MICROBIOLOGIA

AMBIENTAL
MANUAL DE LABORATORIO

H.E.LEAL

UNIVERSIDAD DE LA FRONTERA
TEMUCO – CHILE
 NORMAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO
LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA

1. Siempre lleve puesto el delantal: Esto no sólo protege su ropa de cualquier

contaminación accidental, sino que la protege de ser manchada por los colorantes
utilizados en las tinciones.

2. Lave sus manos: Esto debe hacerlo antes y después de las prácticas de laboratorio.

3. Libere el mesón de trabajo de artículos ajenos al trabajo de laboratorio, excepto aquellos

que necesite para su experimento. Retire libros, cuadernos u otros materiales no
relacionados, de tu lugar de trabajo.

4. Antes de comenzar con el trabajo, limpie su lugar con desinfectante: Esto reduce el
peligro de contaminación de los cultivos bacterianos, reduce los microorganismos
transportados por el polvo. Para proteger a los siguientes estudiantes que trabajen en tu
mesón, repita el procedimiento de limpieza al final del trabajo práctico, para remover los
microorganismos que pudieran haber contaminado la mesa. Rocíe desinfectante y seque
con papel absorbente.

5. No coma, beba o fume en el laboratorio: Haga un hábito el mantener las manos lejos de
la cara. Recuerde que mascar el lápiz puede producir una ingestión accidental de
microorganismos utilizados en el laboratorio.

6. Para evitar quemarse: Mantenga todos los líquidos inflamables como acetona o alcohol
lejos de la llama. Cuando lleve el pelo largo, utilice un gorro o pinche para tomarse,
evitando así accidentes. Recuerde que la llama superior del mechero durante momentos
de mucha luz, no se vé, pudiendo causar algún accidente.

7. Todos los materiales de cultivos, deben ser apropiadamente marcados con el nombre,
fecha y experimento: La identificación del material es importante para evitar usos
indebidos o disposición final del material utilizado.

8. Cuando tenga el asa de cultivo cargada con algún cultivo de microorganismo, no se

desplace de un área a otra, ya que puede contaminar, trabaje sólo en su puesto.

9. Ponga los cultivos viejos o contaminados en receptáculos apropiados para ser

autoclavados: No permita que su lugar de trabajo se llene de cultivos que ya no tienen
valor para su trabajo. Los tubos de ensayo deben ser puestos en gradillas. Retire las
etiquetas adhesivas de los tubos.

10. Si ha derramado accidentalmente un cultivo bacteriano, rocíelo con un desinfectante, y

cubra con papel, notificando inmediatamente al instructor para que se asegure de
desinfectar apropiadamente la zona.

11. Tenga cuidado con las preparaciones teñidas ya que pueden salpicar colorantes a
mesones y pisos.
 12. En caso de cualquier accidente o daño personal, comuníquelo inmediatamente al
instructor, para tomar las acciones apropiadas según las circunstancias.

13. Quien tenga heridas en las manos, debe abstenerse de participar en los trabajos
prácticos, esto es necesario para evitar cualquier tipo de infección. En su defecto deberá
usar guantes. En caso que la herida ocurra en el interior del laboratorio es necesario
limpiar inmediatamente la zona afectada con desinfectante y cubrir con un parche.

14. Al Final del práctico debe dejar el lugar de trabajo limpio y ordenado.

OTRAS CONSIDERACIONES

A) Antes de iniciar la sesión de laboratorio, atienda la explicación de los ejercicios

que va a realizar y con cuidado tome nota del plan de trabajo. Asegúrese de
entender como efectuar cada experimento, y cuales son los principios
fundamentales que se pondrán en relieve.

B) Cada sesión de trabajo se iniciará con una corta explicación y período de

instrucciones. No comience a trabajar ni manipular ningún material, hasta que
haya recibido las instrucciones. Consulte cuando no entienda el método o la
finalidad de algún experimento. Una buena técnica de laboratorio depende
primordialmente de saber que se va hacer.

C) Anote cuidadosamente todas sus observaciones en el momento de hacerlas.

D) El examen de materias se referirá no sólo a la información proporcionada por el

instructor, sino también a sus propias observaciones y deducciones.

BIBLIOGRAFÍA:

1. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Section III: Laboratory biosafety level
criteria. pp 16-18; section IV: Vertebrate animal biosafety level criteria, 1999, pp 45-47. CDC/NIH.

2. Biosafety in the Laboratory. Prudent practices for the hanling and disposal of infectious
materials. Apendix A, section III: Laboratory biosafety level criteria. pp 89-92. section V:
Vertebrate animal biosafety level criteria, 1999, pp 98-99. National Academy Press.

3. Gamazo C, Lopez-Goñi, Alonso-Urmeneta B. 2005. Manual Práctico de Microbiología 3 Ed.

Elsevier Masson Editorial.
 ESTERILIZACIÓN

1. Material de laboratorio

El LM debe contar con material de vidrio, metal y plástico que no afecte el desarrollo de los m.o. El
material de vidrio debe ser de pirex, borosilicato o vidrio neutro, a fin de evitar cambios en el pH
de los medios.

Los únicos metales aceptables para uso en microbiología son de acero inoxidable y el aluminio.
Esta totalmente contraindicado el uso de material de cobre o sus aleaciones ya que este material
es tóxico para los m.o.

El material plástico debe ser autoclavable y no contener residuos tóxicos. El plástico que no pueda
ser esterilizado mediante calor, debe ser esterilizado con alcohol al 70% durante 30 minutos, o
bien con radiaciones UV durante 5 minutos.

Para esterilizar y guardar las pipetas estériles es recomendable el uso de estuches metálicos que
pueden ser de aluminio o de acero inoxidable. No se permite el uso de estuches de cobre, por su
efecto tóxico. Las pipetas también se pueden envolver en forma individual en papel Kraft, que es
resistente a la esterilización, sin embargo debido al gran número de pipetas que se utilizan, este
sistema es poco práctico.

2. Lavado

Todo el material de vidrio del LM debe ser guardado perfectamente limpio y seco, y sólo en caso
de análisis microbiológico dicho material debe ser esterilizado.

Se lavará cuidadosamente todo el material de vidrio con un detergente adecuado y agua caliente,
se enjuagará con agua caliente para eliminar todos los residuos del compuesto de lavado y, por
último, se enjuagará varias veces con agua pura de laboratorio, agua destilada.

Es obligación de cada LM demostrar que el material de vidrio utilizado está libre de residuos
tóxicos o inhibidores provenientes del proceso de lavado. Siempre que sea necesario se deben
llevar a cabo las siguientes pruebas de comprobación de limpieza del material de vidrio:

• Comprobación del pH, con solución de azul de bromotimol al 0,04%.

• Comprobación de residuos inhibidores en el material de vidrio y plástico, algunos

detergentes que se usan para el lavado producen sustancias bactericidas o inhibidoras, lo
que obliga a realizar varios enjuagues para eliminar y asegurar que no existe actividad
bactericida residual. Esta prueba requiere el uso de un cultivo de Enterobacter aerogenes
que asegure un recuento de entre 50 a 150 UFC/mL.
 3. Control del crecimiento bacteriano

Por “control” de los m.o. se entiende tanto la inhibición del crecimiento o multiplicación
microbiana como la destrucción de aquellos.

4. Esterilización

Proceso que destruye toda clase de vida o todas las formas viables de cualquier tipo de vida
microbiana. Es decir, la esterilización es un proceso absoluto e incluye la destrucción de las
esporas y formas vegetativas, los virus. Con fines microbiológicos, los m.o. se destruyen in situ,
mediante procedimientos químicos, físicos o mecánicos.

Técnicas de esterilización
Para la esterilización de materiales, equipos, medios de cultivo y otros, se emplea calor seco,
flameado, radiaciones, gases, filtración por membrana.

a. Esterilización por calor seco: Se realiza en horno de esterilización aplicando temperatura de

170ºC  10ºC durante un máximo de 2 horas.

b. Esterilización por calor húmedo: Se realiza en autoclave a temperatura de 121ºC  2ºC durante
10 a 15 minutos.

Si las normas de preparación no indican otra cosa, la esterilización de los medios de cultivo se
realiza a 121ºC  2ºC durante 15 minutos.

La esterilización sólo se consigue con seguridad cuando se ha desalojado correctamente el

aire de la cámara de vaporización del autoclave y de los recipientes en ella contenidos. Con
este fin, se deja fluir ampliamente la corriente de vapor manteniendo abierta la válvula de
purga durante el comienzo de la fase de calentamiento del autoclave. Tras la esterilización y
después de haber alcanzado el equilibrio de presiones (entre el interior y el exterior del
autoclave) y para evitar la sobre carga térmica del medio de cultivo, deben sacarse los
recipientes y enfriarlos rápidamente. Se recomienda para ello bañar los recipientes con agua
corriente fría.

c. Esterilización mediante incineración: Se realiza por exposición directa del material a la llama de
un mechero de gas. En estos casos el material debe ser calentado al rojo para asegurar su total
esterilización.

d. Esterilización mediante flameado: Se realiza por incineración del material impregnado en

alcohol en la llama de un mechero a gas.

e. Esterilización por filtración: Esta técnica es aplicable a líquidos, los cuales se hacen pasar a
través de membranas o bujías esterilizantes de 0,22 m de porosidad que retienen en su
superficie todas las partículas superiores a este tamaño.
 Los medios de cultivo empleados en las técnicas de filtro membrana no se esterilizan por calor
húmedo, debido a que por su composición altamente compleja, se destruyen mediante este
proceso. Sólo se permite calentarlos hasta casi ebullición para lograr su total solubilización y
luego enfriarlos rápidamente.

4.1. Esterilización del material de vidrio

La esterilización del material de vidrio se realiza mediante calor seco, aplicando 170ºC  10ºC
durante una hora. El material a esterilizar debe estar totalmente seco y envuelto en papel Kraft
para preservar su esterilización. Por ejemplo:

• Las placas de Petri se preparan en paquetes de 7 a 10 placas según el tamaño,

envolviéndolas con papel Kraft.
• Los tubos de ensayo se tapan cada uno con un tapón de algodón y se envuelven con papel
en paquetes. Por otro lado, a las pipetas se les coloca un tapón de algodón hidrófobo en
su parte superior y se envuelve con papel.

Para evitar rupturas del material el horno debe estar frío antes de cargarlo y una vez finalizado el
proceso de esterilización, se debe esperar que el horno se enfríe a temperatura de ambiente antes
de retirar el material.

Los materiales de vidrio tales como placas Petri, pipetas, baguetas y otros que se almacenan
dentro de cajas metálicas, deben ser esterilizados dentro de sus envases, mediante calor seco a
170ºC  10ºC durante 2 horas.

4.2. Esterilización del material metálico

La esterilización de envases metálicos se debe realizar de preferencia mediante calor seco,

aplicando 170ºC  10ºC durante 2 horas. También se puede esterilizar por autoclave a 121ºC  2ºC
durante 15 a 20 minutos siempre que se envuelva en papel resistente o papel de aluminio.

La esterilización de las asas metálicas de inoculación se realiza por incineración directa a la llama
hasta que el material se torne rojo. También puede ser por flameado, dejando el asa sumergida en
alcohol y luego pasando por la llama.

4.3. Esterilización de medios de cultivo y reactivos

Siempre que no se indiquen otras especificaciones, los medios de cultivo y reactivos empleados en
bacteriología, se deben esterilizar mediante calor húmedo, en autoclave a 121ºC durante 15
minutos. El tiempo máximo de exposición al calor de los medios debe ser de 60 minutos, desde
que se introduce hasta que se retira el material del autoclave, a fin de evitar del deterioro de sus
componentes. La mayoría de los medios de cultivo contienen azúcares, peptonas, aminoácidos y
otras sustancias, que se hidrolizan o caramelizan con el exceso de calentamiento.
5. Desinfección

Proceso en el que se destruyen al menos las formas vegetativas de los m.o. más comunes, pero no
necesariamente las esporas. En general, el desinfectante es un producto químico excesivamente
tóxico para ser usado directamente sobre tejidos vivos y se suela aplicar sobre objetos superficies.
Muy pocos desinfectantes llegar a esterilizar.

La eficacia del proceso de desinfección es afectada por la presencia de suciedad. Es decir, que
cuanto más limpia la superficie a desinfectar mayor es la eficacia del desinfectante. La
desinfección debe seguir inmediatamente a la limpieza. El agua hirviendo posee una acción
desinfectante, pero no elimina las endoesporas de ciertas bacterias Gram (+).

Los desinfectantes deben cumplir con las condiciones:

• Destruir rápidamente los microorganismos, siendo igual de eficaces tanto para las
bacterias Gram (+) como Gram (-). Den destruir la mayoría de las esporas fúngicas, como
también las esporas bacterianas.

• No deben ser corrosivos

• No deben ser tóxicos, ni irritantes a los ojos o la piel

• Solubles al agua Estable en el tiempo en forma concentrada y en menor tiempo en su

forma diluida.

• Económico y efectivo

6. Calidad del agua para la preparación de los medios de cultivo y los reactivos

La calidad el agua obtenida mediante un sistema de purificación depende del sistema utilizado
(unidades de desionización del agua o alambique) y de su mantenimiento. En la Tabla Nº1
aparecen los límites aceptables del agua de calidad. Si no se alcanzan, hay que investigar y corregir
la causa. Aunque la determinación del pH de agua purificada se caracteriza por sus variaciones, las
lecturas extremas indican contaminación química. El agua destilada se guardará protegida de la luz
solar para evitar el crecimiento de algas.

Para la preparación de los medios de cultivo y de los reactivos se utilizará únicamente agua
destilada o desmineralizada que haya sido analizada y no presente trazas de metales disueltos ni
de compuestos bactericidas o inhibidores.

6. Equipos y material de trabajo

Además de un ambiente apto para el trabajo microbiológico, el laboratorio requiere de una

instrumentación básica. Por otro lado, el laboratorio debe estar diseñado de tal forma que permita
un fácil proceso de limpieza. A continuación se detallan algunos equipos y material mínimo
requerido:

• Autoclave • Campana de flujo laminar

• Horno Pasteur • Estufa de incubación

• Microscopio óptico • Contador de colonias

• pH-metro • Refrigerador

• Asas de siembra • Pipetas

• Contenedores de acero-inoxidable • Cepas microbianas

• Medios de cultivo

Tabla Nº1. Calidad del agua purificada utilizada en pruebas microbiológicas.

Pruebas Frecuencia Límites
Químicas
Conductividad Continuamente < 2 mhos/cm a 25ºC
pH Con cada uso 5,5 – 7,5
Carbono orgánico total Mensual < 1 mg/L
Metales pesados Anual < 0,0,mg/L
(Cd, Cr, Cu, Ni, Pb y Zn)
Amoniaco/nitrógeno orgánico Mensual < 0,1 mg/L
Cloro residual total Mensual o con cada uso < Límite de detección
Bacteriológicas
Recuento en placa heterotrófica Mensual < 1000 UFC/mL
Fuente: Standard Methods for the examination of water and wastewater (2005).

7. Trabajo experimental

7.1. Objetivos

• Conocer las normas de higiene, orden personal y normas de trabajo en un laboratorio de

microbiología
• Preparar material de vidrio, metal y plástico para su esterilización
7.2. Materiales

• Pipetas de vidrio
• Puntas para micropipetas
• Tubos de ensayo
• Placas de Petri
• Espátulas
• Algodón hidrófobo
• Papel Kraft

7.3. Actividad

Cada grupo recibirá material de vidrio (pipetas, tubos de ensayo, placas de Petri, entre otros),
contenedores de acero-inoxidable, papel Kraft, tijeras, cinta engomada, algodón hidrófobo, entre
otros. De acuerdo a las instrucciones que serán recibidas durante el laboratorio cada grupo
preparará este material para su posterior esterilización.

8. Bibliografia

Gamazo C, Lopez-Goñi, Alonso-Urmeneta B. 2005. Manual Práctico de Microbiología 3 Ed. Elsevier

Masson Editorial.