UNIVERSIDADE METODISTA DE ANGOLA

FACULDADE DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

CURSO DE ANÁLISES CLÍNICAS E SAÚDE PÚBLICA
(VI Semestre)

DISCIPLINA – BIOTECNOLOGIA
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Capítulo II:
BIOQUÍMICA DO CRESCIMENTO E METABOLISMO MICROBIANO.

1. CINÉTICA DO CRESCIMENTO MICROBIANO

Entende-se por crescimento microbiano ao incremento dos constituintes

celulares que resultam no aumento do número de células ou biomassa celular
microbiana.

O conceito de crescimento microbiano considera aumento de populações ao

invés de crescimento de células individuais.

Figura 1 - Esquema representativo do crescimento microbiano (bacteriano)

O crescimento microbiano compreende quatro (4) fases: Fase Lag (adaptação);

Fase Log (Crescimento exponencial); Fase Estacionária; Fase de Declínio.

1 Biotecnologia – Material de apoio Professor Kuta Luís

 Figura 2 - Curva do crescimento microbiano

As actividades microbianas que resultam no crescimento são intensamente

afectadas pelas condições nutricionais e ambientais. O entendimento das
influências ambientais ajuda a explicar a distribuição dos microrganismos na
natureza, tornando possível o desenvolvimento de métodos para o controle ou
optimização das actividades microbianas.

O crescimento dos microrganismos pode ser afectado por 4 factores principais:

temperatura, pH, pressão osmótica e concentração de oxigénio.

a) EFEITO DA TEMPERATURA

Relativamente a temperatura, são considerados três (3) níveis: mínimo, óptimo e

máximo, sendo que, as reacções metabólicas que resultam no crescimento dos
microrganismos, devem ocorrer em ambientes com níveis óptimos.

Figura 3 – Influência dos diferentes níveis de temperatura sobre a taxa de crescimento microbiano

2 Biotecnologia – Material de apoio Professor Kuta Luís

b) INFLUÊNCIA DE pH

A maioria dos ambientes apresenta valores de pH na faixa de 5 a 9. Os

microrganismos mais comuns são os adaptados a esses valores. Os fungos, de
uma maneira geral, são mais tolerantes a acidez.

Figura 4 – Influência dos diferentes níveis de acidez sobre a taxa de crescimento microbiano

c) PRESSÃO OSMÓTICA

Figura 5 – Influência dos níveis de salinidade sobre a taxa de crescimento microbiano

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d) OXIGÉNIO E O CRESCIMENTO MICROBIANO

Figura 6 – Influência das concentrações de oxigénio sobre a taxa de crescimento microbiano

Vários métodos podem ser empregues na mensuração da massa celular,

adaptáveis a diferentes organismos ou situações:

 Avaliação directa – contagem directa de células ao microscópio,

mensuração através da membrana filtrante e técnica do número mais
provável.

Figura 7 – Avaliação do crescimento microbiano através da contagem directa

4 Biotecnologia – Material de apoio Professor Kuta Luís

  Avaliação indirecta – turbidimetria, actividade metabólica e peso seco.

Figura 8 – Avaliação do crescimento microbiano através da turbidez da amostra

2. PROCESSOS FUNDAMENTAIS PARA ÁREA DA BIOTECNOLOGIA.

A indústria biotecnológica moderna, com estirpes seleccionadas e

geneticamente melhoradas produz milhões de toneladas por ano de compostos
úteis. Existem quatro (4) principais classes de produtos obtidos industrialmente
via biotecnológica: metabólitos primários, metabólitos secundários, enzimas e
microrganismos.

A matéria-prima utilizada como substrato para transformação constitui um

aspecto importante a considerar tendo em atenção a sua adequabilidade ao
processo, sua abundância e o seu custo. Resíduos celulósicos, efluentes da
indústria, hidrocarbonetos entre outros, têm sido utilizados com vista a obter
produtos de alto valor acrescentado.

O rastreio e selecção dos microrganismos adequados são uma das etapas mais
importantes desse processo. Identificado o microrganismo, o passo seguinte é
melhorar as suas capacidades.

A genética aplicada permite realizar modificações no microrganismo

seleccionado para render maior da produção do composto desejado ou, obter
novos produtos.

Neste sentido, um longo e frutuoso trabalho tem sido realizado, recorrendo a

técnicas convencionais de genética, mutegénese e tecnologia do DNA
recombinante para o melhoramento de tais estirpes, seguindo-se o controlo do
processo (esterilização), bem como importantes processos a jusante do
biorreactor, o isolamento do produto e a sua purificação.

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Segue-se uma lista de alguns agentes biológicos e suas aplicações
biotecnológicas:
a) ALGAS

Spirulina - O seu alto teor proteico, que corresponde a 60% do peso seco, lhe
confere um elevado valor nutritivo. Em África, mais propriamente no lago
Tchad, ainda hoje essa alga é colhida e consumida como alimento. Spirulina,
assim como Chlorella, são vendidas em tabletes como complemento nutritivo.

b) FUNGOS

Saccharomyces cerevisiae - Conhecido como levedura de cerveja é utilizado na

preparação de alimentos (pão, biscoitos, fermento de padaria) e de bebidas
(cerveja, vinho e destilados), assim como na produção de outras substâncias de
importância industrial (etanol, vitaminas e outros metabólitos).

Essa levedura cresce facilmente em laboratório. Também pode ser manipulada

geneticamente. Nos fermentadores ou biorreactores industriais onde se
multiplica rapidamente a partir de matéria-prima de baixo custo, ela permanece
activa durante períodos longos e, ao concluir o processo, pode ser separada por
filtração ou centrifugação. Com cerca 12.000.000 pares de bases e 6.000 genes
em 16 cromossomas, Saccharomyces cerevisiae, foi em 1997, o primeiro
organismo eucariótico a ter o seu genoma sequenciado.

Aspergillus - Algumas espécies alcançam grande importância industrial, como

Aspergillus niger, utilizada para a produção de ácido cítrico ou de enzimas (em
linhagens modificadas geneticamente).

Penicillium - Algumas espécies são utilizadas na indústria farmacêutica para

produção de penicilina, ou na indústria de alimentos para produção de queijos
azuis, como o Roquefort e o Gorgonzola; queijo Camembert.

c) ARQUEOBACTÉRIAS

Thermus aquaticus - Isolada em um poço do Parque Nacional de Yellowstone

(EUA), esta bactéria produz uma enzima que copia o DNA a uma temperatura
alta. Esta enzima permite obter milhões de cópias de um fragmento de DNA em
um processo semelhante ao chamado PCR (Polymerase Chain Reaction).

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Bactérias metanogénicas - Vivem em lugares onde há ausência de oxigénio, seja
no tubo digestivo de alguns animais (gado, cupins) ou nos pântanos. Estas
bactérias transformam o acetato resultante da degradação de celulose por outras
bactérias em metano, um gás combustível.

d) EUBACTÉRIAS

Bactérias lácticas – As espécies dos géneros Lactobacillus e Streptococcus são

responsáveis por vários processos fermentativos, tais como a elaboração de
queijos e de iogurtes, o envelhecimento dos vinhos, a conservação de alimentos
(sauerkraut ou repolho fermentado); a produção de ácido láctico, um aditivo
utilizado na indústria de alimentos como acidulante e estabilizante.

Bacillus thuringiensis - Este microrganismo prolifera no solo e na superfície das

plantas, sintetizando uma toxina fatal para as larvas de insectos. Esta é
produzida comercialmente há mais de 40 anos, representando 90% das vendas
de insecticidas biológicos e reduzindo a necessidade de aplicação de pesticidas
químicos nas lavouras. Nos últimos anos, o gene codificador da toxina tem sido
transferido em algumas espécies de plantas (algodão, milho) para que estas
sintetizem directamente o insecticida.

Streptomyces - Além do cheiro característico da terra removida, os organismos

deste género de bactérias do solo produzem substâncias antibióticas tais como,
estreptomicina, tetraciclina, eritromicina e antifúngicas como a nistatina.
Sintetizam igualmente substâncias, com as quais se produzem herbicidas,
antitumorais e supressoras de rejeição a transplantes.

Pseudomonas - Várias linhagens deste género são utilizadas na eliminação de

poluentes. Algumas quebram moléculas de hidrocarbonetos, como os existentes
nos acidentes de derrame de petróleo; outras podem remover o mercúrio
aquático.

Agrobacterium tumefaciens - Agente patogénico para as plantas dicotiledóneas

que desenvolvem um tumor ou galha quando infectadas. Com a remoção de um
gene, perde a capacidade de provocar tumores, conservando a capacidade
infecciosa, utilizada na engenharia genética de vegetais.

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Bactérias butíricas - Na indústria têxtil, Clostridium butiricum libera as fibras
vegetais durante a maceração do cânhamo e do linho. Clostridium
acetobutyricum é utilizado na produção industrial de acetona e butanol.

Clostridium botulinum produz uma toxina poderosíssima; calcula-se que um

grama desta bastaria para matar um milhão de pessoas. A ingestão de conservas
contaminadas e mal esterilizadas resulta quase sempre em um desfecho fatal.
Devido a sua acção inibitória da contracção muscular, a toxina botulínica é
utilizada em concentrações muito pequenas, para reduzir as rugas e marcas de
expressão durante certo tempo (efeito cosmético).

Escherichia coli - Descoberta em 1855, esta bactéria Gram-negativa vive no

trato digestivo do homem e de outros animais. Tem forma de bastonete (0,002
mm de comprimento, 0,0008 mm de diâmetro), 1 a 4 moléculas de DNA e
15.000 a 30.000 ribossomas. Os flagelos permitem que se movimente
rapidamente. Algumas linhagens são patogénicas, podendo contaminar os
alimentos (carne, leite, vegetais) que devem ser cozidos adequadamente. Os
seus requerimentos nutricionais básicos são simples. Água, sais minerais, uma
fonte de nitrogénio e uma fonte de energia. Em condições adequadas, se divide
a cada 20-40 minutos; também pode se multiplicar por conjugação.

Devido à facilidade com que ela pode ser cultivada no laboratório, Escherichia
coli tem-se tornado uma ferramenta indispensável para estudos bioquímicos e
genéticos, incluindo a Engenharia Genética. O seu genoma compreende 4,6
milhões de pares de bases que codificam em torno de 4.000 proteínas diferentes.

A introdução de transgenes em Escherichia coli K12, uma linhagem inofensiva

de laboratório, possibilitou os primeiros processos de produção de insulina, de
interferon e de hormona de crescimento. Entretanto, por se tratar de uma célula
procariótica, nem sempre é a melhor opção de "fábrica" para a síntese de
produtos de origem animal ou vegetal, tendo sido aos poucos substituída por
outras células eucarióticas, como a levedura.

3. METABOLISMO MICROBIANO

Metabolismo é o conjunto de reacções químicas que ocorrem no interior das

células, resultando na síntese ou na degradação dos compostos orgânicos.

8 Biotecnologia – Material de apoio Professor Kuta Luís

A actividade biossintética (anabolismo) ocorre em simultâneo com a
degradação de moléculas (catabolismo). As reacções anabólicas ou de síntese
(endergónicas) consomem energia, ao passo que, as reacções catabólicas ou de
degradação (exergónicas) libertam energia sob forma de ATP.

O anabolismo e o catabolismo estão indissoluvelmente ligados. Por um lado, as

reacções de síntese necessitam da energia que lhes é fornecida pelas reacções de
catálise; por outro lado, para que as reacções catabólicas ocorram são
necessárias enzimas, que devem ser constantemente sintetizadas, uma vez que,
estas se vão degradando e desactivando com uso.

O anabolismo é a fase edificadora do metabolismo na qual ocorre a biossíntese

enzimática de determinados componentes moleculares das células, tais como
ácidos nucleicos, proteínas, polissacáridos e os lípidos, a partir dos seus
precursores, consumindo energia sob forma de ATP, que é gerado durante o
catabolismo. Os compostos intermediários do metabolismo também são
chamados metabólitos.

No catabolismo, moléculas relativamente grandes e complexas, como

carbohidratos, lípidos, e as proteínas, provenientes do ambiente celular ou de
seus próprios depósitos de nutrientes, são degradadas para produzir moléculas
menores e simples, tais como o ácido láctico, o ácido acético, o CO 2, a amónia
ou ureia. Da actividade degradativa de certas moléculas há libertação gradual de
energia que é armazenada, sob forma de energia química, para ser
posteriormente usada nas mais diversas actividades da célula. Esta fase do
metabolismo compreende três (3) etapas:

a) Etapa preparatória - Nesta etapa, ocorre a mobilização e decomposição

de macromoléculas em moléculas mais simples com ajuda de enzimas
especiais, com libertação de pouca energia sob forma de calor.
b) Etapa anaeróbia - As substâncias obtidas na primeira etapa continuam a
sua dissociação na ausência de oxigénio.

A Fermentação é um dos vários processos que pode ocorrer nesta fase.

Trata-se de um processo caracterizado por uma série de reacções
consecutivas, onde participam mais de uma dezena de enzimas que se
encontram no citoplasma das células.

9 Biotecnologia – Material de apoio Professor Kuta Luís

 Neste processo fermentativo participam glucose (C6H12O6), a ADP e o
ácido fosfórico como matérias-primas, obtendo-se como produto final
ácido láctico (C3H6O3), ATP e água, sendo por isso designado,
igualmente por etapa de decomposição incompleta. Parte da energia
libertada durante o processo de fermentação é utilizada na síntese de ATP
a partir de ADP e ácido fosfórico.

c) Etapa aeróbia – Também designada por etapa de decomposição

completa, pois os produtos formados na fase anterior sofrem uma
oxidação total, dando como resultado dióxido de carbono (CO2) e água –
produtos finais da oxidação. A condição principal para que este processo
se realize é a existência de enzimas apropriadas e de oxigénio no meio.
Esta etapa decorre nas mitocôndrias e consiste, tal como a etapa
anaeróbia, duma série de reacções em cadeia realizadas com ajuda de
enzimas especiais. Nestas reacções também participam o ácido fosfórico
e o ADP e dá-se uma síntese de ATP, porém, a diferença fundamental
entre estes dois processos é que neste último se sintetiza muito mais ATP.
A oxidação aeróbia de duas moléculas de ácido láctico, obtidas durante a
glicólise, origina a síntese de 36 moléculas de ATP, ou seja, 36 ligações
fosfóricas, ricas em energia.

Durante a etapa anaeróbia formam-se duas moléculas de ATP e na

aeróbia 36, ou seja, 18 vezes mais, o que indica uma maior rentabilidade
deste último processo.

Nas células vegetais e em algumas leveduras a decomposição da glucose é feita

através da fermentação alcoólica, que é muito semelhante à glicólise. As
diferenças encontram-se na etapa final, pois os produtos finais da fermentação
alcoólica são o dióxido de carbono (CO2), o álcool etílico (C2H5OH), o ATP e
água. Neste processo também participam o ácido fosfórico e o ADP.

A energia armazenada é necessária à biossíntese de material celular, bem como

à manutenção de funções vitais da célula, afluxo e efluxo de substâncias através
da membrana citoplasmática, degradação de macromoléculas, movimento de
flagelos e outras actividades essências.

10 Biotecnologia – Material de apoio Professor Kuta Luís

A capacidade de utilizar e transformar energia é uma das propriedades
fundamentais dos sistemas vivos. Alguns microrganismos obtêm energia a partir
da luz solar, enquanto outros obtêm-na a partir da degradação de moléculas que
vão gradualmente libertando a energia que contêm. Assim grande parte dos
constituintes envolvidos no metabolismo podem ser doadores de electrões
(redutores) ou receptores de electrões (oxidantes).

4. PROCESSOS DE OBTENÇÃO DE ENERGIA

A partir de 1977, Carl Woese baseado em estudos que usaram as modernas

técnicas de biologia molecular e de modo especial o RNA ribossomal, veio
concluir que ao contrário do que se pensava anteriormente, que os eucariotas
mais complexos constituiriam uma evolução com ponto de partida em seres
vivos mais simples - os procariotas, todos os seres vivos teriam, segundo
Woese, uma forma ancestral comum que teria evoluído de modo diferente.

Woese propõe assim uma classificação dos seres vivos em apenas três domínios
designados por: Eukarya (eucariotas, albergando protozoários, algas, fungos,
plantas e animais), Bacteria (restantes bactérias, incluindo as patogénicas para o
homem, bactérias do solo e da água e as fotossintéticas) e Archaea (bactérias
produtoras de gás metano e termófilas extremas).

No entanto, esses organismos apresentam diferentes formas de obtenção de

carbono, podendo ser divididos em dois grupos. Os organismos autotróficos
podem utilizar o dióxido de carbono como a única fonte de carbono e, através
dele sintetizar as suas moléculas orgânicas. Os heterotróficos, por outro lado,
precisam obter o carbono a partir do ambiente na forma reduzida e
relativamente complexa.

Um segundo critério é a natureza de sua fonte de energia. Os organismos que

usam a luz como fonte de energia são fototróficos; os que usam as recções de
oxirredução são quimiotróficos.

Por sua vez os quimiotróficos podem ser ainda subdivididos em função da

natureza dos doadores de electrões que eles oxidam para obter energia. Os
quimiotróficos que requerem moléculas orgânicas complexas como doadores
de electrões são chamados de quimiorganotróficos.

11 Biotecnologia – Material de apoio Professor Kuta Luís

Os que podem empregar simples doadores inorgânicos de electrões, tais como
hidrogénio, sulfureto de hidrogénio, amónia ou enxofre, são denominados
quimiolitotróficos.

Os heterotróficos podem ser divididos em duas principais classes: aeróbios, os

quais usam o oxigénio molecular como o último aceptor de electrões e os
anaeróbios, que ao invés do oxigénio usam outras moléculas como aceptores de
electrões.

Muitos organismos podem viver tanto aerobica como anaerobicamente; estes

são denominados facultativos. Eles usam oxigénio quando este é disponível,
mas quando não é, podem usar determinados compostos orgânicos como
aceptores de electrões. Os organismos que são inteiramente incapazes de utilizar
o oxigénio são chamados de anaeróbios restritos. A maioria dos organismos
heterotróficos, especialmente os superiores é facultativa.

Porém, é importante notar que nem todas as células de um dado organismo são
de uma mesma classe e que alguns tipos de células possuem grande
flexibilidade metabólica. Exemplo, nas plantas superiores, as células verdes
contendo clorofila nas folhas são autotróficas fotossintéticas, enquanto as
células da raíz são heterotróficas.

É lógico concluir que os microrganismos autotróficos obtêm átomos de carbono

necessários pela fixação do CO2:

1) Fermentação - Quando o dador e o receptor de electrões são ambos

compostos orgânicos;

2) Respiração - Se o receptor de electrões for o oxigénio (respiração

aeróbia); se o receptor for um composto inorgânico oxidado, como
nitrato, sulfato (respiração anaeróbia);

3) Fotossíntese - Se o dador e receptor de electrões for a clorofila

(fosforilação cíclica).

12 Biotecnologia – Material de apoio Professor Kuta Luís

5. ENZIMAS

As enzimas são substâncias que promovem as reacções químicas que ocorrem

na célula. São substâncias de natureza protéica que, para além da sua acção
catalisadora, são específicas para determinada reacção. A especificidade relativa
à actividade catalítica da enzima é determinada pela sua natureza protéica, cuja
estrutura complexa providencia o ambiente adequado à ocorrência da reacção e
permite o reconhecimento de um determinado substrato.

A região da proteína que participa directamente na conversão do substrato no

produto é designada por local ou sítio activo. A conformação da proteína
mantém-se definida em condições favoráveis, porém, valores extremos de
temperatura e de pH provocam modificações na configuração da proteína
(desnaturação) que consequentemente, perde a actividade catalisadora.

Figura 9 – Modo de acção de uma enzima sobre o respectivo substrato

As enzimas exigem frequentemente, componentes adicionais, para que possam

ter actividade catalítica, que incluem grupo prostético, coenzimas (NAD+,
NADP+, tiamina-pirofosfato) e activadores metálicos (Mn2+ K+, Mg2+, Cu2+,
Zn2+).

O grupo prostético é um cofactor que está permanentemente ligado à estrutura

da enzima; a coenzima é uma pequena molécula orgânica, estável ao calor, que
se dissocia rapidamente da enzima, após a reacção.

13 Biotecnologia – Material de apoio Professor Kuta Luís

As enzimas podem ser monoméricas ou oligoméricas e a designação que lhes é
atribuída, de acordo com o Sistema Internacional de Nomenclatura, envolve o
substrato que utilizam.

A velocidade de uma reacção enzimática é geralmente determinada pela

quantidade do produto formado.

A velocidade inicial é proporcional à concentração da enzima. Assim, a uma

dada concentração do substrato, a quantidade de produto formado será duas
vezes maior quando se duplica a concentração da enzima.

A uma dada concentração da enzima, a velocidade de reacção aumenta de uma

forma hiperbólica com a concentração do substrato, tendendo para um valor
máximo (Vmáx). A concentração de substrato correspondente a metade da
velocidade máxima, é a constante de Michaelis-Menten (KM).

𝑽𝒎á𝒙[𝑺]
Vo =
𝑲𝑴+[𝑺]

As reacções enzimáticas em alguns microrganismos têm um valor de pH e de

temperatura óptimos. No entanto, importa realçar que relativamente a alguns
procariotas, nomeadamente Archaebacteria, mantêm sua actividade enzimática
em condições extremas1 de pH e temperatura. Algumas espécies termófilas
oxidam o enxofre elementar a sulfato e crescem optimamente a pH 2 a 3 e a
temperatura de 70 a 75 ℃.
1
A sua parede contém proteínas e/ou glicoproteínas, os lípidos da membrana são ricos em ácidos gordos saturados, pelo que mantêm
fluidez e estabilidade a elevadas temperaturas.

14 Biotecnologia – Material de apoio Professor Kuta Luís

Geralmente, podem existir numa célula duas enzimas a actuar sobre o mesmo
substrato e que diferem relativamente à temperatura óptima de actividade, à
afinidade com o substrato e/ou a natureza do produto formado. A distinção
destas enzimas pode ser efectuada por electroforese.

Na maioria das reacções biológicas de oxidação-redução a transferência de

electrões é efectuada através das coenzimas NAD+, NADP+, FAD e FMN, os
quais tornam-se alternadamente oxidados ou reduzidos por libertação ou
aceitação de dois electrões e dois protões.

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BIBLIOGRAFIA

CASTILHO, L. “Biotecnologia para saúde humana”. Apresentação realizada no

BNDES em 23.10.2008.

FARIA, M., A. Metabolismo microbiano produtor de energia. Microbiologia.

Lidel, Edições Técnicas. 2006.

MADIGAN, M.T., MARTINKO, J.M., PARKER, J.Microbiologia de Brock.

São Paulo: Prentice Hall, 2004.

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