Instrumentación de HPLC

1. Reservorio: Contiene a la Fase Móvil.

2. Bomba: Impulsa a la Fase Móvil dentro del sistema de elución de HPLC.
3. Inyector (Automuestrador o Manual): Permite introducir la muestra al sistema.
4. Columna (Precolumna, Guardacolumna y Horno): Sistema de análisis.
5. Detector: Es un transductor que tiene como función el registro del paso de
componentes de una muestra en el orden en el que eluyen.
6. Colector de Fracciones: Sirve para recibir o contener por separado los
componentes que ya eluyeron por si se requiere un análisis posterior de alguno
de ellos.
7. Computador: Sistema de almacenamiento.

1) Consideraciones del Reservorio

• Frasco cerrado de vidrio o de algún polímero resistente al disolvente con
paredes homogéneas.
• Contiene un filtro de metal poroso que ayuda a retener partículas de tamaño
mayor a 10μm. • Previo al bombeo del disolvente hacia el sistema de HPLC, se
realiza un tratamiento por desgasificación por ultrasonicación o un burbujeo con
un gas inerte (He excelencia).
Consideraciones del Disolvente
• El disolvente debe ser de alta pureza (grado HPLC).
• Disolver el analíto.
• Tener baja viscosidad.
• No debe reaccionar con el empaque de la columna.
• Debe ser volátil.
• Polaridad adecuada para el tipo de análisis que se lleve a cabo.
2) Bombas
• Impulsan a la FM hacia el sistema de HPLC.
• Generan presiones de hasta 6000 psi (lb/in2).
• Tienen flujo libre de pulsaciones, evitando así la variación de presión dentro del
sistema.
• Tienen intervalos caudal de 0.1 a 10 ml/min.
Tipos de bombas
• Binarias: Impulsan un solo disolvente hacia el sistema.
• Secundarias: Impulsan 2 disolventes hacia el sistema.
• Terciarias: Impulsan 3 disolventes hacia el sistema.
• Secundarias: Impulsan 4 disolventes hacia el sistema.
 Elución Isocrática
Se mantiene la misma proporción de disolventes durante todo el proceso.
 Elución en gradiente
La proporción de la mezcla de disolventes cambia en algún punto del proceso.
Este tipo de elución se utiliza cuando se tiene una mezcla compleja de
componentes con polaridad diferente.

3) Inyector
• Permite introducir la muestra al sistema de HPLC para su análisis sin
despresurizar el sistema y sin interrumpir el caudal.
• La muestra se introduce en el “Loop”, el cual se encarga de introducir la muestra
al sistema. • Tiene una posición de carga y otra de inyección.

4) Columnas y Precolumnas
• Es el medio donde se lleva a cabo la separación y es el contenedor de la FE.
• Las precolumnas deben contener la misma FE que el empaque de la columna,
este evita el posible ingreso de partículas contaminantes y en general prolonga
la vida media de la columna.
Características de las columnas
• Diámetro interno 3.9 - 4.6 mm
• Longitud de 10, 15, 25, 30 cm
• Tamaño de partícula de 3.5, 5, 10 μm

5) detectores
A diferencia de la cromatografia de gases, en la cromatografía de líquidos no hay
detectores tan aplicables universalmente ni tan fiables como los detectores de
ionización de llama y de conductividad térmica. Uno de los mayores retos en el
desarrollo de la cromatografía de líquidos ha sido el perfeccionamiento de los
detectores.
• Un detector ideal para cromatografía de líquidos debería poseer todas las
propiedades listadas en relación con la cromatografía de gases, con la excepción
de que un detector para cromatografía de líquidos no es necesario que sea
sensible en un intervalo tan grande de temperaturas. Además, un detector de
HPLC debe tener un volumen interno mínimo a fin de reducir el ensanchamiento
de banda.
• Los detectores en cromatografia de líquidos son de dos tipos básicos. Los
detectores basados en una propiedad de la disolución responden a una
propiedad de la fase móvil, tal como el índice de refracción, la constante
dieléctrica, o la densidad, que se modifica por la presencia de los analitos. Por
contraste, los detectores basados en una propiedad responden alguna.

TIPOS DE DETECTORES
Detector de índice de refracción
Detector de desviación
Detector de desviación
Detector de reflexión (Fresnel)

Detectores de ultravioleta/visible

• Se encarga de transducir la energía emitida de un compuesto.

• Funciona únicamente para compuestos que absorban en UV/VIS.
• Puede utilizarse en gradiente de elución.
• Es altamente selectivo sobre compuestos que posean dobles enlaces.
Tipos de detectores UV/VIS
Detectores de longitud de onda fija
Detectores de longitud de onda variable
Detectores de fluorescencia
Detectores electroquímicos
Detectores electroquímicos
Detector de conductividad electrolítica