MÉTODOS DE DETERMINACIÓN DE BIOELEMENTOS

La muestra es introducida de manera continua en un

Permite determinar de forma cuantitativa la mayoría
sistema de nebulización que forma un aerosol, el cual
de los elementos de la tabla periódica a niveles de
ICP Plasma de Acoplamiento Inducido es transportado por el argón a la antorcha del
traza y ultratraza, partiendo de muestras en
plasma, acoplado inductivamente por radio
disolución acuosa.
frecuencia.
La muestra en forma líquida es transportada por medio de una bomba peristáltica hasta el sistema
Absorción y
nebulizador, donde es transformada en aerosol gracias a la acción del argón. Dicho aerosol es conducido a
Emisión Plasma de Acoplamiento Inducido
la zona de ionización (plasma generado al someter un flujo de gas argón a un campo magnético oscilante
Atómica ICP-OES +
inducido por una corriente de alta frecuencia). Los átomos de la muestra son ionizados/excitados y, al volver
Espectrofotómetro de Emisión Óptico
a su estado fundamental, emiten radiaciones de una longitud de onda característica. Los espectros son
dispersados por la red de difracción y el detector se encarga de medir las intensidades de las líneas.
Plasma de Acoplamiento Inducido
ICP-MS + Permite identificar y cuantificar los bioelementos.
Espectrofotómetro de Masas
El electrodo de ion selectivo debe estar sumergido en la solución acuosa que se contiene
Se utilizan para medir la concentración de una especie en particular en la solución y el ion que se desea medir, y en la misma solución estará el electrodo de referencia. Cuando
están diseñados para que su potencial dependa únicamente de la concentración de las el ion a medir atraviesa la membrana del electrodo de ion selectivo, debido al gradiente de
especies deseadas. concentración, se genera una diferencia de potencial, la cual es proporcional a la
concentración molar del ion.
Electrodos
Membranas
Selectivos (ISE) Cristal único Policristalino
Cristalinas
Membranas No
Vidrio Líquidos
Cristalinas
Electrodos
Gases Enzimas
Sensores
Métodos espectrofotométricos indirectos O-cresolftaleína Arsenazo III
Calceína (A: 490 nm; E: 520 nm) y otros indicadores como EDTA y EGTA.
Calcio
Método fluorescente Calcio + calceína → complejo fluorescente; el EDTA y el EGTA son más afines al calcio → se observa
pérdida de fluorescencia –↑EDTA/EGTA, ↑Calcio.
Métodos Forma complejos con sales de molibdato → azul de molibdeno (A: 690 nm).
Químicos Fósforo Método espectrofotométrico Se utilizan agentes para reducir el complejo de fosfomolibdeno.
Debe evitarse la presencia de citrato, oxalato, EDTA y pigmentos como la bilirrubina.
Métodos de emisión atómica
Hierro Batofenantrolina + Fe (II) → complejo de color rojo Ferrozina + Fe (II) → complejo de color magenta (A:
Métodos espectrofotométricos
(A: 540 nm). 562 nm).
 MÉTODOS DE DETERMINACIÓN DE AMINOÁCIDOS
1. La ninhidrina provoca la descarboxilación oxidativa de los aminoácidos produciendo amoníaco y
Permite la determinación de aminoácidos que
reduciéndose.
presentan un grupo carboxilo y un grupo amino
Método 2. El amoníaco se combina con una molécula de ninhidrina reducida y con otra molécula de ninhidrina
libres. Es una reacción general para todos los
de la Ninhidrina dando un complejo de color púrpura-azulado.
aminoácidos, excepto para la prolina y la
➢ La reacción transcurre a pH ácido (3-4) y a temperaturas elevadas.
hidroxiprolina, que son iminoácidos.
➢ Requiere de la eliminación previa de proteínas, amoníaco y urea.
El reactivo de Sanger (2,4-dinitrobenceno) +
Método de El coeficiente de extinción molar de cada Las lecturas a 420 nm dan mejores resultados para
grupo amino libre (medio básico) → dinitrofenil
Sanger aminoácido varía. una mezcla de aminoácidos.
Aminoácidos derivado (DNP) amarillo.
Totales Método de
Aminoácidos + reactivo de Edman (fenilisotiocianato, PITC) → feniltiocarbamil aminoácidos (A: 254 nm).
Edman
Aminoácidos + o-ftaldehído + reductor fuerte Sin necesidad de calentamiento. Prolina e hidroxiprolina + agente oxidante
Método del
(2-mercaptoetanol) (pH 9-11) → compuesto Más sensible que el de la ninhidrina → se emplea en (hipoclorito sódico).
O-ftaldehído
fluorescente (A: 340 nm; E:455 nm). cuantificación de aminoácido por analizadores. Cisteína y cistina → a ácido cisteico.
El producto es inestable en disoluciones acuosas →
Reacción Aminoácidos (aminas primarias) +
reactivo en acetona. Prolina e hidroxiprolina (aminas secundarias) + N-
de la Fluorescamina (medio básico) → derivado
La reacción tiene lugar rápidamente a temperatura clorosuccinimida → aminas primarias.
Fluorescamina fluorescente (A: 390 nm; E: 475nm).
ambiente.

Tirosina Tirosina + 1-nitroso-2-naftol + nitrato sódico → compuesto de color rojo + calor + ácido nítrico → compuesto fluorescente amarillo (A: 460 nm; E:570 nm).

Fenilalanina + ninhidrina + dipéptido (glicil-leucina o leucilalanina) → compuesto fluorescente + tartrato de cobre alcalino (pH 5.8) → compuesto más
Fenilalanina
fluorescente (A: 365 nm; E: 515 nm).
Para cistina y homocistina → reducirse con cianuro
Cisteína Aminoácidos sulfurados + nitroprusiato sódico → compuesto rojo-púrpura.
sódico.

Aminoácidos En las mismas condiciones, el tiempo que tarda en salir un compuesto o el Salen los aminoácidos La MetSO es el patrón
El área del pico será la
Individuales HPLC volumen necesario para que eluya de la columna (tiempo o volumen de según su polaridad, de interno → controlar las
concentración.
retención) será siempre el mismo. más polares a menos. pérdidas de muestra.

Utilizan resinas de intercambio iónico para la separación de éstos.
La variación del pH del tampón eluyente permite separar los aminoácidos.
Analizador
Los aminoácidos son eluídos de manera diferencial aumentando el pH del
Automático
eluyente de manera gradual, lo que provoca que los aminoácidos con pI
más bajo sean eluídos en primer lugar.
A la salida de la columna de separación cromatográfica, se acopla la entrada de
reactivo de ninhidrina y se incuba el eluido junto con el reactivo en un baño a 100
ºC.
Los aminoácidos reaccionan con la ninhidrina produciendo compuestos
coloreados (A: 570 y 440 nm, para aminoácidos e iminoácidos respectivamente).
 MÉTODOS DE DETERMINACIÓN DE CARBOHIDRATOS
Digestión alcalina de las muestras con KOH al 30% → solubilización de las proteínas y liberación de
Purificación glucógeno + etanol → precipitación del glucógeno con restos proteicos + ácido tricloroacético →
Glucógeno solubilización del glucógeno y precipitación de las proteínas.
Deshidratación de azúcares con ácidos concentrados (antrona) + calor → formación de furfurales + fenoles
Cuantificación
→ derivado cíclico verdeazulado (A: 590 nm).
Métodos
Glucosa Oxidasa Hexoquinasa
Enzimáticos
Carbohidratos
Totales Almidón Puede determinarse por hidrólisis enzimática por acción de la amiloglucosidasa seguida de la determinación enzimática de la glucosa formada.

Los crisoles se pesan: uno para las cenizas y otro

La fibra precipita con etanol → filtrado de la solución para el contenido residual de proteínas por el método
Eliminación de proteínas y carbohidratos que
en dos crisoles de 40-60 μm de poro → se eliminan Kjeldahl.
Fibra no forman parte de la fibra (amilasa, proteasa
los compuestos solubles que han aparecido tras la Fibra = muestra original – filtrado (del que se
y amiloglucosidasa).
acción de las enzimas. descuentan las proteínas residuales y de cenizas).

Tiene que llevarse a cabo utilizando los derivados volátiles de los Las condiciones de la derivatización han de ser suaves para evitar las
GC
carbohidratos: los más utilizados son los derivados del O-trimetilsilil. isomerizaciones al azar.
Carbohidratos Para la determinación se emplea el índice de refracción, que es dependiente de
Individuales la longitud de onda de la luz incidente y de la densidad (dependiente de la
HPLC No requiere de la formación de derivados volátiles.
composición, temperatura y presión) y que se mide con el detector del índice de
refracción.
MÉTODOS DE DETERMINACIÓN DE LÍPIDOS
Tejido → ruptura celular (homogeneizadores, dispersores o sonicadores) → extracción de lípidos
(Folch, cloroformo2:1metanol) → lavados con NaCl → dos fases: superior (acuosa con sustancias El método más sencillo de cuantificación: gravimetría
Extracción con polares y parte del metanol) e inferior (cloroformo + lípidos) → lavados → mezcla de → evaporación de los disolventes que acompañan a
Lípidos Totales Disolventes cloroformo:metanol con lípidos → extracto de Folch o extracto de lípidos purificados. los lípidos sobre el extracto de lípidos purificados de
Orgánicos Folch a bajas temperaturas bajo atmósfera de
El metanol rompe los enlaces entre los lípidos y desnaturaliza proteínas de membrana y lipasas. nitrógeno hasta obtener un peso constante.
El cloroformo permite la disolución de los lípidos
Se pueden acoplar reacciones como las de la glicerol quinasa, la piruvato quinasa, la lactato
Glicerol Métodos enzimáticos
deshidrogenasa, la glicerol-fosfato deshidrogenasa y la diaforasa, midiendo la desaparición de NADH.
Métodos químicos Dos procesos:
Individuales
Triacilglicéridos 1. Hidrólisis de los TAG para formar glicerol y ácidos grasos libres.
Métodos enzimáticos
2. Medida del glicerol liberado, directamente o convirtiéndolo en otro producto.
Colesterol Métodos químicos
 Mediante la colesterasa, la colesterol oxidasa y la
Métodos enzimáticos Más costoso y más preciso.
catalasa.
Cromatografía en capa fina (TLC), donde los menos
Fraccionamiento Con éter o heptano a pH ácido (los ácidos grasos
Con acetona fría. apolares se unen más fuertemente a la placa de gel
con Disolventes son más polares).
de sílice.
Cromatografía de Gases, donde, en las mismas condiciones, el tiempo que tarda en salir de la columna (tiempo de retención) es el mismo siempre para un
Ácidos Grasos
determinado compuesto.
Papel y gel de agarosa: separaciones similares, aunque el gel de agarosa
aumenta la resolución y se puede emplear para separar subclases.
Lipoproteínas Electroforesis, ya que presentan distinta relación carga/tamaño.
Un soporte de acetato de celulosa no permite diferenciar los quilomicrones, que
migran con las VLDL.
Separación del extracto de Folch a partir de su precipitación con acetona →
Fosfolípidos de HPLC → fotodiodo.
HPLC, TLC, por diferencias de polaridad.
Membrana Los fosfolípidos, al ser polares, han de separarse en columnas de fase normal
(sílice) y utilizando disolventes apolares.
MÉTODOS DE DETERMINACIÓN DE VITAMINAS
Importantes los precursores de coenzimas: tiamina, riboflavina, piridoxal,
Se emplea una columna apolar, por lo que salen de más polar a más apolar.
HPLC ácido pantoténico, B12, ácido fólico, biotina, nicotinamida.
Con un único análisis se miran todas las hidrosolubles.
Tienen cierto grado de hidrofobicidad, pero son solubles en agua.
Vitamina C reduce las sales de tetrazolio → formación de formazán
Vitaminas Método Se lee la absorbancia antes y después de añadir la ascorbato oxidasa, de forma
(violeta).
Hidrosolubles Enzimático que la pérdida de absorbancia corresponderá con la concentración de vitamina
Vitamina C + ascorbato oxidasa → reducción de la vitamina C → incapaz
(Vitamina C) C.
de reducir el formazán.
Técnicas Biotina + ácido fólico → determinación por extracción con agua de un
Son caras y hay que hacer un kit para cada una de ellas.
Inmunológicas homogenado de muestras → ELISA competitivo.
Se emplean: disolventes orgánicos, ácido ascórbico (antioxidante), medio En la fase normal, la columna es menos apolar que el eluyente.
Vitaminas
HPLC básico (destruir el alimento), KOH (para romper), etanol (para saponificar,
Liposolubles
los hace más hidrofóbicos) y corriente de nitrógeno (evitar oxidación). En la fase reversa, la columna es más apolar que el eluyente.
MÉTODOS DE DETERMINACIÓN DE HORMONAS
HPLC
Catecolaminas
ELISA
RIA Las hormonas tiroideas poseen yodo, el cual tiene un isótopo radiactivo.
Tiroideas
HPLC
LC-MS/MS
Esteroideas
ELISA
Peptídicas ELISA