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Voet, Biochemie,Deutsch Corinne Haller

Kapitel 18.3-19.5 Juni 2001


3. Durch ATP angetriebener aktiver Transport

Stöchiometrie des Transportprozesses:


1. Uniport: nur ein Molekül wird auf einmal transportiert
(Bsp.:Glucosetransporter der Erythrocyten).
2. Symport: gleichzeitig werden zwei verschiedene Molekülsorten in gleicher
Richtung transportiert.
3. Antiport: zwei verschiedene Molekülsorten werden in unterschiedl. Richtung
transportiert.
Elektrischer Charakter:
1. Elektroneutral: Transport ohne Veränderund der Nettoladung, d.h. entweder
duch Symport entgegengesetzt geladener Ionen oder Antiport gleichartig
geladener Ionen.
2. Elektrogen: Transportprozess führt zu einer Aenderung der Gesamtladung
auf beiden Membranseiten.)

Ist die Konzentration auf der einen Seite der Membran höher als auf der anderen,
geschieht der Transport gewöhnlich automatisch. Ist die auf der einen Seite zur
Verfügung stehenden Konzentration jedoch geringer als auf der anderen Seite
benötigt, müssen die Substanzen aktiv durch die Membran transportiert werden.

Aktiver Transport = endergonischer Prozess, häufig an Hydrolyse (= Spaltung


von Molekülen) von ATP gekoppelt.

A. Die (Na+/K+)-ATPase der Plasmamembran

Aktives Transportsystem: (Na+/K+)-ATPase, besteht vermutlich aus drei


Untereinheiten:
- eine nichtglycosylierte -Untereinheit, auf der die katalytische Aktivität und die
Ionen-Bindungsstellen des Enzyms liegen
- eine glycosylierte -Untereinheit mit unbekannter Funktion
- eine -Untereinheit, hat vermutlich regulatorische Funktion

Das Enzym wird häufig (Na+/K+)-Pumpe genannt, da es Na+ aus der Zelle heraus-
und K+ in die Zelle hineinpumpt, während gl.zeitig intrazelluläres ATP hydrolysiert
wird. Gesamstöchiometrie:
3Na+(innen) + 2K+(aussen) + ATP ⇌ 3Na+(aussen) + 2K+(innen) +ADP + Pi
Es handelt sich also um einen elektrogenen Antiport: es verlassen drei pos.
Ladungen die Zelle, während zwei eintreten. Ohne funktionierende (Na+/K+)-Pumpe
würden tierische Zellen quellen und platzen.
Der durch diese Pumpe erzeugte elektrochemische Potentialgradient ist ferner für die
elektrische Erregbarkeit von Nervenzellen verantworlich und liefert Freie Enthalpie
für den aktiven Transport von Glucose und Aminosäuren (AS) in manchen Zellen.
(Bild 1)

ATP phosphoryliert während des Transportprozesses ein essentielles Asp


Phosphorylierung: Bezeichnung für die Einführung eines Phosphorsäurerests in ein
Substrat, das dadurch biochemisch aktiviert wird.
Die freie Enthalpie der ATP-Hydrolyse treibt den endergonischen Transport von Na+
u. K+ entgegen dem bestehenden elektrochemischen Gradienten an.

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Das Protein wird während dem Transport von Na+ durch ATP phosphoryliert. Diese
Phosphorylierung erfolgt an einem Asp-Rest, es entsteht ein hochreaktives
Aspartylphosphat-Zwischenprodukt.
(Bild 2)

Die Kopplung des aktiven Transports mit der ATP-Hydrolyse erfolgt über einen
geordneten Reaktionsmechanismus
1. E13Na+, dessen Na+ aus dem Zellinneren stammt, bindet ATP und bildet
E1ATP3Na+.
2. Dieser Komplex reagiert zum energiereichen Aspartylphosphat-
Zwischenprodukt E1~P3Na+.
3. Dieses energiereiche Zw.produkt fällt in seine energiearme Konformation, E2-
P3Na+, zurück und setzt das von ihm gebundene Na+ ausserhalb der Zelle
frei, d.h. Na+ ist durch die Membran transportiert worden.
4. E2-P bindet zwei K+ von ausserhalb der Zelle, so dass E2-P2K+ entsteht.
5. Die Phosphatgruppe wird hydrolysiert, was zu E22K+ führt.
6. E22K+ wechselt seine Konformation, entlässt 2K+ ins Zellinnere und ersetzt
sie durch drei Na+. Dadurch wird der Transportkreislauf (welcher
normalerweise nur im Uhrzeigersinn verläuft) geschlossen.
(Bild 3)

Die Geschwindigkeit des Na+- und K+-Transports beruht auf wechselweiser


Destabilisierung
Damit beim oben beschriebenen Mechanismus eine ausreichende
Transportgeschwindigkeit gewährleistet ist, muss die Freie Enthalpie bei allen
Zw.produkten in etwa gleich sein. Wäre ein Zw.produkt stabiler als das andere,
würde es zu einer Anhäufung des stabilsten kommen und die Gesamtgeschw.keit
des Transports würde stark zurückgehen.

B.Ca 2+-ATPase
Mechanismus ähnlich wie (Na+/K+)-ATPase. Zw. beiden Proteinen besteht
Sequenzhomologie, was auf gemeinsame Vorfahren schliessen lässt.
Ca2+ fungiert häufig als sekundärer Botenstoff. Ein vorübergehender (Ca2+)-Anstieg
im Cytosol kann zahlreiche Reaktionen in Zellen triggern (= zeitl. definiertes Auslösen
eines Vorganges oder einer endlichen Folge), z.B. Muskelkontraktion, Freisetzung
von Neurotransmitter, Glykogenabbau, wichtiger Aktivator des oxidativen
Stoffwechsels.
Im extrazellulären Raum liegt Ca2+ vier Gössenordnungen höher als im Cytosol vor.
Dieser gr. Konzentrationsgradient wird durch die Plasmamembran, das ER
(=endoplasmatisches Reticulum) und die innere Mitochondrienmembran
aufrechterhalten. Plasmamembran und ER enthalten eine Ca2+-ATPase, die aktiv
Ca2+ aus dem Cytosol pumpt, wofür ATP hydrolysiert werden muss.

Calmodulin reguliert die Ca2+ -Pumpe


(Bild 4)
Die Regulation der Ca2+ -Pumpe in der Plasmamembran wird über den Ca2+
-Spiegel kontrolliert und zwar durch die Vermittlung von Calmodulin (CaM).
CaM: ist ein Protein in Eukaryonten vorkommend, bindet Ca2+ und ist an
regulatorischen Prozessen der Zelle beteiligtreguliert Ca2+ -Pumpen, Protein-

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Kinasen, Motilitäts-Proteine und ist an der Kontrolle des Glykogenstoffwechsels
beteiligt.
Ca2+  Calmodulin aktiviert die Ca2+ -ATPase der Plasmamembran.
Ca2+ reguliert seine eigene cytoplasmatische Konzentration: liegt der Ca2+ -Spiegel
unterhalb der Dissoziationskonstante des Calmodulins für Ca2+, so ist die Ca2+
-ATPase relativ inaktiv. Steigt aber Ca2+ auf diesen Wert, so bindet Ca2+ an
Calmodulin, das dann selber an die Ca2+ - Pumpe bindet und diese aktiviert.

Ca2+ + CaM ⇌
Ca2+CaM + Pumpe(inaktiv) ⇌
Ca2+CaMPumpe(aktiv)
(CaM = aktiviertes Calmodulin)

D.Gruppentranslokation

Gruppentranslokation: Variante des ATP-getriebenen aktiven Transports, um


bestimmte Zucker aufzunehmen; im Unterschied zum aktiven Transport werden die
transportierten Moleküle gleichzeitig chemisch modifiziert.
PTS (= Phosphoenolpyruvat-abhängige Phosphotransferase-System) transportiert
Zucker und phosphoryliert sie gleichzeitig. Da die Zellmembran für Zuckerphosphate
undurchlässig ist, bleiben diese in der Zelle, sobald sie einmal hineingelagert sind.
Zum PTS-System gehören zwei lösliche cytoplasmatische Proteine:
1.Enzym I (EI)
2.HPr
Sie sind am Transport aller Zucker beteiligt.
Daneben gibt es für jeden Zucker, den das System transportiert, ein spezifisches
Transmembran-Transportprotein E II und in manchen Fällen ein zuckerspezifisches
Protein E III.
(Bild 5)
Der Glucosetransport wird somit über die indirekte, exergonische Phosphorylierung
durch PEP angetrieben.
PEP: Phosphoenolpyruvat = der Phosphorylgruppen-Donor für dieses System.

Der Zuckertransport in Bakterien ist genetisch reguliert


Wenn einer durch das PTS transportierten Zucker im Ueberfluss vorhanden ist, wird
der aktive Transport von Zuckern, die über andere Transportsysteme in die Zelle
gelangen, gehemmt. Diese Hemmung wird Katabolitrepression genannt und wird
durch die cAMP-Konzentration vermittelt (Abschnitt 29-3C).
Wenn Glucose im Ueberfluss vorhanden ist, nimmt die
Fliessgleichgewichtskonstante von E IIIg ~ P(siehe Bild 5) ab, da es während des
PTS-Transportprozesses G6P (= Glucose-6-P, siehe Bild 5) bildet. Daher wird
Adenylylcyclase (siehe Bild 5) inaktiviert, die cAMP-Konzentration sinkt und die
Synthese von Lactose-Permease wird – ebenso wie die Synthese anderer am
Lactosestoffwechsel beteiligte Proteine – verlangsamt.
Für die Zelle ist dies eine Art Energiesparmassnahme: Es werden keine Proteine
synthetisiert, welche am Stoffwechsel oder am Transport sämtlicher Zucker beteiligt
sind, solange ein einziger Zucker in genügender Menge für den Stoffwechsel
vorkommt.

4.Durch Ionengradienten angetriebener, aktiver Transport


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Systeme wie die (Na+/K+)-ATPase nutzen die Freie Enthalpie der ATP-Hydrolyse
zur Erzeugung von elektrochemischen Potentialgradienten über Membranen.
Umgekehrt kann die Freie Enthalpie, die in einem elektrochemischen
Potentialgradienten steckt, als Triebkraft für verschiedene endergonische
physiologische Prozesse ausgenutzt werden.

A.Na+/Glucose-Symport

Glucose aus der Nahrung wird in den Bürstensaum-Zellen des Darmepithels durch
einen Na+-abhängigen Symport aktiv konzentriert. Sie wird von diesen Zellen über
einen Glucose-Uniport in das Blutkreislaufsystem weitertransportiert.
Die unmittelbare Enthalpiequelle für den Glucosetransport aus dem Darm ist zwar
ein Na+ -Gradient, aber es ist eigentlich die Freie Enthalpie der ATP-Hydrolyse, die
diesen Prozess antreibt.
(Bild 6)

B.Lactose-Permease

Gram-negative Bakterien wie E.Coli enthalten verschiedene aktive Transportsysteme


zur Anreicherung von Zucker.
(Bakterien lassen sich in gram-negative und gram-positive Formen unterteilen –
entsprechend ihrem Verhalten bei der Gram-Färbung.Gram-positive Bakterien haben
eine dicke Zellwand um ihre Plasmamembran, gram-negative Bakterien nur eine
dünne Zellwand, die von einer komplexen äusseren Membran bedeckt ist)
Lactose-Permease benutzt den über die Bakterienzellmembran aufgebauten
Protonengradienten für den Cotransport von H+ und Lactose.
(Bild 7)
Der Protonengradient wird – ähnlich wie in den Mitochondrien – mit Hilfe des
oxidativen Stoffwechsels aufgebaut. Der durch diese beiden Systeme erzeugte
elektrochemische Potentialgradient wird vor allem als Triebkraft für die ATP-Synthese
verwendet.

C.ADP/ATP-Translokator

ATP, erzeugt in der Mitochondrienmatrix, wird zum grossen Teil im Cytosol zum
Antrieb von Biosynthese, aktiven Transport und Muskelkontraktion (alles
endergonische Prozesse) verwertet.
Ein System in der inneren Mitochondrienmembran befördert ATP aus der Matrix
heraus, im Austausch dafür kommt ADP hinein. ADP ist durch ATP-Hydrolyse im
Cytosol entstanden. Dieser Austausch ist elektrogen, da ADP 3- gegen ADP4-
ausgetauscht wird.
Der ADP/ATP-Translokator hat eine Bindungsstelle, um welche ADP und ATP
konkurrieren und zwei Konformationen, wobei einer davon die ADP/ATP-
Bindungsstelle zum Mitochondrieninnern, der andere nach aussen zeigt. Der
Translokator ist ein Antiporter: Er geht nur dann mit physiologisch sinnvoller
Geschwindigkeit von einem Konformationszustand in den anderen über, wenn ein
Ligand an ihn gebunden ist.
Der ADP/ATP-Translokator ist selbst kein aktives Transportsystem. Sein elektrogener
Export von einer negativen Ladung pro Transportcyclus in Richtung des ATP-

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Exports/ADP-Imports wird jedoch von der Membranpotentialdifferenz über die innere
Mitochondrienmembran (aussen positiv) angetrieben. Dies führt zum Aufbau von
ATP- und ADP-Gradienten über die Membran.
(Bild 8)

KAPITEL 19
CITRONENSÄURE-CYCLUS

Citronensäure-Cyclus=Tricarbonsäure-Cyclus(TCA-Cyclus)=Krebs-Cyclus,
kommt bei Eu- und bei Prokaryonten vor, ist „Drehscheibe“ des
Stoffwechselsystemes: Er ist für den grössten Teil der Kohlenhydrat-, Fettsäure- und
Aminosäureoxidation verantwortlich und erzeugt zahlreiche Vorstufen der
Biosynthese. Er ist amphibolisch, d.h. er arbeitet sowohl katabolisch wie anabolisch.

1.Ueberblick

Der Citronensäure-Cyclus besteht aus einer Reihe von Reaktionen, durch die die
Acetylgruppe eines Acetyl-CoA-Moleküls zu zwei Molekülen CO 2 oxidiert wird, wobei
die freigesetzte Freie Enthalpie zunächst konserviert wird, um später für die ATP-
Erzeugung bereitzustehen.
(Bild 9)

A.Reaktionen

Die acht Enzyme des Citronesäure-Cyclus katalysieren eine Reihe von organischen
Reaktionen, die zusammengenommen eine Acetylgruppe zu zwei Molekülen CO 2
oxidieren, wobei drei Moleküle NADH, ein Molekül FDAH und ein Molekül GTP
erzeugt werden.
1.Citrat-Synthese katalysiert die Kondensation von Acetyl-CoA und Oxalacetat zu
Citrat.
2. Citrat wird zu einem leichter oxidierbaren Isomer umgelagert und oxidiert.
Aconitase überführt Citrat (= schwer oxidierbaren tertiären Alkohol) in den leichter
oxidierbaren sekundären Alkohol Isocitrat. Dabei gibt’s eine Wasserabspaltung,
wobei cis-Aconitat entsteht und eine anschliessende Wasseranlagerung, so dass
zuletzt die Hydroxygruppe des Citrats auf ein benachbartes C-Atom übertragen wird.
3. Isocitrat-Dehydrogenase oxidiert Isocitrat zum Zw.Produkt Oxalsuccinat=-
Ketocarbonsäure; dieses wird anschliessend zu -Ketoglutarat decarboxyliert.
Dies ist der erste Schritt, bei dem die Oxidation an eine NADH-Produktion gekoppelt
ist und gleichzeitig auch der erste Schritt, der CO2 freisetzt.
4.-Ketoglutarat wird oxidativ zu Succinyl-Coenzym-A decarboxyliert. Ein zweites
NAD+ wird zu NADH reduziert und ein zweites CO2 gebildet. Zwei CO2 sind gebildet
worden, so dass die Netto-Oxidation der Acetylgruppe abgeschlossen ist. Wichtig:
Nicht die Kohlenstoffatome des eingetretenen Acetyl-Co-A sind oxidiert worden.
5. Succinyl-CoA-Sythetase überführt Succinyl-Coenzym A zu Succinat. Die Freie
Enthalpie der Thioesterbindung wird durch die Bildug von GTP aus GDP und P i
gespeichert.

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6. Die restl. Reaktionen dienen dazu Succinat, zur Vorbereitung der nächsten Runde,
wieder zu Oxalacetat zu oxidierenFumarat. Gl.zeitig wird das Redox-Coenzym FAD
zu FADH2 reduziert.
7. Fumarase katalysiert die Hydratation der Doppelbindung von Fumarat zu Malat.
8. Schliesslich bildet Malat-Dehydrogenase Oxalacetat zurück, indem sie die
sekundäre Alkoholgruppe des Malats zum entsprechenden Keton oxidiert; gl.zeitig
wird ein drittes NAD+ zu NADH reduziert.
Acetylgruppen werden dadurch vollständig zu CO2 oxidiert:

3NAD+ + FAD + GDP + Acetyl-CoA + Pi  3NADH + FADH2 + GTP + CoA + 2CO2

Der Cyclus wirkt infolge der Regeneration katalytisch: eine unendliche Anzahl
Acetylgruppen kann mit Hilfe eines einzigen Oxalacetat-Moleküls oxidiert werden.

2.Stoffwechselquellen für Acetyl-Coenzym A

Acetylgruppen treten als Acetyl-Coenzym A (Acetyl-SCoA oder Acetyl-CoA), das


gemeinsame Produkt des Kohlenhydtrat-, Fettsäure- und Aminosäureabbaus, in den
Citronensäre-Cyclus ein.
Coenzym A (CoASH oder CoA) besteht aus einer -Mercaptoethylamin-Gruppe, die
eine Amidbindung mit dem Vitamin Pantothensäure eingeht.
Die Acetylgruppe von Acetyl-CoA ist als Thioester an den Schwefel der -
Mercaptoethylamingruppe gebunden.
CoA fungiert dabei als Trägermolekül (Carrier) für Acetyl- und andere Acetylgruppen
(das A in CoA steht für Acetylierung).

A.Pyruvat-Dehydrogenase-Multienzymkomplex

Die unmittelbare Vorstufe für Acetyl-CoA aus Kohlenhydraten ist das Glycolyse-
Produkt Pyruvat.
Acetyl-CoA wird aus Pyruvat durch oxidative Decarboxylierung, katalysiert durch den
Multienzymkomplex Pyruvat-Dehydrogenase, gebildet. Dieser hat drei katalytische
Aktivitäten:
1.Pyruvat-Dehydrogenase (E1)
2.Dihydrolipoyl-Transacetylase (E2)
3.Dihydrolipoyl-Dehydrogenase
(Bild 10)

Bei Säugetieren tritt dieser Komplex in den Mitochondrie auf und bedeutet in der
Evolution der katalytischen Effizienz einen Fortschritt mit folgenden Vorteilen:

1.Die Geschwindigkeit von Enzymreaktionen hängt davon ab, wie oft das
Enzym mit seinem Substrat zusammenstösst. Innerhalb eines
Multienzymkomplexes verringert sich die Entfernung, welche die Substanzen zw. den
aktiven Zentren durch Diffusion zurücklegen müssen, und die Geschwindigkeit
nimmt zu.

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2.Durch Komplexbildung können Stoffwechselzwischenprodukte von einem Enzym
eines Stoffwechselweges zum nächsten weitergeleitet und somit Nebenreaktionen
vermieden werden.
3.Koordinierte Kontrolle möglich.

Die Acetyl-CoA-Bildung umfasst fünf Reaktionen


Der Pyruvat-Dehydrogenase-Multienzymkomplex katalysiert eine Folge von fünf
Reaktionen der Gesamstöchiometrie:

Pyruvat + CoA + NAD+ → Acetyl-CoA + CO2 + NADH


(Bild 11a-e)

Der Lipoyllysyl-Arm befördert die Zwischenprodukte von einer Untereinheit zur


nächsten
(Bild 12)

Der Lipoyllysyl-Arm fungiert wie eine Liane, an der das Disulfid mit seinem
reduzierten acetylierten Reaktionsprodukt (Reaktion 2) von E1 nach E3 schwingt.

B.Kontrolle der Pyruvat-Dehydrogenase

Der Pyruvat-Dehydrogenase-Multienzymkomplex reguliert den Eintritt von


Acetyleinheiten (welche aus Kohlenhydraten stammen) in den Ctronensäure-Cyclus.
Die Reaktion muss genau reguliert werden durch folgende zwei Systeme:
(Bild 13)

1.Kontrolle durch Produkthemmung: NADH und Acetyl-CoA konkurrieren mit


NAD+ und CoA um die Bindungsstellen an ihren jeweiligen Enzymen.
E2 bleibt in der acylierten Form, so dass es die Hydroxyethylgruppe vom TPP an E1
nicht übernehmen kann. Dadurch muss TPP an der E1-Untereinheit in seiner
Hydroxylform bleiben, und die Geschw.keit der Pyruvat-Decarboxylierung sinkt.

2.Kontrolle durch Phosphorylierung/Dephosphorylierung: Diese Kontrolle erfolgt


nur in eukaryontischen Enzymkomplexen. Die Komplexe enthalten Pyruvat-
Dehydrogenase-Kinase und Pyruvat-Dehydrogenase-Phosphatase, die an den
Dihydrolipoyl-Transacetylase-Kern gebunden sind.
Die Kinase inaktivuert die Pyruvat-Dehydrogenase-Untereinheit (E1) durch
Phosphorylierung eines spezifischen Ser-Restes der Dehydrogenase. Hydrolyse
dieses Phosphoserin-Restes durch die Phosphatase reaktiviert den Komplex.

3.Die acht Enzyme des Citronesäure-Cyclus

A.Cytrat-Synthase :
(Bild 14)
Citrat-Synthase (citratkondensierendes, freies, dimeres Enzym) katalysiert die
Kondensation von Acetyl-CoA mit Oxalacetat.

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Die Bindung des Oxalacetats induziert die Konformationsänderung, diese erzeugt die
Acetyl-CoA-Bindungsstelle und das gebundene Oxalacetat schliesst das
Lösungsmittel aus.

B.Aconitase:
(Bild 15)
Aconitase katalysiert die reversible Isomerisierung von Citrat und Isocitrat mit cis-
Aconitat als Zwischenprodukt. Citrat besitzt zwar eine Symmetrieebene und ist
deshalb optisch inaktiv, aber es ist prochiral: Aconitase kann die pro-R- und pro-
S-Carboxymethylgruppe des Citrats unterscheiden.

C.NAD+ -abhängige Isocitrat-Dehydrogenase


(Bild 16)
Isocitrat-Dehydrogenase katalysiert die oxidative Decarboxylierung von Isocitrat zu -
Ketoglutarat, wobei erstmalig im citonesäure-Cyclus CO 2 und NADH gebildet weden.
Säugetiere haben zwei unterschiedl. Formen dieses Enzyms. Dasjenige, das am
Citronesäure-Cyclus beteiligt ist, befindet sich nur in den Mitochondrien und braucht
als Coenzym NAD+.
Das andere kommt in den Mitochondrien und auch im Cytosol vor und sein Coenzym
ist NADP+.

D.-Ketoglutarat-Dehydrogenase:
Dieses Enzym katalysiert die oxydative Decarboxylierung einer -Ketocarbonsäure,
wodurch das zweite CO2 und das zweite NADH des Cyclus frei weden. Die
Gesamtreaktion ist der vom Pyruvat-Dehydrogenase-Multienzymkomplex
katalysierten Reaktion sehr ähnlich.
Auch hier handelt es sich um einen Multienzymkomplex, bestehend aus
--Ketoglurat-Dehydrogenase (E1)
-Dihydrolipoyl-Transsuccinylase (E2)
-Dihydropoyl-Dehydrogenase (E3)

E.Succinyl-CoA-Synthetase
Dieses Enzym hydrolysiert die “energiereiche“ Verbindung Succinyl-CoA unter
Kopplung an die Synthese eines „energiereichen“ Nucleosidtriphosphats.
Bei Säugetieren wird GDP+Pi synthetisiert und es entsteht ATP. Bei Pflanzen und
Bakterien verwenden die Enzyme ADP+Pi und es entsteht ATP.

F.Succinat-Dehydrogenase
(Bild 17)
Succinat-Dehydrogenase katalysiert stereospezifisch die Dehydrierung von Succinat
zu Fumarat.
Stark gehemmt wird das Enzym von Malonat, einem Strukturanalogon des Succinats
und klassisches Beispiel eines kompetitiven Hemmstoffes.
(Bild 18)
Succinat-Dehydrogenase enthält ein FAD, den Elektronenaktzeptor der Reaktion. Die
biochemische Aufgabe des FAD besteht darin, Alkane zu Alkene zu oxidieren, so wie
NAD+ Alkohole zu Aldehyde oder Ketone oxidiert.
Succinat-Dehydrogenase wird über eine Elektronentransportkette reoxidiert. Dies
erklärt, warum Succinat-Dehydrogenase, die in die innere Mitochondreinmembran

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eingebettet ist, das einzige membrangebundene Enzym des Citronensäure-Cyclus
ist; alles anderen sind in der mitrochondrialen Matrix gelöst.

G.Fumarase
Fumarase katalysiert die Hydratation der Fumarat-Doppelbindung unter Bildung
von S-Malat.
Zum Verständnis des Mechanismus wurden verschiedene Experimente durchgeführt,
wobei man z.T. zu widersprüchlichen Ergebnisse gekommen ist.

H.Malat-Dehydrogenase
Dieses Enzym katalysiert die letzte Reaktion des Citronensäure-Cyclus: die
Regeneration von Oxalacetat. Dies ist eine NAD+ -abhängige Reaktion unter
Oxidation der Hydroxylgruppe des S-Malats zu einem Keton.
(Bild 19)
Dieser Prozess ermöglicht es, dass die Citrat-Bildung auch bei niedrigen
physiologischen Konzentrationen von Oxalacetet noch exergonisch ist und eine
weitere Runde des Kreislaufes eingeläutet werden kann.

I.Gesamtbild des Citronensäure-Cyclus

Bedeutung des Citonensäure-Cyclus für die ATP-Produktion


Folgende chemische Reaktionen finden in jeder Runde des Citronensäure-Cyclus
statt:
1.Eine Acetylgruppe wird in einem Vier-Elektronenpaar-Prozess netto zu zwei
Molekülen CO2 oxidiert.
2.Drei Moleküle NAD+ werden zu NADH reduziert, wobei drei der Elektronenpaare
versorgt sind.
3.Ein Molekül FAD wird zu FADH2 reduziert, damit ist auch das vierte Elektronenpaar
versorgt.
4.Es wird eine „energiereiche“ Phosphatgruppe in Form von GTP (oder ATP) erzeugt.

Die im Cyclus von der Acetylgruppe abgespaltenen acht Elektronen werden


anschliessend an die Elektronentransportkette weitergeleitet, wo sie dann zwei
Moleküle O2 zu Wasser reduzieren. Jedes der drei Elektronenpaare aus NADH trägt
über die oxidative Phosphorylierung zur Produktion von drei ATP bei, während ein
Elektronenpaar vom FADH2 zwei ATP bildet. Eine Runde des Cyclus liefert also 12
Moleküle ATP.

Isotopen-Untersuchungen zur Stereochemie des Citronensäure-Cyclus


Die Reaktionen des Cycluses wurden mit radioaktiven Tracern bestätigt. Erstmals
konnten Verbindungen synthetisiert werden, die mit dem stabilen 13C oder mit dem
radioaktiven 11C, das eine Halbwertszeit von nur 20 Minuten hat, angereichert waren.
In einem bahnbrechenden Experiment wurde 4-[11C]-Oxalacetat aus 11CO2 und
Pyruvat dargestellt...
(Bild 20)
...und anschliessend in den Citronensäure-Cyclus stoffwechselaktiver Muskelzellen
eingeschleust; die gebildeten Zwischenprodukte wurden isoliert. So ist die
Identifizierung der markierten Position im isolierten -Ketoglutarat gut möglich.
Verfolgt man den Werdegang des isotopenmarkierten Kohlenstoffs () im Cyclus, so
erkennt man, dass es bei der -Ketoglutarat-Dehydrogenase-Reaktion als CO2

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abgegeben wird. Zwar besteht die Nettoreaktion des Cyclus in einer Oxidation der C-
Atome von Acetyl-Einheiten zu CO2 , doch stammt das abgespaltene CO2 jeweils aus
dem Kohlenstoffgerüst des Oxcalacetats.
Es wurden Experimente mit 1-[14C]-Acetat durchgeführt, das in Zellen in 1-[14C]-
Acetyl-CoA überführt wird:
(Bild 21)
Verfolgt man den Weg dieser Markierung, so sieht man, dass er sich zwar innerhalb
des Cyclus gabelt, jedoch erst bei der Bildung von Succinat = dem ersten
rotationssymmetrischen Zwischenprodukt.

4.Regulation des Citronensäure-Cyclus

Citrat-Synthase, Isocitrat-Dehydrogenase und -Ketoglutarat-Dehydrogenase sind


die Schrittmacher-Enzyme des Cyclus
Die Bestimmung der geschwindigkeitsbestimmenden Schritte erweist sich beim
Cyclus als schwierig, da die meisten Metaboliten in den Mitochondrien und im
Cytosol vorkommen und die Verteilung zwischen diesen beiden Kompartimenten
nicht bestimmt ist.
Wenn wir jedoch annehmen, das zw. diesen beiden Kompartimenten ein
Gleichgewicht besteht, können wir aus dem Gesamtgehalt der Zellen an diesen
Substanzen ihre Konzentration in den Mitochondrien abschätzen.
(Bild 22)
In dieser Tabelle sieht man, dass drei Enzyme wahrscheinlich weit vom
Gleichgewicht entfernt arbeiten (=negatives G).
(Bild 23)

Der Citronensäure-Cyclus wird im wesentlichen über die Verfügbarkeit der Substrate,


durch Produkthemmung und Hemmung durch andeere Zwischenprodukte des
Cyclus reguliert
Da Sauerstoffverbrauch, NADH-Reoxidation und ATP-Produktion eng miteinander
gekoppelt sind, muss der Cyclus über Rückkoppelungsmechanismen, die seine
NADH-Produktion auf den Energieverbrauch abstimmen, reguliert werden.

Die regulatorischen Enzyme des Cyclus scheinen auf drei Arten kontrolliert zu
werden:
1.Substratverfügbarkeit
2.Produkthemmung
3.kompetitive Rückkopplungshemmung durch später im Cyclus auftretende
Intermediate.

Die vielleicht wichtigsten Regulatoren des Cyclus sind seine Substrate, Acetyl-CoA
und Oxalacetat, und sein Produkt NADH. Sowohl Acetyl-CoA als auch Oxalacetat
liegen in den Mitochondrien in Konzentrationen vor, die die Citrat-Synthase nicht
sättigen.Der Stoffwechselfluss durch das Enzym hängt also von der
Substratkonzentration ab, unterliegt also einer Kontrolle durch
Substratverfügbarkeit.

Beim Uebergang von niedrigen zu hohen Arbeits- und Atmungsgeschwindigkeiten


gibt’s eine [Citrat]-Abnahme, dies führt zu einem „Domino“-Effekt:

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1.Citrat ist für die Citrat-Synthase ein zu Oxalacetat kompetitiver Inhibitor
(Produkthemmung); die durch gesteigerte Isocitrat-Dehydrogenase-Aktivität
verursachte [Citrat]-Abnahme steigert die Geschwindigkeit der Citratbildung.
2.-Ketoglutarat-Dehydrogenase wird ebenfalls stark durch ihre Produkte, NADH und
Succinyl-CoA, gehemmt. Ihre Aktivität steigt daher, wenn [NADH] sinkt.
3.Succinyl-CoA konkurriert ausserdem in der Citrat-Synthase-Reaktion mit Acetyl-
CoA(kompetitive Rückkopplungshemmung).
Dieses ineinandergreifende System dient eineer koordinierten Regulation des
Cyclus.

ADP, ATP und Ca2+ sind allosterische Regulatoren für die Enzyme des
Citronensäure-Cyclus
Eine Zunahme der Arbeitsbelastung geht mit einem [ADP]-Anstieg einher, der aus
der durch die Belastung erhöhten Geschwindigkeit der ATP-Hydrolyse resultiert. ADP
fungiert als allosterischer Aktivator der Isocitrat-Dehydrogenase.

Ca2+ erfüllt neben vielen anderen biologischen Funktionen auch die eines wichtigen
Stoffwechselregulators.
Ca2+ spielt auch eine Rolle bei der Regulation des Cyclus: es aktiviert die Pyruvat-
Dehydrogenase-Phosphatase, Isocitrat-Dehydrogenase und -Ketoglutarat-
Dehydrogenase.

Die Reaktionen des Citronensäure-Cyclus spielen nicht nur beim


Energiestoffwechsel eine wichtige Rolle, sondern auch bei vielen Biosynthesewegen.

5.Amphibole Natur des Citronensäure-Cyclus

Ein Stoffwechselweg ist:


1.katabolisch: erzeugt (und konserviert) Freie Enthalpie
oder 2.anabolisch: verbraucht Freie Enthalpie
Citronensäure-Cyclus: naturgemäss katabolisch, da er über abbauende
Reaktionen verläuft und in den meisten Organismen ein wichtiges System zu
Konservierung Freier Enthalpie bildet. Die Zwischenprodukte des Cyclus brauchen
nur in katalytischen Mengen vorhanden zu sein, um die Abbaufunktionen des Cyclus
aufrechtzuerhalten. Jedoch dienen diese Zwischenprodukte auch als
Ausgangssubstanzen für verschiedene Biosynthesewege (Anabolismus). Der
Cyclus ist daher amphibolisch=sowohl anabolisch als auch katabolisch.
Alle Biosynthesewege, die Zwischenprodukte des Cyclus verwerten, benötigen auch
Freie Enthalpie. Die katabolische Funktion des Cyclus darf daher nicht unterbrochen
werden: werden Zwischenprodukte des Cyclus abgezogen, so müssen sie
nachgeliefert werden.
(Bild 24)

Reaktionen, die die Zwischenprodukte des Citonensäure-Cyclus wieder auffüllen


Reaktionen, die die Zwischenprodukte des Cyclus nachliefern, heissen
anaplerotisch=“auffüllend“. Die wichtigste Reaktion dieses Typs wird durch
Pyruvat-Carboxylase katalysiert und liefert Oxalacetat:

Pyruvat + CO2 + ATP + H2O⇌Oxalacetat + ADP + Pi

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Voet, Biochemie,Deutsch Corinne Haller
Kapitel 18.3-19.5 Juni 2001
Das Enzym “misst” über seinen Aktivator=Acetyl-CoA ob ein grösserer Bedarf an
Zwischenprodukten des Cyclus besteht. Jede Verlangsamung des Cyclus, die durch
einen Mangel an Oxalacetat oder anderen Zwischenprodukten verursacht wird, führt
zu einem Anstieg des Acetyl-CoA-Spiegels, da es nicht vollständig verwertet wird.
Dies aktiviert die Pyruvat-Carboxylase, die Oxalacetat nachliefert und so die
Geschwindigkeit des Cyclus erhöht. Wird allerdings der Cyclus bei einem anderen
Schritt gehemmt, so wird ihn eine erhöhte Oxalacetat-Konzentration nicht aktivieren.
Statt dessen stellt sich ein Gleichgewicht zwischen dem überschüssigen Oxalacetat
und Malat ein.
Abbauwege liefern Zwischenprodukte:
1.Die Oxidation von Fettsäuren mit ungerader Anzahl von C-Atomen führt zur
Produktion von Succinyl-CoA.
2.Der Abbau der AS Isoleucin, Methionin und Valin führt auch zur Produktion von
Succinyl-CoA.
3.Trans- und Desaminierung von AS führt zur Produktion von -Ketoglutarat und
Oxalacetat.

Der Citronensäure-Cyclus steht somit imMittelpunkt des Stoffwechsels. Seine


reduzierten Produkte, NADH und FADH2 , werden in der oxidativen
Phosphorylierung durch die Elektronentransportkette reoxidiert, und die dabei
frei werdende Freie Enthalpie treibt die Biosynthese von ATP an.
Zwischenprodukte des Cyclus werden für die Biosynthese vieler
Zellbestandteile verwendet.

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