Extracción y separación de ADN

Resultados

Extracción de DNA:
Para obtener el DNA del banano primero se realizó una solución con detergente, agua
destilada, sal y ablandador de carne y otra solución que consistía en la maceración de
aproximadamente una pulg3 de la fruta hasta obtener una mezcla homogénea, esto ayudó a
que la superficie de la membrana se hiciera más fácil de disolver. Luego se mezclaron las
dos preparaciones y se dejó actuar por 5 minutos. Después se hizo una filtración, la cual se
obtuvo un líquido de consistencia más transparente, esta solución se introdujo en un tubo de
ensayo previamente marcado y finalmente se agregó alcohol etílico al 70% - 90% frío. Al
cabo de pocos minutos se observaron tres capas bien diferenciadas, en la cual encima se
encontraba el alcohol, debajo de este se encontraban los restos celulares del plátano y los
otros componentes y en la interfase observamos una especie de hilos blancos rodeados de
burbujas que indico la presencia de ácidos nucleicos en la solución, y fueron posteriormente
almacenados en microtúbulos.

Figura 1. Filtración del macerado de banano y solución amortiguadora.

La formación de las capas al agregar el alcohol se da porque el DNA al reaccionar con el

etanol a muy baja temperatura hace que se vuelva apolar e insoluble en el etanol formándose
un precipitado justo entre la capa con etanol líquido y la capa con el extracto. El DNA es el
único componente de la solución que no es soluble en el etanol, y se hace visible porque las
diferentes cadenas se van aglutinando entre sí al precipitar debido a la acción de fuerzas
físicas. El alcohol es menos denso que el agua del extracto y por eso flota sobre la capa del
extracto.

Electroforesis de DNA:
La cámara de electroforesis fue organizada previamente por el instructor de laboratorio, la
limpió, colocó la peinilla de la cámara en el lugar correspondiente y procedió a vertir la
agarosa al 1% (líquida) en la cámara. También añadió TAE 1X a la cámara de electroforesis
hasta donde estaba la marca indicadora del manufacturero. Luego se tomó con una
micropipeta 3ul de azul de bromofenol, se mezcló bien con 5ul de la muestra, y con 2ul de
TAE, finalmente se graduó la micropipeta a 10ul se procedió a absorber toda la solución
preparada y se colocó en el pocillo 2 del gel de electroforesis.

La ruptura de las membranas es un proceso importante en la extracción del DNA ya que una
vez el tejido es disgregado en células, se hace necesario romper las membranas celulares para
la liberación del material genético, esto se logra por acción de procesos químicos facilitados
con detergentes como el SDS. Este resultado de la extracción se relaciona ya que a la muestra
se le adiciono el amortiguador de lisis el cual contiene una cantidad de 40mM de Trisacetato
con pH 7,8, 20mM de acetato de Sodio, 1.0mM de EDTA de SDS al 1%, este SDS es
utilizado como tratamiento para descontaminar la muestra de lípidos y grasas. Luego, se pasó
a la confirmación de DNA por medio de electroforesis usando para este caso gel de agarosa;
este gel contiene poros microscópicos que actúan como un tamiz molecular separando las
moléculas según su carga, forma y tamaño. Estas características en conjunto con las
condiciones del tampón, concentración del gel y voltaje, afectarán a la movilidad de las
moléculas en el gel, la separación ocurre porque las moléculas más pequeñas pasan a través
de los poros del gel más fácilmente que las de mayor tamaño. Se utilizó un marcador
molecular importante ya que nos permitirá calcular los pesos moleculares de las muestras.
Como el DNA tiene una carga negativa a pH neutro migra a través del gel hacia el electrodo
positivo durante la electroforesis, estos serían los resultados esperados en esta práctica.

Al momento de la lectura de la electroforesis el ADN no migro, es decir, no se obtuvieron

resultados, llegando a la conclusión que la muestra en la práctica de extracción de ADN, la
muestra no se mantuvo a la temperatura adecuada llegando a degradar el ADN y al momento
de ponerla a correr en el gel no se obtuvieron datos favorables.

Preguntas
1. ¿Por qué el macerado debe estar cubierto por la solución amortiguadora?

R/= Porque las soluciones amortiguadoras al cubrir el macerado estabiliza el pH mientras

que las células son separadas.

2. ¿Por qué debe evitarse la formación de burbujas al agregar la sustancia amortiguadora?

3. ¿Por qué debe esperarse 5 minutos?

4. ¿Cuál es la función del detergente?

R/= Para extraer el ADN se debe romper la membrana celular, está es formada por
moléculas que tienen una parte grasosa (lípidos) que no interactúa con el agua, aquí
participa el detergente que si interactúa con esta región hidrofóbica y solubiliza la
membrana.

5. ¿Cuál es la función de la sal?

R/= La sal ayuda a mantener estable el ADN para que no pierda su estructura. La doble
hélice tiene fuerzas negativas que repelen y hacen que tienda a abrirse, pero con la sal
(iones positivos) se compensan esas fuerzas. Sin embargo estas cargas no pueden entrar en
contacto ya que están impedidas por el agua, y esta compite para interactuar con ellas y la
sal y el ADN permanecen solubles.

Adema con ayuda del Alcohol frio se logra que los iones positivos de la sal se acerquen a
las cargas negativas del ADN y lo neutralicen.

6. ¿Cuál es la función del ablandador de carne?

R/= Al lisar las células se libera una gran cantidad de proteínas, algunas de estas proteínas
tienen como función degradar al ADN de patógenos como son las bacterias y los virus. Si
no detenemos a estas proteínas (conocidas como nucleasas) nuestro ADN será degradado.
Para evitarlo se agrega el ablandador de carnes, el cual contiene proteasas, es decir,
proteínas especializadas en la degradación de otras proteínas. En los ablandadores de carnes
usualmente encontramos papaína, la cual se extrae de la papaya. Otras fuentes de proteasas
que pueden usarse del ablandador de carnes son: jugo de piña y jugo de papaya.

7. ¿Por qué debe filtrarse el macerado?

R/= Este paso permite separar los restos de los tejidos del plátano y de las células que
hemos roto en los pasos anteriores y así lograr remover los desechos insolubles, es decir,
los restos de la célula. El líquido filtrado que conseguimos es el que contiene el DNA libre
de la membrana nuclear.

8. ¿Cuál, piensas tú, es la función del detergente en la solución amortiguadora?

R/= El detergente es el que permite que se disuelvan las membranas celulares para que
puedan escapar sus contenidos, haciendo que se disuelvan las grasas y se dé la formación
de micelas.

Referencias
1. Velázquez, L. P. A., Martínez, M. D. C. A., & Romero, A. C. (2008). Extracción y
purificación de ADN. Herramientas moleculares aplicadas en ecología: aspectos teóricos y
prácticos, 1.

2. UNIVERSIDAD DE LA RIOJA. Departamento de Química. Operaciones Básicas de

Laboratorio.