EXTRACCIÓN, EVALUACIÓN, CUANTIFICACIÓN, AMPLIFICACIÓN Y

CUANTIFICACIÓN DEL ADN DE “SACCHAROMYCES CEREVISIAE”

1Agredo Steven, 2Olarte María Alejandra 3Estupiñan Nury,

4 Sánchez Vanessa
1steven.agredo00@usc.edu.co 2maría.olarte01@usc.edu.co

3Nury.estupiñan00@usc.edu.co 4Darly.sanchez00@usc.edu.co

Universidad Santiago de Cali, Facultad de Ciencias Básicas, Laboratorio de

Biología Celular y Molecular, Programa de Microbiología

Profesor Mauricio Ramírez

Santiago de Cali, Colombia
Mayo 29 de 2019A

RESUMEN:
Es esencial dentro de la biología celular y molecular efectuar la extracción del ADN
y observarlo de manera macroscópica con fin de resolver problemas genéticos de
humanos y animales, mejoramiento de razas (animales) y variedades, pero esta
práctica no tiene ese final, esta práctica fue realizada con fines educativos para
adquirir habilidades y destreza a fin de realizar correctamente las técnicas para la
extracción de ADN y poder ser cuantificado; Esta práctica fue elaborada de manera
conjunta en tres diferentes sesiones que en general involucran la extracción,
evaluación de cantidad-calidad y cuantificación del ADN de “Saccharomyces
cerevisiae”, utilizando las técnicas de amplificación (región ITS1-ITS2), PCR,
electroforesis y espectrofotometría. En la primer sesión se extrajo el ADN de
levadura seca activa y pigmentada, la cual fue preparada anteriormente con SDS
(dodecilsulfato sódico) el cual nos ayudó a desnaturalizar el ADN, Isopropanol,
etanol, acetato de potasio, buffer T.E que nos ayudaron a solubilizar el ADN,
posteriormente se almacenaron en tubos eppendorf a 20°C temperatura; En la
segunda sesión se evaluó la calidad y cantidad del ADN por medio de
espectrofotometría UV, para el desarrollo posterior de PCR. Posterior a los
resultados de la cuantificación del ADN, se observa una contaminación gracias al
resultado de la relación A260/A280 el cual es mayor a 1.8 ng / µl, por lo cual se
concluye que el resultado de nuestro ADN no fue puro.
PALABRAS CLAVES:
ADN, Levadura, cuantificación, amplificación, PCR.
INTRODUCCION

El ácido desoxirribonucleico (ADN) es un ácido que contiene toda la información

genética hereditaria que sirve de “manual de instrucción” para desarrollarnos, vivir
y reproducirnos, se encuentra en los organismos llamados eucariotas, el ADN se
encuentra dentro de un área compartimental izada dentro de la célula llamada
núcleo. Debido a que la célula es muy pequeña, y porque los organismos tienen
muchas moléculas de ADN por célula, cada molécula de ADN debe estar
empaquetada de forma muy compacta y precisa. Esta forma supe rempaquetada
del ADN se denomina cromosoma.

Durante la replicación del ADN, el ADN se desenrolla para que pueda ser copiado.
En otros puntos del ciclo celular, secciones puntuales del ADN también se
desenrollan cuando es necesario para que distintos juegos de instrucciones se usen
en la fabricación de proteínas y para otros procesos biológicos. Pero, durante la
división celular, el ADN se encuentra en su forma compacta de cromosoma para
hacer posible la transferencia a nuevas células.

La extracción de ADN se realiza para obtener las moléculas aisladas con alto grado
de pureza y poderlas utilizar en investigación científica, a la hora de escoger el
método de extracción se deben tener en cuenta varios factores: la cantidad de la
muestra para extraer ADN, el tipo de muestra o fuente de la que se quiere obtener
el ADN, la pureza con la que se quiere obtener el ADN extraído, el tiempo que
consume cada método, su costo y el rendimiento esperado además del uso que se
le va a dar al ADN extraído. Con la diversidad de métodos conocidos actualmente
se pueden extraer ADN de muchos sustratos como la sangre, la saliva, la orina y
otros fluidos corporales, tejidos vivos, cultivos celulares, liquido amniótico entre
otros.

Numerosos métodos para la extracción de ADN de levaduras se han descrito

(Kurtzman y Fell, 1998). Éstos se diferencian básicamente en qué procedimiento ha
sido utilizado para la lisis de la pared celular de la levadura, y qué protocolo es usado
para la purificación del ADN. Casi todos los métodos empleados son variaciones
tanto de procedimientos de agitación con perlas de vidrio (Hoffman y Winston, 1987;
Ros-Chumillas et ál., 2007) como de lisis de pared celular por tratamiento enzimático
(Querol et ál., 1992).

Hoffman y Winston (1987) proponen un protocolo en el cual el rompimiento de la

pared celular se produce mediante fraccionamiento mecánico con perlas de vidrio,
seguido por una purificación usando una mezcla de fenol-cloroformo. Sin embargo,
cuando se procesa un gran número de muestras, el uso de perlas de vidrio es
insuficiente.
 Querol et ál. (1992) presentan un protocolo de extracción de ADN, donde el
rompimiento celular se lleva a cabo mediante lisis con la enzima Zimolasa, y la
liberación del ADN no requiere el uso de fenol-cloroformo. Esta metodología ha sido
ampliamente acogida ya que elimina el uso del fenol. [Estandarización de un
protocolo sencillo para la extracción de ADN genómico de levaduras, revista
colombiana de biotecnología, universidad nacional de Colombia]

La PCR en tiempo real o cuantitativa (Higuchi et al., 1992) permite amplificar y

cuantificar la secuencia de ácidos nucleicos de forma simultánea, dentro del mismo
vial. Mediante fluorescencia, es posible conocer al momento la cantidad de ADN
que se está formando. La emisión de fluorescencia tras cada ciclo es proporcional
a la cantidad de ADN que se está amplificando. Esta técnica permite empleando un
fluorocromo de unión inespecífica a la doble hebra de ADN, identificar fragmentos
amplificados de DNA concretos a partir de la Tm que es específica para el fragmento
amplificado que se está buscando; y cuyos resultados son obtenidos a partir de la
observación de la curva de disociación de las muestras de DNA analizadas. Para la
identificación de la especie, mediante un visor de genoma, se busca el gen o la
secuencia de interés e indica el número de repeticiones y en qué especies. Además,
también se puede identificar la especie por secuenciación del fragmento amplificado
o mediante el uso de marcadores moleculares.

La Electroforesis en gel de campo pulsado (Pulsed-field gel electrophoresis, PFGE)

(Schwartz y Cantor 1984), es una técnica que permite diferenciar especies y
también a nivel de cepas. Debido a que los fragmentos superiores a 20-40kb no
pueden separarse empleando la electroforesis convencional en gel de agarosa, se
altera periódicamente la orientación del campo eléctrico, permitiendo a las
moléculas desplegarse y avanzar a través de los poros en conformación extendida.
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN:
Luego de haber extraído y examinado el ADN, se escogieron dos muestras M1 y M2 más
un control positivo para ser cuantificadas como se ve en la tabla 1. La cual nos da la
cuantificación del ADN de “saccharomyces cerevisiae” para nuestra primera muestra (M1)
se obtuvo la absorbancia a 260= 0,332 ng / µl, la absorbancia a 280=0,159 ng / µl y la
proporción A260/A280= 2,09 ng / µl nos muestra evidentemente una contaminación, al igual
que nuestra muestra 2 (M2), ya que nuestras muestras tienen una proporción A260/A280
mayor a 1.8 ng / µl.
MUESTRA CONCENTRACION UNIDADES A260 A280 A260 /
DE ACID. NUC. NANOGRAMOS/MICRO A280
LITROS
Control 0,1 ng / µl 0,002 -0,008 -0,28
(+)
M1 16,6 ng / µl 0,332 0,159 2,09
M2 22,8 ng / µl 0,456 0,200 2,28
Tabla 1. Cuantificación ADN

REACTIVO [STOCK] VOL VOL En la muestra M2 se puede observar

1 2 que contiene mayor concentración
Agua Mili-Q 13,9 55,6 que M1 como se puede observar en la
tabla 1, pero en la figura 1 se
Buffer 10 2,5 10 contrarresta esta información
MgCl2 50 Mm 1,5 6 tabulada, debido a que evidentemente
ITS 1 20 0,8 3,2 la barra no se ve bien marcada.
ITS 4 20 0,8 3,2 En la figura 1 podemos observar que
DNTP 1 0,3 1,2 M1 muestra una barra de color verde
TAQ 5U 0,2 0,8 fluorescente poco iluminada,
Tabla 2. Cálculo de volúmenes en comparada con nuestro control
solución de Stock positivo, mostrada por Sybr Green.

La tabla 2 muestra los cálculos de las

soluciones utilizadas para distintas
técnicas usadas en el laboratorio entre
estas la extracción y desnaturalización
del ADN.

Figura 1. Resultado de PCR.
El ADN puro tiene una relación A260 /
A280 de 2.0, por lo tanto, si una
muestra de ADN tiene una proporción
A260 / A280 mayor que 1.8, esto
podría sugerir una contaminación por
ARN. Sin embargo, debido a la
similitud en los perfiles de absorción
de ARN y ADN, probablemente la
forma más precisa de determinar la
contaminación por ADN es hacer
funcionar la muestra en un gel de
agarosa donde se verá claramente
que el ARN migra delante del ADN. [1]
El SDS (Dodecilsulfato sódico) actúa
rompiendo enlaces no covalentes en
las proteínas, desnaturalizándolas,
provocando que estas moléculas
proteicas pierdan su conformación
nativa. Esto ocurre porque el SDS se
une a las zonas apolares del
polipéptido.[2]
El tampón TE es una solución tampón
de uso común en biología molecular,
especialmente en procedimientos que
involucran ADN, ADNc o ARN. "TE" se
deriva de sus componentes: Tris, un
tampón de pH común, y EDTA, una
molécula que quela cationes como Mg
2+. El propósito del tampón TE es
solubilizar ADN o ARN, mientras se
protege de la degradación.[3]
Las principales técnicas de
identificación de levaduras están
basadas en la aplicación de métodos
de biología molecular como la PCR
(Reacción en cadena de la
polimerasa), permitiendo resultados
más específicos, extremadamente
sensibles y en corto tiempo.[4]
El factor de dilución del ADN
dependerá de la intensidad de la
banda observada en el gel de
agarosa; Un valor obtenido de
aproximadamente 1.8 es considerado
puro para ADN Si es menor hay
contaminación con proteínas, fenoles
u otras sustancias que absorben en
una longitud de onda cercana a
280.[5]
En la técnica de electroforesis, el
SYBR Green representa una
alternativa como tinte al bromuro de
etidio, ya que es hasta 100 veces más
sensible que éste y mucho menos
perjudicial para la salud.[6]
La espectrofotometría UV/Visible nos
permite confirmar que contamos con
cantidad suficiente de ácidos
nucleicos (DNA/RNA) de calidad
adecuada antes de llevar a cabo
ensayos de PCR cuantitativa en
tiempo real (QRTPCR), análisis de
SNPS (Polimorfismos de nucleótido
único) o la secuenciación automática
demuestras de DNA de plásmidos,
cósmidos, productos de PCR.[7]
El NanoDrop es un espectrofotómetro
de espectro total (220-750nm) que
mide concentraciones con 1 µl de
muestra, con gran exactitud y
reproductibilidad. Utiliza una nueva
tecnología que usa la tensión
superficial para mantener la muestra
en su sitio y se eliminan las cubetas de
mesura. Además, el ND-1000 tiene la
capacidad de medir muestras muy
concentradas, sin necesidad de
diluirlas (acepta 50X más de
concentración que las medidas
estándares con cubetas). Esta
característica lo hace idóneo para
medir la concentración de ácidos
nucleicos y para determinar su
cualidad. El software calcula
automáticamente la concentración de
los ácidos nucleicos siguiendo la
relación: 1 A260nm = 1 OD DNA = 50
µg/ml. 1 A260nm = 1 OD RNA = 40
µg/ml. [8]
CONCLUSIONES
La PCR es la técnica más importante
en la biología molecular porque con
ella se ha logrado la simplificación e
innovación de muchas técnicas
moleculares que permiten abordar
nuevas líneas de investigación en
diferentes ramas de la biología,
medicina forense, patología, entre
otras y son innumerables las
aplicaciones que se derivan de ella.
Las técnicas asociadas a la PCR han
avanzado de forma vertiginosa en los
últimos años y cada vez se encuentran
nuevas aplicaciones a la PCR.
Los termocicladores son capaces de
realizar rápidos cambios de
temperatura que permiten realizar los
tres pasos de la reacción de PCR de
forma cíclica: desnaturalización del
DNA, alineamiento o unión del
cebador con la secuencia de DNA
complementaria y extensión de la
cadena.
Para asegurar la validez de la reacción
es importante incluir controles en la
ejecución (control negativo, positivo y
control de inhibición). Los primeros
son moléculas de entre 10 y 30 bases
de ADN de cadena sencilla. Estas
moléculas son los que van a delimitar
el fragmento de ADN a amplificar.
Fue posible comprobar de manera
eficiente la estandarización de
protocolos de extracción de ADN, el
establecimiento de las condiciones y
el programa de PCR para el primer
ITS1
BIBLIOGRAFIA
[1] El factor de dilución del ADN
dependerá de la intensidad de
la banda observada en el gel de
agarosa.
[2] A. Nassif, S. C. Chan, F. J. Storrs
and J. M. Hanifin. Abstract:
Abnormal skin irritancy in atopic
dermatitis and in atopy without
dermatitis. Arch Dermatol.
November 1994;130(11):1402.
.[3] Krebs, JE Goldstein, ES y
Kilpatrick, ST, 2009. Genes X de
Lewin, 10ª ed. Jones y Bartlett.

[4] Berg, JM, Tymoczko, JL &

Stryer, L., 2006. Stryer
Biochemistry, 4ª ed. WHFreeman
& Co Ltd.

[5] Dawson, RMC Elliot, DC, Elliot,

WH y Jones, KM, 1989. Data for
Biochemical Research , 3ª ed.
Prensa de la Universidad de
Oxford.
[6] Ross; Haites, Kelly (1990).
"Repetición de congelación y
descongelación de ADN en
suspensión: efectos sobre el
rendimiento y la integridad del
ADN”. Revista de Genética
Médica. 27 (9): 569

[7] Molinari HB, Crochemore ML.

Extração de DNA genômico de
Passiflora spp para análisis PCR-
RAPD. Revista Brasileira de
Fruticultura, Jaboticabal - SP
2001; 23 (2): 447- 450.
[8] Nanodrop 1000 | Servei
Genòmica Bioinformàtica
Sct.uab.cat.