UNMSM

<Revista peruana de biología ISSN-L 1561-0837

Bistriopelma, a new genus with two new species from Peru

Facultad de Ciencias Biológicas UNMSM

TRABAJOS ORIGINALES

Evaluación de anticuerpos producidos en Ratones de la cepa BalB/C con antígeno

secretor salival del tipo A

Evaluation of antibody production of mice of the BalB / C strain with salivary secretory
antigen of type A

Lopez Adolfo, Huaman Celeste, Electo Jorge, Bardales Segundo, Robledo Luis, Sialer Antonella,
Quezada Rosa, Capuñay Junior, Carrión Dante

Laboratorio de Inmunología, mesa 3 horario: 10 am a 2pm

E.P. Genética y Biotecnología

Abstract:
Immunization in animals is usually used for the production of antibodies that
recognize specific molecules (Antigens), these antibodies are essential tools in
the clinical and biotechnological field and have proved useful in the diagnosis
and treatment of infectious, immunological and neoplastic diseases. The ABH
antigens of the ABO blood system can be found on the surface of red blood
cells as well as in fluids and secretions in individuals classified as "secretors",
different studies have shown the importance of the presence of these antigens
and the development of antibodies against these , in this sense in the present
article was obtained polyclonal serum of female mice of the BalB / C strain of
6 weeks of age that were immunized with salivary antigen type A, this serum
was evaluated by the hemagglutination technique where detected a titer of 32 in
mice with two immunization procedures
Resumen:
La inmunización en animales es usualmente utilizada para la producción de
anticuerpos que reconocen moléculas específicas (Antígenos), estos anticuerpos
son herramientas esenciales en el ámbito clínico y biotecnológico y han
probado ser útiles para en el diagnósticos y tratamientos de enfermedades
infecciosa, inmunológicas y neoplásicas. Los antígenos ABH del sistema
sanguíneo ABO pueden ser encontrado en la superficie de los glóbulos rojos
tanto como en fluidos y secreciones en individuos clasificados como
“secretores”, diferentes estudios han demostrado la importancia de la presencia
de estos antígenos y el desarrollo de anticuerpos contra estos, en este sentido en
el presente articulo se realizó la obtención de suero policlonal de ratones
hembra de la cepa BalB/C de 6 semanas de edad que fueron inmunizadas con
antígeno salival del tipo A, este suero fue evaluado mediante la técnica de
hemaglutinación donde se detectó un título de 32 en ratones con dos
procedimientos de inmunización.

Palabras Clave: Suero Policlonal, CCF, CIF, Primera inmunización, Segunda

Inmunización, Vía subcutánea, Vía intraperitoneal

© Los autores. Este artículo es publicado por la Revista Peruana de Biología de la Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Nacional Mayor de
San Marcos. Este es un artículo de acceso abierto, distribuido bajo los términos de la Licencia Creative Commons Atribución-NoComercial-
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en cualquier medio, siempre que la obra original sea debidamente citadas. Para uso comercial, por favor póngase en contacto con
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1
Rev. Per. Biol
Introducción
Los antígenos ABH del grupo sanguíneo ABO,
descubiertos por Landsteiner, se encuentran como
sacáridos que forman parte de glicoproteínas y
glicoesfingolípidos, a diferencia de los antígenos
encontrados en otros grupos sanguíneos, o bien como
oligosacáridos libres (Clausen, Bennett & Grunnet,
1994). El sistema sanguíneo ABO constituye
antígenos que contienen estructuras terminales que
son cadenas de glicanos los cuales provienen de 5
tipos de precursores y constituyen diferentes subtipos
entre los grupos sanguíneos (Marionneau, et al. 2001).
Su actividad antigénica se debe a dichos azúcares
ligados que no se encuentran determinados
directamente por genes, más bien por enzimas
encargadas de añadir azúcares como la
fucosiltransferasa I codificada por el gen FUT1
(Handin et al, 2003; Wacklin et al, 2011). Estos
antígenos pueden encontrarse también en el mucus u
otras secreciones y dicha expresión es generada por la
enzima fucosiltransferasa II, codificada por el gen
FUT2 (Wacklin et al, 2011), antígenos similares a los
del sistema ABH se encuentran ampliamente
distribuidos en el ambiente a través de bacterias,
plantas, comida y polvo, y una exposición a ellos
genera la producción de anticuerpos naturales contra
cualquiera de los antígenos ABH que estén ausentes
en el individuo expuesto (Handin et al, 2003).
La producción de anticuerpos policlonales (pAbs) y
monoclonales (mAbs) humanos es de gran interés
desde su descubrimiento en 1891 por Emil Adolf von
Behring (Tonse et al 2006) por su gran especificidad
para identificar, cuantificar y separar moléculas o
células. Estos tienen un papel muy importante para
estudios clínicos, como la clasificación de diferentes
grupos sanguíneos para evitar reacciones hemolíticas
post-transfusionales o para trasplantes alogénico,
diagnóstico de enfermedades virales, infecciones
bacterianas e inmunización pasiva, además para
investigaciones científicas son usualmente utilizadas
para inmunoensayos como análisis
inmunohistoquímico, inmunofluorescencia o recuperándose el sobrenadante. A este se le agregaron
radioinmunoensayo (Machado et al 2006). Como estos
ensayos inmunológicos necesitan ser muy precisos
para dar un diagnóstico certero es altamente
recomendable el uso de Anticuerpos monoclonales por
su alta especificidad, evitando así reacciones cruzadas
que podrían generar un falso positivo (De Leeuw et al
1997), pero la elaboración de los anticuerpos
monoclonales requiere un tiempo de plazo más
extenso, un mayor costo de producción y el uso de
tecnología más complejo, es por ello la decisión para
producir anticuerpos policlonales o monoclonales
depende de la aplicación, el tiempo y el dinero
disponible (Leenaars at el 2014).
La obtención de anticuerpos con antígenos secretados
ABO puede tener ciertas aplicaciones dentro del área
de diagnóstico así como en áreas médicas más
aplicadas, por ejemplo, para evaluar el rol de la
producción de estos anticuerpos producto de
trasplantes (Kim et al, 2017). También en estudios
donde se han determinado que la participación de los
antígenos del grupo histo-sanguíneo, y en particular en
estado secretor, controlado por el gen de la
fucosiltransferasa 2 (FUT2), determina la
susceptibilidad a las infecciones por virus (Roger,
2009). Algunos casos son los del norovirus o del virus
de la enfermedad hemorrágica del conejo (Roger,
2009; Ruvoën-Clouet, 2000). En el caso de virus
algunos estudios se han realizado con el motivo de
bloquear la unión de ciertos tipos de estos con los
antígenos ABH como es el caso del virus Norwalk
(Harrington et al., 2002) así como el uso de
anticuerpos con antígenos Lewis para bloquear la
unión de la norovirus GII.4 con antígenos presentes en
saliva (Carmona-Vicente et al., 2016).
En el presente estudio se realizó la producción de un
suero policlonal en ratones hembra de la cepa BalB/C
usando antígeno salival del tipo A.
Materiales y Métodos
1. Material biológico.
Se adquirieron ocho ratones hembra de la cepa BalB/c
de seis semanas de edad con un peso aproximado de
30 g procedentes del Instituto Nacional de Salud del
Perú. Los ratones se mantuvieron en el bioterio del
laboratorio de Inmunología con 10 horas de luz y 14
horas de oscuridad; además, se alimentó a cada uno
con aproximadamente 3 g de ratonina por día y con
una fuente constante de agua.
2. Preparación del antígeno.
Siguiendo el protocolo brindado por el laboratorio de
Inmunología de la UNMSM, se colectaron 10 mL de
saliva de un individuo secretor del antígeno A; esta
muestra fue incubada a 95° C durante 30 minutos y se
centrifugó a 4000 rpm durante 10 minutos,
2 volúmenes de etanol absoluto frío y se mantuvo a
-20°C durante toda la noche. Posteriormente se
centrifugó a 15000 rpm a 15° C durante 10 minutos y
se descartó el sobrenadante por inversión, para luego
ser colocado en un extractor de gases durante 3 horas.
El pellet fue resuspendido en PBS estéril (1X, pH 7)
hasta un volumen final de 10 mL y se conservó a
-20° C hasta su uso.
Para demostrar la presencia del antígeno A se realizó
la prueba de microinhibición de la hemaglutinación.
En una microplaca se agregó 50 µL del Antígeno A,
50 µL de Anticuerpos Anti-A y 100 µL GRH tipo A y
se observó la formación del botón.
3. Inmunización de ratones.
Demostrada la presencia del antígeno de tipo A, se murieron durante el desarrollo del experimento. Se
procedió a inocular el antígeno a los ratones optó por utilizar el suero más abundante del grupo 1,
pertenecientes al grupo 1 y grupo 2, cada grupo de manera que la cantidad requerida para realizar la
compuesto de 3 ratones. Se estableció para el grupo 1 prueba de hemaglutinación sea suficiente y no surjan
sólo un procedimiento de inmunización con inconvenientes.
coadyuvante completo de Freund (CCF, Sigma), En la prueba de hemaglutinación directa el suero
mientras que para el grupo 2, se establecieron dos: un obtenido por el grupo 2 presentó hemaglutinación, lo
primero con CCF y un segundo con Coadyuvante cual dio paso a la siguiente evaluación del título
incompleto de Freund (CIF, Sigma). Inicialmente se correspondiente a dicho suero. Tanto el suero del
homogenizó una mezcla de antígeno con CCF, en grupo control como el del grupo 1 dieron negativo
proporción de 1:1, mediante un sistema de jeringas de para la prueba de hemaglutinación en todas las
vidrio (Fig. 1) conectadas entre ellas hasta la diluciones; en cambio, el suero del grupo 2 dio
obtención de una mezcla pastosa, luego se les positivo para la prueba hasta la dilución de 1/32 (Tabla
administró 50 µL del homogenizado por vía 1, Figura 2), evidenciándose en esta última una leve
subcutánea a los ratones del grupo 1 y grupo 2; malla de aglutinación. De esta manera, se determinó
además, se inoculó 50 µL de PBS estéril vía que el título de anticuerpos anti-A contenidos en el
subcutánea a uno de los dos ratones del grupo control suero fue de 32 (Costabile, 2010).
y el otro fue sacrificado para obtener su suero. Al cabo
de 10 días, se procedió a sacrificar a los ratones del Tabla 1. Determinación de presencia de anti-A en los
grupo 1 y se les realizó una sangría mediante punción sueros obtenidos y determinación del título de
anticuerpos.
cardíaca (Fig. 2) para luego obtener el suero mediante
centrifugación de la muestra de sangre obtenida;
adicionalmente, se realizó una nueva mezcla de Prueba de Título de
Grupo
antígeno con CIF, en proporción de 1:1, mediante el Hemaglutinación directa anticuerpo
mismo sistema y se le administró 100 µL vía Contro
intraperitoneal a los ratones pertenecientes al grupo 2, Negativo No determinado
l
mientras que al grupo control se le inoculó 100 µL de
PBS estéril por la misma vía. Seis días después, se 1 Negativo No determinado
sacrificó un ratón del grupo control y se extrajo sangre
mediante punción cardíaca para obtener el suero
sanguíneo mediante centrifugación. El mismo 2 Positivo 32
procedimiento se le realizó a un ratón del grupo 2 al
cabo de cinco días.
4. Determinación del título de anticuerpos
Inicialmente, para comprobar que había presencia de
anticuerpos, se colocó 25 µL del suero sin diluir del
grupo 2 con 25 µL de glóbulos rojos humanos de tipo
A en una placa para evidenciar la hemaglutinación. El
título de anticuerpos se determinó mediante pruebas
serológicas de hemaglutinación en microplaca,
utilizando glóbulos rojos humanos del grupo A al 2%.
Se diluyó 50 µL de suero obtenido en 50 µL de PBS
para la primera dilución (1/2), posteriormente se
utilizó 50 µL de la dilución anterior y se agregó 50 µL
de PBS, realizándose así diluciones seriadas del suero
obtenido hasta llegar a una dilución de 1/4096 tanto
para el grupo control, como para el suero obtenido del
grupo 1 y del grupo 2. Se agregó 25 µL de glóbulos
rojos del tipo A en cada una de las diluciones y se dejó
incubar overnight. Se realizó la prueba de
hemaglutinación y se evaluó la persistencia de esta
luego de una agitación suave, para lo que se asumió
como el título de anticuerpos IgM producidos a la más
alta dilución que muestre aglutinación (de França et
al., 2011).
Resultados
De todo el procedimiento realizado solo se pudo
obtener el suero de un ratón perteneciente al grupo
control, dos ratones pertenecientes al grupo 1 y un
ratón perteneciente al grupo 2. No se pudo obtener
suero de los demás ratones debido a que estos
Figura 1. Sangría total de un ratón del grupo control mediante punción cardíaca.
Figura 2. Título de anticuerpos IgM medido mediante la prueba de hemaglutinación . Cada columna indica la dilución del
suero y cada fila indica grupo al que pertenece el suero.
Discusión:
Los resultados obtenidos muestran que existen
diferencias considerables en la producción de
anticuerpos IgM entre el grupo 1 y 2, lo cual puede
estar relacionado con factores como el número de
procedimientos de inmunización, el uso de los
coadyuvantes y la vía de inoculación.
En un primer punto, los ratones del segundo grupo
obtuvieron un alto título de anticuerpos frente al grupo
uno también, esto se puede explicar bajo el desarrollo
de memoria inmunológica adquirida. Comúnmente el
contacto con el antígeno por primera vez muestra una
respuesta de menor intensidad debido a que es mayor
el tiempo que se demoran los linfocitos vírgenes para
proliferar a números suficientes, sin embargo, la
generación de células memoria permite que la segunda
presencia del antígeno causa una respuesta secundaria
de mayor magnitud y duración. Esta sería la primera
razón por la que existiría mayor producción de
anticuerpos, ya que sus células plasmáticas específicas
sensibilizadas contra el antígeno A humano
permanecen mayor tiempo y la respuesta inmune
secundaria es mayor como se contrastó con el alto
título obtenido en los ratones del grupo 2. De hecho,
los títulos específicos de anticuerpos, principalmente
de subclases de inmunoglobulina G (IgG), pueden ser
estables durante años y son producidos principalmente
por células plasmáticas maduras residentes de la
médula ósea, a causa de que los anticuerpos de la
subclase de IgG tienen una vida media de 3 semanas,
la supervivencia de las células plasmáticas en la
médula ósea es un requisito previo para el
mantenimiento de los títulos de los anticuerpos
durante largos períodos de tiempo (Marcus Odendahl
et al., 2004). En ese punto el CIF puede ayudar a
mantener la concentración de IgG ya que una de sus
funciones es la difusión lenta del antígeno para su
mejor difusión.
Referencias Bibliográficas:
Así mismo, en los ratones de grupo 2 se realizaron dos
procesos de inmunización en donde el primero se
realizó con CCF, al igual que los ratones del grupo 1,
el cual es un coadyuvante derivado de aceite vegetal
que establece un depósito con el antígeno en la
posición del sitio de inyección, lo cual permite una
liberación continua y gradual de este; además, provee
un transporte del antígeno por el sistema linfático
hacia los nódulos linfáticos o el bazo y promueve la
interacción con células mononucleares y presentadores
antigénicos (Kidd, 2003). Es también conocido que el
CCF, estimula la actividad de Th1 (O´Hagan, 2000).
Estas células activan a los macrófagos a través de
IFN-g, al mismo tiempo que inhiben la proliferación
de Th2, encargadas de la activación de linfocitos B, y,
por lo tanto, disminuyen la producción de anticuerpos
(Kidd, 2003). Esto representaría una posible
explicación para la no detección de anticuerpos anti-A
con la prueba de hemaglutinación del suero del grupo
1, ya que no se observó la reacción de aglutinación. A
su vez, Katsura (1972) encontró que antígenos
solubles emulsificados con CCF fueron óptimos para
generar una fuerte respuesta secundaria, pero una
débil primaria, al ser inoculados en ratones por vía
subcutánea.
Determinar el título exacto de anticuerpos producidos
mediante el procedimiento experimental realizado no
fue posible debido a la falta de repeticiones, debido a
la muerte de ratones inmunizados en el desarrollo del
experimento, se propone que una de las causas de la
muerte de 2 ratones del grupo 2 después de la
inmunización estaría relacionada con la vía de
administración del antígeno, pues investigaciones
como la de Leenar et. al (1998) sugieren que la vía de
inyección intraperitoneal debería ser evitada, pues el
peritoneo posee una superficie extensa, es susceptible
al daño físico-químico y se encuentra en contacto
íntimo con varios órganos vitales.
Conclusiones
La inoculación de ratones Balb/C con antígeno A
mediante una primera dosis con CCF y una segunda
de refuerzo con CIF, luego de 10 días, induce la
producción de anticuerpos policlonales que reconocen
antígeno A en niveles detectables a través pruebas de
hemaglutinación.
La producción de los anticuerpos está relacionado así
mismo con diversas características como la relación
existente entre la primera y segunda inmunización,
además del uso de coadyuvantes para un mejor
desarrollo de la respuesta inmune y la vía de
inoculación; estas consideraciones se deben tener en
cuenta para posteriores ensayos de obtención de suero
policlonal, así mismo para ensayos más sofisticados
como la producción de anticuerpos monoclonales.
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