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modelo matemático Kinetic para la bioconversión cetona usando Escherichia coli TOP10 pQR239
DF, México
do Departamento de Ingeniería Bioquímica, Universidad de Londres, Londres WC1E 7JE, Reino Unido
reflejos
Un pseudo modelo cinético no informaron intrínseca fue desarrollado sobre las reacciones básicas. El mecanismo de
reacción propuesto siguió el formalismo de Langmuir-Hinshelwood. formación de complejos de la inhibición de sustrato y
la inactivación de oxígeno se contabilizan. constantes nidad fi y de inhibición Af se obtuvieron del modelo cinético. Este
es el primer informe de constante de inactivación de oxígeno (22,3 l METRO).
Historia del artículo: El objetivo del presente trabajo fue desarrollar un pseudo modelo cinético intrínseco, basado en reacciones elementales, para describir el
Recibido el 20 de de septiembre de 2013
comportamiento de la bioconversión de cetonas usando Escherichia coli TOP10 pQR239. Dado que no existen informes de la constante en la
Recibida en forma de noviembre de 2013 18 revisado Aceptado 23 de
literatura inactivación de oxígeno, este estudio dio nuevas perspectivas a FI condiciones nd óptima de un suministro de oxígeno adecuado
de noviembre de 2013 Disponible en línea 1 de diciembre de 2013
durante la bioconversión. En este modelo el mecanismo de reacción propuesto siguió el formalismo de Langmuir-Hinshelwood y considera
tanto la inhibición de sustrato y la inactivación de oxígeno por la formación de complejos intermedios. Por lo tanto, aproximaciones de los
pseudo equilibrio de las velocidades de reacción o las especies intermedias estado estacionario no se consideraron, lo que permitió para la
palabras clave:
identificación de la función de cada etapa de reacción implicada en la bioconversión. Este modelo cinético descrito adecuadamente las
bioconversión
observaciones con y sin inhibición de sustrato y / o inactivación de oxígeno. Y la regresión y los parámetros estimados fueron estadísticamente
Ciclohexanona monooxigenasa Modelado
significativos, hacer estos análisis fiables con respecto al comportamiento cinético de CHMO. Entonces, las constantes de sustrato y af oxígeno
Los parámetros cinéticos de infinito y de inhibición se obtuvieron a partir de los parámetros cinéticos del modelo. Se observó que el oxígeno y el sustrato presentan valores
oxígeno inactivación constantes af infinito similares. La inhibición de sustrato ( K ES) y la inactivación de oxígeno ( K IO2) constantes se determinaron a ser 9,98 l M y 22,3 l M,
Escherichia coli respectivamente, demostrando que la enzima CHMO era dos veces más sensible a la inhibición por un exceso de sustrato que el oxígeno.
1. Introducción coli TOP10 pQR239 [3] . El uso de células enteras permite la regeneración de cofactor de la enzima
para la producción de compuestos enantioméricamente puros [4] . Sin embargo, se ha informado [5,6] que
Las lactonas tienen amplias aplicaciones en avorings fl, como precursores de cáncer y bioconversión cetona usando CHMO es inhibida por el sustrato y producto en concentraciones por
antihipertensivos medicamentos y en la industria farmacéutica [1] . Las lactonas se han obtenido por encima de 0,4 y 4 g L 1, respectivamente. Además, Bennett [7] informaron que la inactivación de la
reacciones de Baeyer-Villiger utilizando proceso catalítico [2] o bioconversión de células enteras con enzima se puede producir debido a la oxidación de residuos de dos serinas cerca del sitio activo. Se
una monooxigenasa ciclohexanona (CHMO) expresada en Escherichia han propuesto una serie de estrategias para evitar estos tipos de inhibición, como la alimentación de
sustrato y en el lugar retirada del producto usando resina Lewatit [8] , Encapsulación biocatalyzer para
evitar la oxidación CHMO [9] , El uso de líquidos iónicos como un depósito de sustrato en fase
inmiscible y en el lugar retirada del producto y mantener
⇑ Autor correspondiente. Tel .: +52 58044999; Fax: +52 5558044712.
1385-8947 / $ - see front matter 2013 Elsevier Todos los derechos reservados.
http://dx.doi.org/10.1016/j.cej.2013.11.047
2 R. Melgarejo-Torres et al. / Diario de Ingeniería Química 240 (2014) 1-9
Nomenclatura
la biocatalyzer (células enteras) en la fase acuosa [4] , Una solución agitada biorreactor de partición esterilizado en un autoclave a 120 C durante 15 min y suplementado con 100 mg L 1 ampicilina
tanque usando líquidos iónicos como la fase dispersa [10] y CHMO cambios en la estructura (previamente filtro esterilizado usando una
molecular para plegar las serinas susceptibles a la oxidación en el interior de la enzima [11] . A pesar 0.25 l m filtro). Erlenmeyer matraces se incubaron a 150 rpm durante 16 h a 37 C. Después de este
de varios estudios experimentales sobre la estructura molecular de CHMO, sus catalíticos tasas de período de crecimiento de 16 h, la expresión de ciclohexanona monooxigenasa se indujo mediante la
actividad y de reacción de los pasos intermedios en la reacción global con el fin de proponer un adición de la cantidad necesaria de solución de arabinosa (100 g L 1) para alcanzar una concentración
mecanismo básico de bioconversión [12-14] , Ha habido pocos estudios sobre cinética de modelado final de 2 g L 1. Después de 3 h de inducción, las células se recogieron por centrifugación a 5000 rpm
teniendo en cuenta fenómenos de sustrato, de productos y de inhibición de oxígeno simultáneas. durante 10 min.
Algunos modelos cinéticos seudo empírica se han reportado siguiente enfoque de Michaelis-Menten
para describir la formación de producto y consumo de sustrato en la cinética de monooxigenasa [15,16,17] Bicíclico bicicleta cetona [3.2.0] hept-2-a-6-ona ( PAG 98%) y bicíclico
. Sin embargo, no toman en cuenta las reacciones elementales que representan el oxígeno como un lactona (1S, 5R) - (-) - 2-oxabiciclo [3.3.0] oct-6-en-3-ona
segundo sustrato para la bioconversión. El uso de este tipo de modelos cinéticos reduce el número ( PAG 99: 0%)) (Fluka, Suiza) se utilizaron como los estándares de sustrato y producto,
de parámetros cinéticos necesarios; sin embargo, los valores cinéticos estimados dependen de la respectivamente. Triptona, extracto de levadura, NaCl y glicerol se adquirieron de Sigma Aldrich
concentración de catalizador y se vuelven independientes del tamaño del reactor y su con fi guración (EUA).
geométrica, proporcionando incertidumbres para expandir la cobertura de bioconversión cetona. En
este sentido, el desarrollo de un modelo cinético basado en un mecanismo de reacción elemental 2.2. Descripción biorreactor de tanque agitado
descripción de Baeyer-Villiger bioconversión hará que sea posible describir, entender y encontrar las
condiciones óptimas para llevar a cabo este tipo de bioconversión pero sobre todo para el diseño y la Un módulo con dos vidrio de 100 ml biorreactores de tanque agitado (MMBR100, UAM-I,
ampliación. México) se utilizó para todos los estudios de bioconversión. Los biorreactores encamisados tenían un
diámetro interno de 4,75 cm y un volumen operativo de 70 ml ( H L / re T = 0,87). Los biorreactores fueron
fi tted con una sola, seis FL en la hoja Rushton turbina, re i = 1,9 cm ( re yo/
re T = 0.40), encuentra a 1,9 cm de la fl en la base del recipiente. El biorreactor fue equipado con
cuatro baf equidistante fl es, 0,5 cm de ancho, para mejorar la mezcla.
k L AE KP t
Y PAG ¼ K PAG mi k L en re 1 Þ
K PAG k L una
2. Materiales y métodos
dónde Y PAG es las concentraciones de oxígeno disuelto adimensionales en el biorreactor definida por
la Ec. (2) .
2.1. Microorganismo y productos químicos
el consumo de energía aireado ( PAG sol) se midió usando la metodología recientemente discutido
por Ascanio et al. [19] . Básicamente, el método se basa en mediciones eléctricas realizadas
directamente en el motor de eje biorreactor agitador por el medidor de vatios y amperímetros. Para
tener en cuenta las pérdidas que ocurren en el sistema de agitación, una pieza en bruto de las
mediciones fue primero realizado con un biorreactor vacía. Todas las mediciones se realizaron por
triplicado.
1,0 g L 1). Durante los experimentos de bioconversión, muestras de 500 l L fueron tomadas cada 3 min Sheng et al. mecanismo de reacción considera oxidación del sitio activo CHMO ( MI) para formar
durante los primeros 15 min y luego cada hora durante tres horas. Las muestras se congelaron el complejo enzima-oxígeno (EO 2)
rápidamente para detener la reacción. Para el sustrato y análisis de productos, las muestras se a una velocidad de reacción r 1 y una estequiométrica coeficiente de 3
centrifugaron a 5000 rpm durante 10 min para separar la biomasa y se analizó el sobrenadante. El
sustrato y el producto eran fi cuantificada por cromatografía de gases. mi þ O 2 ¢ k 1 EO 2; r 1 ¼ k 1 norte T h mi ½ O 2 k 01 norte T h EO 2 re 3 Þ
k01
capilar CYCLOSILB 113-6632 (30 m 530 l m) (J & W Scientific c), y las concentraciones se
EO 2 S es el intermedio para formar el producto de interés ( PAG) a una velocidad de reacción r 5 y
determinaron usando una curva de calibración externa. La temperatura GC inyector se fijó en 250 programa
una estequiométrica coeficiente de 1, y fi nalmente la regeneración del sitio activo ( MI) para empezar
de temperatura C. El GC utilizado fue el siguiente: la temperatura inicial del horno era 100 C, se
de nuevo el ciclo catalítico.
mantuvo durante 1 min, seguido de un aumento de temperatura a 10 C min 1 hasta 150 C, que
después se mantuvo durante 3 min. Los tiempos de retención fueron 3,7 min y
EO 2 S! k 5 mi þ PAG; r 5 ¼ k 5 norte T h EO 2 S re 5 Þ
Sin embargo, este mecanismo no se considera cualquier tipo de inactivación por el exceso de
oxígeno o inhibición de sustrato, y sólo propone la oxidación-reducción dinámica del sitio activo de la
3,95 min para el sustrato (mezcla de isómeros de cetona) y
CHMO para la formación de producto. El mecanismo de reacción propuesto en este documento ( Figura
8,5 min para el producto.
1 ) Tiene en cuenta la posible formación de dos complejos inactivos, uno que implica la oxidación por
encima del sitio activo (O 2 EO 2) a una velocidad de reacción r 2 y un coef estequiométrica fi ciente de 1,
3. Modelo matemático
EO 2 þ O 2 ¢ k 2 O 2 EO 2; r 2 ¼ k 2 norte T h EO 2 ½ O 2 k 02 norte T h O 2 EO 2 re 6 Þ
Para desarrollar un modelo cinético para la bioconversión cetona, el mecanismo de reacción k02
propuesto por Sheng et al. [12] era modi fi ed. El mecanismo de reacción propuesto en este
documento sigue el formalismo Langmuir-Hinshelwood-Hougen-Watson [20] , Teniendo en cuenta los y otro que representa inhibición de sustrato (EO 2 SS) a una velocidad de reacción r 4 y una
re h mi
sustrato [ S], producto [ PAG] y oxígeno [O 2] concentraciones en el reactor durante la bioconversión
norte T r1 re 8 Þ
dt ¼ r 5 se describen por ecuaciones diferenciales:
re h EO 2
norte T r2 r3 re 9 Þ
dt ¼ r 1 re ½ S dt ¼? r 3
r4 re 14 Þ
re h O 2 EO 2
norte T re 10 Þ
dt ¼ r 2 re ½ PAG
re 15 Þ
dt ¼ r 5
re h EO 2 SS
norte T re 11 Þ
dt ¼ r 4 re ½ O 2
½ O 2 Th? r1 r2 re dieciséis Þ
dt ¼ k L una ð½ O 2
re h EO 2 S
norte T r4 r5 re 12 Þ El modelo matemático propuesto fue resuelto mediante la integración de un conjunto de
dt ¼ r 3
ecuaciones diferenciales (ODEs) con el método de Runge Kutta Fehlberg. La estrategia de
Y el equilibrio de las fracciones de la enzima se da como sigue:
estimación de los parámetros cinéticos se presenta en Figura 2 , Que considera la transferencia de
h mi þ h EO 2 þ h O 2 EO 2 þ h EO 2 SS þ h EO 2 S ¼ 1 re 13 Þ masa de oxígeno y las reacciones que tienen lugar en la célula durante la bioconversión.
El modelo contiene nueve parámetros cinéticos, k j, las cuales se estimaron por los mínimos
3.2. Modelo matemático en el biorreactor
cuadrados ponderados de los residuos (RSS) entre las concentraciones calculadas y experimentales
de acuerdo con la siguiente función objetivo ponderada minimizado (Eq.
La transferencia de masa y el mecanismo de bioconversión se consideraron para el desarrollo
del modelo matemático en el biorreactor. Se hicieron las siguientes suposiciones:
(17) ):
una
segundo
[P] g / L
0.4590
0.3790
0.2980
0.2180
0.1380
0.0571
do
Fig. 3. bioconversión cetona bajo diversas condiciones de funcionamiento de velocidades de agitación y aireación, y concentraciones de sustrato: (a) 0,4 g L 1; ( b) 0,7 g L 1; ( c) 1,0 g L 1.
se usó, mientras que la F Se utilizó la prueba para obtener la regresión significación. En este sentido, parámetros a la velocidad de formación de los diferentes intermediarios que inducen la inhibición y la
estadística con fi anza en el desarrollo del modelo cinético nos permitirá relacionar la cinética formación de producto en el ciclo catalítico de la célula.
6 R. Melgarejo-Torres et al. / Diario de Ingeniería Química 240 (2014) 1-9
tabla 1
0.7 8
Estimación de parámetros cinéticos.
una
Los parámetros cinéticos Valor estimado 0.6 7
k3 83,43 (Lg 1 s 1) 4
Tabla 2
1.0
constantes Af infinito y de inhibición obtenidos en este trabajo y reportados en la literatura.
segundo
0.9 [EO 2]
referencias K MO2 ( l METRO) K SRA ( l METRO) K IO2 ( l METRO) K ES ( l METRO)
[EO 2 S]
0.8
Trower et al. [23] una - 0.5 - - [E]
O2
Branchaud y Walsh [24] segundo - 6 - - 0.7
Sheng et al. [12] do - 6.8 - -
fracción Complex
0.6
Torres-Pazmiño et al. [dieciséis] mi 10 80 - - K5
4. Resultados y discusión
Fig. 4. Estudio de caso sin inhibición de sustrato o inactivación de oxígeno. Las condiciones de operación fueron
1.350 rpm, 1 vvm ( k L a = 180 h 1) y 0,35 g sustrato L 1. ( a) Substrato, producto y concentraciones de oxígeno disuelto de
4.1. estudios de transferencia de masa de oxígeno en ausencia de bioconversión los datos experimentales y los valores calculados en función del tiempo de bioconversión. (B) Mecanismo de la
reacción y las fracciones complejas intermediarias estimados durante la bioconversión.
en un 1,0 L matraz con un volumen de 20 ml a 250 rpm. Modificación y control de la k L una valor
4.2. La bioconversión de cetonas en un sistema de gas acuosa (180-290 h 1) podría aumentar la transferencia de oxígeno de la fase gaseosa a la fase acuosa
mediante el mantenimiento de una concentración constante de oxígeno disuelto; Sin embargo, este
Los resultados experimentales de bioconversión obtenidos a través del diseño experimental en mecanismo hace que la oxidación en el biocatalyzer y una disminución en la bioconversión. Bennett [7]
diversas condiciones de operación en términos de velocidades de agitación (750, 1350 y 1950 rpm), informó de que el exceso de oxígeno en el medio de reacción causada oxidación de dos residuos de
las tasas de aireación (0,75, serina periféricos para formar ácido sulfónico, provocando un cambio y la inactivación permanente de
1,0 y 1,4 VVM) y sustrato concentraciones (0,35, 0,7 y 1 g L 1) se muestran en la Fig. 3 . Se observó El CHMO. Estos resultados también fueron observados por Opperman y Reetz [11] que diseñó un
cien por ciento de bioconversión cetona en 1 vvm y 1350 rpm ( k L a = 180 h 1), con concentraciones de CHMO mediante la identificación de los aminoácidos de superficie susceptibles a la oxidación y
sustrato de menos de 0,4 g L 1 ( Fig. 3 una). Sin embargo, cuando las tasas de aireación y agitación se doblando hacia atrás ellos dentro de la enzima. La enzima mutado retiene actividad 40% en H 2 O 2
aumentó a 1,4 vvm y 1950 rpm ( k L a = 290 h 1) a concentraciones de sustrato de menos de
0,4 g L 1, la bioconversión se redujo a 42%. Fig. 3 b muestra que a concentraciones de sustrato mayor (0,2 M), mientras que la enzima de tipo salvaje perdió toda su actividad en 5 MMH 2 O 2.
que 0,4 g L 1, y en 1 vvm y 1350 rpm ( k L a = 180 h 1), se obtuvo sólo el 20% de bioconversión. Una vez
más, cuando las tasas de aireación y agitación se aumentó a 1,4 vvm y 1950 rpm ( k L a = 290 h 1) a
concentraciones de sustrato más de 0.4 g L 1, la bioconversión se redujo a 17%. El análisis estadístico 4.3. Modelo matemático para la bioconversión cetona
usando el cuadro de Pareto se indica que el sustrato tenía el mayor efecto en la bioconversión
cetona. El segundo factor más importante fue la interacción entre la agitación y El modelo cinético propuesto basado en reacciones elementales que incluyen la inhibición de
sustrato y la inactivación de oxígeno se acopló a la modelo biorreactor que da cuenta de un
mecanismo de transferencia de oxígeno desde el gas a la fase acuosa. La resultante
R. Melgarejo-Torres et al. / Diario de Ingeniería Química 240 (2014) 1-9 7
0.7 8 0.7 8
una una
0.6 0.6
7 7
Substrato y la concentración de producto (GL- 1)
0.4 0.4
Oxígeno Oxígeno
sustrato 5 5
sustrato
Producto
0.3 0.3 Producto
4 4
0.2 0.2
3 3
0.1 0.1
0.0 2 0.0 2
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
tiempo bioconversión (min) tiempo bioconversión (min)
1.0 1.0
segundo
[EO 2] segundo
O2
0.8 [EO 2 O 2]
0.8
[EO 2 S] [E]
K5
k'
O2 EO 2
1 'E
0.6
fracción Complex
0.6
fracción Complex
PAG
k3' 3 k1
K5
k2' EO 2 S kk S
K2
[EO 2]
0.4 1 'E EO 2 O 2 EO 2
0.4 [EO 2 SS] k'k4' k 4
PAG k 1 k' S
k3' O2
[EO 2 S] [E]
kk S EO 2 SS
EO 2 S
0.2 3
0.2
0.0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 0.0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
tiempo bioconversión (min)
tiempo bioconversión (min)
Fig. 5. Estudio de caso con la inactivación de oxígeno. Las condiciones de operación fueron 1.950 rpm y 1,4 vvm ( k L a
Fig. 6. Estudio de caso con la inhibición de sustrato. Las condiciones de operación fueron 1.350 rpm y 1,0 vvm ( k L a = 180
= 290 h 1) y 0,35 g sustrato L 1. ( a) Substrato, producto y concentraciones de oxígeno disuelto de los datos
h 1) y 0,70 g sustrato L 1. ( a) Substrato, producto y concentraciones de oxígeno disuelto de los datos experimentales y
experimentales y los valores calculados en función del tiempo de bioconversión. (B) Mecanismo de la reacción y las
los valores calculados en función del tiempo de bioconversión. (B) Mecanismo de la reacción y las concentraciones de
fracciones complejas intermediarias estimados durante la bioconversión.
complejos intermedios estimados durante la bioconversión.
Tabla 2 muestra las constantes nidad fi y de inhibición de AF del sustrato y el oxígeno obtenido a
modelo fue alimentado con bioconversión datos experimentales y de transferencia de masa de
partir de los parámetros cinéticos del modelo ( tabla 1 ), Expresado en l M para la comparación con los
oxígeno coeficientes obtenidos a partir de experimentos abióticos con el fin de estimar los
reportados experimentalmente por otros autores para enzimas monooxigenasas. Af infinito y
parámetros cinéticos.
constantes de inhibición (Eq. (18) ) Se definieron como la inversa de las constantes de equilibrio de las
Con el fin de obtener un mínimo global, para reducir la correlación estadística entre los
reacciones individuales:
parámetros cinéticos para ser estimada y, por lo tanto, para describir el comportamiento enzimática
intrínseca dentro de la célula bajo diversas condiciones de reacción, la estimación de los parámetros
cinéticos considera la siguiente estrategia: (a) estimación de parámetros cinética para la
bioconversión sin que ninguna de inhibición de sustrato o inactivación de oxígeno se llevaron a cabo.
Esto permitió obtener valores fiables de los parámetros k 1, k 0 K ¼ k0
j
re 18 Þ
kj
de los datos experimentales cuando la inactivación de oxígeno estaba presente, en relación con la En el estudio de caso sin inhibición de sustrato o inactivación de oxígeno, las condiciones de
etapa de reacción que tiene en cuenta la inactivación de oxígeno; (C) los parámetros cinéticos k 4 y k 0
operación fueron 1.350 rpm y 1,0 vvm ( k L-
4 se estimaron a partir del experimento a = 180 h 1), con 0,35 g de sustrato L 1. La comparación entre los datos experimentales y calculados
datos mental cuando inhibición de sustrato estaba presente, en relación con la etapa de reacción que obtenidos a partir de la fi t del modelo en función del tiempo se muestra en la bioconversión Fig. 4 a.
causa la inhibición de sustrato; (D) finalmente, el modelo cinético propuesto se validó mediante la Se observó que el modelo cinético describe adecuadamente los datos experimentales. El sustrato se
predicción de observaciones bajo condiciones de reacción en presencia de inhibición de sustrato y la consumió completamente en 70 min; suponiendo un rendimiento sustrato-producto ( Y S / P) de 0,871 y
inactivación de oxígeno de forma simultánea. De acuerdo a t- y pruebas 3,0 g de biomasa L 1, una tasa c especificidad de 0,11 g de lactona g biomasa 1 h 1 fue obtenido. Este
valor es más bajo, pero en el mismo orden de magnitud que los valores reportados previamente para
F- pruebas, la regresión y los parámetros mostraron estadística significación fi dentro del intervalo de la misma cepa; MelgarejoTorres et al. [10] observado una tasa c especificidad de 0,45 g de lactona g
confianza del 95%. No hubo correlación estadística entre los parámetros estimados de acuerdo a la biomasa 1 h 1 en 1,0 g de biomasa L 1 y 0,5 g de cetona L 1. Además, Baldwin
matriz de varianza-covarianza. Los parámetros cinéticos estimados por el modelo se muestran en la tabla
1.
8 R. Melgarejo-Torres et al. / Diario de Ingeniería Química 240 (2014) 1-9
y Woodley [6] observado una tasa c especificidad de 0,65 g de lactona g biomasa 1 h 1 en 2,0 g de
0.7 8
biomasa L 1 y 0,5 g de cetona L 1. La concentración pro fi les de los intermedios estimados presentes una
dentro de la célula durante la bioconversión en función del tiempo se muestran en la bioconversión Fig.
0.6
7
4 segundo. oxidación CHMO se produce en los primeros pocos minutos, la generación de la [EO 2] complejo
k' k2' 2
K2
0.8 1 'E EO 2 O 2 EO 2
PAG
O
56,66 s 1 ( tabla 1 ), Que es la constante de velocidad de reacción ( k gato) para el producto [ PAG] formación. k3'
kk S
EO 2 S
Kamerbeek et al. [26] reportado k gato valores de 14 y 3,7 s 1 para un CHMO tipo salvaje ( E. coli TOP10
3
fracción Complex
0.6 k 4' k4
pQR230) y su mutante, respectivamente. S
EO 2 SS
En el estudio de caso en el que estaba presente la inactivación de oxígeno desde que se 0.4
[EO 2]
aumenta la transferencia de masa de oxígeno en el medio de reacción, las condiciones de operación
[EO 2 O 2]
eran 1.950 rpm y 1,4 vvm ( k L a = 290 h 1),
[EO 2 SS]
0.2
y 0,35 g sustrato L 1. La comparación entre los datos experimentales y calculados en función del [EO 2 S] [E]
valor indica que la reacción de oxidación CHMO era prácticamente irreversible y coincide con lo Fig. 7. Estudio de caso con tanto la inhibición de sustrato y la inactivación de oxígeno. Las condiciones de operación
fueron 1.950 rpm y 1,4 vvm ( k L a = 290 h 1) y 0,70 g sustrato L 1. ( a) Substrato, producto y concentraciones de oxígeno
reportado por Bennett [7] , Que menciona que la oxidación provoca la inactivación de la enzima
disuelto de los datos experimentales y los valores calculados en función del tiempo de bioconversión. (B) Mecanismo
permanente. Con estos parámetros cinéticos, una constante de inactivación de oxígeno ( K IO2) valor de
de la reacción y las fracciones complejas intermediarias estimados durante la bioconversión.
22,3 l Mwas obtenido ( Tabla 2 ). No hay informes de la inactivación de oxígeno constante en la
literatura. En estas condiciones operativas, el porcentaje de bioconversión experimental fue del 42%.
La concentración pro fi les de los intermedios estimados presentes dentro de la célula durante la
bioconversión en función del tiempo de bioconversión se presentan en Fig. 5 segundo. Se observó
sustrato complejo inhibidor [EO 2 SS] formación. Se sabe que una reducción en la concentración de
que la formación de los primeros [EO 2] complejo se redujo, formando rápidamente la [O 2 EO 2] y [EO 2 S] complejos,
sustrato puede revertir la inhibición ya que la enzima permanece activa, como la mayoría de los
complejo de inactivación de oxígeno y un complejo esencial para la formación del producto [ PAG], respectivamente.
La tendencia lineal en [O 2 EO 2] la formación del complejo en relación con la oxidación CHMO muestra sustratos no se unen a las enzimas por unión covalente [21] . Fig. 6 b muestra las concentraciones
que la exposición a estas condiciones hará que la inactivación enzimática total. estimadas de la [EO 2] complejo, que desapareció para formar el [EO 2 S] complejo; esto se transformó
en la inhibición de sustrato [EO 2 SS] complejo, dando lugar a producto reducido [ PAG] formación.
Finalmente, el modelo fue validado para el estudio de caso con tanto la inhibición de sustrato y
la inactivación de oxígeno; Las condiciones de funcionamiento fueron 1.950 rpm y 1,4 vvm ( k L a = 290
Para el estudio de caso en el que estaba presente inhibición de sustrato debido a una mayor h 1), y 0,7 g L 1 de sustrato. La comparación entre los datos experimentales y calculados en función del
concentración de sustrato en el medio de reacción, las condiciones de operación eran 1.350 rpm y tiempo se muestra en la bioconversión Fig. 7 a. rendimiento de bioconversión bajo de inhibición de
1,0 vvm ( k L a = 180 h 1), sustrato y de inactivación de oxígeno condiciones de funcionamiento se calcula el modelo utilizando
y 0,70 g de sustrato L 1. La comparación entre los datos experimentales y calculados obtenidos a partir la constante cinética estimada obtenida para los otros estudios de casos. En estas condiciones
de la fi t del modelo en función del tiempo se muestra en la bioconversión Fig. 6 a. En estas operativas, el porcentaje de bioconversión experimental fue del 17%. El bajo porcentaje de
condiciones operativas, la bioconversión experimental fue de 20%. Se observó que el modelo bioconversión se puede explicar analizando los estimados valores de los parámetros cinéticos de la
también era capaz de predecir la disminución en la producción de lactona debido a la inhibición de formación del complejo. Los complejos intermedios estimados se muestran en la Fig. 7 segundo; k 4 era
sustrato. Los parámetros cinéticos correspondientes estimados para este estudio de caso se k 4 y k 0
dos órdenes de magnitud mayor que k 2, lo que indica que la tasa de formación de la [EO 2-
4. Con
estos parámetros cinéticos, una constante de inhibición de sustrato ( K ES) valor de 9,98 l Mwas
obtenido ( Tabla 2 ), Que es la mitad de lo reportado por Bucko et al. [9] ( Tabla 2 ). Se encontró que k 4 era
tres órdenes de magnitud mayor que k 0 SS] complejo por inhibición de sustrato fue mayor que la de la [O 2 EO 2] complejo por la inactivación de
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