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SUMMARY
Alors que l’acetylcholinesterase est localisee clans les globules rouges, le serum
contient une butyrylcholinesterase responsable de son activite cholinesterasique.
Les variations de l’activite cholinesterasique clu serum interessent a la fois le
clinicien et le toxicologue. Pour le clinicien, la butyrylcholinesterase, au meme titre
que la cholesterolesterase, la lipoproteine lipase et la pyruvate kinase, fait partie
au groupe des enzymes seriques d0nt la diminution a principalement la signification
dune insuffisance fonctionnelle au foier. Pour le toxicologue, les cholinesterases
sdriques sont un temoin de l’intoxication par les anticholinestQasique9.
11 existe de nombreuses m&ho&s pour closer la butyrylcholinesterase: me-
thodes manomCtriques3~*, pH-mCtriquesS-8, titrimCtriquess~lO,colorimetriquesrl-16,
spectrophotomCtriques16-18 et Clectrochimiquesr9-2r. La plupart de ces techniques
sont adaptees a la determination de l’activite cholinesterasique du serum; toutefois,
les methocles colorimetriques sont les plus utilisees en raison de leur sensibilite et de
leur commoclite. Jusqu’a ces clernieres an&es, les techniques clerivant de la reaction
de Hestrinll-r* (reaction des hyclroxamates) ont CtCles plus employees. Recemment,
la reaction de Ellmann16 (substrat : adtylthiocholine, revelateur : clithiobisnitroben-
zoate) a egalement CtCmise a profit.
* Adresse actuelle : Facult6 de M6decine de Paris, Unit6 P.C.E.M. de Bobigny, Rue Marcel Cachin,
Bobigny 93, France
Quelles que soient leur sensibilite et leur commodite, les methodes optiques
peuvent Ctre perturbees par la turbidite et par des colorations anormales des Cchan-
tillons. Aussi nous pensons utile de decrire une nouvelle methode, bake sur l’en-
registrement des variations de conductivite, non influencee par ces causes d’erreurs.
PRINCIPES GtiNi+RAUX
A +$
E
A’ _ KV dG Io6
REdt a
dt
PARTIE EXPRRIMENTALE
A. Techniques utilist!es
La methode conductimetrique est utilisee dans les conditions suivantes:
l’adtylcholine* (c = Z.IO-~ M) en milieu tris-HCI (pH = 8.1) est hydrolysee par
40 ,ul de serum; la duree totale de la mesure est de 4 min.
La methode colorimetrique de reference derive de la reaction de Ellmann. Le
protocole utilise est propose par la firme Boehringer** sous forme de trousses reactifs,
ses caracteristiques &n&ales sont les suivantes: a pH = 7.2 (tampon phosphate),
l’acetylthiocholine est scindee en acide acetique et en thiocholine dosee colorimetri-
quement par le dithiobisnitrobenzoate. Une determination est effect&e en 3 min sur
20 ~1 de serum.
I. MatLrieL
MWhode conductidtrique. Cet appareillage a CtC decrit antCrieurementa3j24. I1
est constitue par les elements suivants: pont de mesure Wayne Kerr A-221 et acces-
soire pour enregistrement B-221 ; ultrathermostat regle a 25” & 0.01; cellule con-
ductimetrique Metrohm EA 660 (capacite 2 ml; constante de cellule K = 11.15
cm-l) ; enregistreur.
Mdhode colorimWrique. Nous avons utilise un spectrophotometre Carl Zeiss
PM Qz avec enregistreur. Les dosages ont CtC effectues dans des cuves de I cm.
Les prelevements habituels sont effect&s a l’aide dune micropipette Marburg de
20 ~1 (& I ~1). Une microseringue Hamilton de plus grande precision a CtC reservee
aux etalonnages.
2. Produits et dactifs
Mbthode conductimdrique. Les reactifs sont prepares a partir de: chlorure
d’acetylcholine BDH (conserve a l’obscurite dans un dessicateur) ; trihydroxymethyl-
aminomethane (= tris) Merck; acide chlorhydrique normal titrisol Merck; butyryl-
cholinesterase du serum de cheval Schwarz (4.5 U.I./mg).
Solutions stock :
R I : chlorure d’acetylcholine 0.1 M (conserve au refrigerateur)
R II: tampon tris-HClo.1 M, pH = 8.15
//
AG
I
50 n Mho
f-7
I/ I’ Imin
Fig. I. En (I), la cellule est remplie avec la solution “temoin”. Aprbs une periode de stabilisation
thermique de I min 30 set environ, il apparait une variation de conductance reguliere, faible
et reproductible. En (2), la cellule est remplie avec la solution “essai”. L’equilibre thermique est
la aussi atteint apres I min 30 environ. Ensuite, la conductance varie regulierement par suite de
l’hydrolyse enzymatique de l’acetylcholine.
4. Factew d’btalonnage B
En principe B = IoeKV/aRE Cependant, l’etude de la constante de vitesse
k en fonction du pH nous a montrC23924que l’optimum cinetique se situe a pH = 8.9 ;
c’est pour des motifs purement conductimetriques (palier de rendement) que nous
avons choisi de fixer le pH a 8.1. Dans un but de normalisation des resultats, (choix
des conditions optimales), nous corrigerons le facteur d’etalonnage par un coefficient
k(pH = 8.9)
f=
k(pH = 8.1)= 1'23
Si bien qu’en definitive:
B = Kg T x 1.23
E
0.3-
L”
t
.-
E
I w-
0
llllr
m-
111.-1.*1 0
v. 1.P
Fig. z. Vitesse de variation de la conductance en fonction de la quantite d’enzyme.
La Fig. 2 montre que dans cette zone la linearite est bien respect&e.
de la mWhode. Dix determinations en serie sur un meme serum
Reproductibilitk
de faible activite nous ont donne les resultats suivants:
x J% = 1840 Lc_60 U.I. 1-l.
enzyme de rkf&ence. Nous avons utilise une butyrylcholinesterase
.l?tude d’une
Schwarz titrant 4.5 U.I. par mg; l’activite 6valuCe par notre methode est de 4.2
U.I. par mg.
AG I I
( t
Imin
TABLEAU I
R$SULTATS CLINIQUES
CONCLUSION
BIBLIOGRAPHIE