MICROBIOLOGIA

AMBIENTAL
MANUAL DE LABORATORIO

H.E.LEAL

UNIVERSIDAD DE LA FRONTERA
TEMUCO – CHILE
 MEDIOS DE CULTIVO

Para el estudio de los microorganismos es necesario cultivarlos en condiciones de

laboratorio. Para ello hay que conocer los nutrientes y condiciones físicas que
requieren, información que disponemos tras investigaciones extensas y con las que
se han desarrollado numerosos medios de cultivo.

Las características de los medios de cultivo que se utilizan para el estudio e

identificación de microorganismos dependen más del comportamiento de las
poblaciones o de los cultivos que de los microorganismos individuales.

Definición de medio de cultivo: substrato óptimo para el mantenimiento y

crecimiento de microorganismos en el laboratorio. El medio variará dependiendo
del tipo de microorganismo.

Un medio de cultivo es cualquier preparado sólido o líquido que contenga las

sustancias nutritivas necesarias para el desarrollo de los microorganismos,
debiendo tener un pH adecuado, estar estéril y protegido contra la contaminación
ambiental, ya sea en placas Petri, tubos, matraces tapados con algodón, etc.

Un cultivo que contiene solamente una clase de microorganismo se conoce como

cultivo puro o axénico. Un cultivo que contiene más de una clase de
microorganismo se conoce como cultivo mixto; en el caso especial de que contenga
sólo dos clases de microorganismos, deliberadamente mantenidos en mutua
asociación, se trata de un cultivo bimembre.

Definición de aislamiento: es la separación de un microorganismo determinado de

las poblaciones mixtas que existen en la naturaleza; el cultivo, es el crecimiento de
poblaciones microbianas en ambientes artificiales (medios de cultivo) bajo
condiciones de laboratorio.

1. Preparación de los medios de cultivo.

Para esta operación es necesario realizar de antemano los siguientes pasos:

1.1. Disolución del medio de cultivo Deshidratado.

Para la preparación de los medios de cultivo los recipientes utilizados son

generalmente matraces Erlenmeyer y vasos precipitados, los cuales serán limpiados
con agua destilada o desmineralizada, con el fin de eliminar residuos de otras
sustancias.

Al medio de cultivo deshidratado y pesado se le añade aproximadamente la mitad

de agua necesaria para proceder a la agitación (el agua utilizada debe ser destilada
y además debe poseer un pH lo mas cercano posible a la neutralidad). Luego se
debe adicionar el restante de agua.

Los medios de cultivo que poseen agar deben ser calentados para conseguir su
disolución, sobretodo en el caso que estos no deban ser sometidos posteriormente
a esterilización el autoclave.

1.2. Ajuste del pH del medio de cultivo.

Por lo general el pH del medio se mide antes de su esterilización. Para medir el pH

lo mejor es el uso de un peachímetro sin olvidar la compensación de temperatura
en el aforo del electrodo.

En los medios de cultivo sólidos, al medición del pH se realiza a 45-50 ºC. en los
medios de cultivo líquidos esta medición se realiza a 25 ºC o temperatura ambiente.
Cuando se requiera ajustar el valor del pH, la corrección se logra por adición de
solución 1n o 0.1N de ácido clorhídrico o de hidróxido de sódico a una muestra de
cultivo exactamente medida. El valor del pH deberá quedar dentro de los límites de
del rango indicado para cada medio de cultivo.

También se debe a proceder a medir el medio una vez ya esterilizado, de este se

debe extraer una porción estéril, y a esta medir el pH. En el caso de requerir ajustes
las soluciones de ácido clorhídrico y de hidróxido de sódico deben estar estériles.

1.3. Esterilización del medio de cultivo.

Si las normas de preparación no indican lo contrario, la esterilización se lleva a cabo

en autoclave, a 121 ºC, durante 15 minutos.

La esterilidad sólo se consigue con seguridad cuando se ha desalojado

correctamente el aire de la cámara de vaporización del autoclave y de los
recipientes en ella contenidos. Para alcanzar esta condición, se deja fluir
ampliamente la corriente de vapor manteniendo abierta la válvula de purgado
durante el comienzo de la fase de calentamiento del autoclave. Tras la esterilización
y después de haber alcanzado el equilibrio de presiones, (entre el exterior y el
interior del autoclave) y para evitar la sobrecarga térmica del medio de cultivo,
deben sacarse en seguida del autoclave los recipientes y enfriarlos rápidamente,
por ejemplo hasta la temperatura de “vertido”. Para este fin, primero el medio de
cultivo se mantiene expuesto al aire circundante hasta que alcance una
temperatura de próxima de 60 ºC, y después se enfría con agua corriente.

1.4. Utilización de medios de cultivo sólidos.

1.4.1. Vertido en placas:

Para la utilización de medios de cultivos sólidos, estos en su estado aún líquido a

una temperatura de 45 a 55 ºC, deben ser vertidos en placas Petri, también
estériles. Esto se realiza a esta temperatura con el objeto de evitar la formación de
gotitas de condensación de agua en la tapa de las placas. Antes de sembrar las
placas puede secarse la superficie húmeda del medio de cultivo sólido en estufas
apropiadas a 30-40 ºC. para ello se invierte la base de la placa de Petri que contiene
el medio de cultivo y se coloca de forma que una parte de su borde se apoye sobre
la tapa. El tiempo de secado debe ser como mínimo de 20 a 30 minutos y puede
durar hasta una hora.

1.4.2. Agar inclinado:

Por ejemplo para conservación de cepas se realizan siembras en tubos de cultivo.

Para ello se precisa una superficie grande de medio de cultivo, pero se puede
obtener mediante agar inclinado. Los tubos llenos con medio de cultivo esterilizado
y aún líquido, se colocan en una posición inclinada, de tal forma que se forme una
capa aproximadamente de 3 cm y una superficie inclinada de iguales dimensiones o
superior. El medio de cultivo se deja solidificaren la posición lograda.

2. Inoculación, traspaso y cultivos puros.

2.1. Inoculación.

Este término, también llamado siembra, es utilizado para el desarrollo y

multiplicación de una pequeña porción microorganismos colocada en un medio
nutritivo. Este procedimiento debe realizarse mediante una técnica aséptica, lo cual
quiere decir, que se debe evitar la contaminación externa utilizando material estéril.

Posteriormente a la inoculación se procede a la incubación del medio inoculado,

bajo condiciones de temperatura apropiadas.

2.2. Traspaso.

Consiste en transferir o llevar microorganismos (colonias, suspensión) desde un

medio nutritivo donde han crecido, a otro medio de cultivo, el cuál puede tener una
composición idéntica o diferente al primero.

2.3. Cultivos puros.

Consta de una población de células derivadas todas ellas de una sola célula
parental. A un cultivo puro se le denomina cepa y esta formado por
microorganismos de una sola especie.

Los métodos de obtención de cultivos puros mas conocidos son:

2.3.1. Siembra en placa por estría.

El inóculo se traspasa o transfiere al medio en condiciones asépticas. Se dispone

sobre una superficie de un cultivo sólido en una placa Petri, haciendo estrías (líneas
zigzagueantes) con el asa de siembra con loop de manera de aprovechar la mayor
superficie posible de medio de de cultivo. Después de la siembra la placa se incuba
bajo condiciones adecuadas, este proceso se realizará con las placas de Petri
invertidas. Posteriormente se traspasa una colonia a otro medio nutritivo en el cual
se desarrollará el cultivo puro.

2.3.2. Siembra en extensión en placa.

Se coloca un determinado volumen de inóculo en el centro de la placa de Petri que

contiene un medio sólido y utilizando un asa de Drigalski (o rastrillo de siembra) se
extiende el inóculo sobre la superficie de medio. En algunas placas aparecen
colonias aisladas, debiendo ser traspasadas a otro medio para obtener el cultivo
puro.
3. Componentes de los medios de cultivo:
- Agua

- Extracto de levadura: fuente rica en vitaminas B; también contiene

nitrógeno orgánico y compuestos de carbono.

- Peptonas: es el producto que resulta de la digestión de materiales

proteicos. Constituye una fuente principal de nitrógeno orgánico; contiene
también algunas vitaminas, y a veces carbohidratos. Distinguimos dos tipos,
dependiendo del tipo de digestión que hayan sufrido:

Hidrólisis química (ácida o alcalina)

Hidrólisis enzimática

- Infusiones y extractos: contienen las sustancias solubles en agua de

tejidos animales (carbohidratos, compuestos orgánicos nitrogenados,
vitaminas solubles en agua y sales). Mientras que un caldo se obtiene por
ebullición de los tejidos, una infusión implica un "colado" del líquido
obtenido. Un extracto es un concentrado de un caldo.

- Azúcares: actuarán como fuente de energía (cuando su proporción es de 1

g/l) o como substrato de prueba (1-2%)

- Sales minerales: podemos distinguir dos tipos, atendiendo a la función

que desempeñan. Estos son:

Sales para el mantenimiento de la presión osmótica (NaCl).

Tampones: carbonatos y fosfatos (este ultimo más eficaz).

- Indicadores de pH: son sustancias que cambian de color cuando el medio

alcanza algún valor determinado de pH. Los más utilizados son:

- Azul de timol (Rojo 1,2 Azul 2,8 Amarillo)

- Púrpura bromocresol (Amarillo 5,2 Anaranjado 6,8
Púrpura)
 - Azul de bromotimol (Amarillo 6,0 Verde 7,6 Azul)
- Rojo fenol (Amarillo 6,8 Rojo claro 8,4 Rojo cereza)
- Rojo neutro (Rojo intenso 6,8 Rojo 8,0 Amarillo)
- Azul de bromofenol, rojo de metilo, rojo de cresol,
fenolftaleina, etc...

- Indicadores REDOX: son sustancias que cambian de color cuando se

producen este tipo de reacciones. Distinguimos:

Azul de metileno (azul-incoloro)

Cloruro de trifenil (incoloro-rojo)

- Agentes selectivos: son sustancias que inhiben el crecimiento de

determinados microorganismos en decrimento de otros. Encontramos
varios tipos:

- Colorantes (antimetabolitos): cristal violeta, verde brillante,

etc...
- Azida sódica: inhibe el metabolismo aerobio (inhibe la
cadena respiratoria); esto afecta principalmente a bacterias
Gram negativas.
- Sales biliares y detergentes: son agentes tensoactivos,
depresores de la tensión superficial. En este caso son las
bacterias Gram negativas las que resisten más su acción.
- Cloruro sódico: a elevadas concentraciones son
perjudiciales para aquellos microorganismos no halófilos.
- pH: cada tipo de microorganismo tiene su rango de pH
óptimo y sus valores críticos.
- Antimicrobianos: sustancias capaces de matar a
microorganismos.

- Suplementos (factores de crecimiento): consiste en uno o mas

compuestos orgánicos que un microorganismo requiere como precursor o
como constituyente de su material orgánico celular, pero que no puede
sintetizar a partir de fuentes de carbono más sencillas, y debe ser
administrado como nutriente. Hay tres clases: aminoácidos, pirimidinas y
vitaminas.

- Agentes solidificantes: permiten solidificar un medio previamente líquido.

Pueden ser de:

- agar-agar (a partir de 10-14 g/l es un medio de cultivo

sólido; para valores inferiores, medios semisólidos).
- gel de sílice
- geles poliacrílicos
- Agentes reductores: estos disminuyen el contenido de O2, obteniéndose
así un ambiente de anaerobiosis. Los más usados son:

- Ácido ascórbico
- Tioglicolato sódico
- Ácido tiomálico
- Cisteina

- Agentes quelantes: son agentes que forman complejos solubles con los
metales, impidiendo así que estos formen un complejo insoluble con los
fosfatos. El más utilizado es el EDTA (ácido etilendiamino tetraacético).

4. Clasificación de los medios de cultivo: atiende a distintos criterios. Estos

son:

- Composición química:

- Definidos o sintéticos
- Indefinidos o complejos

- Origen de sus componentes:

- Artificiales
- Naturales
- Mixtos

- Estado físico:

- Sólidos: rebanadas de pan, etc...

- Líquidos (caldos): caldo nutritivo, leche desnatada, etc...
- Semisólidos: con pequeñas cantidades de agar
(consistencia de "natilla")
- Sólidos reversibles a líquidos: agar nutritivo.

- Uso o aplicación:

- Comunes
- Especiales:
- Medios enriquecidos: adición de componentes, como
sangre, suero, etc..., para proporcionar sustancias nutritivas
complementarias para que el medio pueda soportar el
crecimiento de los heterótrofos exigentes.
- Medios selectivos: medio con ciertas sustancias químicas
específicas que no permitirán el desarrollo de un grupo de
bacterias, sin inhibir a su vez el crecimiento de otros grupos.
 - Medios diferenciales: ciertos reactivos o sustancia químicas
que dan lugar a determinado tipo de crecimiento bacteriano
o cambios para diferenciar las bacterias.
- Medios de prueba: para el ensayo de vitaminas,
aminoácidos y antibióticos se utilizan medios de
composición experimental. También se utiliza este tipo de
medio para probar desinfectantes.
- Medios para recuento: utilizado para el recuento de
microorganismos en una muestra.
- Medios de caracterización bacteriana: para determinar el
tipo de crecimiento producido por los organismos y la
capacidad de la bacteria para producir cambios químicos.
- Medios de mantenimiento: para conservar al
microorganismo durante un elevado tiempo sin dañar su
estructura.

Un medio de cultivo ha de estar libre de microorganismos (solo queremos

aquellos que vamos a estudiar). Por ello se debe de utilizar material y
componentes esterilizados.

BIBLIOGRAFÍA:
1. Merck Microbiology Manual 12. www.merck.de
www.merck.de (visitado el 5 de agosto de 2019)
2. Catalogo para productos de microbiología OXOID
www.thermoscientific.com/microbiology. (visitado el 5 de agosto de 2019)

3. Gamazo C, Lopez-Goñi, Alonso-Urmeneta B. 2005. Manual Práctico de Microbiología 3 Ed.

Elsevier Editorial.
4. Atlas R. 1995. Handbook of media for environmental microbiology. CRC Press