Bienenstände liegen weniger
2000 C als 400 m von den Bienenständen
6700 D des Imkers B entfernt
42 E
12 F
8 G
7 H
<5 Alle übrigen Die Bienenstände liegen mehr als
Bienenstände 700 m von den Bienenständen des
Imkers B entfernt

Mitt. Lebensm. Hyg. 93 (2002) 441


437-446 17.10.2002 8:59 Uhr Seite 442

einzelnen Bienenstände grosse Unterschiede aufwiesen. Die wenigen untersuchten


Proben pro Bienenstand sind zweifelsohne nicht repräsentativ, denn für jedes Bie-
nenvolk, für jede Wabe, für jede Schleuderung und jede Ernte sind andere Werte zu
erwarten. Eine exakte Erfassung der Gesamtkontamination hätte ein Mehrfaches an
Probenuntersuchungen bedingt. Für einen groben Überblick gibt die Zusammen-
stellung der jeweils höchsten gefundenen Konzentrationen allerdings ein ausrei-
chend präzises Bild. Die Standorte der 20 beprobten Bienenstände wurden seit 1999
nie gewechselt.
Sowohl in Honigproben der Ernte 1999, als auch in solchen des Jahres 2000
konnten hohe Konzentrationen dieser unerwünschten Komponente nachgewiesen
werden. Es ist daher davon auszugehen, dass dieser Wirkstoff nicht nur im Jahre
2000, sondern bereits im Jahre 1999 und eventuell auch schon früher zum Einsatz
gelangt ist.

Massnahmen zur Beseitigung der Kontaminationen


Mittels Verfügung von Massnahmen wurde gewährleistet, dass ab sofort kein
Honig mit mehr als 50 µg/kg Sulfathiazol an die Konsumentinnen und Konsumen-
ten abgegeben wurde. Zudem wurden die Imker verpflichtet, ihren Honig der Ernte
2001 im Rahmen der Selbstkontrolle vor dem Verkauf untersuchen zu lassen.
Die Imker mit Toleranzwertüberschreitungen (Imker A, B, C und D) mussten
in ihren Bienenständen eine Reihe von Massnahmen zur Beseitigung der Verun-
reinigungen ergreifen. So mussten sie die kontaminierten Waben entsorgen sowie
die Bienenkasten sauber auskratzen und reinigen. Auch sämtliche Gerätschaften
mussten sie sorgfältig reinigen. Die Entsorgung der Waben war nötig, weil beim
Schleudern stets ein dünner Honigfilm auf der Wachsoberfläche zurückbleibt, der
die nächste Honigernte kontaminieren würde. Bei Konzentrationen, die um ein
Mehrfaches über dem Toleranzwert liegen, sind solch einschneidende Massnahmen
zweifelsohne gerechtfertigt. Um erneute Kontaminationen zu vermeiden, wurde
darauf geachtet, dass alle Imker die Massnahmen in einem engen Zeitraum durch-
führten. Lediglich im Falle des Bienenstandes B-2 ergab sich aufgrund der Unein-
sichtigkeit des Besitzers eine zeitliche Verzögerung.
Im Sommer 2001 wiesen die ersten im Rahmen der Selbstkontrolle gemessenen
Untersuchungswerte auf eine deutliche Verbesserung der Kontaminationssituation
hin. Im Herbst 2001 konnte diese positive Entwicklung mittels Nachkontrollen
bestätigt werden. Die verfügten Massnahmen hatten die gewünschte Wirkung
erzielt, denn es mussten keine Toleranzwertüberschreitungen mehr festgestellt wer-
den. Sulfathiazol konnte nur noch in einer einzigen Honigprobe des Imkers C nach-
gewiesen werden. Die Konzentration lag knapp unterhalb des Toleranzwertes von
50 µg/kg. Da der Stand C selbst sehr sorgfältig gereinigt worden war, muss die Ver-
unreinigung von ausserhalb eingetragen worden sein. Es ist davon auszugehen, dass
die Bienen des Standes C durch Räuberei im zu spät gereinigten Bienenstand B-2
den kontaminierten Honig erneut in den gereinigten Bienenstand C getragen haben.

442 Mitt. Lebensm. Hyg. 93 (2002)


437-446 17.10.2002 8:59 Uhr Seite 443

Dieser Vorfall zeigt, wie wichtig es ist, dass alle Sanierungsmassnahmen gleichzeitig
durchgeführt werden.
Die Ergebnisse der Nachkontrollen zeigen auch, dass im Jahre 2001 kein Sulfa-
thiazol mehr eingesetzt worden ist.

Analytik
Die meisten Proben wurden am Kantonalen Laboratorium Zürich mit einem
flüssigchromatographischen Verfahren und einem Tandem-Massenspektrometer als
Detektor analysiert (LC/MS-MS). Mit der Methode werden 20 verschiedene, anti-
mikrobielle Wirkstoffe erfasst, einschliesslich die beiden Sulfonamide Sulfathiazol
und Sulfadimidin sowie verschiedene Tetracycline. Sulfathiazol liegt im Honig nicht
nur in freier Form, sondern auch in kovalenter Bindung mit Zucker vor. Mittels
vorgängiger Hydrolyse wurde das gebundene Sulfathiazol freigesetzt und somit die
Gesamtkonzentration erfasst. Das eingesetzte Analyseverfahren ist kürzlich von
Kaufmann et al. (8) ausführlich beschrieben worden.

Diskussion und Schlussfolgerungen


Offensichtlich ist in den drei Bienenständen B-1, B-2 und B-3 zur antimikro-
biellen Behandlung der Bienen Sulfathiazol eingesetzt worden. Die Bienen der
Nachbarstände haben durch Räuberei einen Teil des mit Sulfathiazol versetzten
Futters oder des kontaminierten Honigs aus diesen drei hoch belasteten Bienenstän-
den in ihren eigenen Stock und somit in ihren Honig eingetragen. Der Futteraus-
tausch unter Bienen ist besonders intensiv bei einer hohen Dichte der Bienenvölker,
wie sie in der beschriebenen Gegend gegeben ist.
Selbst für eine hohe Kontamination müssen die Bienen keine riesigen Futter-
mengen in den eigenen Stock eintragen (6), wie folgende einfache Rechnung zeigen
soll: Ein Bienenvolk mit einem jährlichen Honigertrag von ca. 20 kg muss lediglich
22 g des mit 45 mg/kg belasteten Honigs in den eigenen Stock eintragen, um eine
Kontamination in der Höhe des Toleranzwertes von 50 µg/kg zu verursachen.
Im Jahre 1999 wurde im Bienenstand I der letzte Faulbrutfall festgestellt und
gemeldet. Die ganze Gegend wurde zum Sperrgebiet erklärt. Es ist durchaus denk-
bar und plausibel, dass der verdächtigte Imker B Angst vor einem Übergreifen der
Krankheit auf seine Völker hatte und seine Bienen prophylaktisch mit Sulfathiazol
zu schützen versuchte.
Selbstverständlich ist auch ein Eintrag aus der Landwirtschaft grundsätzlich
denkbar. Denn Sulfathiazol wurde bis vor kurzem als Tierarzneimittel eingesetzt
und gelangte so mit dem Kot und dem Urin der Tiere auf die Felder. Die geographi-
sche Konzentrationsverteilung von Sulfathiazol spricht hier allerdings klar gegen
einen solchen Eintrag. Auch die Höhe der gefundenen Konzentrationen ist mit
einem Eintrag aus der Landwirtschaft nicht erklärbar. Zudem gelangt Sulfadimidin
viel häufiger zur Anwendung als Sulfathiazol, und entsprechend häufiger können

Mitt. Lebensm. Hyg. 93 (2002) 443


437-446 17.10.2002 8:59 Uhr Seite 444

Rückstände von Sulfadimidin in Urinproben nachgewiesen werden (9). In keiner


der untersuchten Honigproben konnte jedoch Sulfadimidin nachgewiesen werden.
Gemäss Bundesamt für Gesundheit geht man bereits ab einer Konzentration
von 50 µg/kg von einem missbräuchlichen Einsatz von Sulfathiazol aus (4). Die hier
präsentierten Konzentrationsverteilungen zeigen, dass hohe Konzentrationen auch
durch den Eintrag von Futter aus behandelten Nachbarständen möglich sind. Für
die Vollzugsbehörde ergibt sich die wichtige Erkenntnis, dass die Quelle der Verun-
reinigung und somit der primäre Einsatzort der antimikrobiellen Substanz nur
lokalisiert werden kann, wenn auch die Kontamination des Honigs aus den umlie-
genden Bienenständen bekannt ist. Wenn auch auf tieferem Konzentrationsniveau,
so ist doch mit analogen Verteilmechanismen zu rechnen, wenn Streptomycin bei
der Bekämpfung von Feuerbrand eingesetzt wird.
Die beschriebene Ausbreitung einer Substanz macht die grosse gegenseitige
Abhängigkeit von benachbarten Imkern deutlich. Im vorliegenden Fall hat das
Fehlverhalten eines einzigen Imkers zu relevanten Kontaminationen in mindestens
sieben weiteren Bienenständen geführt.

Nachtrag
Der vorliegende Fall ist leider noch nicht abgeschlossen, da der Imker B nicht
geständig ist und das Strafverfahren noch einige Zeit beanspruchen dürfte. Die Fol-
gekosten des illegalen Sulfathiazoleinsatzes betragen einige 10 000 Franken und dür-
fen als beträchlich bezeichnet werden. Nebst der Entsorgung von ein paar 100 kg
Honig, den Materialkosten wie beispielsweise für neue Mittelwände, dem Arbeits-
aufwand für das Reinigen der Bienenkasten, fallen auch die Analysekosten und die
Kosten für die detaillierten Abklärungen vor Ort ins Gewicht. Zudem wurden die
Bienenvölker durch die verfügten Reinigungsmassnahmen empfindlich geschwächt,
was Mindererträge zur Folge hatte. Nicht zu vergessen ist der Imageschaden für das
Naturprodukt Honig.

Dank
Wir danken Herrn Dr. Klaus Wallner von der Landesanstalt für Bienenkunde
der Universität Hohenheim sowie Herrn Dr. Stefan Bogdanov vom Schweizeri-
schen Zentrum für Bienenforschung der Forschungsanstalt für Milchwirtschaft in
Liebefeld für die wertvolle fachliche Unterstützung bei der Interpretation der
Ergebnisse. Florian Erzinger danken wir für die sorgfältige Durchsicht des Manus-
kriptes. Besonders danken wir den beteiligten Lebensmittelinspektoren, dem
Lebensmittelkontrolleur und dem Bieneninspektor sowie dem Kantonstierarzt für
die aktive Mithilfe bei der Abklärung des beschriebenen Falles.

Zusammenfassung
Im Vollzugsgebiet des Amts für Lebensmittelkontrolle der Kantone AR, AI, GL
und SH konnten in Honigproben zweier Imker Rückstände der antimikrobiell

444 Mitt. Lebensm. Hyg. 93 (2002)


437-446 17.10.2002 8:59 Uhr Seite 445

wirksamen Substanz Sulfathiazol nachgewiesen werden. Um die Ursachen abzuklä-


ren, wurden sämtliche Bienenstände dieser Region beprobt und auf derartige Ver-
unreinigungen untersucht. Bei 10 der insgesamt 20 Bienenstände konnten im Honig
Spuren dieses Wirkstoffes nachgewiesen werden. Aufgrund der Analyseergebnisse
konnte die Quelle dieser Kontaminationen bei drei Bienenständen eines Imkers
identifiziert werden. Die höchste gemessene Konzentration lag mit 45 mg pro kg
Honig um das 900fache über dem Schweizer Toleranzwert. Es kann angenommen
werden, dass der Honig durch Räuberei unter den Bienen von diesen drei Standor-
ten in weitere sieben Bienenstöcke getragen worden ist. Um weitere Kontaminatio-
nen zu vermeiden, wurden verschiedene Massnahmen verfügt, u.a. die Entsorgung
von kontaminierten Waben. Diese haben die gewünschte Wirkung gezeigt, denn im
Rahmen der Nachkontrolle konnte Sulfathiazol nur noch in einem einzigen Honig
unterhalb des Toleranzwertes nachgewiesen werden. Der durch den illegalen Ein-
satz von Sulfathiazol erzeugte Schaden von mehreren 10 000 Franken kann als
beträchtlich bezeichnet werden.

Résumé
Dans le périmètre de contrôle du Laboratoire cantonal des cantons AR, AI, GL
et SH, des échantillons de miel, provenant de deux apiculteurs, contenaient des rési-
dus de la substance antibiotique sulfathiazole. Afin de déterminer l’origine de ces
contaminations, des échantillons de miel ont été prélevés dans vingt ruches de cette
région. Dans dix de ces ruches nous avons décelé des résidus de sulfathiazole. Au vu
des résultats d’analyse la source de ces contaminations a pu être localisée dans trois
ruches de l’un des apiculteurs. La concentration maximale mesurée dans ces ruches
était de 45 mg de sulfathiazole par kg de miel, soit 900 fois la valeur tolérée en
Suisse. Il est probable que le miel de ces trois ruches a été pillé par les abeilles et
transporté dans les sept autres ruches. Pour éviter d’autres contaminations une série
de mesures a été décidée, entre autre l’élimination des rayons contaminés. Les mesu-
res prises ont eu les effets escomptés. Lors d’un contrôle ultérieur la sulfathiazole
n’a été décelée que dans un seul échantillon, et à une concentration inférieure à la
valeur de tolérance. Le dommage causé par l’emploi illégal de sulfathiazole, estimé à
plusieurs dizaines de milliers de francs, peut être considéré comme important.

Summary “Contamination of Honey with Sulfathiazole by Robbing


of Bees”
The official food control authority of AR, AI, GL and SH has found residues of
the antibacterial drug sulfathiazole in honey samples of two bee-keepers from the
same area. Subsequently, honey samples in all twenty apiaries in this area were taken
and analysed. Sulfathiazole was detected in honey samples from ten out of the
twenty examined apiaries. The source of the contaminations was located in three
apiaries belonging to the same bee-keeper. The highest measured concentration was
45 mg/kg honey, which surpasses the Swiss maximum residue level by a factor of

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437-446 17.10.2002 8:59 Uhr Seite 446

900. The bees must have carried the contaminated honey from these three apiaries
into seven neighbouring ones. Consequently, several measures have been disposed,
including destruction of honeycombs. The examination of honeys harvested during
the next bee season showed a significant improvement, since small amounts were
detected in only one honey sample. The damage caused by the illegal application of
sulfathiazole is estimated to be several 10000 Swiss francs.

Key words
Sulfonamide, Sulfathiazole, Honey, Contamination, Robbing, Bee

Literatur
1 Bogdanov, S. und Fluri, P.: Honigqualität und Antibiotikarückstände. Schweizerische
Bienen-Ztg 123, 407– 410 (2000).
2 Chantawannakul, P. and Dancer, B.N.: American foulbrood in honey bees. Bee world 82,
168–180 (2001).
3 Bundesamt für Gesundheit: Sulfonamid-Rückstände in Schweizer Honig. Informations-
schreiben Nr. 54 vom 26. Mai 2000.
4 Bundesamt für Gesundheit: Sulfonamid- und Antibiotikarückstände in Honig. Schweizer
Honig nur wenig belastet. Medienmitteilung vom 20. Oktober 2000.
5 Nowottnick, K.: Krankheiten und Schädlinge der Biene, Diagnose-Behandlung-Vorbeugende
Massnahmen. Leopold Stocker Verlag, Graz, Stuttgart 1998.
6 Wallner, K.: Sulfathiazol-Einsatz zur Faulbrutbekämpfung bringt nur Probleme. Allgemeine
Deutsche Imkerzeitung (ADIZ), Heft Nr. 3, 7– 8 (2002).
7 Ritter, W.: Diagnostik und Bekämpfung der Bienenkrankheiten. Gustav Fischer Verlag, Jena,
Stuttgart 1996.
8 Kaufmann, A., Roth, S., Ryser, B. and Widmer, M.: Quantitative LC/MS-MS determination
of sulfonamides and some other antibiotics in honey. J. AOAC 85, 853 – 860 (2002).
9 Jahresbericht des Kantonalen Laboratoriums Zürich 2000, Seite 113–117.

Korrespondenzadresse: Dr. Kurt Seiler, Amt für Lebensmittelkontrolle der Kan-


tone AR, AI, GL und SH, Postfach, CH-8201 Schaffhausen

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Original Papers

Determination of Preservatives
in Finger Paints with HPLC
Urs Hauri, Beat Lütolf, Michael Wagmann and Christopher Hohl,
Kantonales Laboratorium Basel-Stadt, Basel

Received 23 July 2002, accepted 5 August 2002

Introduction
Finger paints allow children to draw without having to use a paint brush.
Besides water as solvent, ingredients such as binding agents, extenders, humectants,
surfactants, colourants, embittering agents and preservatives are used in commercial
products. Water based finger paints must have preservatives in order to avoid
microbiological spoilage. Some of these are known allergens and therefore legal
restrictions, similiar to those applied for cosmetics, are under way to regulate their
use (1). As far as we know, there is only one paper discussing the determination of
preservatives, namely formaldehyde, in finger paints (2). We therefore present our
two HPLC methods which together allow for the determination of 42 preserva-
tives. The first method is used for the determination of 40 uv-absorbing, mostly
aromatic compounds such as parabenes, aromatic alcohols and halogenated aromat-
ics. The second method is used especially for the determination of two polar iso-
thiazolinone compounds, which are applied in far lower concentrations.

Methods

Materials and instruments


Table-top centrifuge, Hereaus Primo (BGB, Anwil); sonicator, Branson 3510
(Merck, Zürich); 0.45 µm nylon filter for HPLC, Titan (Schmidlin, Neuheim); vor-
tex (Bender & Hobein, Basel); quaternary gradient HPLC system consisting of: low
pressure mixing quaternary gradient pump (P4000, narrow bore configuration),
autosampler (AS 3000), photo diode array detector (UV 6000LP fitted with 2 µl
10 mm flowcell) and data station (Chromquest) all from Thermo Finnigan,
Allschwil; column for method 1: Phenomenex Luna, phenyl-hexyl, 3 µm, 100 
4.6 mm; guard column: Phenomenex phenyl-propyl; column for isothiazolinones:

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Phenomenex Prodigy ODS-3, 3 µm, 100  4.0 mm; guard column: Phenomenex
C18, all from Brechbühler, Schlieren.

Reagents
Formic acid, 98–100%, e.g. Merck 100264; methanol for HPLC gradient grade,
e.g. SDS 09337G16; acetonitrile for HPLC gradient grade, e.g. Lichrosolv, Merck
00030; tetrahydrofuran for HPLC., e.g. Merck (08101); demin. water for HPLC.

Reference materials for method 1


Reference materials for method 1 are subdivided into A: those preservatives
which are allowed in finger paints (1), B: preservatives, which are used in cosmetics
but are not on the positive list for finger paints (3) and C: preservatives, which are
either explicitly forbidden in cosmetics (4) or are not used in cosmetics and are not
on the positive list (3).

A
1. benzoic acid, 99.9% (Merck 135) CAS-Nr. 65-85-0,
2. methyl benzoate, ≥99% (Merck 106059) CAS-Nr. 93-58-3,
3. ethyl benzoate, ≥99% (Fluka 12360) CAS-Nr. 93-89-0,
4. propyl benzoate, 99% (Aldrich 30, 700-9) CAS-Nr. 2315-68-6,
5. butyl benzoate, ≥98% (Fluka 12410) CAS-Nr. 136-60-7,
6. sorbic acid, ≥99.0% (Merck 100662) CAS-Nr. 110-44-1,
7. 2-phenylphenol, >98% (Fluka 54890) CAS-Nr. 90-43-7,
8. 4-hydroxybenzoic acid, 99% (Fluka 54630) CAS-Nr. 99-96-7,
9. 4-hydroxy-methyl benzoate, ≥98% (Fluka 54750) CAS-Nr. 99-76-3,
10. 4-hydroxy-ethyl benzoate, ≥99% (Fluka 54660) CAS-Nr. 120-47-8,
11. 4-hydroxy-n-propyl benzoate, ≥99% (Fluka 54790) CAS-Nr. 94-13-3,
12. 4-hydroxy-n-butyl benzoate, ≥99% (Fluka 54680) CAS-Nr. 94-26-8,
13. 4-hydroxy-isopropyl benzoate, ≥98% (Avocado 13930) CAS-Nr. 4191-73-5
14. 4-hydroxy-isobutyl benzoate, (K&K 202548) CAS-Nr. 4247-02-3,
15. 4-hydroxy-benzyl benzoate, ≥98% (Fluka 54670) CAS-Nr. 94-18-8,
16. dehydroacetic acid, 98% (Aldrich D290-0) CAS-Nr. 520-45-6,
17. 2,4-dichlorobenzyl alcohol, 99% (Aldrich 14,666-8) CAS-Nr. 1777-82-8,
18. triclocarban, 99% (Aldrich 10,593-7) CAS-Nr. 101-20-2,
19. 4-chloro-3,5-xylenol, 99.5% (Sigma C-4394) CAS-Nr. 88-04-0,
20. 2-phenoxyethanol, ≥98% (Fluka 77699) CAS-Nr. 122-99-6,
21. climbazole, 99.7% (Riedel-de Haën 45401) CAS-Nr. 38083-17-9,
22. benzyl alcohol, >97% (Merck 981) CAS-Nr. 100-51-6,
23. bromochlorophene, 98% (Merck 3281) CAS-15435-29-7,
24. 3-methyl-4-isopropyl phenol, 99% (Aldrich 31,643) CAS-Nr. 3228-02-2,
25. chlorophene, 98% (Chem Service PS-170) CAS-Nr. 120-32-1
26. chlorophenesine, 99% (Avocado 17386) CAS-Nr. 104-29-0

448 Mitt. Lebensm. Hyg. 93 (2002)


447-458 17.10.2002 9:01 Uhr Seite 449

B
27. 1-phenoxy-2-propanol, ≥93% (Aldrich 48,442-3) CAS-Nr. 770-35-4
28. 4-chloro-m-cresol, ≥98% (Fluka 24940) CAS-Nr. 35421-08-0
29. triclosan, ≥99% (Ciba SC) CAS-Nr. 3380-34-5
30. phenol, 99.5% (Merck 206) CAS-Nr. 108-95-2
31. salicylic acid, ≥99% (Fluka 84210) CAS-Nr. 69-72-7
32. phenyl salicylate ≥98.0% (Fluka 84340) CAS-Nr. 118-55-8
33. dichlorophene, ≥98% (Riedel-de Haën 35992) CAS-Nr. 97-23-4
34. chloramine-T tri hydrate, ≥99% (Merck 102426) CAS-Nr. 127-65-1

C
35. hexachlorophene, 99% (Aldrich 23,458-3) CAS-Nr. 70-30-4
36. 2-n-octyl-4-isothiazolin-3-one, 45–48% (Kathon 893F, Christ Chemie)
CAS-Nr. 26530-20-1
37. 4,5-dichloro-2-octyl-3(2H)-isothiazolone, 99% (Kathon 287T, Christ Chemie)
CAS-Nr. 64359-81-5
38. 1,2-benzisothiazolone, 100% (Acima) CAS-Nr. 2634-33-5
39. 4-Chloro-2-isopropyl-5-methylphenol, 99% (Lancaster) CAS-Nr. 89-68-9
40. Methyl salicylate, ≥99% (Fluka) CAS 119-36-8

Reference materials for method 2 (Isothiazolinones):


41. 2-Methyl-4-isothiazolin-3-one (MI), >98% (Sigma M-6045)
CAS-Nr. 26172-54-3
42. 5-chloro-2-methyl-4-isothiazolin-3-one (MCI), 1.1% (Fluka 00344 or Kathon
CG, Christ Chemie) CAS-Nr. 26172-55-4 (note: MCI is only available as a
mixture with MI)

Procedures

Extractant for method-1 preservatives: 1% methanolic formic acid


Fill 500 ml methanol in a 1000 ml flask. Add 10 ml of formic acid, shake and
dilute to 1000 ml with methanol.

Extractant for MI and MCI: 1% aqueous formic acid


Dilute 10 ml of formic acid to 1000 ml with water.

Calibration solutions for HPLC

Stock solutions for method 1 preservatives


Note: For routine analysis it is convenient to calibrate with the most often
found preservatives only. Prepare 20 ml solutions of 100 mg of compounds 1, 6,

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8–15, 26 and 29 and 200 mg of compounds 20 and 22 in methanol. Solutions can be


stored in a refrigerator for at least one month.

Stock solution for MI/MCI


Weigh 600 mg of a MI/MCI mixture with a certified content in a flask and dilute
to 10 ml with methanol (600 mg of mixture contains 0.375% MI and 1.15% MI).

Calibration solutions for method 1 preservatives


Pipette 1 ml of each stock solution into the same flask and dilute to 20 ml with
0.1% methanolic formic acid (calibration solution (CS) 1: 2.5 µg/10 µl). Dilute 5 ml
of CS 1 to 10 ml (CS 2: 1.25 µg/10 µl), 5 ml to 20 ml (CS 3: 0.625 µg/10 µl), 1 ml CS
1 to 10 ml (CS 4: 0.25 µg/10 µl) and 1 ml to 20 ml (CS 5: 0.125 µg/10 µl) with
methanolic formic acid. Solutions can be stored at 4°C for at least one week.

Calibration solution for MI/MCI


Pipette 1 ml of stock solution into a flask and dilute to 20 ml with 0.1 % aqueous
formic acid (dilution A). Pipette 1 ml of dilution 1 into a flask and dilute as
described above (dilution B). Pipette 1 ml of dilution B into a flask and dilute to
10 ml (dilution C). Calibrate with 5 µl dilution C (0.2 ng MI, 0.7 ng MCI), 10 µl
dilution C (0.5 ng MI, 1.5 ng MCI), 20 µl dilution C (0.9 ng MI, 3 ng MCI), 5 µl
dilution B (2 ng MI, 7 ng MCI), 10 µl dilution B (4 ng MI, 14 ng MCI), 20 µl dilu-
tion B (8 ng MI, 28 ng MCI) and 50 µl dilution B (20 ng MI, 70 ng MCI). (Note:
exact amounts depend on weighed-in quantity.)

HPLC parameters and eluants

Method 1 preservatives
Temperature: 40°C, flow rate: 1.3 ml/min, ternary gradient: see gradient time
table (table 1), run time: 38 min, sample injection volume: 10 µl, detection wave-

Table 1
Gradient time table for method 1 preservatives
Min MeCN 0.1% HCOOH MeOH/THF*
0 10% 85 % 5%
7 10% 85 % 5%
15 20% 70 % 10 %
23.3 35% 55 % 10 %
28 67% 23 % 10 %
31 85% 5% 10 %
34.1 85% 5% 10 %
34.2 10% 85 % 5%
38 10% 85 % 5%
* Mixture of 1 volume part methanol with one volume part THF

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length: 230, 260 and 300 nm, rate: 10 Hz, bandwidth: 11 nm, DAD: wavelength
range: 220–360 nm, rate: 1 Hz, resolution 1 nm, bandwidth 1 nm, measuring time:
35 min. Note: wash column with approximately 30 ml acetonitrile after each series
of samples.

MCI, MI
Temperature: 35°C, flow rate: 1.0 ml/min, run time: 14 min, sample injection
volume: 20 µl, detection wavelength: 280 nm, rate: 10 Hz, bandwidth: 11 nm, rise
time: 0.2 sec. DAD: wavelength range: 220–360 nm, resolution: 1 nm, bandwidth:
1 nm, rate: 1 Hz, binary gradient system 0.2 % aqueous formic acid, methanol
(table 2).

Table 2
Gradient time table for MCI/MI
Min Methanol 0.2% HCOOH
0 5% 95%
9 55% 45 %
9.1 90% 10 %
11.6 90% 10 %
11.7 5% 95 %
17 5% 95 %

Sample preparation

Method 1 preservatives
Weigh 1 g of sample in a 50 ml stoppered Erlenmeyer flask. Add 20 ml 1%
methanolic formic acid. Put stopper on flask and shake thoroughly on a vor-
tex. Place for 15 min in an ultra-sonic bath. Centrifuge suspension for 5 min at
4000 rpm. Filter a 2 ml aliquot of the supernatant through a 0.45 µm filter disc. This
solution is ready for injection.

MCI/MI
Weigh 1 g of sample in a 50 ml stoppered Erlenmeyer flask. Add 20 ml 1% aque-
ous formic acid. Put stopper on flask and shake thoroughly on a vortex. Place for
15 min in an ultra-sonic bath. Centrifuge suspension for 5 min at 4000 rpm. Filter a
2 ml aliquot of the supernatant through a 0.45 µm filter disc. This solution is ready
for injection.

Evaluation of chromatograms
Calculate peak areas at 230 nm (compounds 1–5, 17, 19, 21, 23 –26, 28, 33, 35 and
39), 260 nm (6, 8 –15, 18, 20, 22, 27, 29 –30 and 36 – 37) and 300 nm (7, 16, 31– 32, 38
and 40) for method 1 and at 280 nm for method 2. Peak height calculation gives

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more accurate results if an interference by a close eluting component occurs. Detec-


tion wavelength can be optimized if interferences occur. Peaks are assigned accord-
ing to retention time and UV spectrum.

Quality control
In case of positive samples, identification should be verified and recovery rates
determined by repeating the procedure with a sample aliquot spiked with the pre-
sumed preservative. Individual calibration curves or calibration factors must be
established for every compound found.

Results and Discussion


We originally developed similar methods for the determination of preservatives
in cosmetics with the aim of being capable of separating about 40 compounds of
interest in one HPLC run. This allowed for a very effective supervision of the legal
limits of preservatives and their correct declaration and meant a great progess com-
pared to our older method (5), which was rather time consuming and lacked the res-
olution power necessary for this task. As separation problems are rather smaller in
fingerpaints and only slight modifications were necessary, we could rely heavily on
our experience with cosmetic samples.

Method 1
Preliminary testing of stationary phases showed that phenyl-hexyl columns had
the highest selectivity with acceptable peak shapes, so method 1 development was
further pursued on this phase.
Work with hundreds of cosmetic samples showed us that of over 40 possible uv-
active preservatives, only about a dozen are actually used. We therefore concen-
trated our effort mainly on the separation and quantitation of these substances, the
difficult part being the separation of the often found polar preservatives 1, 6, 8, 9, 16,
20, 22, 27. Further difficulties with the compounds 30, 31 and 38 which we never
found in cosmetics also had to be met.
With the exception of long chained parabenes, apolar compounds were only
occasionally found. Achieving a high peak resolution at high retention times there-
fore wasn’t that important for a reliable identification.
For a method 1 separation on a routine basis, a run time of 40 minutes proved to
be sufficient (fig. 1). Even though not all peaks are baseline resolved, samples con-
taining a problematic combination of preservatives are only rarely encountered. A
serious coelution problem only exists fo 4-chloro-3,5-xylenol and 3-methyl-4-iso-
propyl phenol. Both which we never found in our samples. We therefore think it
highly improbable that this combination would be encountered in the commodities
mentioned. Selectivity wasn’t a problem for fingerpaint samples.
With all the advantages a ternary (pseudo quaternary) gradient has concerning
resolution, method transfer from one HPLC instrument to another sometimes has

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Figure 1 Method 1: Chromatogram at spectrum maximum of a reference solution


containing all preservatives except chloramin-T (34). Coelution of
4-chloro-3,5-xylenol (19) and 3-methyl-4-isopropyl-phenol (24)

to be done with a slight adaption of the gradient. This procedure is necessary when
variations in eluant mixing, resulting in small differences on the composition of the
mobile phase, influence the retention times of polar compounds.
With the first method, aromatic preservatives can be detected even in the lower
mg/kg range. The highest limit of detection (LOD) was observed for benzylic alco-
hol with about 40 mg/kg. Almost all the other preservatives had considerably lower
LODs lying in the range of 0.5 to 5 mg/kg. As we know from our analyses of cos-
metics, application concentrations of most of the preservatives are in the upper
mg/kg and g/kg range. The limit of quantitation is therefore established by the low-
est concentration used for calibration. Calculated for a 1 g sample, range of quanti-
tation is between 0.025% (rsp. 0.05% for compounds 20 and 22) and 0.5% (rsp.
1%). According to prEN 71-7 (1), the lowest legal limits for method 1 preservatives
in fingerpaints are 0.1% (Bromochlorophene and 3-methyl-4-isopropyl phenol)
and 1% (benzylic alcohol and phenoxyethanol).
This demonstrates that the method is on one hand suitable for supervising limits
and on the other hand sensitive enough to detect illegal respectively unallowed
preservatives such as hexachlorophene, benzisothiazolone, 2-n-octyl-4-isothia-
zolin-3-one or 4,5-dichloro-2-octyl-3(2H)-isothiazolone.
The method was used in an interlaboratory test by four laboratories on two
fingerpaint samples. Sample one contained about 0.3% 4-chloro-m-cresol (fig. 2),

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Figure 2 Method 1: Chromatogram at 260 nm of a finger paint sample containing


0.26 % 4-chloro-m-cresol

Figure 3 Method 1: Chromatogram at 260 nm of a finger paint sample containing


0.2 % 4-hydroxy-n-propyl-benzoate and 0.1 % 4-hydroxy-ethyl-benzoate.
Traces of 4-hydroxy-benzoic acid and benzylic alcohol are visible

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sample two contained about 0.2% 4-hydroxy-ethyl benzoate and about 0.1%
4-hydroxy-n-propyl benzoate (fig. 3). Interlaboratory relative standard deviation
for 4-chloro-m-cresol and 4-hydroxy-ethyl benzoate was 6% and for 4-hydroxy-
n-propyl benzoate 0.6%.

Method 2
Compared to the method 1 preservatives the two isothiazolinones MCI and MI
show some special characteristics which led to a modification of the first method:
The legal limit for the sum of MCI and MI being 15 mg/kg, quantitation must be
performed in much lower concentrations. In addition, MI as a rather polar compo-
nent shows little retention at method 1 conditions. A determination with method 1
would therefore only be possible if no interfering compounds were present. Experi-
ence with several dozens of analysed samples shows that this is unfortunately not
the case. The problem was solved by using aqueous instead of methanolic formic
acid as extractant and by changing column, eluant and injection volume (fig. 4). Cal-
culated for a 1 g sample the limit of detection for both MI and MCI is better than
0.1 mg/kg and the limit of quantitation is 0.3 mg/kg for MI and 0.8 mg/kg for MCI.
The method is therefore sensitive enough for supervising the legal limit of 15 mg/kg
for the sum of MI and MCI. As with method 1, we didn’t encounter selectivity
problems with the 29 samples of the market survey. The identity of MCI and MI can
easily be established by comparison of retention times, uv spectra and by cochro-

Figure 4 Method 2: Reference solution containing 2 ng MI and 7 ng MCI

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mAU

Minutes

Figure 5 Method 2: Chromatogram of a finger paint sample containing 6 mg/kg


MI and 8 mg/kg MCI

matograms of spiked samples. The method was used in an interlaboratory test by


three laboratories on two fingerpaint samples. Samples were analysed twice by each
laboratory. Sample one contained about 9 mg/kg MI and 4 mg/kg MCI, sample two
contained about 7 mg/kg MI and 9 mg/kg MCI. Interlaboratory relative standard
deviation for both samples was 9 and 11% for MI, respectively 10 and 5% for MCI.
When determining MCI one has to take into account the reactivity and instability of
this compound. Degradation of MCI is highly dependent on the other components
of the matrix. Different colours of the same finger paint set can therefore have dif-
ferent concentrations of MCI at the time of analysis. Both methods are also suitable
for determining benzisothiazolone, which currently isn’t allowed as a preservative
in finger paints.
The two methods were used in 2000 in a market survey on 29 finger paints out
of five sets sold on the Swiss market. Each set contained between four and six dif-
ferent colours. Three sets contained a mixture of MCI and MI. One colour had a
concentration of 30 mg/kg (sum MCI, MI) which is twice the permitted limit. Six
colours of one set contained 4-chloro-m-cresol in concentrations of about 0.26%.
This preservative is not on the positive list and therefore not allowed. One set con-
tained a mixture of 0.2% 4-hydroxy-ethyl benzoate and 0.1% 4-hydroxy-n-propyl
benzoate. Using another HPLC method with an electro-chemical detector, we also
found bronopol in one set. In interpreting the results of the survey one has to take

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into account, that prEN 71-7 was (and still is) a provisional document. As our
results for MCI/MI and 4-chloro-m-cresol show, the definitive norm will certainly
have an impact on the use of preservatives in finger paints.

Acknowledgements
We would like to thank the following laboratories for participating in the round
robin tests: Clariant (Schweiz) AG, Qualitätskontrolle/Chromatographie, Muttenz;
Kantonales Laboratorium Zürich; Laboratoire cantonal vaudois, Epalinges.

Summary
Two HPLC methods for the determination of 42 preservatives in finger paints
are presented. With the first method mostly aromatic compounds such as parabenes,
aromatic alcohols and halogenated aromatics are first extracted with methanolic
formic acid and then separated and detected on a quaternary gradient HPLC-DAD-
system using a phenyl-hexyl column. The second method is used for the determina-
tion of polar isothiazolinones which are extracted with aqueous formic acid and
separated on a third generation C18 column. Both methods were used in interlabo-
ratory tests and in a market survey and proved to be suitable for supervising future
legal restrictions.

Zusammenfassung
Es werden zwei HPLC-Methoden für die Bestimmung von insgesamt 42 Kon-
servierungsmitteln in Fingerfarben vorgestellt. Mit der ersten Methode werden
meist aromatische Verbindungen wie Parabene, aromatische Alkohole und haloge-
nierte Aromaten zuerst mit methanolischer Ameisensäure extrahiert und dann auf
einem HPLC-DAD mit quaternärem Gradientensystem und Phenyl-hexyl-Säule
aufgetrennt und detektiert. Die zweite Methode wird speziell für die Bestimmung
polarer Isothiazolinone gebraucht. Diese werden mit wässeriger Ameisensäure
extrahiert und dann auf einer C18-Säule der dritten Generation aufgetrennt. Beide
Methoden wurden für Ringversuche und eine Marktübersicht gebraucht und erwie-
sen sich als geeignet für die Überwachung zukünftiger gesetzlicher Beschrän-
kungen.

Résumé
Les deux méthodes présentées permettent de déterminer 42 agents conservateurs
dans des peintures à doigts. Avec la première méthode, les substances aromatiques
comme les parabènes, les alcools aromatiques et des aromatiques halogénés sont
d’abord extraits avec de l’acide formique dans du méthanol puis séparés et détectés
par HPLC-DAD sur une colonne de phényl-hexyl. La deuxième méthode est utili-
sée pour la détermination des isothiazolinones polaires. L’extraction se fait avec de
l’acide formique dilué. La séparation est exécutée sur une colonne C18 de la troi-
sième génération. Les deux méthodes ont été contrôlées par des tests interlabora-

Mitt. Lebensm. Hyg. 93 (2002) 457


447-458 17.10.2002 9:02 Uhr Seite 458

toires et ont été appliquées pour un contrôle du marché. Elles se sont avérées être
des méthodes utilisables pour vérifier le respect des exigences légales.

Key words
Preservatives, Finger paints, Toys, HPLC

References
1 CEN European Standard prEN 71-7 (June 2001) Safety of toys – Part 7: Finger paints –
Requirements and test methods. European Committee for Standardization. Brussels, Bel-
gium
2 Garrigós, M.C., Reche, F. and Jiménez, A.: Potentially toxic colorant precursors and preserv-
atives used in finger-paints. Bull. Environ. Contam. Toxicol. 66, 557– 562 (2001).
3 Verordnung über kosmetische Mittel (VKos), vom 26. Juni 1995 (Stand am 7. März 2000),
Anhang 2
4 Verordnung über kosmetische Mittel (VKos), vom 26. Juni 1995 (Stand am 7. März 2000),
Anhang 3
5 Bürgi, Ch. und Otz, T.: Bestimmung von Konservierungsstoffen in Duschmitteln und
Schaumbädern. Mitt. Gebiete Lebensm. Hyg. 83, 492 – 508 (1992).

Corresponding author: Kantonales Laboratorium Basel-Stadt, Dr. Urs Hauri,


Postfach, CH-4012 Basel, E-mail: urs.hauri@kl.bs.ch

458 Mitt. Lebensm. Hyg. 93 (2002)


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Travaux originaux

Dosage des acides gras trans et


linoléique conjugués dans la matière
grasse du lait par chromatographie
gaz-liquide :
Comparaison des méthodes et étude
de la variation des teneurs en
fonction des saisons et de l’altitude
Marius Collomb, Patrick Malke, Monika Spahni, Ueli Bütikofer et Robert Sieber
Station fédérale de recherches laitières (FAM), Liebefeld, CH-3003 Berne

Reçu le 13 août 2002, accepté le 8 septembre 2002

Introduction
La matière grasse (MG) laitière contient de nombreux acides gras trans (AGT)
qui sont formés dans le rumen de la vache par biohydrogénation bactérienne des
acides polyinsaturés de la MG des fourrages (1). Une méthode de dosage de la com-
position en acides gras de la matière grasse laitière développée à la FAM permet de
doser plus de 25 AGT (2). Ces AGT ont suscité un grand intérêt auprès des spécia-
listes en nutrition dans les années 90 depuis la parution d’un travail de Willett et al.
(3). Dans cette étude (Nurses’ Health Study) dans laquelle 69 181 femmes ont été
prises en compte durant huit ans, la consommation en AGT a pu être corrélée signi-
ficativement avec les maladies cardiovasculaires chez 431 femmes. Cependant, ces
corrélations ne concernaient pas les graisses animales dans lesquelles l’acide trans-
vaccénique (C18: 1 t11) est prédominant mais les graisses végétales hydrogénées
dans lesquelles l’acide trans-élaïdique (C18: 1 t9) est présent en concentration très
élevée. Une autre étude de ce groupe a d’ailleurs démontré plus tard que les AGT
d’origine animale n’étaient pas corrélés avec une augmentation des risques cardio-
vasculaires (4). Un grand nombre d’autres influences des AGT sur le métabolisme
comme une élévation du taux de lipoprotéines LDL (Low Density Lipoproteine)
dans le sérum du sang ou une augmentation du besoin en acides gras essentiels fut
observé (5). Ces effets sont la raison pour laquelle la FDA (Food and Drug Admi-

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459-480 17.10.2002 9:02 Uhr Seite 460

nistration) (6) a récemment proposé que les teneurs en AGT soient dorénavant indi-
quées dans les valeurs nutritives des aliments consommés aux Etats-Unis.
Parmi les AGT de la MG laitière, les acides linoléiques conjugués (CLA=
Conjugated Linoleic Acids) tels que les isomères C18 : 2 -cis (c) 9 trans (t)11, -t11
c13, -t9c11, -t9t11, -c10t12, -t10c12, -t10t12 ont été beaucoup étudiés ces dernières
années. L’acide octadécadiénoïque c9t11 ou acide ruménique représente à lui seul
plus du 82% des CLA de la MG laitière (7). Il se forme par action de la bactérie
Butyrivibrio fibrisolvens (8) du rumen de la vache sur les acides gras polyinsaturés
du fourrage ainsi que de manière endogène par action de la cis 9 désaturase (9) sur
l’acide trans-vaccénique dans les tissus de l’homme (10) et des animaux (11). Ces
CLA trans ont entre autres des propriétés antiathérogènes et surtout anticancéri-
gènes ches les animaux (11–13). C’est surtout le cas pour l’acide ruménique, consi-
déré comme le composant le plus efficace contre le cancer, en particulier du cancer
du sein. Les teneurs en CLA de la MG du lait peuvent être influencées par l’affoura-
gement des vaches, notamment la ration (14), l’addition d’huiles comestibles (14,
15–17) ou de graines de colza ou de soja (18). D’autres facteurs déterminants sont la
race des vaches (19), l’âge de l’animal (14), la saison (2, 20, 21) et l’altitude (22).
Le dosage des AGT est habituellement effectué par chromatographie gaz-
liquide (GLC) des esters méthyliques obtenus par transestérification de la MG lai-
tière. Les isomères trans C18: 1 (23) doivent d’abord être séparés des isomères cis
par chromatographie sur couche mince imprégnée de nitrate d’argent selon la
méthode IUPAC 2.208 (24) adaptée par Ulberth et Henninger (25) ou par Molken-
tin et Precht (23). Les esters méthyliques des isomères trans C18 : 2 peuvent être
dosés directement sans séparation préalable sur couche mince argentée selon les
méthodes de Precht et Molkentin (26) ou Collomb et Bühler (2). La méthode GLC
la plus performante pour le dosage des CLA est celle selon Precht et Molkentin (27)
qui permet de doser 11 CLA ou mélanges de CLA, dont la plupart ne sont malheu-
reusement pas été identifiés.
Le but du présent travail consiste à doser les teneurs en AGT et en CLA par
GLC dans des MG laitières d’hiver de plaine et d’été provenant de diverses altitudes
par chromatographie gaz liquide selon trois méthodes complémentaires et à compa-
rer les résultats obtenus.

Partie expérimentale

Provenance des échantillons de MG analysés


Quarante échantillons de MG laitière ont été analysés. Dix échantillons sont des
MG produites en hiver. Il s’agit de 10 beurres (de choix et de petit lait) provenant de
cinq grandes centrales beurrières suisses. Les trente autres échantillons ont été pro-
duits en été. Ils proviennent de lait mélange provenant de 3 altitudes différentes
(10 laits produits en plaine à une altitude se situant entre 600 et 650 m, 10 laits pro-
duits en zone montagnarde à une altitude se situant entre 900 et 1210 m et 10 laits

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459-480 17.10.2002 9:02 Uhr Seite 461

produits en zone subalpine à une altitude se situant entre 1275 et 2120 m). Ces
30 laits ont été prélevés dans le cadre d’un projet étudiant les relations existantes
entre la composition botanique des pâtures et celle de la matière grasse laitière à
différents étages de végétation (28–31). Le nombre de vaches prises en compte était
de 45–50 en plaine, quatre à six troupeaux de 10 à 30 vaches en montagne et 57 à
88 vaches à l’étage subalpin.

Méthodes de dosage des acides gras trans et des CLA


Les esters méthyliques des AGT et des CLA ont été dosés par chromatographie
gaz-liquide selon trois méthodes différentes:
a) selon la méthode générale à haute performance selon Collomb et Bühler (2)
avec laquelle une isolation des AGT sur couche mince argentée est omise
(GC direct). Elle permet de doser tous les AGT C18:2 de la MG laitière
(C18: 2 –t9t12; -(c9t13+t8c12); -(c9t12 +-t8c13) et -(t11c15 +t9c12)), les
AGT C18: 1 les plus représentatifs (trans 4, 5, 6 +7+8, 9, 10 +11, 12) ainsi que
les CLA principaux (C18: 2 -(c9t11+c,t/t,c 7,9 +8,10)1 ; -(c9c11 +t11,13) et
-t9t11)).
b) selon la méthode proposée par Molkentin et Precht (23) avec un programme
de température du four lent (27) qui permet de doser tous les AGT C18 : 1
(trans 4, 5, 6+7+8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 et 16) après isolation des isomères
trans sur couche mince argentée (AgTLC-GC (TLC=thin layer chromato-
graphy))2.
c) selon Precht et Molkentin (27) (GC direct) qui permet de doser 11 CLA ou
mélanges de CLA.
Remarque: Pour le calcul des teneurs en AGT selon b) et des CLA selon c), une
méthode générale telle que celle selon a) est nécessaire afin de quantifier le ou les
acides gras choisis comme standards internes.

Réactifs
Les réactifs correspondent à ceux indiqués dans les publications des trois
méthodes de dosage employées (2, 23, 27).

Appareillage
Etuve thermostatée, environ 50°C. Balance de précision, résolution 1 mg.
Plaques de gel de silice 60 en verre, 20  20 cm avec indicateur de fluorescence, épais-

1
Par GC direct, l’acide ruménique ne peut être séparé des isomères 7, 9 et 8, 10. Par mesure de
simplification et en accord avec un principe généralement appliqué dans la chimie des MG, on
n’indiquera que l’isomère principal (C18:2 c9t11) dans la suite de ce travail.
2
Un programme de température du four rapide, non utilisé dans cette étude, permet de séparer les
AGT C18:1 4, 5, 6 +7+8, 9, 10, 11, 12, 13 +14, 15 et 16 de manière convenable en 55 min. Cepen-
dant, on peut avoir des problèmes d’intégration pour les AGT C18:1 t10 et t11 dont les pics
chromatographiques ne sont pas entièrement séparés l’un de l’autre.

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seur de couche: 0,25 mm, (p. ex. Merck, Darmstadt), Linomat III (Camag, Mut-
tenz). Tubes à essai de 10 ml avec fermetures à vis, munis de septa en téflon. Fioles
de 2 ml pour passeur d’échantillons, p. ex. Crimp top vial 2-CV et bouchons pour
fioles, p. ex. Crimp cap 11-AC-TST 1 (Infochroma, Zoug). Micro-pipettes Capilet-
tor 5 et 10 µl (Boehringer Mannheim, Rotkreuz). La même colonne a été utilisée
pour les différentes méthodes employées: colonne capillaire Chrompack CP-Sil 88,
100 m, 0,25 mm d.i., épaisseur de film 0,20 µm, domaine de température: 50 – 240°C,
minimum 300000 plateaux théoriques, no art. 7489 (P.H. Stehelin & Cie AG, Bâle).
Précolonne: Methyl deactivated non polar, longueur 20 cm, 0,53 mm d. i., Art. no
8009 (P.H. Stehelin & Cie AG, Bâle). Chromatographe en phase gazeuse HP 6890
avec détecteur FID, passeur d’échantillons HP 7673 et logiciel d’évaluation des don-
nées HP 3365 Chem Station Upgrade (Hewlett Packard, Urdorf).

Préparation des esters méthyliques d’acides gras


La matière grasse est extraite des produits laitiers selon une norme FIL qui pro-
pose des techniques d’extraction rapides (32). La transestérification des graisses en
esters méthyliques d’acides gras est effectuée par une solution de KOH dans le
méthanol selon la norme FIL (33) en concordance avec Collomb et Bühler (2).

Séparation des AGT C18 :1 sur couche mince argentée


Cette séparation correspond à celle utilisée par Molkentin et Precht (23) avec
diverses modifications. C’est pourquoi l’ensemble du processus est décrit ci-après.
Les plaques de gel de silice sont d’abord immergées dans une solution aqueuse
de 5 g par 100 ml de nitrate d’argent pendant env. 30 min, séchées à env. 35°C dans
une étuve, activées à 120°C pendant 30 min et laissées refroidir à température
ambiante (ces plaques doivent être utilisées dans un espace maximal d’une heure).
70 µl d’une solution de 0,5 g de MG transesterifiée dans 5 ml d’hexane obtenus selon
Collomb et Bühler (2) sont appliqués sous forme de fines bandes de 5 mm de largeur
(laisser libre un espace de 1,5 cm par côté) à l’aide du Linomat III. Les AGT sont
élués par une solution d’heptane: éther diéthylique 90 : 10 (v/v) (env. 1 h). Les
plaques séchés à l’air dans un endroit sombre sont ensuite vaporisées par une solu-
tion de 0,2 g de 2,7-dichlorofluorescéine dans 100 ml d’isopropanol. Les AGT sont
visualisés sous lumière UV à 366 nm (trois bandes sont visibles, du haut vers le bas
de la plaque de gel de silice : AG saturés, trans puis cis), la bande centrale corres-
pondante aux AGT est marquée au crayon, raclée et extraite 3 fois par 5 ml d’éther
diéthylique, suivie chaque fois par une centrifugation rapide de 2 min à env. 500 g.
Les extraits combinés sont évaporés à sec à l’aide d’un flux d’azote, le résidu est
encore extrait quatre fois avec 250 µl d’éther diéthylique. Les extraits éthérés sont
introduits dans le flacon d’injection, évaporés à sec et redissous par 80 µl d’heptane.
Après fermeture et agitation, on injecte 1,0 µl de la solution (seringue de 5 µl).

462 Mitt. Lebensm. Hyg. 93 (2002)


459-480 17.10.2002 9:02 Uhr Seite 463

Conditions chromatographiques
Comme les conditions chromatographiques peuvent légèrement différer de
celles données dans les méthodes, elle sont indiquées ci-dessous.

Pour le dosage des AGT par GC direct selon Collomb et Bühler (2)
Gaz porteur : hydrogène. Pression constante à l’entrée de la colonne : 160 kPa
(1,5 ml/min, 31 cm/s). Injecteur on column, mode track oven (la température est
toujours 3°C plus élevée que la température du four). Détecteur FID, 255°C. Pro-
gramme de température : 60°C, 5 min, rampe de 14°C/min jusqu’à 165°C, 1 min. à
165°C, rampe de 2°C jusqu’à 225°C, 17 min à 225°C. Temps total : 60 min. Volume
injecté : 0,5 µl (seringue de 5 µl).

Pour le dosage des AGT C18:1 par AgTLC-GC selon Molkentin et Precht (23)
Gaz porteur : hydrogène. Pression constante à l’entrée de la colonne : 200 kPa
(1,6 ml/min, 34 cm/s). Injecteur : 255°C, mode split 100 : 1. Détecteur : FID,
280°C. Température du four : 120°C, isotherme. Temps total : 270 min. Volume
injecté : 1,0 µl (seringue de 5 µl).

Pour le dosage des CLA par GC direct selon Precht et Molkentin (27)
Gaz porteur : hydrogène. Pression constante à l’entrée de la colonne : 160 kPa
(1,1 ml/min, 27 cm/s). Injecteur 255°C, mode split 100 : 1. Détecteur FID, 255°C.
Programme de température : 125°C, 0 min, rampe de 1°C/min jusqu’à 240°C.
Temps total : 115 min. Volume injecté : 1,0 µl (seringue de 5 µl).

Calcul de la composition en AGT et en CLA


Le calcul des résultats obtenus selon Collomb et Bühler (2) (en g par 100 g de
MG ; standard interne : acide nonanoïque) est donné dans la publication y relative.
Les concentrations en AGT C18: 1 selon Molkentin et Precht (23) et celles des
CLA selon Precht et Molkentin (27) sont respectivement calculées par rapport aux
concentrations en AGT C18: 1 t10 et t11 et en AGT C18 : 2 c9t11 obtenues selon
Collomb et Bühler (2) :
A(AGTi)
c(AGTi)=c(AGTis) 
A(AGTis)
c(AGTi) = concentration de l’AGT i à doser en g/100 g de MG
c(AGTis) = concentration de l’AGT utilisé comme standard interne obtenue selon
Collomb et Bühler (2)
A(AGTi) = surface du pic chromatographique de l’AGT i à doser
A(AGTis) = surface du pic chromatographique de l’AGT utilisé comme standard
interne

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Précision des trois méthodes employées (2, 23, 27)


La répétabilité (r) a été déterminée à partir des 40 MG laitières analysées à
double (80 pesées). Elle a été calculée avec la formule suivante :


m
di2
i=1
Sr= 2m

r = 2,83  Sr
Sr = écart-type de la répétabilité
di = différences entre les déterminations à double
m = nombre de déterminations à double
r = répétabilité

Analyses statistiques
L’analyse de variance et les comparaisons par paire des valeurs moyennes avec
le test Fisher LSD ont été exécutées avec le programme Systat pour Windows, ver-
sion 9,0.

Résultats et discussion
La figure 1 présente le chromatogramme partiel des AGT C18 : 1 et C18 : 2
obtenu selon Collomb et Bühler (2), la figure 2 celui des AGT C18 : 1 selon Molken-
tin et Precht (23) obtenu avec un programme de température lent, la figure 3 le chro-
matogramme partiel des CLA obtenu selon Collomb et Bühler (2) et la figure 4 celui
des CLA selon Precht et Molkentin (27).
Dans la méthode générale selon Collomb et Bühler (2), les AGT C18 : 2 (fig. 1)
peuvent être déterminés sans recouvrement avec des isomères cis. Il en est de même
pour les AGT C18: 1 t 4 à t12. Par contre, le pic des AGT C18 : 1 t13 –14 apparaît à
un temps de rétention identique à celui des acides gras C18 : 1 c6 +7 +8, celui de
l’AGT C18 : 1 t15 à celui de l’acide oléique (C18 : 1 c9) présent en concentration éle-
vée dans la MG laitière et celui de l’AGT C18:1 t16 à celui de l’AGT C18 : 1 c14.
Seule la méthode de dosage des AGT C18: 1 selon Molkentin et Precht (23) (fig. 2)
permet un dosage correct de tous les AGT C18 : 1 avec en plus une séparation des
isomères C18: 1 t10 et t11 non séparés selon la méthode de Collomb et Bühler (2).
Le tableau 1 présente les valeurs de répétabilité pour les AGT C18 : 1 et C18 : 2
obtenues selon la méthode de Collomb et Bühler (2) comparée à celles analysées
pour les AGT C18: 1 selon Molkentin et Precht (23) et le tableau 2 celles pour les
CLA obtenues selon la méthode de Precht et Molkentin (27).

464 Mitt. Lebensm. Hyg. 93 (2002)


459-480
17.10.2002

(23)
//
//

200
C18:1 trans 4

et Bühler (2)
31
C18:1 trans 5 C18

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9:03 Uhr

C18:1 trans 4
C18:1 trans 6+7+8

210
C18:1 trans 9 C18:1 trans 5
C18:1 trans 10
C18:1 trans 6-8
C18:1 trans 9

32
C18:1 trans 11
C18:1 trans 10-11
C18:1 trans 12

220
C18:1 trans 12 C18:1 trans 13-14 + cis 6-8
Seite 465

C18:1 trans 13 C18:1 cis 11 C18:1 cis 9


C18:1 trans 14
C18:1 cis 12
C18:1 cis 13

230
33
C18:1 cis 14 + trans 16
C19
C18:1 trans 15

Temps de rétention (min)


C18:2 -trans, trans-NMID

Temps de rétention (min)


C18:2 trans 9, trans 12

240
C18:2 cis 9, trans 13 + (trans 8, cis 12)
34

C18:2 cis 9, trans 12 + (cis, cis-MID + trans 8, cis 13)

250
C18:2 trans 11, cis 15 + trans 9, cis 12

C18:2 cis 9, cis 12


C18:2 cis 9, cis 15
35

C18:1 trans 16

260
//

//

465
grasse du lait obtenu à l’aide de la méthode selon Molkentin et Precht
tière grasse du lait obtenu à l’aide de la méthode générale selon Collomb

Figure 2 Chromatogramme partiel des acides gras trans C18:1 de la matière


Figure 1 Chromatogramme partiel des acides gras trans C18:1 et C18:2 de la ma-
459-480 17.10.2002 9:03 Uhr Seite 466

C18:2 cis 9, trans 11


C18:3 cis 9, cis 12, cis 15

C18:2 trans 11, cis 13 + cis 9, cis 11

C18:2 trans 9, trans 11

C20:2 cis, cis (n-6)

C22
// //
37 37.5 38 38.5 39 39.5
Temps de rétention (min)

Figure 3 Chromatogramme partiel des acides gras linoléique conjugués (CLA) de


la matière grasse du lait obtenu à l’aide de la méthode générale selon
Collomb et Bühler (2)
C18:2 cis 9, trans 11

C18:2 cis 9, cis 11

C18:2 trans 9, trans 11 + CLA 5


CLA 4
C18:2 trans 9, cis 11

C18:2 trans 10, cis 12

CLA 2 + 3
CLA 1

CLA 6
C21

CLA 7 + 8

CLA 9

// //
64 65 66 67 68 69 70
Temps de rétention (min)

Figure 4 Chromatogramme partiel des acides gras linoléique conjugués (CLA) de


la matière grasse du lait obtenu à l’aide de la méthode selon Precht et
Molkentin (27)

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La différence absolue entre deux résultats distincts obtenue par le même opéra-
teur avec le même appareillage sur la même graisse de lait dans un court laps de
temps ne doit pas dépasser les valeurs de r tabulées pour un intervalle de confiance
de 95%. La norme ISO 15885 (34) spécifie que la différence entre deux détermina-
tions pour des constituants présents à des concentrations supérieures à 5 g/100 g ne
doit pas être supérieur à 5% relatif avec un maximum de 1 g/100 g en absolu. Pour
des acides gras présents à des concentrations se situant entre 1 et 5 g/100 g, cette dif-
férence ne doit pas excéder 12% relatif avec un maximum de 0,5 g/100 g en absolu.
Nos résultats se situent largement dans le cadre de ces exigences.

Tableau 1
Répétabilité r des teneurs en AGT de la MG laitière selon deux méthodes de
dosage (40 paires d’échantillons; g d’acides par 100 g de graisse de lait)
Acide gras trans Méthode selon
Collomb et Bühler (2) Molkentin et Precht (23)
C14:1 t 0,002 n. d.
C16:1 t 0,011 n. d.
C17:1 t 0,006 n. d.
C18:1 t4 0,006 0,025
C18:1 t5 0,003 0,024
C18:1 t (6+7+8) 0,048 0,076
C18:1 t9 0,070 0,087
C18:1 t10 n. d. 0,067
C18:1 t11 n. d. 0,158
C18:1 t10+11 0,134 n. d.
C18:1 t12 0,026 0,044
C18:1 t13 n. d. 0,083
C18:1 t14 n. d. 0,074
C18:1 t (13+14)+c(6+7+8) 0,044 n. d.
C18:1 t15 n. d. 0,049
C18:1 t16 n. d. 0,097
C18:1 (t16+c14) 0,028 n. d.
C20:1 t 0,009 n. d.
C18:2 ttNMID 0,021 n. d.
C18:2 t9t12 0,008 n. d.
C18:2 c9t13+t8c12 0,024 n. d.
C18:2 c9t12+t8c13 0,027 n. d.
C18:2 t11c15+t9c12 0,021 n. d.
C18:2 c9t11 0,055 n. d.
C18:2 t11 c13 +c9c11 0,013 n. d.
C18:2 t9t11 0,010 n. d.
∑ C18:1 trans 0,2181 0,4042
∑ trans sans CLA trans 0,281 n. d.
∑ CLA trans 3 0,055 n. d.
∑ C18:2 trans sans CLA trans 0,092 n. d.
Légendes : AGT= acides gras trans ; MG = matière grasse ; t = trans ; c = cis ; CLA = Conjugated linoleic acid ;
ttNMID = trans, trans non methylene interrupted diene ;
1 ∑C18:1 t4 à t16 + c14 ; 2 ∑C18:1 t4 à t16 ; 3 ∑ C18:2 c9t11, (t11c13 + c9c11) + t9t11 ; n. d. = non déterminé.

Mitt. Lebensm. Hyg. 93 (2002) 467


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Tableau 2
Répétabilité r des teneurs en CLA de la MG laitière selon Precht et Molkentin (27)
(40 paires d’échantillons ; g d’acides par 100 g de graisse de lait)
Acides gras trans Répétabilité r
C18:2 c9t11 0,055
C18:2 t9c11 0,002
C18:2 t10c12 0,001
C18:2 c9c11 (CLA cis) 0,004
CLA n. i. 1 0,003
CLA n. i. 2 + 3 0,004
CLA n. i. 4 0,003
CLA t9t11 + CLA n. i. 5 0,002
CLA n. i. 6 0,004
CLA n. i. 7 + 8 0,003
CLA n. i. 9 0,001
∑ CLA cis et trans 0,068
∑ CLA trans connus1 0,055
Légendes: voir tableau 1; 1 ∑ C18:2 c9t11 + t9c11 + t10c12 ; n. i. = non identifié.

Composition en acides gras trans des MG laitières analysées


Le tableau 3 donne les teneurs moyennes, les écart-types ainsi que les valeurs
minimales et maximales des AGT C18: 1, C18: 2 et des CLA de la MG laitière obte-
nus par GC direct selon Collomb et Bühler (2) ainsi que des AGT C18 : 1 obtenus
par AgTLC-GC selon Molkentin et Precht (23) pour les 40 MG laitières.
Les AGT C18: 1 t4 à t12 étant bien isolés avec les deux méthodes, leurs concen-
trations devraient être similaires en raison des acides C18 : 1 t10 +11 quantifiés selon
Collomb et Bühler (2) servant de standard interne pour doser les AGT selon Mol-
kentin et Precht (23). Avec cette dernière méthode, on remarque cependant des
pertes en AGT C18: 1 -t6+7+8 et -t9, attribuables à l’isolation des AGT sur couche
mince. Toutefois, ces pertes sont faibles (de l’ordre de 0,1 g/100 g de MG) et les
sommes des teneurs en AGT C18: 1 t4 à t12 de l’hiver à l’été en zone subalpine sont
très proches (resp. 2,03, 2,65, 4,47 et 6,19 g/100 g selon Collomb et Bühler (2) et
resp. 1,90, 2,55, 4,27 et 6,01 g/100 g selon Molkentin et Precht (23)).
En comparant les résultats obtenus selon les deux méthodes avec ceux de la litté-
rature (tableaux 4 et 5), on remarque que les valeurs pour les périodes hivernale et
estivale en plaine et en montagne se situent en général dans les domaines de concen-
trations obtenues par d’autres auteurs. En zone subalpine cependant, les domaines
de concentrations des AGT C18: 1 t10+11 (4,65 – 6,04 g/100 g) et de l’acide rumé-
nique (1,98–2,41 g/100 g) obtenues selon Collomb et Bühler (2) ainsi que de celui de
l’acide trans-vaccénique (4,37–5,67 g/100 g) dosé selon Molkentin et Precht (23) se
situent nettement en dessus de ceux de la littérature (tableau 4: resp. 0,52 – 4,26 g/
100 g pour le C18: 1 t10+11, 0,25–1,95 g/100 g pour l’acide ruménique et 0,52 –
4,0 g/100 g pour l’acide trans-vaccénique). Les teneurs élevées de la somme des
AGT C18: 1 aux altitudes élevées (p. ex. en zone subalpine: 7,39 g/100 g de MG

468 Mitt. Lebensm. Hyg. 93 (2002)


459-480

Tableau 3
Composition en acides gras trans des MG de lait mélange d’hiver et d’été (zones collinéenne, montagnarde et subalpine) ;
(MG d’hiver : n =10 ; MG d’été : n =10 par zone) selon les méthodes de Collomb et Bühler (2) et de Molkentin et Precht (23)
(g/100 g)
17.10.2002

MG d’hiver MG d’été
Acides gras Zone collinéenne Zone montagnarde Zone subalpine
(600 – 650 m) (900 –1210 m) (1275 –2120 m)
x– sx Min. Max. x– sx Min. Max. x– sx Min. Max. x– sx Min. Max.

Mitt. Lebensm. Hyg. 93 (2002)


9:03 Uhr

Méthode selon Collomb et Bühler


C14:1 t 0,01A 0,002 0,01 0,01 0,01A 0,002 0,01 0,02 0,01A 0,002 0,01 0,02 0,01A 0,002 0,01 0,01
C16:1 t 0,08D 0,009 0,07 0,10 0,11C 0,012 0,10 0,13 0,21B 0,018 0,18 0,24 0,32A 0,027 0,27 0,35
C17:1 t 0,01C 0,001 0,01 0,01 0,01C 0,002 0,01 0,01 0,02B 0,002 0,01 0,02 0,03A 0,007 0,02 0,04
C18:1 t4 0,01B 0,002 0,01 0,01 0,01B 0,002 0,01 0,02 0,02A 0,002 0,01 0,02 0,01B 0,002 0,01 0,02
C18:1 t5 0,01B 0,001 0,01 0,01 0,01B 0,001 0,01 0,01 0,01A 0,002 0,01 0,02 0,01B 0,001 0,01 0,01
Seite 469

C18:1 t (6+7+8) 0,10C 0,012 0,09 0,12 0,12C 0,018 0,10 0,14 0,21B 0,024 0,18 0,24 0,25A 0,016 0,17 0,22
C18:1 t9 0,22C 0,013 0,20 0,24 0,21C 0,019 0,19 0,24 0,30A 0,030 0,26 0,36 0,25B 0,016 0,22 0,27
C18:1 t10 +11 1,53D 0,132 1,39 1,77 2,09C 0,254 1,76 2,50 3,69B 0,312 3,20 4,16 5,40A 0,393 4,65 6,04
C18:1 t12 0,16D 0,015 0,14 0,18 0,21C 0,035 0,15 0,26 0,24B 0,023 0,18 0,26 0,27A 0,032 0,23 0,32
C18:1 t(13+14)+c(6+7+8) 0,43C 0,032 0,38 0,49 0,73A 0,090 0,60 0,86 0,60B 0,040 0,50 0,64 0,74A 0,095 0,61 0,89
C18:1 (t16 +c14) 0,22C 0,019 0,18 0,25 0,35B 0,049 0,26 0,41 0,34B 0,024 0,30 0,38 0,38A 0,034 0,33 0,42
C20:1 t 0,03A 0,004 0,02 0,03 0,03A 0,003 0,02 0,03 0,03A 0,003 0,03 0,03 0,03A 0,003 0,02 0,03
C18:2 ttNMID 0,08D 0,012 0,06 0,10 0,11C 0,017 0,09 0,14 0,16B 0,013 0,15 0,18 0,21A 0,021 0,18 0,26
C18:2 t9t12 0,01B 0,001 0,01 0,01 0,02AB 0,005 0,01 0,02 0,02AB 0,003 0,01 0,02 0,02A 0,002 0,01 0,02
C18:2 c9t13 +t8c12 0,16C 0,011 0,14 0,17 0,24B 0,030 0,18 0,28 0,24B 0,014 0,22 0,26 0,31A 0,023 0,27 0,35
C18:2 c9t12 +t8c13 0,23D 0,008 0,22 0,24 0,26C 0,028 0,21 0,29 0,28B 0,007 0,27 0,29 0,30A 0,015 0,28 0,33
C18:2 t11c15 +t9c12 0,24D 0,036 0,18 0,29 0,34C 0,050 0,26 0,43 0,44B 0,039 0,39 0,50 0,70A 0,120 0,60 0,98
C18:2 c9t11 0,65D 0,079 0,55 0,77 0,78C 0,091 0,67 0,93 1,49B 0,192 1,22 1,81 2,21A 0,145 1,98 2,41
C18:2 c9c11+t11 c13 0,04C 0,012 0,02 0,06 0,04C 0,007 0,03 0,05 0,08B 0,009 0,07 0,10 0,14A 0,028 0,11 0,19
C18:2 t9t11 0,02AB 0,002 0,02 0,03 0,02C 0,004 0,01 0,03 0,03A 0,003 0,02 0,03 0,02B 0,003 0,02 0,03
∑ trans sans les CLA 3,51D 0,185 3,17 3,80 4,83C 0,486 3,95 5,66 6,81B 0,446 5,94 7,41 9,17A 0,653 8,07 10,45
∑ C18:1 trans 1 2,67D 0,132 2,41 2,85 3,72C 0,379 3,07 4,34 5,41B 0,379 4,68 5,91 7,25A 0,521 6,31 8,15
∑ CLA trans 2 0,71D 0,089 0,60 0,85 0,84C 0,096 0,72 1,01 1,60B 0,201 1,32 1,94 2,37A 0,148 2,15 2,55
∑ C18:2 trans sans CLA 0,72D 0,060 0,62 0,81 0,96C 0,108 0,75 1,14 1,13B 0,062 1,04 1,22 1,54A 0,150 1,42 1,89

469
459-480

470
MG d’hiver MG d’été
Acides gras Zone collinéenne Zone montagnarde Zone subalpine
(600 – 650 m) (900 –1210 m) (1275 –2120 m)
x– sx Min. Max. x– sx Min. Max. x– sx Min. Max. x– sx Min. Max.
Méthode selon Molkentin et Precht
17.10.2002

C18:1 t4 0,02A 0,006 0,01 0,03 0,02A 0,007 0,01 0,03 0,02A 0,007 0,01 0,04 0,02A 0,006 0,01 0,03
C18:1 t5 0,01B 0,006 0,01 0,03 0,02AB 0,006 0,01 0,03 0,02A 0,006 0,01 0,04 0,02AB 0,006 0,01 0,03
C18:1 t (6+7+8) 0,04B 0,015 0,02 0,07 0,06AB 0,019 0,04 0,11 0,08A 0,029 0,04 0,13 0,07A 0,023 0,03 0,10
C18:1 t9 0,12C 0,020 0,10 0,16 0,11C 0,021 0,09 0,16 0,20A 0,039 0,15 0,26 0,17B 0,031 0,12 0,22
C18:1 t10 0,19C 0,022 0,17 0,22 0,22B 0,024 0,20 0,27 0,34A 0,024 0,30 0,39 0,34A 0,039 0,28 0,41
9:03 Uhr

C18:1 t11 1,34D 0,147 1,19 1,58 1,87C 0,252 1,56 2,29 3,34B 0,298 2,90 3,80 5,07A 0,371 4,37 5,67
C18:1 t12 0,18C 0,029 0,15 0,24 0,25B 0,046 0,17 0,31 0,27B 0,015 0,25 0,31 0,32A 0,040 0,25 0,37
C18:1 t13 0,21C 0,025 0,18 0,27 0,38A 0,055 0,29 0,46 0,31B 0,019 0,27 0,34 0,38A 0,047 0,31 0,44
C18:1 t14 0,21C 0,025 0,16 0,25 0,35AB 0,065 0,26 0,43 0,32B 0,020 0,28 0,35 0,38A 0,060 0,27 0,44
C18:1 t15 0,16C 0,012 0,15 0,18 0,26AB 0,049 0,18 0,32 0,24B 0,012 0,22 0,26 0,27A 0,036 0,21 0,32
C18:1 t16 0,17C 0,027 0,12 0,20 0,29B 0,070 0,19 0,40 0,30B 0,035 0,21 0,33 0,36A 0,051 0,26 0,42
Seite 470

∑ C18:1 trans 2,65D 0,33 2,25 3,23 3,83C 0,62 3,00 4,81 5,45B 0,51 4,65 6,24 7,39A 0,71 6,13 8,44
Légendes: voir tableau 1. En caractères gras : teneurs croissantes de l’hiver à l’été en plaine et en fonction de l’altitude en été. A > B > C > D = différences significatives (P <_ 0,05)

Mitt. Lebensm. Hyg. 93 (2002)


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Tableau 4
Revue de la composition en acides gras trans C18:1 et C18:2 dans la MG laitière
selon des données bibliographiques (moyennes annuelles) (g/100 g)
Acides gras trans n x– s Min. Max. x Références/Pays
C16:1 t 27 0,13 0,05 0,05 0,25 Molkentin et Precht (35)/D
C16:1 t 24 0,11 0,030 0,07 0,15 Wolff (36)/F
C18:1 t4 100 0,05 0,022 0,02 0,13
C18:1 t5 100 0,05 0,025 0,02 0,12
C18:1 t (6+7+8) 100 0,17 0,055 0,03 0,30
C18:1 t9 100 0,24 0,037 0,16 0,31
C18:1 t10 83 0,17 0,046 0,00 0,26 Precht et Molkentin (41)/D
C18:1 t11 83 1,75 0,985 0,52 4,00
C18:1 t12 100 0,21 0,043 0,11 0,31
C18:1 t13+14 100 0,48 0,111 0,25 0,73
C18:1 t15 100 0,28 0,083 0,10 0,47
C18:1 t16 100 0,34 0,070 0,16 0,51
∑ C18:1 trans 1756 3,83 1,344 1,91 6,34
∑ C18:1 trans 2098 3,70 n.i. 1,29 7,31 Precht et Molkentin (40)/D
∑ C18:1 trans 31 3,33 0,99 1,75 5,20 Henninger et Ulberth (37)/A
∑ C18:1 trans 24 3,75 0,46 2,46 5,18 Wolff (36)/F
C18:2 ttNMID 11 0,19 0,085 0,10 0,38
C18:2 t9t12 11 0,09 0,023 0,06 0,12
C18:2 c9t13+t8c12 100 0,11 0,027 0,07 0,16
C18.2 t9t12+t8c12+c9t13 100 0,22 0,059 0,05 0,37 Precht et Molkentin (26)/D
C18:2 t8c13+ccMID 100 0,11 0,028 0,04 0,20
C18:2 c9t12 100 0,10 0,026 0,05 0,16
C18:2 t9c12 100 0,07 0,049 0,02 0,48
C18:2 t11c15 100 0,33 0,150 0,04 0,68
C18:2 c9t11 238 0,81 0,392 0,25 1,95
∑ C18:2 trans sans CLA 100 0,99 0,250 0,56 1,58
et C18:2 ttNMID
∑ C18:2 trans sans CLA 1756 0,63 n.i. 0,11 1,41 Precht et Molkentin (40)/D
et C18:2 ttNMID
Légendes: ccMID = cis, cis methylene interrupted diene ; D = Allemagne ; F = France, A = Autriche ; autres légendes :
voir tableau 1.

selon la méthode de Molkentin et Precht (23) sont surtout dues à celles de l’acide
trans-vaccénique (en zone subalpine: 5,07 g/100 g de MG). Selon Precht et Molken-
tin (40), la graisse de lait contient en moyenne 3,70 g/100 g (1,29 à 7,31 g/100 g;
n=2098 MG laitières) d’AGT C18 : 1 et 0,63 g/100 g (0,11 à 1,41 g/100 g ; n=1756
MG laitières) d’AGT C18:2, CLA trans non compris.
Quant aux influences des saisons et de l’altitude, on remarque pour les deux
méthodes que les concentrations en AGT individuels indiqués en caractères gras
augmentent significativement (P <_0,05) de l’hiver à l’été et en fonction de l’altitude
durant la période estivale. Les autres AGT individuels sont tous présents en concen-
trations les plus élevées en zone subalpine, mis à part les AGT C18 : 1 t6 +7+8 et t9
et ceux présents en concentrations de l’ordre de 0,01 à 0,03 g/100 g de MG pour la

Mitt. Lebensm. Hyg. 93 (2002) 471


459-480 17.10.2002 9:03 Uhr Seite 472

Tableau 5
Revue de la composition en acides gras trans (AGT) individuels C18:1 et des ∑ en
AGT C18:1 et C18:2 dans des MG laitières allemandes produites durant différentes
périodes de lactation selon Precht et Molkentin (27)
Acides gras Hiver (n = 927) Transition (n = 236) Eté (n = 593) Références
trans x– (Min.– Max.) x– (Min.– Max.) x– (Min.– Max.)
C18:1 t4 0,05 (0,02– 0,07) 0,05 (0,04– 0,07) 0,05 (0,03–0,08) (38)
C18:1 t5 0,05 (0,02–0,11) 0,04 (0,01–0,06) 0,05 (0,00 – 0,07)
C18:1t(6+7+8) 0,13 (0,07– 0,20) 0,17 (0,12– 0,22) 0,21 (0,16–0,27)
C18:1 t9 0,21 (0,16–0,29) 0,24 (0,21–0,27) 0,26 (0,20 – 0,30)
C18:1 t10 0,16 (0,04–0,33) 0,17 (0,04–0,26) 0,18 (0,03 – 0,29)
C18:1 t11 0,93 (0,35–1,96) 1,78 (0,85–2,73) 2,87 (1,45 – 4,43)
C18:1 t12 0,19 (0,10–0,26) 0,22 (0,18–0,29) 0,24 (0,19 – 0,31)
C18:1 t13–14 0,42 (0,00–0,63) 0,52 (0,38–0,81) 0,57 (0,41 – 0,85)
C18:1 t15 0,22 (0,04–0,33) 0,29 (0,18–0,46) 0,37 (0,19 – 0,48)
C18:1 t16 0,29 (0,11–0,44) 0,35 (0,21–0,46) 0,39 (0,24 – 0,52)
∑ C18:1 trans 2,65 (1,29–4,21) 3,80 (2,71–4,94) 5,08 (3,28 – 6,75)
C18:2 c9t11 0,45 (0,10– 1,05) 0,76 (0,19– 1,19) 1,20 (0,49–1,89) (39)
∑ C18:2 trans 0,46 (0,11– 0,95) 0,66 (0,40– 1,14) 0,87 (0,54–1,41) (40)
Légendes : voir tableau 1.

méthode selon Collomb et Bühler (2) ainsi que de l’isomère C18 : 1 t6 +7+8 pour
celle selon Molkentin et Precht (23). Quant aux sommes des concentrations des
divers AGT C18: 1 et C18: 2 ainsi que des CLA, elles augmentent toutes significati-
vement pour les deux méthodes de l’hiver à l’été en plaine et en fonction de l’altitude
durant la période estivale. Enfin, on remarque pour les deux méthodes que, mis à
part l’AGT C18: 1 t9, les teneurs de tous les AGT présents en concentration supé-
rieure à 0,12 g/100 g de MG augmentent significativement de la période hivernale à
la période estivale.
Selon Precht et Molkentin (41), la concentration de l’acide trans-vaccénique
représente approximativement le 90% de la concentration totale des 2 isomères
C18: 1 t10+11 qui ne peuvent pas être séparés sous les conditions chroma-
tographiques proposées par Collomb et Bühler (2). Le résultats présentés dans le
tableau 6 confirment les indications de Precht et Molkentin (41) et indiquent en plus

Tableau 6
Part centésimale des teneurs en acide trans vaccénique (C18 :1 t11) dans le
mélange C18:1 t10 + t11
Saison/altitude Moyenne Ecart type
Hiver 87,22D 2,321
Eté/plaine 89,27C 1,467
Eté/montagne 90,66B 0,649
Eté/Alpes 93,79A 0,592
Légende : voir tableau 3.

472 Mitt. Lebensm. Hyg. 93 (2002)


459-480 17.10.2002 9:03 Uhr Seite 473

une augmentation significative en passant de l’hiver à l’été et de la plaine en zone


subalpine durant la période estivale.

Composition en CLA des MG laitières analysées


La méthode de dosage des AGT C18: 1 selon Molkentin et Precht (23) rend pos-
sible le dosage de tous les AGT C18: 1 qui pourrait être exigé pour toutes les denrées
alimentaires dans le futur, mais surtout celui de l’acide trans vaccénique, important
pour le métabolisme du rumen et de la glande mammaire des vaches (2, 22 – 43). Les
concentrations croissantes des acides trans-vaccénique et ruménique (CLA princi-
pal de la MG laitière) de l’hiver à l’été en zone subalpine peuvent être interprétées à
l’aide du schéma métabolique récemment élucidé et décrit dans la figure 5 (44).
On constate que l’acide -linoléique de la MG des fourrages peut être isomérisé
en acide ruménique qui est lui même réduit en acide trans-vaccénique dans le rumen
de la vache. L’acide linolénique est aussi un précurceur de l’acide trans-vaccénique
mais donne un nombre plus important d’intermédiaires (44). La réduction des
C18: 1 trans est généralement une étape limitante pour l’hydrogénation complète en
acide stéarique, induisant une accumulation ruminale des C18 : 1 trans. Une partie
du CLA provenant de l’hydrogénation ruminale des acides gras polyinsaturés est
absorbée au niveau intestinal, prélevée par la glande mammaire et sécrétée dans le
lait. La synthèse d’acide ruménique se fait cependant pour plus de 75 % dans la

Acide linoléique Acide ␣-linolénique


(C18:2 cis 9 cis 12) (C18:3 cis 9 cis 12 cis 15)

Isomérase dans le
rumen

Acide linoléique conjugué (CLA)


(C18:2 cis 9 trans 11)

Biohydrogénation dans le Désaturase dans la


rumen mamelle

Acide trans-vaccénique
(C18:1 trans 11)

Biohydrogénation dans le
rumen

Acide stéarique
(C18)

Désaturase dans la mamelle

Acide oléique (C18:1 cis 9)

Figure 5 Principales voies de synthèse des acides gras trans et du CLA principal
du lait

Mitt. Lebensm. Hyg. 93 (2002) 473


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mamelle mais pour cela, il est nécessaire qu’une quantité suffisante d’acide trans-
vaccénique ait été formée dans le rumen. La transformation de l’acide trans-vaccé-
nique en acide ruménique par l’enzyme cis 9 désaturase de la glande mammaire
constitue donc l’étape principale de la formation de ce CLA dans le lait (9). L’hy-
drogénation dans le rumen, généralement définie comme le pourcentage de dispari-
tion des acides linoléique et linolénique entre la bouche et le duodénum est en
moyenne de 80 à 92% (44). Par rapport à l’hiver, les teneurs plus élevées en acides
linoléique et linolénique (45) de la MG des herbages d’été conduit à des teneurs plus
élevées en acides gras trans et en CLA dans la MG du lait et ceci au détriment de
l’acide stéarique. Les acides gras polyinsaturés ne sont en effet pas synthétisés par les
tissus des ruminants, de sorte que leur concentration dépend étroitement des quan-
tités absorbées dans l’intestin et donc des quantités quittant le rumen. Cette quantité
peut donc être accrue par l’apport alimentaire et par les facteurs réduisant l’hydro-
génation, incluant l’emprisonnement des acides gras dans les cellules végétales (44).
Quant à la désaturation de l’acide stéarique en acide oléique, elle a essentiellement
lieu dans la glande mammaire.
Le tableau 7 donne les teneurs moyennes, les écart-types ainsi que les valeurs
minimales et maximales pour 4 CLA identifiés et 9 CLA inconnus obtenus par GC
direct selon la méthode de Precht et Molkentin (27) pour les 40 MG laitières. En
comparaison, Precht et Molkentin (27) ont déterminé des teneurs allant de 0,10 à
1,89 g/100 g de la MG dans 1756 échantillons de lait.
On remarque que les moyennes des teneurs en CLA C18 : 2 c9t11, n. i. 1 et
4 ainsi qu’en CLA totaux présentées caractères gras dans ce tableau augmentent
significativement de l’hiver à l’été et en fonction de l’altitude durant la période esti-
vale. La concentration de l’acide ruménique est naturellement identique à celle obte-
nue à l’aide de la méthode générale selon Collomb et Bühler (2) (tableau 3) en raison
l’emploi de cet acide comme standard interne. La somme des CLA est par contre
supérieure à celle obtenue à l’aide de la méthode générale en raison du dosage d’un
nombre de CLA plus important dont la plupart sont malheureusement non identi-
fiés. Quant à la nature des CLA connus déterminés, cette méthode permet de doser
en plus de l’isomère principal, l’acide ruménique, les CLA C18 : 2 t9c11 et t10 c12
présents en faibles concentrations et non dosés en utilisant la méthode générale.
Pour le CLA C18: 2 c9c11, sa concentration est identique à celle obtenue pour le
mélange C18: 2 c9c11+t11 c13 selon la méthode de Collomb et Bühler (2) indiquant
ainsi une présence probable du deuxième isomère au même temps de rétention. La
concentration du CLA t9t11+CLA n. i. 5 est légèrement plus élevée que celle de
l’isomère C18: 2 t9t11 bien isolé avec la méthode générale en raison des deux iso-
mères qui se superposent.

474 Mitt. Lebensm. Hyg. 93 (2002)


459-480

Tableau 7
Composition en CLA des graisses de lait d’hiver et d’été (zones collinéenne, montagnarde et subalpine ; g d’acides/100 g de
MG) (MG d’hiver : n =10 ; MG d’été : n =10 par zone) selon la méthode de Precht et Molkentin (27)
17.10.2002

MG d’hiver MG d’été
Acides gras Zone collinéenne Zone montagnarde Zone subalpine
(600 – 650 m) (900 –1210 m) (1275 – 2120 m)
x– sx Min. Max. x– sx Min. Max. x– sx Min. Max. x– sx Min. Max.
C18:2 c9t11 0,649D 0,079 0,550 0,775 0,780C 0,091 0,670 0,935 1,493B 0,193 1,220 1,815 2,211A 0,145 1,975 2,415

Mitt. Lebensm. Hyg. 93 (2002)


9:03 Uhr

C18:2 t9c11 0,008C 0,001 0,007 0,009 0,008C 0,001 0,007 0,009 0,011B 0,001 0,009 0,013 0,015A 0,003 0,011 0,020
C18:2 t10c12 0,003AB 0,000 0,002 0,003 0,004A 0,001 0,003 0,005 0,004A 0,001 0,003 0,005 0,002B 0,001 0,002 0,004
C18:2 c9c11 0,041C 0,011 0,025 0,062 0,045C 0,009 0,033 0,062 0,082B 0,008 0,072 0,100 0,140A 0,029 0,108 0,203
CLA n. i. 1 0,018D 0,001 0,015 0,020 0,029C 0,003 0,026 0,036 0,031B 0,001 0,028 0,033 0,039A 0,003 0,033 0,043
CLA n. i. 2 +3 0,037C 0,003 0,032 0,040 0,063B 0,008 0,055 0,081 0,059B 0,003 0,055 0,063 0,072A 0,003 0,067 0,076
CLA n. i. 4 0,021D 0,005 0,013 0,027 0,028C 0,004 0,023 0,037 0,041B 0,006 0,033 0,050 0,070A 0,008 0,063 0,086
Seite 475

CLA t9t11 +CLA n. i. 5 0,008B 0,001 0,006 0,010 0,008B 0,001 0,008 0,010 0,010A 0,001 0,009 0,012 0,009A 0,001 0,007 0,010
CLA n. i. 6 0,036B 0,001 0,034 0,037 0,038B 0,006 0,031 0,051 0,044A 0,002 0,040 0,048 0,040B 0,002 0,037 0,043
CLA n. i. 7+8 0,006B 0,002 0,004 0,009 0,007B 0,001 0,005 0,008 0,008A 0,001 0,007 0,009 0,009A 0,001 0,008 0,010
CLA n. i. 9 0,001C 0,000 0,001 0,002 0,001B 0,000 0,001 0,002 0,002B 0,000 0,001 0,002 0,002A 0,000 0,002 0,002
∑ CLA totaux 0,826D 0,097 0,696 0,985 1,010C 0,109 0,893 1,218 1,784B 0,208 1,483 2,133 2,609A 0,156 2,374 2,794
Légendes : voir tableau 1 et 3.

475
459-480 17.10.2002 9:03 Uhr Seite 476

Conclusions
Le présent travail démontre que la méthode générale de dosage des acides gras de
la MG laitière proposée par Collomb et Bühler (2) permet de doser tous les AGT
C18: 2 et la plupart des AGT C18:1 de la MG laitière. Cependant, il est nécessaire
de disposer en plus d’une méthode complémentaire faisant appel à une séparation
des AGT C18:1 sur couche mince argentée pour déterminer correctement l’en-
semble de ces AGT. Cela permet d’une part, de pouvoir répondre aux exigences du
contrôle des denrées alimentaires et d’autre part, d’obtenir des renseignements
concernant le métabolisme du rumen et de la glande mammaire des vaches lors d’es-
sais d’affouragement.
Quant à la méthode de dosage des CLA par chromatographie gaz-liquide selon
Precht et Molkentin (27), elle n’apporte pas vraiment des connaissances nouvelles
par rapport à la méthode générale selon Collomb et Bühler (2) en ce qui concerne les
différences des teneurs en CLA entre les saisons et en fonction de l’altitude. De plus,
de nombreux pics chromatographiques ne sont malheureusement pas identifiés. Des
méthodes plus modernes (46, 47) faisant appel à la chromatographie liquide-liquide
sur colonne imprégnée de nitrate d’argent on été récemment développées qui per-
mettent de séparer les CLA en trois séries de pics (C18 : 2 cis cis; C18 : 2 cis trans et
trans cis et C18: 2 trans trans).
Quant aux teneurs en AGT C18: 1, C18: 2 et en CLA de la MG laitière, elles
sont généralement plus élevées en été qu’en hiver et augmentent en fonction de l’al-
titude en période estivale. Ces résultats sont à corréler avec les teneurs plus élevées
en acides gras polyinsaturés de la MG des fourrages en été par rapport à l’hiver et en
fonction de l’altitude durant la période estivale. Ces acides gras du fourrages sont en
effet transformés en acides gras trans dans le rumen de la vache augmentant ainsi les
teneurs en AGT et CLA dans le lait.

Résumé
Le présent travail présente les teneurs en acides gras trans et en acides linoléique
conjugués (CLA) par chromatographie gaz-liquide dans 40 MG laitières produites
en saison hivernale et à trois altitudes différentes en zone estivale selon trois
méthodes complémentaires. Les teneurs en acides gras trans et en CLA sont en
général significativement plus élevées en été qu’en hiver et augmentent significative-
ment en fonction de l’altitude durant la période estivale. Les méthodes utilisées se
complètent de la manière suivante: la méthode générale basée sur une séparation des
acides gras sur colonne CP Sil 88 de 100 m permet de doser les acides gras trans et
linoléiques conjugués les plus importants de la matière grasse laitière. Cependant,
une méthode complémentaire procédant par une séparation préalable des isomères
trans C18: 1 sur couche mince argenté est nécessaire afin de doser tous les isomères
et en particulier l’acide trans-vaccénique en raison de son importance dans le méta-
bolisme des graisses du fourrage dans le rumen de la vache. Pour le dosage des CLA,
la méthode par chromatographie gaz-liquide peut être avantageusement remplacée

476 Mitt. Lebensm. Hyg. 93 (2002)


459-480 17.10.2002 9:03 Uhr Seite 477

par une méthode par chromatographie liquide-liquide sur colonnes imprégnées de


nitrate d’argent.

Zusammenfassung
Diese Arbeit zeigt die Resultate von trans-Fettsäuren und konjugierten Linol-
säuren (CLA) in 40 Milchfettproben, die mit drei sich ergänzenden gaschromato-
graphischen Methoden erhalten wurden. Die Proben stammten aus einer Winter-
produktion und von drei verschiedenen Höhenlagen aus Sommerproduktionen.
Die Gehalte an trans-Fettäuren und CLA sind normalerweise im Sommer signifi-
kant höher als im Winter und nehmen in Abhängigkeit zur Höhenlage im Sommer
signifikant zu. Die verwendeten Methoden ergänzen sich folgendermassen: Die all-
gemeine Methode, die auf der Trennung mit einer CP Sil 88-Kapillarsäule von
100 m Länge basiert, erlaubt die wichtigsten trans- und konjugierten Fettsäuren des
Milchfettes zu bestimmen. Jedoch ist eine weitere Methode notwendig, die eine
Vortrennung der trans-Fettsäuren auf einer mit Silbernitrat imprägnierten Dünn-
schichtplatte einschliesst. Sie erlaubt, alle C18 : 1 trans-Isomeren zu trennen, insbe-
sondere die trans-Vaccensäure, die eine zentrale Rolle im Futterfettstoffwechsel im
Pansen der Kuh darstellt. Für die Bestimmung der CLA kann heute die in dieser
Arbeit verwendete gaschromatographische Methode vorteilhaft durch eine HPLC-
Methode mit Silbernitrat imprägnierten Säulen ersetzt werden.

Summary “Analysis of Trans and Conjugated Linoleic Acids (CLA) in Milk


Fat using Different Gas-Liquid Chromatographic Methods: Comparison of
the Methods and Study of the Variation of the Levels as a Function of the
Season and of the Altitude”
This work presents the results of trans and conjugated linoleic fatty acids (CLA)
in 40 milk fats produced in winter and at three altitudes in summer using three com-
plementary gas chromatographic methods. The levels of the trans and CLA fatty
acids in 40 milk fat samples were significantly higher in summer samples compared
to the winter ones and increased during the summer time as a function of the alti-
tude. The methods used were complementary: The general method using a direct
separation of the fatty acid on a 100 m CP Sil 88 column allows the determination of
the main trans and conjugated fatty acids. However, an other method based on a
pre-separation of the trans-C18: 1 isomers on silver-impregnated thin layer plate is
necessary for the determination of all these isomers and particularly of the trans-
vaccenic acid in view of the importance of this latter acid for the fodder fat metabo-
lism of the cow rumen. For the determination of the CLA, the gas chromatographic
method used in this work can be now advantageously replaced by a method using
liquid liquid chromatography with columns impregnated with silver nitrate.

Key words
Milk fat, Trans fatty acids, CLA, Method, Capillary gas chromatography

Mitt. Lebensm. Hyg. 93 (2002) 477


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Adresse du correspondant: Dr Marius Collomb, Station fédérale de recherches


laitières, Liebefeld, CH-3003 Berne. E-mail: marius.collomb@fam.admin.ch

480 Mitt. Lebensm. Hyg. 93 (2002)


481-501 17.10.2002 9:04 Uhr Seite 481

Reviews

Analytical Methods for the


Authentication of Meat and Meat
Products: Recent Developments
Gérard Gremaud1, Stéphane Karlen2 and Karin Hulliger2

1 Swiss Federal Office of Public Health, food safety, 3003 Bern


2 BSE-Unit of Switzerland 3003 Bern

Received 31 July 2002, accepted 17 September 2002

Introduction
Authentication was defined by Dennis (1) as the process by which a food is ver-
ified as complying with its label description. Indeed, labels on meat and meat prod-
ucts give allegations on issues such as species, type of feed given or composition of
meat products. These allegations may be verified in some cases, using analytical
methods. However, as shown in Table 1, the analyst is faced with a very broad spec-
trum of possible frauds and mislabelling and the development of an applicable analy-
tical tool is not always feasible. As shown in some recent reviews (see e.g. (1, 2)) the
analytical tools involved in the assessment of authentication, which can be highly
complex in some cases, still are under development for some authenticity issues.
The aim of this paper is therefore to assess which new developments occurred
recently, trying to emphasise on what are the weaknesses and the strength of the
currently available methods, and trying to identify which authenticity issues are still
lacking an adequate analytical tool.
This paper focuses on authenticity issues such as determination of the geo-
graphic origin, animal species, type of feed, as well as treatment (such as irradiation,
freezing) and composition of meat and meat products (issues are listed in table 1).
Further aspects, such as contamination of meat with veterinary drugs or detection
of processing aids and additives are beyond the scope of this review.
It was found that the various authenticity issues are very unevenly covered by
the existing analytical methods and that quality labels and organic meat are among
the issues that are currently most badly missing efficient analytical tools for their
authentication.

Mitt. Lebensm. Hyg. 93, 481– 501 (2002) 481


481-501 17.10.2002 9:04 Uhr Seite 482

Table 1
Some authenticity issues linked with meat/meat products
Production step before end consumer authenticity issues
animal feed production farm type of feed (GMO-free, hay, protein
concentrate), animal husbandry issues:
“biological” or “organic” meat, quality labels
slaughterhouse flow separation between meat for human
consumption/other types of meat, flow
separation between organic/conventional,
geographic origin, + issues mentioned above
transformation/process addition of blood proteins, addition of
mechanically recovered meat, addition of
non-meat proteins, animal species/breed/sex,
irradiation, meat content, + issues mentioned
above
retailers, restaurants specific cuts, freezing-then-thawing, + issues
mentioned above

Analytical methods for the determination of the geographic origin


Despite of the crises that stroke the meat and meat product sector, the interna-
tional trade of these items is permanently growing. Every day large amounts of beef,
poultry and pork meat travel across Europe. The major European producers of
meat are Netherland (pork, beef, poultry), Belgium (pork), France (beef, poultry),
Germany (beef) and Danemark (pork). The European community also imports sig-
nificant amounts of meat from Brazil (beef, poultry) and Argentina (beef) (3). On
the other hand, the enlargement of the European community also could mean that
the meat trade with eastern Europe, with Russia and with Ukraine will be strongly
increased. This calls for adequate analytical tools allowing the control of the
declared origin.

Trace Elements
Elemental composition and especially heavy metals may be relevant indicators
for the region of origin as they may be transferred from soils to meat through for-
age. Indeed, the trace element selenium is found in higher concentrations in beef
when forage and soil present higher levels in these elements. A study on 138 cull
cows (4) showed that selenium concentrations in soil and grass were positively cor-
related to selenium content of skeletal muscle. Selenium concentration in whole
blood, diaphragm and liver also were significantly correlated to its concentration in
skeletal muscles. In a previous study performed on food items from different
countries including meat from beef, pork, veal, horse, sheep, game and chicken (5),
American beef showed markedly higher selenium concentrations (435 ±56 ng/g)
than Swiss beef (256±89 ng/g). However, Swiss and French beef samples laid in

482 Mitt. Lebensm. Hyg. 93 (2002)


481-501 17.10.2002 9:04 Uhr Seite 483

the same range. For sheep meat, Switzerland (219 ±117 ng/g) was similar to New-
zealand (291 ±165 ng/g), but both were markedly lower in selenium than Australian
sheep meat (484±10 ng/g). The largest differences were observed for horse meat,
where Swiss origin (337±115 ng/g) was characterised by less than half the selenium
concentration found in meat of American origin (876 ±601 ng/g).
In a study where cadmium was analysed in organs and tissues of horses slaugh-
tered in Italy (6), the geographic origin was recognised as the main factor influenc-
ing the cadmium content of the equine species analysed. The differences between
horse meat imported from Poland, Lithuania and Hungary were statistically signif-
icant. In opposite, a study on Canadian wildlife including deer and caribou did
show that the concentration of cadmium in tissue samples was not correlated to
cadmium in exposed bedrock close to the animals nor to the proximity to anthro-
pogenic sources of cadmium but was correlated to the age of the animal (7). Finally,
in a recent Swedish study on the transfer of radiocesium from fallout to reindeer
meat it was suggested that both the extent of transfer of 137Cs to reindeer meat and
its subsequent decline with time, were affected by the different geographic origin of
samples (8).
However, metals in meat are not fully governed by natural enrichment of local
forage and soils but also on supplementation from feedstuffs and probably meta-
bolic factors and age, making the interpretation of differences difficult. Moreover,
animals are not only fed local grass or hay but also agricultural by-products such as
peanut hulls, almond shells, waste form bakeries and poultry manure. These com-
modities are shipped all over the world (9).

Stable isotope composition/analysis


As mentioned in recent papers (10, 11) the relevance of site-specific natural iso-
tope fractionation and of stable isotope ratio analysis to authentify the geographic
origin of meat is obvious and these techniques will probably play a key role in this
field. The abundance of lighter elements (H, C, N and O) is most frequently used.
However, heavier stable isotopic tracers such as 208Pb, 87Sr or 143Nd may be more
closely correlated with the geological parameters and soil composition but are less
often measured as the lighter ones. The type of samples amenable to isotopic analy-
sis include raw or processed meat as well as meat water and also protein and lipid
fractions.
In two recent communications it was reported (12, 13) that the abundance of 13C
in meat can be used to assess the amounts of C3 or C4 plants that were included in
the local cattle’s diet. Moreover, the abundance of 15N was found to be related to the
type of fertilizers applied to the acreage. The abundance of 18O in body fluids was
influenced by drinking water and the latter was related to local climate conditions.
Using the isotopic ratios of 2H/H and 18O/16O, meat samples from Germany and
Argentinia showed a perfect separation of the geographic origins, and even a clear
differentiation between southern and northern Germany (14). In a further study

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481-501 17.10.2002 9:04 Uhr Seite 484

using the same principle, the abundance of 18O exhibited significant differences in
beef meat samples from Germany, United Kingdom and Argentina (15). In a study
on lamb meat, the isotopic data from 15N and 13C of protein produced a good sepa-
ration between UK, Iceland and France. Moreover, these origins could be discrimi-
nated from a cluster including southern countries Italy, Spain and Greece (16). It
should be objected here that isotopic methods using 18O/16O and 2H/H work
apparently fine on fresh meat, but that their reliability is unknown in the case on
processed meat products, such as dried meat and cooked sausages where technolog-
ical treatments may significantly alter the isotopic composition. Moreover, these
parameters are bound to local climatic conditions, which are likely to change from
year to year.

DNA Analysis
The geographic origin may be in some cases connected with the breeds, which
are domestic in a certain geographic zone. Analysis of genomic or mitochondrial
DNA may discriminate species and breeds within species. Methods proposed
include RAPD (random amplified polymorphic DNA), AFLP (amplified fragment
length polymorphism) and polymorphic microsatellites or STS (sequence tagged
sites) (17). However, the proposed identification of “robust markers” for breeds still
has to be done.
Traceability systems are one of the most direct way to relate a piece of meat with
its geographical origin. Indeed, using these systems, an unbroken chain of informa-
tion should link a cut of beef that landed in the consumer’s plate with the place
where the animal was born and grown up, with the type of animal husbandry, what
kind of fodder it received and where it was butchered. In Switzerland, every head of
cattle shipped elsewhere will travel with a “passport” and all animal movements will
be integrated into a database. Species such as beef, pork, goats, sheep, and captive
game should bear an ear tag in order to follow each animal from its birth to the place
where it is butchered. However, full-traceability stops, except for organically pro-
duced meat, at the slaughterhouse’s door. Meat and meat cuts being thereafter
pooled in batches, irrespective of the production site. Finally, it is always possible to
go around any traceability system. As observed in UK, some pieces of cattle were
never declared at birth, were then illegally butchered without the documents allow-
ing a cattle entering a slaughterhouse and were illegally purchased by retailers (18).
For these reasons, traceability systems should be completed using laboratory meas-
urements. In some countries, the sliver of displaced ear is collected and used as a
DNA link between shelf meat and farm animal (19). The DNA sample will be
stored and only accessed where disputes arise or for random checking. The elec-
tronically marked tube will be also cross-linked to farm records such as health and
drug treatments. This DNA tagging may also be used to certify a PGI product (Pro-
tected Geographic Indicator). A cheaper version of DNA tagging named digital
DNA-signatures was also recently proposed as an alternative (20). Using a robot-

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ized version of DNA-analyser, the measurement of genotype on up to 60 000 sam-


ples of bovine ear/day was feasible (21).

Analytical methods for the determination of species


As shown by reports of Swiss food control authorities, false declaration of
species still occurs regularly, though often by ignorance of the regulations. In year
1999 food control authorities found out, on the base of random controls, a rate of
false declaration of species between 7% and 15 %. In some meat products (sausages)
it was up to 40% (22). Two years later, the percentages were from 13 to 27 % (23). It
is nevertheless clear that these figures do represent only a very small sample size and
may not be representative of all the meat and meat products sold on the market.
The differentiation of animal species is a theme which has given birth to many
scientific papers and a broad variety of methods are currently available. They are
mostly of two types. Methods of the first type are protein-based (immunoassays,
electrophoretic techniques). They use markers such as soluble proteins, structural
proteins and/or heat-stable proteins. The second type of methods are DNA-based
(hybridisation, Polymerase Chain Reaction, fingerprinting, sequencing, PCR-
RFLP). Finally some further methods are based on physical or chemical parameters.
A review on PCR methods can be found for example in the abstracts of the confer-
ence on Food Authenticity (issues and methodologies) (24).

Protein-based methods
The well established electrophoretic methods are widely used to differentiate
meat species. They offer the possibility to differentiate between a large number of
species (25). Isoelectric focusing (IEF) is described as a quick and accurate method
for identification of closely related species (26). Using specific monoclonal antibod-
ies in an Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA), it was possible to detect
5 g/kg of pork, beef, lamb and horse meat in cooked poultry products (27). This was
a marked increase in sensitivity compared to previous methods based on mono-
clonal antibodies and ELISA (100g/kg chicken meat in mixed meats (28). Moreover,
chicken could not be distinguished from turkey, duck or pheasant. Specific assays
for immunoglobulin G in pork, chicken and beef was also previously developed to
detect the adulteration of ground meats by meats of other origins (29).

DNA-based methods
Working on meat and bone meal samples, a PCR assay based on the amplifica-
tion of the mitochondrial ATPase 6/8 gene in bovine, ovine, porcine and poultry
species (30) showed a detection limit of 0.3% for bovine and ovine specific primers
and 1% for porcine specific primers. More recently, the methods using PCR of the
mitochondrial cytochrome b sequence with subsequent restriction fragment length
polymorphism (RFLP) have been re-examined (31) and sequencing of the PCR
fragment together with a BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) search in a

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public database for meat was proposed to solve problems such as unavailability of
reference material. Using Quantitative Competitive (QC) PCR (32), it was possible
to differentiate between contamination and intentional admixture of pork meat.
This QC-PCR could also be used in detection of minimal amounts (1g/kg) of pig
meat in products which must not contain any porcine residue. Using an actin gene-
related PCR test for chicken meat mixtures, detection of admixtures with other
meat species at a level of 1% was feasible in fresh and cooked meat (33). Random
amplification of polymorphic DNA (RAPD) was the technique chosen to differen-
tiate meat from beef, buffalo, pork, lamb, horse, mule, donkey, elk, reindeer, goat,
kangaroo and ostrich. Each meat species generated a species-specific RAPD finger-
print, allowing identification even in frozen, boiled and canned meat and in salami
(34).
The performances of DNA-based and proteins-based methods have been
recently reviewed and compared (35). The authors concluded that both ELISA and
PCR were able to detect raw and poorly heat-treated (100°C, 15 min.) raw materi-
als and finished products if there is a certain amount of ruminant material present.
Detection limits were about 0.5 to 1 g/100 g for beef and 1 to 2 g/100 g for sheep.
However, both types of methods cannot detect bovine, ovine or caprine material in
very strongly heat-treated material. Detection limit went down to 0.1 g/100 g for
beef (wet petfood) in some cases but all sensitivity was lost when a more intensive
heat treatment was applied (125°C, 125 min).
Many PCR-based assays use DNA targets in the mitochondrial genome. These
non-nuclear targets possess several advantages over nuclear genes. They are gener-
ally more abundant in any given sample tissues than single copy nuclear genes (by a
factor up to 10000), thus lowering the threshold of detection. Then, mitochondrial
DNA has a relatively high mutation rate compared with nuclear DNA and thus
contains more sequence diversity, facilitating the identification of closely related
species. Mitochondrial DNA tends to be inherited through the maternal germline
and the resulting lack of heterozygosity in the alleles simplifies analysis (36). Thus,
the use of mitochondrial DNA with target genes such as cytb in conjunction with
PCR-RFLP or multiplex-PCR provides specific and sensitive analytical tools to
distinguish between species, breed and sex. However, the sensitivity of the PCR
approach depends on the type of food/meat matrix being examined. Indeed, Rügge-
berg et al. (37) reported that the sensitivity of PCR analysis for various admixtures
of meat heated for 100°C for 20 minutes varied between 1 %–10 %. Longer incuba-
tion periods and higher temperatures also markedly affect the quality of data (38).
In addition, successive rounds of baking procedures result in a marked decrease in
PCR efficiency (39).
Although DNA is a relatively stable molecule and can survive quite severe food
manufacturing processes, it can be degraded by chemical, physical or enzymatic fac-
tors. Prolonged heat-treatment such as autoclaving used in some canning processes
may result in DNA hydrolysis, which fragments the DNA or modify its chemistry

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in such a way that the PCR steps may not work. This may also occur at low pH (e.g.
products in vinegar). Enzymatic degradation of DNA by nucleases may also occur
on prolonged storage of fresh foodstuffs. A well recognised problem in using PCR
methods with foods is the presence of PCR inhibitors that reduce the efficiency of
the genetic amplification process. These include many common food components
such as cations (e.g. Ca2+ or Fe3+), trace heavy metals, carbohydrates, tannins, phe-
nolic compounds or salts (e.g. sodium chloride or nitrites).
All the PCR-based methods described in this article require some form of sec-
ondary analysis that is generally based on gel electrophoresis. Despite the develop-
ment of automatic systems, this type of analysis remains laborious and is usually
only qualitative or at the best semi-quantitative. There is however a particular need
for methods allowing to quantify the relative amounts of different genomes in a
mixed food product. The rapid development of Real Time PCR provides an elegant
alternative to classical PCR. The method makes use of fluorescent primers and
probes, meaning that the amplification products can be monitored quantitatively
during the course of the reaction. The size of the amplified products being also
smaller, a higher sensitivity can be reached since specific targets can potentially be
amplified in partly altered materials. Real Time PCR is gradually being adopted for
use in food-related testing (40).

Further analytical methods


Other methods for species identification, based on physical or chemical proper-
ties, were also developed. Authenticity of species designation may be an important
issue for some religious communities, therefore a specific method based on HPLC-
RI profile of triacylglycerols was developed to detect the presence of pork fat (lard)
at a level down to 5% (on a fat basis) in process food (41).
As screening method infrared reflectance spectroscopy has been successfully used
to distinguish lamb in beef mixtures (42). In a study on 230 homogenized meat sam-
ples (chicken, turkey, pork, beef and lamb) species identification was attempted
using mid-infrared (2000–800 cm-1), near-infrared (400 –750 cm-1) and visible (400 –
750 nm) reflectance combined with statistical techniques such as discriminant PLS,
FDA and KNN. Turkey and chicken meat could not be separated using this tech-
nique. Otherwise, correct classification rates in excess of 90 % were achieved in all
cases (43).

Analytical methods for the determination of breed


To distinguish between 3 different beef cattle breeds, RAPD was successfully
used working with genome sample collected from meat (44). In a study on five
indigenous chinese goat breeds used for meat production (45), microsatellites mark-
ers allowed to identify the breed.

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Analytical methods for the determination of sex


Using an electronic nose of the type MOS (Metal Oxide Semiconductor gas sen-
sor), it was possible to rapidly detect sex-linked differences in meat products com-
position (46).

Analytical methods for the determination of the type of feed


Here will methods deal with the detection in the meat of a prolonged use of
some feed types and not on methods for analysing feed themselves. By the Euro-
pean council decision of 2000/766/EC of 4 dec. 2000, processed animal proteins
(meat and bone meal, meat meal, bone meal, blood meal, dried plasma and other
products) are totally banned in feed destined to farmed animals which are kept, bred
or fattened for the production of food. The regulations are even stricter for organi-
cally fed animals.
Using 15N abundance in cattle hair (47) a marked difference was observed
between animals fed with protein concentrates and those fed only with hay. The
method however integrates the isotopic composition over a long period of time and
is unlikely to detect short term feeding with protein concentrates.
Plant pigments such as carotinoids offer an interesting alternative to this iso-
topic method. A study with lambs fed either with green grazed grass (G group) or
concentrate and hay (S group) showed the two groups could distinguished using
the reflectance of adipose tissue at 450 and 510 nm, measured using a portable
spectrophotometer (48). Again, this method is unlikely to detect short term
feeding with concentrate and may be easy to fool by adding plant pigments in
concentrates.
Using Curie point Pyrolysis-MS (Py-MS) techniques, samples of subcutaneous
fat, lamb fed milk or concentrate or pasture could be correctly classified in 92 % of
cases (49). The free fatty acid and volatile compounds of Iberian swine subcuta-
neous fat was also used as an indicator of different feeding systems. Using such an
approach (50), it was possible to differentiate swine fed on a traditional diet based
on acorns from those fed on concentrates. Depending on the type of botanical flora
present in hay, various terpenes may accumulate in meat. Based on this principle, it
was proposed that terpenes in meat could be used as tracer for both, type of food
and geographic origin of the animal (51).
Near Infrared Reflectance Spectroscopy (NIRS) (52, 53) has been tentatively
used to identify high quality Iberian pig meat and meat sausage. These pigs are fed
mostly with acorns from Quercus Ilex and Quercus suber and also some grass as
protein supplement. On the other hand some lower quality pigs, fed with a mixture
of corn, barley or compound feedingstuff are also produced to satisfy the market
demand. NIRS and PCA statistical treatment was proposed as fast, cheap and non-
destructive alternative to more complex techniques (GC-based) already allowing a
correct classification. The method proved however to be unsuccessful in this
instance and results showed that only a considerable intake of acorn during a long

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period of time may produce enough difference in fat spectral properties. A method
is currently being developed (12) to assess the use of meat flours by isotopic analy-
sis of meat, hair and horns. The stable isotopes of carbon (13C) and sulfur (34S) have
been used to characterise products of iberian swine in relation to feeding regimes
(54). Isotopic composition of adipose tissue and of liver have been used in the men-
tioned study.

Analytical methods for the determination of quality label and organic meat
The numerous scandals that occurred in the last ten years, such as bovine
spongiform encephalopathy disease crisis, dioxin and more recently antibiotics, led
to a marked loss of consumer’s confidence in meat and meat products. Since then,
many quality labels have flourished in the hope of restoring consumer confidence.
By definition, quality labels imply a defined type of feed, breed and keeping. How-
ever, these labels may actually lead to further deceptions and frauds. Therefore there
is an obvious need to develop adequate analytical tools to control these products.
For the authentication of label chicken (such as Loué, label Rouge or others) a
study was published by the Gembloux Agricultural Research Center (55). This
work reports the use of NIRS for the authentication of fast or slow-growing
chicken breeds. The NIRS could resolve about 80 % of the cases. Nevertheless, the
drawback of the NIRS is that it requires to build up a database of authentic samples
which the unknown ones has to be compared with. AFLP was also used successfully
for the same purpose. In the same study, an attempt with PCR-RFLP to detect
admixtures of turkey and chicken meat was assessed, but the method was found to
be inappropriate for this scope. Using muscle development index and fat score
together with intramuscular fat composition, a 100 % correct attribution could be
performed for 2 populations of chicken (“label fermier” vs “standard”). For ducks,
the classification was correct at a 98% level (56).
Approaches using multiple parameters such as proposed by Marquina (57) may
offer a greater separation power than those relying on one single parameter. In an
attempt of characterization and differentiation of commercial type of Aragon
sausages, several measurands have been considered such as moisture, ash, fat, total
protein, nitrates, non-protein nitrogen, collagen, free fatty acids, hydroxyproline,
pH-value, curing conversion index and water activity. However the statistical tools
involved in data reduction of these multi-parameter studies are often trickier to
handle.
These multi-parameter approaches for authentication may include physical, iso-
topic, chemical and microbiological data and are being used with much success on
other matrices such as Emmental cheese from Switzerland (58). However, it also
implies the creation of databases of authentic samples, which could not be done on
a general basis for all meat products.
Isotopic data from (12, 13) may also be used to assess the types of feed that were
used to feed the animal. Indeed, 13C-data can be used to assess the amounts C3

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plants (such as grass) or C4 plants (such as maize) included in the fodder and that
15N is related to the type of fertilizers applied to the acreage.

The authentication of quality labels and organic meat is very much related to
legal definition of these production modes and these definitions may be different
from one land to the other. Moreover, it is obvious that some criteria required by
organic labels (such as number of days spent outside and space allocated to each ani-
mal) could hardly be analytically measured, but can be better controlled by on-site
inspections.
As stated in the regulation EC 1804/1999, organic fed herbivores must receive at
least 60% of dry matter in daily rations in roughage. Commercially available fodder
usually contain synthetic -tocopherol (8 isomers), whereas cattle fed with natural
food receive mostly the natural form (RRR- -tocopherol). Based on this fact, a
method using chiral HPLC was designed to compare the tocopherol composition of
organic and conventional beef meat (59).

Analytical methods for the determination of frozen and then thawed meat
In Switzerland, recent analytical results showed that the freezing-then-thawing
practices have not disappeared. The canton laboratories of Appenzell, Glarus,
Schaffhausen investigated the question of frozen-then-thawed meat. As a result, out
of 43 samples of “fresh” meat, 15% actually contained frozen-then-thawed meat
but were not declared as such (23). Storage in frozen form is the best technique for
preservation of meats, however even a short time storage implies a deterioration of
quality. Thus, meat that was previously frozen must be labelled accordingly. Meth-
ods often cited for detection of previously frozen meat use HADH activity or near
IR reflectance spectroscopy of drip juice. The latter uses a combination of near
infrared (1100– 2498 nm) spectroscopy and chemometric methods (60). The former
HADH-activity method proved to be efficient to detect freezing in selected cuts of
beef, pork, lamb, chicken, turkey and duck breast, but not in frozen liver or kidneys
from red meat species (61).

Analytical methods for the determination of irradiation


Several European standard methods are currently available from CEN to assess
the irradiation of food. The EN 1786:1996 “CEN standard for the detection of irra-
diated food containing bone” is based on the detection by ESR of the radicals that
are formed by ionising radiations. These radicals are stable for a period up to several
months in foodstuffs. The EN 1784:1996 “CEN standard for the detection of irra-
diated food containing fat, GC analysis of hydrocarbons” is based on the fact that
irradiation lead to the formation of alcenes or alcadienes by some triglycerides,
which are measured by GC-FID or GC-MS (62). The standard EN 1785:1996
“CEN standard for the detection of irradiated food containing fat, GC analysis of
2-alklylcyclobutanones” is more complex to use and should be regarded as a confir-
mation method. An alternative method has been recently published for irradiated

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chicken (63). It permits simultaneous determination of 2-alkylcyclobutanones


(RCBs) and hydrocarbons (HCs) using cleanup of fat extract by Soxhlet extraction
and Florisil chromatography followed by GC/FID analysis. For chicken again, a
fluorometric HPLC method was proposed, based on the fact that irradiation of pro-
tein-rich foods produces an increase of o-tyrosine production (64). This method was
compared with ESR method (on bones). The ESR signal intensity correlated with
the logarithm of o-tyrosine production.
As a screening method, the DNA comet assay (EN 13 784 : 2001) should be
mentioned for the detection of irradiated meat.
However, as it appeared in the data published by food control authorities, unlaw-
ful irradiation of meat/meat products seems not to be an issue in Switzerland (22).

Analytical methods for the determination of addition of non-meat proteins


or addition of blood proteins
Near infrared techniques may be used to detect adulteration of beef hamburgers
with adulterants such as skim milk powder or wheat flour. In a recent study, 5 – 25 %
admixture of these products in beef hamburger could be detected with an accuracy
up to 92.7% (65). Some other, older methods, mostly based on the search for target
protein structures by binding of specific antibodies, are still valid (24).
The methods available for determination of addition of non-meat protein are
numerous as they are related with specific adulterants. It requires a practical knowl-
edge of the potential adulterants. Methods for blood protein may be easier to define
as the type of protein structures to be expected are well defined. Semiquantitative
detection of albumin with electroimmunodiffusion is mentioned as an example for
the detection of blood plasma or serum in meat products (66).

Analytical methods for the determination of meat percentage in meat


products
From 14 February 2000, the directive 97/4/EC (QUID directive) requires for
food, which is sold with reference to a characterising ingredient, a quantitative dec-
laration of this ingredient on the label. However, there are no direct analytical tech-
niques allowing the determination of fruit, meat, milk, etc. as such. In the case of
meat content, Farnell (67) measured nitrogen and fat, and converted these analytical
data into information about the composition of the sample. This requires in turn the
collection of considerable amounts of background information to ensure that the
interpretation is valid, as chemical substances in the meat are subjected to natural
variation due to age, sex, breed, cut, and species. A thematic network has been set
up, managing the efforts of European food law enforcement laboratories. As a
result, procedures and factors have been developed to calculate meat content from
nitrogen and fat. Several pitfalls are remaining both on analytical (example: other
sources of proteins) as well as on the interpretational side (example: contribution of
N-factor variability to uncertainty).

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As 3-methylhistidin is only present in actin and myosin, the HPLC determina-


tion of this trace amino acid was proposed as a potential indicator of the amount of
meat protein (without protein from conjunctive tissues) in meat products. In a
study of the German federal bureau for meat research, cooked ham samples were
measured for amount of meat with a method based on 3-methylhistidin. The results
were compared with the indirect method proposed in the German directive for meat
and meat products. In most cases the results agreed within ±0.6 % (68). As clearly
shown in Farnell (64), the question of analytical assessment of meat amount in meat
products is not yet solved. A clear and universally accepted definition of what is
meat should be found before an analytical solution is proposed.

Analytical methods for the determination of prohibited parts in meat


products (central nervous system (CNS), spinal marrow, mechanically
recovered meat (MRM))
The outbreak of bovine spongiform encephalopathy (BSE) and the occurrence
of a new variant of Creutzfeldt-Jakob disease have focussed the attention on the use
of tissues of the central nervous system (CNS) in food. Indeed, CNS tissue such as
brain, spinal cord and some tissue of the peripheral nervous system contains more
than 95% of BSE-activity in animals approaching the end of incubation period.
Therefore, to effectively control the banning of CNS tissues for human consump-
tion, several methods for the detection of CNS tissue in meat products have been
developed and are quoted in this chapter.
Commonly used are the methods based on the detection of specific marker pro-
teins. Available is, on one hand, the method detecting the neuron specific enolase
(NSE) using the Western Blot technique (see for example 69, 70, 71) and on the
other hand, the ELISA-based test using antibodies against the glial-fibrillary-acidic
protein (GFAP) (72). Both of them are very sensitive (detect 2.5 g/kg of brain tissue)
and are commercially available as test kits.
The Western Blot technique mentioned above is highly specific and detects
semiquantitatively the neuron-specific -enolase NSE (standard samples are
included in the kit). Compared to other enolases, NSE is relatively heat-stable and
mainly found in CNS tissue. Eventhough NSE is also present in peripheric nervous
tissue, its low concentration does not affect the interpretation of the results. For
the detection of NSE, monoclonal antibodies are used, but these not only bind to
-enolase but also to - and -enolases. This together with the problem of matrix-
dependent background may complicate the interpretation of the immunoblots and
may lead to false positive results. On the other hand, negative results of
immunoblotting must be carefully interpreted in the case of intensively heat-treated
meat products (canned food). Despite the fact that NSE is relatively heat-stable,
high heat exposure of the product may damage native proteins, and therefore higher
concentrations of NSE are required to test products as positive. Thus, there is a
need for further studies to increase the sensitivity of immunoblotting (71). Further-

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more the application of the Western Blot technique is in general time-consuming


and requires some practice.
The ELISA-based test detecting the glial-fibrillary-acidic protein GFAP is easy
to perform, automated and rapid, and has a high sample throughput. It is an enzyme
immunoassay for the semiquantitative analysis of CNS in raw and processed meat
(83) as well as on contaminated surfaces (73). Standards are also included in the test
kit. The limits of detection are 0.2% for brain tissue and ≤0.01 % for spinal cord tis-
sue. When results are interpreted, it has to be considered that the contents of marker
proteins in different risk materials (brain, spinal cord) may considerably vary.
Therefore, spinal cord will lead to positive results even in lower concentrations.
Because of native marker proteins, samples containing raw meat will be detected
positive at lower levels. The method worked as well for items cooked at 80°C for
60 min. However, heating the products to 115°C for 100 min. prevented the
detectability of GFAP (73). In a study with 220 samples of commercial meat prod-
ucts (including salami, raw and cooked, sausage), 41 samples (18.6 %) were found
positive (including 27 samples positive on MRM). Test based solely on neurone spe-
cific enolase appeared to give false positives as they sometimes could not be con-
firmed by the glial-fibrillary-acidic protein method (74). It is now established that
raw poultry meat may cause false positive NSE- resp. GFAP-results (75).
Both tests differentiate neither between brain and spinal cord tissue nor between
species like beef, pork, chicken, sheep and goat, which would require additional tests.
The facts, that the methods cannot be applied to all matrices and that intensively
heat treatment like sterilisation of the product may affect the structure of the
marker proteins and therefore reduces the sensitivity of the tests, are restrictions
and need to be mentioned. New developments are on their way to cure the prob-
lems encountered with current methods. In a recent study, an immunohistological
approach for the detection of tissues of the central and peripherous system
(CNS/PNS) was proposed (76). In the latter work, NSE and GFAP were used, but
also other marker proteins: myelin basic protein (MBP), neurofilament (NF) and
peripherin. NF proved to be relatively less sensitive to heat treatment when com-
pared to other markers. More efforts are still needed to achieve the requested stan-
dards of reliability.

Further analytical methods


Other methods based on totally different principles were developed for detect-
ing CNS tissue in meat products. Results obtained by quantification of brain spe-
cific fatty acids (nervonic acids) using GC-MS with a detection limit down to
0.1 g/kg CNS indicate that the method may serve as a reference for immunochemi-
cal and immunohistochemical determination of CNS tissue in processed meat prod-
ucts (77). Compared to other methods, the differentiation of beef, pork and sheep
species is possible down to a level of 0.05 % brain tissue based on the ratio of
cis/trans nervonic acid (78).

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Because concentration of cholesterol in CNS tissue is higher than in muscle


meat, quantification of cholesterol provides another and low-cost screening method
for the rapid analysis of meat products suspicious with regard to CNS tissue addi-
tion (67, 79). Prior to the application of the method, normal cholesterol concentra-
tions in authentic samples of meat products need to be defined. Intensive heat treat-
ment while processing meat products does not affect cholesterol contents compared
to protein-based methods. However, further food components like egg or other tis-
sues such as liver with increased levels of cholesterol could provide false results, if
found in the product. Therefore increased concentration of cholesterol is more an
indication than a proof of addition of CNS tissue to food products. With regard to
preventive health protection and correct labelling, integrated procedures for the
detection of CNS tissue propose to use cholesterol, NSE and GFAP as markers
(67).
Mechanically recovered meat may contain parts of the spinal column, but the
contamination with spinal cord might be lower than a detectable level. The useful-
ness of different methods like immunohistochemistry, histochemistry and polariza-
tion microscopy was investigated for the detection of spinal cord in products con-
taining MRM (80). Generally if MRM is found using histochemistry, the product is
considered to contain traces of CNS tissue.

Analytical methods for the determination of admixture with offals and/or


cheaper cuts in pure muscle tissue
The admixture of offals (heart, tripe, kidney, liver) in cooked “pure beef” meat
products at a niveau of 20% w/w of adulterants was investigated using mid-infrared
spectroscopy. The results showed a 97% discrimination between all five sample
types (pure beef and beef containing each one of the four adulterants) (81). Once
again, the level of cooking had a negative influence on the precision of the method.
In a similar study from the same author, but on minced beef adulterated with kidney
or liver, samples containing 10 to 100% of either liver or kidneys were detected. The
same author reported previously on a 1H NMR method to detect the adulteration of
beef cuts with offal (82).

Aknowledegment
We thank Dr R. Charrière, Swiss Federal Office of Public Health, for reviewing
the manuscript.

Summary
This review includes 83 references encompassing most of the recent analytical
developments in the field of meat and meat products authentication. It shows that
most authenticity issues concerning meat or meat products can be at least partly
addressed using the presently available analytical techniques. An overview of these
methods is given in table 2. However, in many cases, the methods proposed are only

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Table 2
Overview of methods for authenticity testing of meat and meat products
Analytical Method Analyte Applicability Literature Reference
ICP-MS Trace elements Geographic origin 4, 5, 6, 7
2
Stable isotope ratio H, 13C, 15N, 18O Type of feed and 10, 11, 14, 15, 16
208
analysis Pb, 87Sr, 143Nd Geographic origin 12, 13, 47, 54
DNA-based Genomic or Species identification 17, 20, 21, 24, 30, 31,
methods mitochondrial 32, 33, 34, 35, 36, 37,
DNA 38, 39, 40, 44, 45
Irradiation EN 13 784:2001
Protein-based Protein patterns Species identification 25, 26,
methods 27, 28, 29
Blood protein 66
NSE Central nervous syst. 69, 70, 71, 68
GFAP Central nervous syst. 73, 74, 75, 76
HPLC-RI Triacylglycerols Species identification 41
profile
HPLC-UV Tocopherols in meat Organic meat 59
HPLC-fluorimetry o-tyrosine Irradiation 64
3-methylhistidin Meat percentage 68
Infrared Reflectance signals Species identification 42, 43
spectroscopy at specific Type of feed 52, 53, 55
wavelength Frozen-then-thawed 60
Non-meat protein 65
offals 81
UV-visible Reflectance signals Type of feed 48
spectroscopy at specific
wavelength
Electronic nose Volatile compounds Sex identification 46
1H-NMR meat offals 82
GC-MS Volatile compounds Type of feed 50
Terpenes Type of feed 51
Alcenes or
alcadienes Irradiation 62
Nervonic acids Central nervous syst. 77, 78
cholesterol Central nervous syst. 79
GC 2-alkylcyclo- irradiation 63, EN 1785:1996
butanone
Pyrolysis mass Fingerprint Type of feed 49
spectrometry spectrum of
pyrolysed meat
Muscle development Muscle meat Label chicken 56
index
Enzyme activity HADH Frozen-then-thawed 61
ESR radicals irradiation EN 1786:1996
microscopy Spinal cord Mechan. Rec. meat 80

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481-501 17.10.2002 9:04 Uhr Seite 496

valid for specific applications or may lack robustness. The analytical methods for
authentication issues are rather unevenly developed. Some issues such as detection
of irradiation are covered with international analytical standards (e.g. irradiated
meat) whereas some other issues mostly have been the subjects of preliminary work
(e.g. authentication of organic meat, labels).

Zusammenfassung
Der vorliegende Review-Artikel umfasst 83 Referenzen und beschreibt sowohl
die aktuelle Situation als auch die neuen Entwicklungen auf dem Gebiet der Analy-
tik für die Prüfung der Authentizität von Fleisch und Fleischerzeugnissen. Dabei
wird festgehalten, dass diesbezüglich mit den heute vorliegenden analytischen
Methoden bereits annähernd alle Fragen zu diesem Thema behandelt werden. Eine
Übersicht der Methoden ist in der Tabelle 2 gegeben. Die vorgestellten Methoden
jedoch sind in vielen Fällen nur für ganz bestimmte Anwendungen verwendbar
oder es fehlt ihnen eine gewisse Robustheit. Zudem ist die Analytik zur Überprü-
fung der Authentizität von Fleisch und Fleischerzeugnissen nicht für alle Bereiche
gleichermassen entwickelt. Einige Aspekte sind heute bereits durch internationale
analytische Standards abgedeckt (z.B. bestrahltes Fleisch), während andere Aspekte
erst in präliminären Studien bearbeitet wurden (z.B. Authentizität von Bio-Fleisch,
Labels).

Résumé
Une revue de littérature incluant 83 références est présentée sur les nouveaux
développements et la situation actuelle des méthodes existantes pour l’authentifica-
tion de la viande et des produits à base de viande. On constate que la plupart des
questions liées à l’authenticité peuvent déjà être partiellement ou totalement traitées
en recourant aux méthodes disponibles aujourd’hui. Ces méthodes sont résumées
dans le tableau 2. Cependant, dans beaucoup de cas, les méthodes proposées ne sont
valables que pour certains produits carnés donnés et peuvent manquer de robus-
tesse. Le développement de l’analytique dans les différents aspects de l’authenticité
est aussi inégal. Certains aspects de l’authenticité sont couverts par des standards
analytiques internationaux (par ex. la détection de l’irradiation) alors que seulement
des travaux préliminaires existent pour d’autres sujets (comme l’authenticité de la
viande bio et des labels).

Key words
Meat authenticity, Analytical method, Review article

496 Mitt. Lebensm. Hyg. 93 (2002)


481-501 21.10.2002 15:07 Uhr Seite 497

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Corresponding author: Gérard Gremaud, Swiss Federal Office of Public Health,


CH-3003 Bern, E-mail: gerard.gremaud@bag.admin.ch

Abbreviations used
AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism
CEN European Committee for Standardization
CNS Central Nervous System
DNA Deoxyribonucleic Acid
ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
FDA Factorial Discriminant Analysis
GC-FID Gas Chromatography Flame Ionisation Detection
GC-MS Gas Chromatography Mass Spectrometry
GFAP Glial Fibrillary Acid Protein
HPLC High Performance Liquid Chromatography
HPLC-RI HPLC-Refractive Index
KNN Kohonen Neural Network
MBP Myelin Basic Protein
MOS Metal Oxide Semiconductor Gas Sensor
MRM Mechanically recovered Meat
NF Neurofilament
NIRS Near Infrared Reflectance Spectrometry
NMR Nuclear Magnetic Resonance
NSE Neuron Specific Enolase
PCA Principal Component Analysis
PCR Polymerase Chain Reaction
PLS Partial Least Squares
Py-MS Pyrolysis Mass Spectrometry
QC-PCR Quantitative-Competitive PCR
RAPD Random Amplification of Polymorphic DNA
RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism
RT-PCR Real Time PCR
STS Sequence Tagged Sites

Mitt. Lebensm. Hyg. 93 (2002) 501


502-527 17.10.2002 9:05 Uhr Seite 502

Reviews

Bakteriozine und bakteriozinähnliche


Substanzen von milchwirtschaftlich
relevanten Mikroorganismen und
ihre Anwendung in der Lebensmittel-
technologie und in probiotischen
Erzeugnissen
Dino Isolini und Urs Spahr, Eidgenössische Forschungsanstalt für Milchwirtschaft
(FAM) Liebefeld, Bern

Eingegangen 13. August 2002, angenommen 23. September 2002

Einführung
Bakteriozine gewinnen in der Lebensmitteltechnologie und in der Biotechno-
logie zunehmend an Bedeutung. Ihnen werden verschiedene potenzielle Wirkungen
zugesprochen, so z.B. die Hemmung von Lebensmittelverderbern oder pathogenen
Keimen. In der Fachliteratur wird der Begriff Bakteriozin oft strapaziert und gene-
rell für antimikrobiell oder sogar probiotisch wirksame Substanzen verwendet. Für
Praktiker in der Biotechnologie und in der Lebensmittelbranche ist es nicht immer
einfach, sich ein realistisches Bild über die Erfolgschancen einer Anwendung von
Bakteriozinen zu machen. Mit der vorliegenden Literaturübersicht möchten wir
einen Beitrag zum besseren Verständnis von Bakteriozinen und ihrem Anwen-
dungspotenzial leisten. Dabei konzentrieren wir uns auf Bakteriozine, welche für
die Milchwirtschaft von Interesse sind.

Was sind Bakteriozine?

Definition
Neben den «klassischen Antibiotika» können auch andere metabolische Stoffe,
lytische Substanzen, Enzyme, defekte Phagen und Bakteriozine eine antibakterielle
Wirkung aufweisen. Die Unterschiede zwischen diesen Stoffen sind unscharf defi-
niert und werden in der Praxis oft synonym verwendet.

502 Mitt. Lebensm. Hyg. 93, 502–527 (2002)


502-527 17.10.2002 9:05 Uhr Seite 503

Der Begriff Bakteriozin wurde 1953 von Jacob et al. eingeführt für Protein-
Antibiotika mit einem relativ hohen Molekulargewicht und einer antibakteriellen
Wirkung gegenüber Zielzellen der gleichen oder nahe verwandten Spezies (1).
Der Begriff hat sich in den folgenden Jahrzehnten inhaltlich stark gewandelt.
Noch 1980 verstand man unter Bakteriozinen hochspezifische Proteine oder Pro-
teide mit antibiotikaähnlicher Wirkung, die hauptsächlich gegen andere Stämme der
gleichen Art wirken (2). Bakteriozine dienten lange Zeit lediglich zu Typisierungs-
zwecken von Bakterienstämmen.
Für den Begriff Bakteriozin stellten Tagg et al. 1976 folgende Kriterien auf (3):
1. Beschränktes Wirkungsspektrum, begrenzt auf homologe Spezies;
2. Bindung der biologischen Aktivität an einen Proteinbestandteil;
3. Bakterizide Wirkung;
4. Bindung an spezifische Rezeptoren;
5. Bakteriozin-Produktion und Immunität der Zielzellen sind plasmidgebunden;
6. Biosynthese des Bakteriozins führt zum Zelltod.
Für den Prototypen der Bakteriozine, den Colicinen der Gram negativen Spe-
zies Escherichia coli treffen alle diese Kriterien zu. Die von Gram positiven Bakte-
rien gebildeten Bakteriozine unterscheiden sich von diesen Kriterien vor allem
darin, dass sie ein weiteres Wirkungsspektrum gegenüber mehreren Spezies haben.
Tagg et al. schlugen deshalb vor, den Begriff Bakteriozin nur für solche Stoffe zu
verwenden, welche insbesondere die Punkte 2 und 3 der obigen Kriterien erfüllen.
Bei allen anderen Substanzen sollte besser von bakteriozinähnlichen Substanzen
gesprochen werden (3).
Heute hat sich eine relativ offene Definition von Jack et al. 1995 (4) durch-
gesetzt: Bakteriozine sind primäre oder modifizierte Produkte der bakteriellen ribo-
somalen Synthese, die extrazellulär freigesetzt werden und über ein relativ enges
Spektrum einer bakteriziden Wirkung verfügen. Die Wirkung richtet sich im Mini-
mum auf einige Stämme der produzierenden Spezies, wobei der produzierende
Stamm über Mechanismen verfügt, die ihn gegen sein spezifisches Bakteriozin
schützen.
Mit dieser Definition rücken die Bakteriozine in die Nähe der Peptidantibiotika,
eine neue vielversprechende Gruppe therapeutisch einsetzbarer Antibiotika. Damit
wird eine korrekte und eindeutige Abgrenzung zum Begriff Antibiotikum schwie-
rig. Als Antibiotikum gilt eine natürlich vorkommende, von Mikroorganismen
(Pilze, Aktinomyzeten, Bakterien) produzierte antibakterielle Substanz (2, 5). Im
Hinblick auf mögliche Einsatzformen von Bakteriozinen in Lebensmitteln sollte
man sich also davor hüten, den Begriff Bakteriozin als Euphemismus für antibio-
tisch wirkende Substanz zu verwenden, bevor die Natur eines Bakteriozins nicht
eindeutig aufgeklärt ist.
Im Zusammenhang mit Bakteriozinen taucht auch häufig der Begriff Lanti-
biotika auf. Lantibiotika sind kleine Peptide, welche die ungewöhnlichen Dehydro-
und Thioether-Aminosäuren Lanthionin und 3-Methyl-Lanthionin enthalten. Die

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Lantiobiotika bilden die Klasse I der Bakteriozine der Milchsäurebakterien. Typi-


sche Vertreter von Lantibiotika sind u.a. Nisin, Lacticin und Lactocin (6).

Funktion
Bakteriozine sind proteinhaltige Toxine, die je nach Definition gegen ein mehr
oder weniger breites Spektrum von Bakterien wirken. Die Bakteriozinbildung ist
vererbbar und an Plasmide (das Bakteriozinogen) gebunden. Bakteriozine können
in extrazellulärer Form oder an die jeweilige Bakterienzelle gebunden vorkommen.
Voraussetzung für die Wirkung der Bakteriozine ist aber immer die Bindung an
Rezeptoren sensibler Zellen (7, 8). Diese sensiblen Zellen werden auch Empfänger-
oder Rezeptorzellen genannt. Andere Bezeichnungen lauten Ziel- oder Indikator-
organismus.
Die Wechselwirkung zwischen Bakteriozin und Bakterium (Zielorganismus)
läuft in zwei Schritten ab. Der erste Schritt ist die reversible Anlagerung des Mole-
küls an einen Zellwandrezeptor. Der zweite Schritt besteht aus einer irreversiblen
biochemischen Schädigung der jeweiligen Zielzelle (3). Die Anlagerung an die ent-
sprechende Bakterienzelle kann aber auch vollkommen unspezifisch erfolgen, wie
dies für Staphylococcin 1580 gezeigt wurde (9).
Verschiedene Bakteriozine können die DNA- oder die Proteinsynthese hem-
men. Einige sind auch in der Lage, gleichzeitig eine ganze Reihe von Zellaktivitäten
zu hemmen, wie die DNA-, RNA- und Proteinsynthese und weisen auch eine
Permeasefunktion auf. Sie interferieren vermutlich in erster Linie mit den Energie-
trägern des Bakteriums (10, 11). Die Wirkung von Bakteriozinen kann sehr stark
sein, oft genügt ein Bakteriozinmolekül, um ein Bakterium abzutöten (12).
Die Bakteriozinbildung kann in vitro relativ einfach beobachtet werden. Die
Bildung in vivo (Darm) resp. in situ (in einem Lebensmittel) ist immer noch recht
umstritten (6) auch wenn sie in einzelnen Fällen nachgewiesen werden konnte
(13–18).
Über die biologische Bedeutung von Bakteriozinen wird selten bis nie geschrie-
ben. Gerade die Publikationen neueren Datums behandeln nur Aspekte der poten-
ziellen Anwendungsmöglichkeiten in der Lebensmittelindustrie. Selbst die Lehr-
bücher der Mikrobiologie widmen diesem Phänomen wenig Platz. Es wird etwa auf
einen Zusammenhang zwischen Bakteriozinogenen als defekte Prophagen hinge-
wiesen (8). Das wiederum hiesse, dass Bakteriozine defekten Phagen entsprechen
könnten.

Klassierung der Bakteriozine von Milchsäurebakterien


Bakteriozine und bakteriozinähnliche Substanzen von Milchsäurebakterien
werden heute in vier Klassen eingeteilt (6, 7, 19, 20). Die Tabelle 1 bietet dazu einen
Überblick. Diese Klassierung muss als vorläufig angesehen werden. Sie widerspie-
gelt keine natürliche Ordnung, die auf einer klaren phänotypischen oder geneti-
schen Basis aufbaut. Es handelt sich vielmehr um ein pragmatisches System für eine

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Tabelle 1
Klassifizierung der Bakteriozine, die von Milchsäurebakterien gebildet werden
Klasse Subklasse Eigenschaften Beispiele
I Lantibiotika Nisin A, Nisin Z,
Lacticin 481
II kleine (<10 kDa), moderat (100°C) bis
hoch (121°C) hitzestabile, membranaktive
Peptide, die nicht Lanthionin enthalten
IIa anti-Listeria-aktive Peptide mit Pediocin PA1 (AcH),
-Y-G-N-G-V-X-C- in Nähe der Sakacin A, Leucocin A
Aminoendung
IIb Bakteriozine aus zwei Peptiden Lactococcine,
Plantaricine, Lactacin F
IIc Thiol aktivierte Peptide Lactococcin B
IId nicht zuteilbare Bakteriozine

III Grosse (>10 kDa) hitzestabile Proteine Helveticin J

IV Komplexe Bakteriozine: Protein mit


Lipid- und/oder Kohlehydrat-Bestandteil
Nach Cenatiempo et al. 1996 (55) und Nes et al. 1996 (20)

grobe Einteilung, die zum Teil die Screening-Absichten reflektiert. So kommt in der
Klasse IIa der anti-Listeria-Bakteriozine ein Pik in der Forschungsaktivität der
1990er Jahre zum Ausdruck, als sich weltweit unzählige Projekte mit der Suche
nach Bakteriozinen als natürliche Inhibitoren unerwünschter Bakterien in Lebens-
mitteln beschäftigten. Damals stand nach verschiedenen lebensmittelbedingten
Ausbrüchen Listeria monocytogenes im Mittelpunkt des Interesses.
Die Klasse I besteht aus kleinen Bakteriozinen, sogenannten Lantibiotika, die
nicht nur bei den Milchsäurebakterien, sondern auch bei zahlreichen anderen Gram
positiven Bakterien vorkommen. Diese Bakteriozine enthalten eine veränderliche
Anzahl modifizierter Aminosäuren (Dehydroalanin, Dehydrobutyrin, Lanthionin,
-Methyllanthionin). Prototypen davon sind Nisin A und Z, oder Lacticin 481.
Die Klasse II besteht aus Bakteriozinen mit verschiedenen Strukturen; dies
führte zu einer Untergruppierung innerhalb der Klasse.
– Die Bakteriozine der Klasse IIa sind klein (kleiner als 10 kDa) und besitzen eine
anti-Listeria-Aktivität von der Art des Pediocin PA-1 (oder AcH). Diese Bakte-
riozine (Sakacine, Leucocine, Mesentericine, Bavaricine, Acidocine, Carnobac-
teriocine) besitzen eine gemeinsame Struktur; die Aminosäuresequenz -Y-G-N-
G-V-X-C- (wobei X eine variable Aminosäure ist) in der Nähe vom NH2-Ende.
Mehrere Bakteriozine dieser Gruppe sind sehr ähnlich oder sogar identisch:
Sakacin A und Curvacin A sind identisch; ein Teil der Leucocine sind identisch
und sind alle dem Mesentericin Y105 sehr nah. Pediocin unterscheidet sich von

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den anderen bekannten Bakteriozinen dieser Gruppe, in dem es eine Disulfid-


brücke in der Nähe des C-Endes besitzt.
– Die Charakteristik der Bakteriozine der Klasse IIb ist das Vorkommen von
mehreren kurzen Peptiden, die einen Komplex bilden, der die Voraussetzung für
die biologische Aktivität ist. Zu dieser Gruppe gehören verschiedene Lactococ-
cine, Plantaricine und Lactacin F. Diese Bakteriozine sind vor allem gegen die
Milchsäurebakterien selber aktiv.
– Die Bakteriozine der Klasse IIc werden durch Thiole aktiviert; dazu gehört
Lactococcin B.
– Zu der Klasse IId gehören die Bakteriozine, die nicht den anderen Gruppen zu-
geteilt wurden.
Die Klasse III gruppiert Bakteriozine, die grösser als 10 kDa sind; als Beispiel ist
Helveticin J (37 kDa) zu erwähnen.
Die Klasse IV ist als Klasse nicht generell akzeptiert, da sie vermutlich viele bak-
terielle Bakteriozine beinhaltet, die nicht sauber gereinigt wurden (6).
Nicht zu den Bakteriozinen im eigentlichen Sinn werden die niedermolekularen,
antimikrobiellen Wirkstoffe Reuterin von Lactobacillus reuteri und 2-Pyrrolidon-
5-Carboxylsäure (PCA) von Lactobacillus casei ssp. casei, Lactobacillus casei ssp.
pseudoplantarum und Streptococcus bovis gerechnet (6).
Die Anzahl bekannter Bakteriozine hat ständig zugenommen, jedoch scheint die
reelle Anzahl neuer Strukturen zu stagnieren. Verschiedene Laboratorien haben
Bakteriozine charakterisiert, die sich voneinander nur sehr wenig unterscheiden
(7, 21–23).
Die systematische Wahl von nur einer begrenzten Anzahl Indikatorstämme
(sehr oft eine pathogene Spezies wie Listeria) führt zur Entdeckung von Bakteriozi-
nen, die schon durch andere Arbeitsgruppen identifiziert wurden. Ausserdem hin-
dert ein solches limitiertes Screening die Entdeckung anderer Bakteriozine, die
durch das gleiche Bakterium möglicherweise synthetisiert werden. Dies wurde
mehrmals bei den Carnobacterien nachgewiesen (7, 24, 25).

Bakteriozine von Milchsäurebakterien


Verschiedene Bakterienspezies, die in der Gewinnung und Veredelung von
Lebensmitteln eingesetzt werden, vermögen Bakteriozine zu bilden. Wir beschrän-
ken uns hier auf Bakteriozine von Milchsäurebakterien, die für die Fermentation
von Milchprodukten und anderen Lebensmitteln, wie z.B. Fleischprodukte, ver-
wendet werden. Die Tabelle 2 gibt eine Übersicht über Bakteriozine, die hauptsäch-
lich von Milchsäurebakterien aber auch von Bifidobakterien und Propionsäure-
bakterien gebildet werden. Für diese Zusammenstellung wurden Publikationen
berücksichtigt, die seit 1990 erschienen sind.
Von den bakteriozinbildenden Stämmen erhofft man sich eine Wirkung gegen-
über unerwünschten Keimen (pathogene und Schadkeime) in Produkten. Dies zeigt
sich in der Auswahl der Stämme, auf die sich das Wirkungsspektrum erstrecken soll.

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Tabelle 2
Bakteriozine von Milchsäurebakterien, Bifidobakterien und Propionsäurebakte-
rien und ihr Wirkungsspektrum
«Producer»-Stamm Bakteriozin Wirkungsspektrum Referenz
Lactobacillus
L. acidophilus Acidocin B L. monocytogenes; C. sporo- 56
genes; Brochothrix thermos-
phacta; L. fermentum; L. del-
brueckii subsp. bulgaricus
L. acidophilus 147 Bakteriozin LA-147 L. leichmanii; L. acidophilus; 57
L. fermentum; L. reuteri;
P. acidilactici; P. pentosaceus
L. acidophilus 30SC Bakteriozin ohne L. delbrueckii subsp. lactis; 58
Bezeichnung L. plantarum; Leuconostoc
subsp. L. ivanovii; S. aureus;
B. cereus; B. subtilis; L. casei
L. acidophilus CH5 Acidocin CH5 L. delbrueckii subsp. lactis 59
L. acidophilus IBB 801 Acidophilin 801 Lactobacillus spp., E. coli; 60
S. panama
L. acidophilus JCM 1132 Acidocin J1132 L. acidophilus; L. casei; 61
L. fermentum; L. plantarum
L. acidophilus JCM 1229 Acidocin J1229 Lactobacillus spp. 62
L. acidophilus LA-1 Acidophilicin LA-1 L. delbrueckii subsp. 63
bulgaricus; L. casei;
L. helveticus; L. jugurti
L. acidophilus LAPT1060 Acidophilucin A Lactobacillus spp. 64
L. acidophilus LF221 Acidocin LF221A L. acidophilus; L. delbrueckii 65
Acidocin LF221B subsp. bulgaricus; L. helveti-
cus; C. tyrobutyricum;
C. sporogenes; C. feseri;
C. septicum; C. difficile
L. acidophilus M46 Acidocin B Lactobacillus spp.; 66
C. sporogenes
L. acidophilus N2 Lactacin B L. leichmanii; L. bulgaricus; 67, 68
L. delbrueckii subsp. lactis;
L. helveticus
L. acidophilus TK8912 Acidocin 8912 Lactobacillus spp. 69
L. acidophilus TK9201 Acidocin A Lactobacillus spp.; 70
L. monocytogenes
L. bavaricus MI401 Bavaricin A L. monocytogenes 71
L. brevis 37 Brevicin 37 Pediococcus spp.; 72
Leuconostoc spp.;
Lactobacillus spp.
L. casei B80 Caseicin 80 L. casei 73

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«Producer»-Stamm Bakteriozin Wirkungsspektrum Referenz


L. casei CRL 705 Lactocin 705 L. plantarum CRL 691 74
L. curvatus IFPL105 Bakteriozin ohne L. lactis; S. salivarius subsp. 75
Bezeichnung thermophilus; L. casei;
L. curvatus; L. acidophilus;
L. bulgaricus; L. helveticus;
L. fermentum; P. pentosa-
ceus; E. faecalis; L. innocua;
L. monocytogenes;
B. subtilis; C. sporogenes;
C. tyrobutyricum
L. curvatus LTH1174 Curvacin A Lactobacillus spp.; 76
Listeria spp.; E. faecalis
L. curvatus SB13 Curvacin 13 L. monocytogenes 77
L. delbrueckii Bakteriozin ohne Influenzavirus 78
Bezeichnung
L. delbrueckii subsp. Bakteriozin ohne B. cereus F 4810 79
bulgaricus CFR 2028 Bezeichnung
L. delbrueckii subsp. Lactobacillin G4 L. delbrueckii subsp. 80
lactis G4 bulgaricus
L. fermentum Fermenticin L. fermentum FI 81
L. gasseri JCM 2124 Gassericin B1-B4 L. acidophilus; L. amylovorus; 82
L. casei; L. crispatus;
L. gallinarum; L. gasseri;
L. helveticus
L. gasseri KT7 Gassericin KT7 Lactobacillus spp.; Clostri- 83
dium spp.; Listeria spp.;
Enterococus spp.
L. gasseri LA39 Gassericin A L. delbrueckii subsp. 84, 64
bulgaricus; L. delbrueckii
subsp. lactis; L. helveticus;
L. casei subsp. casei; L. brevis;
L. plantarum
L. helveticus 481 Helveticin J L. helveticus; L. delbrueckii 85, 86
subsp. bulgaricus
L. helveticus LP27 Lactocin 27 L. helveticus; L. acidophilus 87, 88
L. helveticus V-1829 Helveticin V-1829 L. helveticus; L. delbrueckii 89
subsp. bulgaricus
L. johnsonii VPI11088 Lactacin F Lactobacillus spp.; E. faecalis 90, 91
L. pentosus TV35b Pentocin TV35b C. sporogenes; C. tyrobutyri- 92
cum; L. curvatus; L. fermen-
tum; L. sake; L. innocua;
P. acidipropionici;
Propionibacterium spp.;
Candida albicans

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«Producer»-Stamm Bakteriozin Wirkungsspektrum Referenz


L. plantarum Plantacin B L. plantarum 340 u. 1752; 93
L. mesenteroides 8015;
P. damnosus 1832
L. plantarum Plantaricin S Milchsäurebakterien; 94
Propionibacterium spp.;
C.tyrobutyricum
L. plantarum 35d Plantaricin 35d S. aureus; L. monocytogenes; 95
Aeromonas hydrophila
L. plantarum 83 Plantaricin SIK-83 S. aureus 96
L. plantarum C-11 Plantaricin A Milchsäurebakterien 97
L. plantarum UG1 Plantaricin UG1 B. cereus ATCC 14579 98
L. sake 706 Sakacin A Lactobacillus spp.; Leuco- 99, 100
nostoc spp.; Enterococcus
spp.; L. monocytogenes
L. sake CT372 Sakacin T L. monocytogenes; S. aureus 101
L. sake L45 Lactocin S Pediococcus spp.; Leucono- 102
stoc spp.; Lactobacillus spp.
L. sake LTH673 Sakacin P Lactobacillus spp.; 76
L. monocytogenes
L. salivarius M17 Salivaricin B Lactobacillus spp.; 66
L. monocytogenes; B. cereus;
B. thermosphacta;
E. faecalis
L. salivarius subsp. Salivacin 140 Actinomyces viscosus; 103
salicinus T140 L. monocytogenes;
S. aureus; S. mutans;
P. acnes; Y. enterocolitica
Lactococcus
L. lactis subsp. Diplococcin Lactococcus spp. 104,
cremoris 346 105
L. lactis subsp. Lactococine B E. coli 106,
cremoris 9B4 und M 107
L. lactis subsp.
diacetylactis UL720 Diacetin B L. monocytogenes; S. aureus; 108
Clostridium spp.
L. lactis subsp. lactis Nisin Streptococcus spp.; Lacto- 109, 110,
coccus spp.; Lactobacillus spp.; 111, 112,
Pediococcus spp.; Staphylo- 113
coccus spp.; Micrococcus spp.;
Listeria spp.
L. lactis subsp. Lacticin 3147 L. monocytogenes; L. para- 114, 16,
lactis DPCL4275 casei subsp. paracasei 115

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«Producer»-Stamm Bakteriozin Wirkungsspektrum Referenz


L. lactis subsp. Lacticin 3147 Streptococcus agalactiae; 116
lactis DPC3147 S. dysgalactiae; S. uberis;
S. aureus
L. lactis subsp. Lacticin 481 Milchsäurebakterien; 117, 118
lactis CNRZ 481 C. tyrobutyricum
L. lactis subsp. Lactococcin 484 Lactococcus spp.; L. mono- 119, 120
lactis 484 cytogenes; B. cereus; S. aureus;
S. thyphi; S. dysenteriae
L. lactis subsp. lactis Lactostrepcinsäure Lactococcus spp.; Strepto- 121
und cremoris coccus spp., L. helveticus,
Leuconostoc spp.
L .lactis subsp. lactis Lactococcin A Lactococcus spp. 122, 123,
und cremoris 124
L. lactis subsp. Lactococcin I Lactococcus spp.; 125
cremoris ACI Clostridium spp.
L. garviae L1–5 Garviaecin L1–5 Lactococcus spp.; L. mono- 126
cytogenes; Clostridium spp.
Streptococcus salivarius subsp. thermophilus
S. thermophilus St10 Bakteriozin S. thermophilus; L. bulgaricus 127, 128
ohne Bezeichnung
S. thermophilus Sfi13 Thermophilin 13 Listeria spp. 129
S. thermophiluus ST134 Thermophilin A S. thermophiluus 130
S. thermophilus 347 Thermophilin 347 L. monocytogenes 131
S. thermophilus Thermophilin T C. tyrobutyricum 132
ACA-DC 0040
Leuconostoc
L. gelidum UAL 187 Leucocin A-UAL Milchsäurebakterien; 133, 21
187 L. monocytogenes
L. mesenteroides Mesenterocin 5 L. monocytogenes; L. ivanovii; 134
E. faecalis; Brevibacterium
linens; P. pentosaceus
L. mesenteroides Mesenterocin Y105 L. monocytogenes 22
subsp. mesenteroides
L. paramesenteroides OX Leucocin S Milchsäurebakterien; 135
L. monocytogenes; S. aureus;
C. botulinum
Pediococcus
P. acidilactici PAC1.0 Pediocin PA-1 Milchsäurebakterien; Propioni- 136, 137,
(=AcH) bacterium spp.; Brochothrix 138, 139,
spp.; S. aureus; C. perfringens; 14, 15,
C. botulinum; L. mono- 140
cytogenes

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«Producer»-Stamm Bakteriozin Wirkungsspektrum Referenz


P. pentosaceus FBB61 Pediocin A L. mesenteroides; Pedio- 97, 141,
coccus spp. Micrococcus 113
luteus; E. faecalis; B. cereus;
S. aureus; Clostridium spp;
L. monocytogenes;
L. innocua; L. seeligeri;
L. ivanovii; L. welshimeri
Pediococcus sp. JD1-23 Bakteriozin ohne L. monocytogenes 142
und MP1-08 Bezeichnung
Bifidobacterium
B. bifidum NCFB 1454 Bifidocin B Listeria spp.; Enterococcus 143
spp.; Bacillus spp.; Lacto-
bacillus spp.; Leuconostoc
spp.; Pediococcus spp.
Propionibacterium
P. jensenii DF1 Propionicin SM1 P. jensenii DSM 20274 144
P. thoenii P127 Propionicin PLG-1 L. monocytogenes; 145
P. fluorescens; V. parahaemo-
lyticus; Y. enterocolitica;
Corynebacterium spp.

Die Stämme der Acidophilus-Gruppe sind aus der Probiotikasicht interessant.


Auffallend ist, dass deren Bakteriozine gegen eine ganze Reihe von Lactobacillus-
Stämmen wirksam sind.
Normalerweise wirken Bakteriozine gegen andere Bakterien. Nur in Ausnah-
mefällen wird über Wirkungen gegenüber anderen Mikroorganismen berichtet. So
hemmte der Stamm Lactobacillus pentosus TV35b neben verschiedenen Bakterien
auch die Hefe Candida albicans (92). Von einem Lactobacillus delbrueckii Stamm
wird über eine Wirkung gegenüber Influenzaviren in Hühnerembryo-Fibroblasten
berichtet (78).
Die Bakteriozine von Milchsäurebakterien können grob in zwei Gruppen einge-
teilt werden. Die erste Gruppe ist entweder nur gegen Stämme nahe verwandter
Spezies oder Spezies, die um dieselbe ökologische Nische konkurrieren, aktiv. Der
grösste Teil dieser Bakteriozine wird von Lactobacillus- und Lactococcus-Spezies
produziert. Die zweite Gruppe ist gegen ein breiteres Spektrum Gram positiver
Keime inklusive Lebensmittelverderbern und pathogenen Keimen aktiv. Beispiele
dafür sind Nisin, Pediocin A, und Pediocin PA-1. Die Anwendung solcher Stämme
als Starterkulturen kann die Vermehrung kompetitiver Keime unterbinden oder ein-
schränken, aber auch pathogene Keime in fermentierten und nicht fermentierten
Produkten unter Kontrolle halten (26).

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Etablierte Anwendungen von Bakteriozinen

Lebensmitteltechnologie
Bakteriozinbildende Stämme oder ihre Bakteriozine selbst sind für die Lebens-
mitteltechnologie sehr interessant. Im Hinblick auf die Wirkung der Bakteriozine
wurde auch der Begriff «Biokonservierung» verwendet (27, 28). In der Fleisch- und
Milchtechnologie wird nach Bakterienstämmen gesucht, die einerseits über gute
Startereigenschaften verfügen und darüber hinaus ebenfalls Bakteriozine zu bilden
vermögen, von denen man sich eine Eliminerung unerwünschter Keime verspricht.
Der grosse Erfolg ist aber bisher ausgeblieben.
Die Pediocine von Pediococcus acidilactici und die Bakteriozine der Nisingruppe
gehören wohl zu den best untersuchten Bakteriozinen der letzten Jahre. Verschie-
dene praktische Anwendungen zur Hemmung von L. monocytogenes und anderen
unerwünschten Keimen in Lebensmitteln sind beschrieben worden. Für Nisin sind
verschiedene Anwendungen in Lebensmitteln etabliert (29). In den meisten Län-
dern ist der Einsatz von Nisin bei der Lebensmittelherstellung mit Einschränkun-
gen erlaubt, in einigen Ländern ist er ganz freigegeben. So darf Nisin in Belgien,
Schweden und den Niederlanden in Käse, Schmelzkäse und weiteren Käsespezia-
litäten bis zu 500 Einheiten/g eingesetzt werden. Frankreich und Finnland erlauben
den Einsatz von Nisin in Schmelzkäse ohne Mengeneinschränkungen. Australien
und England erlauben Nisin generell für Käse ohne Limit (27). In der Schweiz ist
der Einsatz von Nisin (E234) seit dem 4. Juni 2002 erlaubt (30). Gereiften Käsen
sowie Käseerzeugnissen (Schmelz- und Streichschmelzkäse) darf bis 12,5 mg/kg
zugesetzt werden. In Mascarpone sind 10 mg/kg erlaubt. Griess- und Tapioka-
pudding und ähnliche Erzeugnisse dürfen 3 mg/kg enthalten.
Neben Nisin ist PA-1 von P. acidilactici wohl das am besten untersuchte Bakte-
riozin mit einem Potenzial zum Einsatz in Lebensmitteln. Es wurde bereits 1989
patentiert (140). PA-1 blieb während einer 28-tägigen Kühllagerung von Fleisch sta-
bil und vermochte L. monocytogenes zu hemmen (14). In Milchprodukten wie Cot-
tage cheese-Zubereitungen, Halbrahm, und Cheddar cheese soup konnte eine Hem-
mung von L. monocytogenes durch dieses Bakteriozin unter Laborbedingungen
ebenfalls nachgewiesen werden (15). In anderen Milchprodukten ist der erfolgreiche
Einsatz bisher aber nicht dokumentiert worden.
Bakteriozinbildende Stämme der Spezies Lactobacillus paracasei, Lactobacil-
lus lactis und Enterococcus faecalis hemmten das Auswachsen geringer Mengen von
L. monocytogenes in Camembert, wenn sie als einzelne Starterorganismen einge-
setzt wurden. Wurden sie zusammen mit anderen Starterkulturen eingesetzt, zeigte
sich aber nur eine sehr kleine Hemmwirkung (17). Andere lebensmitteltechnologi-
sche Anwendungen waren weniger erfolgreich. So konnten bakteriozinbildende
Pediokokken in Würsten L. monocytogenes, welche die Hitzebehandlung überlebt
hatten, nicht eliminieren (142).

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Mittlerweile werden verschiedene Bakteriozine als Konservierungsmittel in


Fleisch- und Fischprodukten eingesetzt. Ihr Beitrag zur Lebensmittelsicherheit
beschränkt sich dabei aber auf eine Barrierefunktion im Sinne der «Hürdentechno-
logie». Dabei können die in diesen Lebensmitteln aktiven proteolytischen Enzyme
die Wirkung der Bakteriozine zum Teil neutralisieren (31, 32).
Wisby vertreibt seit einigen Jahren die Oberflächenkultur ALC01 (ALC=Anti
Listeria Culture) zur Prävention von L. monocytogenes auf Käsen mit Rotschmiere-
reifung. Die Kultur wird in der Schweiz mit unterschiedlichem Erfolg eingesetzt
(R. Imhof und F. Rentsch, persönliche Mitteilung). Es handelt sich dabei um eine
Reinkultur eines Lactobacillus plantarum-Stamms, der aus Rohmilchweichkäse mit
Rotschmiere isoliert wurde und ein Bakteriozin vom Pediocintyp bildet. In Versu-
chen mit Vacherin Mont-d’Or, die künstlich mit Listeria innocua kontaminiert wur-
den (aus Sicherheitsgründen wurde für diesen Versuch eine nicht pathogene Spezies
verwendet), konnte bei allen Käsen, die mit ALC01 behandelt wurden, eine mehr
oder weniger starke Verminderung der L. innocua-Population beobachtet werden.
Der präventive Einsatz schien erfolgversprechender zu sein als der therapeutische
(33).

Ernährung und Medizin


Über den praxisreifen Einsatz von Bakteriozinen oder bakteriozinbildenden
Stämmen zur Beeinflussung der Darmflora sind in der Literatur keine Angaben zu
finden.

Eigene Erfahrungen

Bekämpfung unerwünschter Keime auf Käseoberflächen


An der Forschungsanstalt für Milchwirtschaft (FAM) wurden zwischen 1986
und 1994 verschiedene Arbeiten über die Möglichkeit der Hemmung von L. mono-
cytogenes auf der Käseoberfläche mit Bakteriozinen oder bakteriozinbildenden
Stämmen durchgeführt.
In einem unveröffentlichten Versuch 1986 wurde Nisin direkt auf Weichkäse,
die natürlich mit L. monocytogenes kontaminiert waren, aufgetragen. Dadurch
konnte eine deutliche Reduktion der Anzahl L. monocytogenes während 24 Stunden
erreicht werden. Anschliessend erreichte die Kontamination wieder das ursprüng-
lich Niveau. Als Grund wurden eine Resistenzbildung der L. monocytogenes-Flora
angenommen.
1989 wurden 80 Stämme verschiedener Bakterienarten, die aus der Rinde von
Vacherin Mont-d’Or isoliert wurden, auf eine allfällige Hemmwirkung gegen
L. monocytogenes untersucht. Bei neun Stämmen konnte eine In vitro-Hemmwir-
kung nachgewiesen werden, die an die Zellwand der Bakterien gebunden war. Ste-
rilfiltrate von Flüssigkulturen zeigten keine Hemmwirkung. Unter den neun Isola-
ten war kein Vertreter der Milchsäurebakterien dabei, es handelte sich um Stämme

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der Spezies Arthrobacter protophormiae, Arthrobacter uratoxidans sowie um Serra-


tia liquefaciens (34). Die Natur der Hemmwirkung wurde damals nicht abschlies-
send untersucht. Ein A. protophormiae-Stamm wurde 2001 in die FAM-Ober-
flächenmischkulturen OMK 702 und 703 aufgenommen.
1991 wurden ca. 80000 Kolonien aus Rohmilch und Käsen auf eine mögliche
Hemmwirkung gegenüber L. monocytogenes gescreent. Dabei wurden 118 poten-
zielle Donorstämme gefunden. Diese wurden 1992 auf ihre antagonistische Wir-
kung gegenüber Listeria spp. und anderen pathogenen Bakterien geprüft. Sieben
Stämme mit einer Wirkung gegen mehrere L. monocytogenes-Stämme wurden
gefunden: 2  Aerococcus viridans, 4  Enterococcus faecalis und 1  Brevibacterium
spp. Die Natur der Hemmwirkung wurde nur teilweise abgeklärt (35). Diese sieben
Stämme und ihre Kulturfiltrate wurden anschliessend auf Vacherin Mont-d’Or und
auf Halbhartkäsen auf eine in situ Hemmwirkung gegenüber L. monocytogenes
geprüft. Der erwünschte Erfolg blieb aber aus. In einigen Fällen vermochten sich
die Listerien auf den Versuchskäsen sogar noch besser vermehren (unpublizierte
Resultate).

Hemmung von Clostridien


Aktypis et al. (132) berichteten von einem Streptococcus thermophilus-Stamm,
dessen Bakteriozin Clostridium tyrobutyricum hemmte. In der Folge untersuchte
die FAM 1999 die S. thermophilus-Stämme ihrer Stammsammlung sowie 200
S. thermophilus-Stämme aus Rohmilchproben erfolglos auf eine Bakteriozinbil-
dung. Die untersuchten Rohmilchen stammten aus Käsereien, die ihre Molke nicht
an die Milchlieferanten abgaben. Dies stellte sicher, dass nicht Stämme aus FAM-
Kulturen, sondern Wildstämme isoliert wurden, was mittels genetischer Charakte-
risierung auch bestätigt werden konnte (M. Casey, persönliche Mitteilung).

Möglichkeiten und Grenzen der Bakteriozinforschung

Lebensmitteltechnologie: unerwünschte Keime in Produkten


Viele Bakterienspezies biotechnologischen Interesses sind in der Lage Bakterio-
zine zu produzieren. Potenzielle Ökosysteme für den Einsatz bakteriozinbildender
Stämme sind
– Produkte aus der Milchwirtschaft (L. lactis ssp. lactis und ssp. cremoris, Leuco-
nostoc, Pediococcus spp., Lactobacillus helveticus, L. delbrueckii ssp. lactis und
ssp. bulgaricus, L. casei, L. plantarum);
– fermentierte Fleischprodukte (Lactobacillus sake, Pediococcus spp., Leuconostoc);
– fermentierte pflanzliche Produkte (L. casei, L. plantarum, Pediococcus spp.).
Aus verschiedenen Arbeiten ist ersichtlich, dass Produktion, Stabilität, Wir-
kungsspektrum und andere Eigenschaften von Bakteriozinen selbst unter gleich
bleibenden Versuchsbedingungen oft variable Parameter sind. Dies könnte die
Möglichkeiten eines Einsatzes in der Praxis stark begrenzen (36). Arbeiten über die

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Faktoren, welche die Mikroflora innerhalb eines Mikroökosystems beeinflussen


können, sind selten. Sehr selten wurde die Aktivität in vivo gezeigt. Da die meisten
Ökosysteme sehr komplex sind, ist es schwierig die chemischen, physikalischen und
mikrobiologischen Bedingungen für das Studium in vitro zu reproduzieren (37, 28).
Der Einsatz von Starterkulturen mit antimikrobieller Aktivität kann im Sinne
der Hemmung pathogener Erreger oder Verderbniskeime vorteilhaft sein. Anderer-
seits können solche Kulturen andere Milchsäurebakterien und andere nützliche
Keime hemmen und somit die Eigenschaften des Produktes verändern (38, 39). Die
Tatsache, dass Bakteriozine auch gegen andere Stämme der eigenen Spezies wirken,
ist fatal bei Stämmen, die sich für die Herstellung von Milchprodukten eignen.
Doch wurden bereits Strategien entwickelt, wie Stämme innerhalb des Wirkungs-
spektrums resistenter gemacht werden können, etwa durch Exposition an steigende
Bakteriozin-Konzentrationen (115). Ein grosses Problem für die Beurteilung der
Vergleichbarkeit der Wirksamkeit von Bakteriozinen in verschiedenen Studien sind
die fehlenden Angaben über die minimale inhibitorische Konzentration (40).
Hug-Michel et al. wiesen schon 1989 darauf hin, dass im Hinblick auf einen Ein-
satz hemmstoffbildender Stämme zur Bekämpfung unerwünschter Keime auf der
Käseoberfläche das Wirkungsspektrum der Hemmstoffbildner genau untersucht
werden muss. Es dürfen nur Organismen auf die Käseoberfläche gebracht werden,
die nicht gleichzeitig auch das delikate Gleichgewicht der erwünschten Reifungs-
flora verschieben (34). Mehrere Autoren konnten die Störung des Gleichgewichtes
innerhalb von Startern zeigen, die aus verschiedenen Stämmen oder Spezies
zusammengesetzt waren und einen bakteriozinbildenden Stamm enthielten (41–
43, 117, 127).
Die Voraussetzungen für die Anwendung bakteriozinbildender Milchsäure-
bakterien sind nach Giraffa und Carminati (37):
1. Isolierung aus dem selben Ökosystem, in dem sie später eingesetzt werden
sollen;
2. Bestimmung des Wirkungsspektrums;
3. Das Studium der optimalen Bedingungen für die Produktion der Bakteriozine;
4. Die Überprüfung der Aktivität in vivo; die Selektion kompatibler Stämme (resis-
tent gegen das Bakteriozin) für die Vorbereitung der Starterkultur;
5. Die Charakterisierung und die Reinigung der Substanz.
Die rasche Ausbildung von Resistenzen gegenüber Bakteriozinen wurde bei
verschiedenen pathogenen Keimen mehrfach beobachtet. Mögliche Auswege sind
bereits vorgedacht worden, z.B. durch kombinierten Einsatz zwei verschiedener
Bakteriozine (77) oder durch Verbesserung der Stabilität des Bakteriozins mit mole-
kularbiologischen Techniken (44). Aber die Häufigkeit des Auftretens von Resis-
tenz gegenüber Nisin und anderen Bakteriozinen stellt die Wirksamkeit der Bakte-
riozine für die Konservierung von Lebensmitteln in Frage (45).
Durch den kombinierten Einsatz von Enterokokken-Kulturen und bakteriozin-
bildenden Starterkulturen (aktiv gegen die Enterokokken) wird versucht, die rasche

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Freisetzung von Reifungsenzymen in Käse zu bewirken. Entsprechende technische


Anwendungen sind in Entwicklung, Publikationen sind aber kaum verfügbar (114).
Lediglich das Klonen des Pediocin-Operons in S. thermophilus ist beschrieben wor-
den (46).

Ernährung: Beeinflussung der Darmflora


Als Anwendung wäre die Abtötung pathogener oder anderer erwünschter
Keime im Darm denkbar. Der Einsatz von Bakteriozinbildnern in Lebensmitteln
hätte dabei wohl analog den Probiotika eher eine prophylaktische denn eine thera-
peutische Wirkung.
Neben der schnellen Resistenzbildung bei den Zielorganismen kommt die emp-
findliche Natur der Bakteriozinmoleküle erschwerend hinzu. Als Proteine resp.
Peptide sind sie in Lebensmitteln wie Milchprodukten und auch im Verdauungs-
trakt verschiedenen Enzymen ausgesetzt, die ihre Wirkung zunichte machen. Um
dieser Verdauungswirkung zu entgehen, müssten zuerst entsprechende Wege für die
erfolgreiche Einschleusung gefunden werden (verdauungsresistente Kapseln).
Sollen Bakteriozinbildner erfolgreich im Darm angesiedelt werden, müssen
diese Stämme die entsprechenden Kriterien zur Konkurrenzfähigkeit sowie Leis-
tung und Funktionalität erfüllen wie sie für die probiotischen Stämme formuliert
wurden und in der Tabelle 3 zusammengestellt sind.

Tabelle 3
Wichtigste Selektionskriterien für probiotische Keime
Behauptung am Zielort Wirkungen
– Fähigkeit zum Überleben, zur Vermehrung – Fähigkeit, eine oder mehrere klinisch
und zur metabolischen Aktivität im Darm dokumentierte Gesundheitsvorteile zu
bewirken
– Gallenresistenz
– Antagonistisch gegenüber pathogenen/
– Säureresistenz kariogenen Bakterien

– Fähigkeit, mit der normalen Mikroflora – Produktion antimikrobieller Verbin-


zu konkurrieren, einschliesslich der dungen (Bakteriozine, Wasserstoff-
gleichen oder eng verwandten Arten; peroxid, organische Säuren oder andere
grösstmögliche Resistenz gegenüber hemmende Verbindungen)
Bakteriozinen, Säuren und anderen von
der normalen Mikroflora produzierten – Immunstimulation
antimikrobiellen Verbindungen
– Antimutagene Wirkung
– Potenzial zur Haftung und Kolonisierung
im Darm – Antikarzinogene Wirkung

– Produktion bioaktiver Verbindungen


(Vitamine, Vakzine, Peptide)
Nach Klaenhammer and Kullen 1999 (146).

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Die für die Milchwirtschaft interessanten Keime, welche zur Zeit als Probiotika
in Frage kommen, gehören vor allem zur Acidophilus-Gruppe, zu den Bifidobakte-
rien und zur Spezies Lactobacillus rhamnosus. Während über die Bildung von Bak-
teriozinen durch die Bifidobakterien (143) und L. rhamnosus wenig bekannt ist,
sind diese Zusammenhänge bei Lactobacillus acidophilus besser untersucht. So
berichten Barefoot et al. dass 63% der von ihnen isolierten Stämme von L. acido-
philus Bakteriozine produzieren (67). Da L. acidophilus im Darm von gesunden
Menschen vorkommt, könnte die Selektion bakteriozinbildender Stämme von
L. acidophilus für die Kontrolle und Regulierung der Darmflora interessant sein
(47). Meistens haben aber die Bakteriozine von L. acidophilus ein sehr enges Wir-
kungsspektrum, das auf nahe verwandte Lactobacillus-Spezies begrenzt ist (84).
Es wird aber auch über L. acidophilus-Stämme berichtet, die gegen andere Gram
positive Keime aktiv sind. Der Stamm LF221 z.B. produziert mindestens zwei Bak-
teriozine (Acidocin LF221A und LF221B), die auch gegen einige Gram positive
Keime, u.a. L. innocua, S. aureus und D-Streptokokken, aktiv sind (65). Das Bakte-
riozin von L. acidophilus 30SC hemmt u.a. Stämme von Bacillus cereus, Bacillus sub-
tilis, Listeria ivanovii und Staphylococcus aureus. Gram negative Keime werden aber
nicht gehemmt (58).
L. acidophilus AR1 produziert ein Bakteriozin, das in vitro gegen Stämme von
B. subtilis, Bacillus megatherium, S. aureus, Escherichia coli, Enterobacter aerogenes,
Salmonella typhosa, Salmonella paratyphi und Hefe-Spezies aktiv ist (48). Zamfir et
al. haben ein Bakteriozin von L. acidophilus gereinigt und charakterisiert (Acido-
philin 801), das gegen die enteropathogenen E. coli und Salmonella panama aktiv ist
(60). Kawai et al. (49) haben einen Stamm der Acidophilus-Gruppe (Spezies wird
nicht angegeben) isoliert, das gegen Salmonella thyphimurium und E. coli aktiv ist.
Von fünf untersuchten Stämmen von Bifidobacterium bifidum bildete nur der
Stamm NCFB 1454 Bifidocin B, das auch gegen Stämme der Genera Listeria, Entero-
coccus und Bacillus aktiv ist (143). Mantere-Alhonen et al. (50) berichten über
Stämme von L. acidophilus, B. bifidum und Bifidobacterium longum, die das
Wachstum von E. aerogenes, E. coli, Enterobacter cloacae, Pseudomonas vulgaris
und S. aureus durch proteinhaltige Substanzen hemmen. Gonzales et al. (51) unter-
suchten Stämme von L. acidophilus, die inhibierende Substanzen gegen E. coli,
Klebsiella pneumoniae, S. typhimurium, Serratia marcescens und E. cloacae in vitro
bildeten. Allerdings wurde nicht abgeklärt, ob es sich dabei um Bakteriozine han-
delt. Die untersuchten Stämme wurden von den Autoren als potenzielle Therapeu-
tika beim Mensch in Betracht gezogen. Der Überstand einer Kultur von L. acido-
philus (Lactobacillus johnsonii) La1 scheint eine Substanz zu enthalten, die H. pylori
in vitro hemmt. Die Natur dieser Substanz wurde nicht näher beschrieben (52).
Es wurde auch bereits versucht, den menschlichen Darm mit Präparaten von
L. acidophilus selektiv zu kolonisieren. Oft mit wenig Erfolg und ohne messbare
Wirkung auf die Anzahl der Coliformen. Eine Vielzahl von Studien über die
Behandlung von Durchfall mittels L. acidophilus war erfolglos; andere hingegen

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zeigten einen positiven Effekt. Die Hauptfrage scheint diejenige der erfolgreichen
Besiedlung zu sein (53).

Sicherheitsaspekte
Alle Spezies in der Tabelle 2 sind in die Risikogruppe 1 eingeteilt; sie gelten
somit als Mikroorganismen, die kein oder ein vernachlässigbares Risiko aufweisen.
Einzig Lactobacillus garviae und L. rhamnosus werden der Risikogruppe 2 zuge-
ordnet (54), wobei im Falle von L. rhamnosus die Stämme, die langjährig sicher in
der technischen Anwendung gehandhabt wurden, in der Gruppe 1 eingeteilt wer-
den. Bei Lactobacillus gasseri, L. johnsonii, L. plantarum, Lactobacillus mesenteroi-
des subsp. mesenteroides findet sich zusätzlich die Bemerkung «In Einzelfällen als
Krankheitserreger nachgewiesen oder vermutet, überwiegend bei erheblich abwehr-
geminderten Menschen».
Die BUWAL-Liste beurteilt die Gefahren, die beim Umgang mit Mikroorganis-
men auftreten können. Über die Eignung zum Einsatz eines Stammes in Lebensmit-
teln sagt sie nichts aus. Dazu müssen weitere Fragen zu Eigenschaften eines Stamms
geklärt werden, welche die menschliche Gesundheit betreffen, wie z.B. die Bildung
biogener Amine, natürlicher und erworbener Antibiotikaresistenzen, toxische
Stoffe und Allergene.

Schlussfolgerungen
Verschiedene Einsatzmöglichkeiten von Bakteriozinen in der Lebensmitteltech-
nologie und im Bereich vom functional food werden zwar intensiv untersucht, aber
bis jetzt sind, mit Ausnahme von Nisin, keine praxisreifen Anwendungen doku-
mentiert. Erfolgsversprechende Resultate im Laboratorium können in der prakti-
schen Anwendung bei Lebensmitteln meist nicht bestätigt werden. Die Inak-
tivierung der Bakteriozine in enzymhaltigen Lebensmittelmatrizes und im
Verdauungstrakt und die rasche Resistenzbildung bei Zielorganismen sind für
dieses Phänomen verantwortlich.
Die Wirkungsmechanismen und die Wirkungsspektren der meisten Bakterio-
zine sind nur ungenügend abgeklärt. Die möglichen unerwünschten Wirkungen der
Bakteriozine auf den menschlichen Organismus, wie Veränderungen der Darm-
flora, Allergien oder Stoffwechselinterferenzen, sind ebenfalls nicht eingehend
untersucht.
Das Anwendungspotenzial von Bakteriozinen in der Milchwirtschaft muss zur
Zeit als gering eingeschätzt werden.

Zusammenfassung
Die vorliegende Literaturübersicht fasst die neuesten Erkenntnisse aus der Bak-
teriozinforschung seit 1990 zusammen und zeigt Trends in der Nutzung von Bakte-
riozinen in der Lebensmitteltechnologie, insbesondere der Milchwirtschaft und bei
probiotischen Erzeugnissen auf. Die Bakteriozinforschung kann zwar für einige

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Anwendungen Erfolgsmeldungen verbuchen. Eine durchschlagende Anwendung


von Bakteriozinen in der Lebensmitteltechnologie oder im Bereich von functional
food zeichnet sich aber nicht ab. Zwei Faktoren sind für dieses Phänomen verant-
wortlich: Die Inaktivierung der Bakteriozine in enzymhaltigen Lebensmittelmatri-
zes und im Verdauungstrakt sowie die rasche Resistenzbildung bei Zielorganismen.
In der Bakteriozinforschung folgen auf «erfolgversprechende» In vitro-Resultate
oft ernüchternde In vivo-Resultate. Dies und die Tatsachen, dass meist weder die
Wirkungsmechanismen noch die Wirkungsspektren der Bakteriozine genügend
abgeklärt werden, können als Indiz dafür gewertet werden, dass den Bakteriozinen
wohl doch nicht der durchschlagende Erfolg beschieden sein wird wie den Antibio-
tika.

Résumé
Le présent aperçu relatif à la littérature de référence résume les dernières
connaissances issues de la recherche dans le domaine des bactériocines depuis 1990
et indique les tendances concernant l’utilisation des bactériocines en technologie ali-
mentaire et en particulier dans l’industrie laitière. La recherche dans le domaine des
bactériocines a certes pu enregistrer des succès au niveau de certaines applications.
Cependant, une application efficace des bactériocines en technologie alimentaire ne
se profile pas. Deux facteurs sont responsables de ce phénomène : l’inactivation des
bactériocines dans une matrice alimentaire contenant des enzymes et dans le tube
digestif ainsi que la formation rapide de résistance auprès des organismes cibles.
Dans le domaine de la recherche des bactériocines, les résultats «prometteurs» enre-
gistrés in vitro sont souvent suivis par des résultats décevants in vivo. Ceci et le fait
que, la plupart du temps, ni les mécanismes d’activité ni les spectres d’activité des
bactériocines ne peuvent être suffisamment clarifiés peut être considéré comme un
indice que les bactériocines ne sont apparemment pas promis à un succès aussi écla-
tant que les antibiotiques.

Summary “Bacteriocins and Bacteriocin-like Substances of Lactic Acid


Bacteria and their use in Food Technology”
This review summarizes recent research on bacteriocins and shows trends in the
use of bacteriocins in food technology. It focusses on bacteriocins of lactic acid bac-
teria and other bacterial species important to the dairy field. Research on bacteri-
ocins has resulted in a few promising applications. But so far there has been no real
breakthrough for their use in food technology. Two factors are responsible for this
phenomenon: the inactivation of bacteriocins in food matrices containing active
enzymes, and the rapid development of resistant target micro-organisms. Further-
more, in most cases the mechanisms of action and the spectrum of susceptible
strains has only been investigated poorly. There is a lack of investigations on the
possible undesired effects of bacteriocins on human organisms such as changes in

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the intestinal flora, development of allergies, or metabolic interferences. This indi-


cates that bacteriocins could not have the same succes as antibiotics.

Key words
Bacteriocin, Lactic acid bacteria, Food technology, Probiotics, Safety aspects

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biol. 50, 45 – 57 (1999).

Korrespondenzadresse: Dino Isolini, Forschungsanstalt für Milchwirtschaft Liebe-


feld, CH-3003 Bern. E-mail: dino.isolini@fam.admin.ch

Mitt. Lebensm. Hyg. 93 (2002) 527


528 17.10.2002 9:06 Uhr Seite 528

Veranstaltungshinweise

EURO FOOD CHEM XII


Strategies for Safe Food
24–26 September 2003
Congresscenter Oud Sint-Jan
Brugge, Belgium
Info: http://allserv.rug.ac.be/~hdbraban/VCV-EFC12home.html

EURO FOOD CHEM XII Secretariat


c/o Rudy Senten
Karel Mertensstraat 15
BE-2020 Antwerpen
Belgium
Fax +32 65 204 645
E-mail: rudy.senten@antwerpen.be

Call for papers: bis 15. Januar 2003

528 Mitt. Lebensm. Hyg. 93 (2002)


529 17.10.2002 9:06 Uhr Seite 529

Schweizerische Gesellschaft für Lebensmittelhygiene (SGLH)


Die Schweizerische Gesellschaft für Lebensmittelhygiene (SGLH) hat sich im
Interesse der öffentlichen Gesundheit die Förderung einer hygienisch sicheren
Ernährung, die Bearbeitung fachspezifischer Anliegen der Lebensmittelhygiene
sowie den Erfahrungsaustausch unter den Mitgliedern zur Aufgabe gemacht.
Diese Ziele sucht die SGLH mit der Durchführung von jährlichen Arbeits-
tagungen, praktisch orientierten Fachkursen, Fachvorträgen und Workshops zu
erreichen. Sie schafft und fördert Arbeitsgruppen zur Behandlung aktueller
Probleme der Lebensmittelhygiene und unterstützt aktiv das Ausarbeiten von
Vorschlägen für Normen und Beurteilungskriterien mikrobiologischer Unter-
suchungen. Diese Ziele möchte die SGLH in enger Zusammenarbeit mit anderen
Fachgruppierungen, Behörden, Lehranstalten und weiteren Interessenvertretern
der Lebensmittelsicherheit realisieren.
Den Veranstaltungen sind jeweils Themen aus dem Bereich der Lebensmittel-
hygiene gewidmet, vor allem Fragen der hygienischen Behandlung von Lebens-
mitteln, der modernen mikrobiologischen Diagnostik und der Bekämpfung von
Lebensmittelinfektionen und -intoxikationen. Das Verständnis aktueller For-
schungsresultate und deren Umsetzung in die Praxis soll generell gefördert werden.
Die SGLH zählt 560 Mitglieder. Zu ihnen gehören insbesondere Vertreter der
gewerblichen und industriellen Lebensmittelproduktion, Mitglieder schulischer
Einrichtungen sowie Mitarbeiter der Überwachungsbehörden.
Der Mitgliederbeitrag beträgt Fr. 50.– für Einzelmitglieder und Fr. 200.– für
Kollektivmitglieder.
Die «Mitteilungen aus Lebensmitteluntersuchung und Hygiene» sind das offi-
zielle Publikationsorgan der SGLH. Der Preis für das Abonnement ist im
Mitgliederbeitrag inbegriffen.
Weitere Informationen zu Leitbild und Schwerpunkten der SGLH-Aktivitäten
sind auf der Homepage unter www.sglh.ch zu finden.

Werden auch Sie Mitglied der SGLH!


Anmeldung direkt via Internet mit dem Formular auf der Homepage
www.sglh.ch.
Leo Meile, Präsident der SGLH, Labor für Lebensmittelmikrobiologie, ETHZ,
CH-8092 Zürich, E-mail: leo.meile@ilw.agrl.ethz.ch

Mitt. Lebensm. Hyg. 93 (2002) 529


530 17.10.2002 9:07 Uhr Seite 530

Société suisse d’hygiène des denrées alimentaires (SSHDA)


La société suisse d’hygiène des denrées alimentaires (SSHDA) œuvre dans
l’intérêt de la santé publique par la promotion de la sûreté hygiénique des aliments,
en informant sur les questions actuelles liées à l’hygiène des denrées alimentaires et
en favorisant les échanges d’expérience entre ses membres.
La SSHDA assure la poursuite de ces buts par des journées de travail, des cours
techniques orientés vers la pratique, des conférences spécialisées et des workshops.
Elle crée et encourage la mise sur pied de groupes de travail consacrés à l’analyse des
problèmes actuels et soutient activement l’élaboration de propositions de normes et
de critères d’appréciation pour les analyses microbiologiques alimentaires. La
SSHDA veut réaliser ces buts en étroite collaboration avec d’autres associations, les
instances officielles, les universités, les écoles supérieures et d’autres personnes ou
institutions œuvrant dans le domaine de la sûreté alimentaire.
Les activités de la société sont consacrées à des thèmes d’actualité liées à l’hy-
giène des denrées alimentaires, avant tout dans les domaines du traitement hygiéni-
que des denrées alimentaires, des méthodes modernes de diagnostic microbiologi-
que et de la lutte contre les intoxications et infections d’origine alimentaire. La
compréhension des résultats de recherche actuels et leur application dans la pratique
doivent être encouragées d’une manière générale.
La SSHDA compte 560 membres. Parmi eux se trouvent en particulier des re-
présentants de l’industrie alimentaire et de la production alimentaire artisanale, des
membres d’institutions de formation professionnelle, ainsi que de nombreux colla-
borateurs des instances officielles de surveillance.
La cotisation annuelle s’élève à Fr. 50.– pour les membres individuels et à
Fr. 200.– pour les membres collectifs.
Les «Travaux de chimie alimentaire et d’hygiène» constituent l’organe de publi-
cation officiel de la SSHDA. Le prix de l’abonnement est compris dans le montant
de la cotisation.
Des informations concernant la vision directrice et les centres d’intérêt de la
SSHDA se trouvent sur Internet à l’adresse www.sglh.ch.

Devenez vous aussi membre de la SSHDA!


Inscription en qualité de membre de la SSHDA directement par Internet sur le
site www.sglh.ch.
Leo Meile, président de la SSHDA, Labor für Lebensmittelmikrobiologie, ETHZ,
CH-8092 Zürich, E-mail: leo.meile@ilw.agrl.ethz.ch

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