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24-5.

DNA Reparatur
DNA Schäden müssen repariert werden um die Unversehrtheit der genetischen Information zu wahren.
A. Direkte Behebung des Schadens
Einige Enzyme erkennen DNA Basenmodifikationen und können diese direkt korrigieren.
- Ein Pyrimidin-Dimer ist eine Vereinigung von zwei Pyrimidin-Basen desselben DNA-Strang durch ein
Cytclobutanring. Sie werden durch UV-Strahlung gefördert und verhinderen, dass der betroffene Abschnitt
als geeignete Matrize für die Transcription und die Replikation in Frage kommt. Durch ein
lichtabsorbierendes Enzym, photoaktivierendes Enzym oder Photolyase, kann die monomere Form von
Pyrimidin-Dimeren widerhergestellt werden.
- Ist die DNA alkylierenden Agentien ausgesetzt, so entsteht neben anderen Produkten O6–Alkylguanin-
Reste. Die Bildung solcher Alkylderivate wirken stark mutagenisierend, da während der Replikation oft
Thymin anstelle von Cytosin in den komplementären Strang eingebaut wird. O6–Methylguanin-DNA-
Methyltransferase repariert die DNA-Schadstellen von O 6–Methylguanin- und O6–Ethylguanin-DNA-
Schadstellen indem die störenden Alkylgruppe direkt von der Base auf ein Cystein-Rest der Transferase
übertragen wird. Durch diese Reaktion wird das Protein inaktiviert.
B. Excisionsreparatur
Bei der Excisions- oder Ausschneidereparatur wird das Oligonucleotid mit der Schadstelle aus der DNA
ausgeschnitten und die daraus resultierende Einzelstranglücke aufgefüllt. Bei E.Coli wird das Pyrimidin-Dimer
von einem Enzym (UvrABC-Endonuclease) mit mehreren Untereinheiten erkannt. In einer ATP-abhängigen
Reaktion wird der DNA-Strang mit dem Dimer durch das Enzym gespalten. Das ausgeschnittene Oligonucleotid
wird durch eine DNA-Polymerase ersetzt und die DNA-Ligase schliesst die Einzelstrangbrüche.(D: 31-29,
S.976; E: 24-28, S.799)
Beim Fehlen der Excisionsreparatur entstehen Krankheiten wie Xeroderma pigmentosum, wobei die
Hautzellen unfähig sind durch UV-induzierte DNA-Schäden zu reparieren.
Glycosylasen entfernen veränderte Basen
DNA mit einer modifizierten Base kann durch eine Art Excisionsreparatur (DNA-Glycosylase) wiederhergestellt
werden. Tritt Uracil in der DNA auf wird es rasch durch die Uracil-N-Glycosylase entfernt und über die
Excisionsreparatur durch Cytosin ersetzt. Wäre Uracil ein normaler Bestandteil der DNA, würde die
Eigenschaft, dass Cytosin sehr leicht zu Uracil desaminiert, zu einer hohen Mutationsrate führen.
C. Rekombinationsreparatur
Es kann vorkommen, dass beschädigte DNA repliziert wird. Die DNA-Replikation wird bei einer
Konformationsstörung der Matrizen-DNA unterbrochen und erst in einem gewissen Abstand wieder
aufgenommen. Der Tochterstrang weisst also eine Lücke auf, welche durch die Rekombinations- oder
Postreplikationsreparatur behoben wird. Dabei werden die entsprechenden Abschnitte der DNA-
Schwesterstränge gegeneinander ausgetauscht und die Lücke aufgefüllt und verschlossen. Die
Rekombinationsreparatur besitzt starke Ähnlichkeit zur genetischen Rekombination. (D: 31-31, S.978; E: 24-30,
S. 801)
D. SOS-Antwort
Die SOS-Antwort sind komplexe zelluläre Veränderungen, welche dazu führen, dass sich solche Zellen nicht
mehr teilen und ihre DNA-Reparatur-Kapazität gesteigert wird.
Während des normalen Wachstums ist die Expression der SOS-Gene überwiegend durch das Protein LexA
reprimiert. Wenn nach der Replikation durch zu viele Schäden Lücken auftreten, verbindet sich das RecA Protein
mit dem einzelsträngigen DNA-Bereich und simuliert die Spaltung von LexA. Die bis dahin von LexA
reprimierten Gene können nun exprimiert werden und die Synthese von SOS-Proteinen beginnt. Dieser Vorgang
ist fehleranfällig und kann zu Mutationen führen, weil sogar Basen eingesetzt werden, bei denen keine
Informationen über die ursprüngliche Base vorliegt.

24-6. Rekombination

A. Allgemeine Rekombination
Mit allgemeiner Rekombination wird der Austausch von homologen Abschnitten zwischen zwei DNA-
Molekülen bezeichnet.
Wenn sich zwei homologe DNA-Doppelhelicses in gleicher Orientierung in engen Kontakt zueinander befinden
können nach dem Holliday-Modell folgende Reaktionen ablaufen: (D: 31-34, S.982; E: 24-32, S.802)
In zwei einander entsprechende Stränge werden Einzelstrangbrüche eingeführt, diese überkreuzen sich und
paaren mit den nahezu komplementären Stränge des homologen DNA-Moleküls, es entsteht in diesem Bereich

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eine Heteroduplex-DNA. Die Brüche werden verschlossen. Diese Holliday-Struktur ist recht stabil, denn es
kommt zu keinen sterischen Spannungen. Die Überkreuzungsstelle kann sich bei der Schenkelwanderung in
beide Richtungen verschieben. Die Holliday-Struktur kann auf zwei Wege aufgelöst werden:
1. Durch ein Aufbrechen der sich nicht überkreuzenden Stränge werden die Enden der ursprünglichen
Doppelstränge gegeneinander ausgetauscht.
2. Durch Spaltung der sich überkreuzenden Stränge entsteht ein Bereich, indem homologe Einzelstränge
getauscht worden sind.
RecA katalysiert die allgemeine Rekombination bei E.Coli
RecA bindet an eine einzelsträngige DNA. Durch diesen Protein-DNA-Komplex wird RecA stimuliert
zusätzliche doppelsträngige DNA zu binden und nach Komplementarität abzusuchen. Dabei entwindet das
RecA-Protein die Helix und tauscht unter Hydrolyse von ATP den Einzelstrang gegen den entsprechenden Strang
der Doppelhelix aus. Dieser Strangaustausch benötigt ein freies Ende und toleriert Falschpaarung nur bis zu
einem gewissen Grad. Der Einzelstrang muss dabei von seinem 5’-Ende aus in den Doppelstrang eindringen.
RecBCD initiiert die Rekombination durch einen Einzelstrangbruch
Das RecBCD-Protein, welches aus Produkten der SOS-Gene besteht (recB, recC und recD), führt die
Einzelstrangbrüche in die DNA ein. Dazu bewegt es sich in einer Richtung auf der DNA-Doppelhelix und
entwindet diese. Dabei entsteht, da sich die Helix nicht so schnell wieder verwindet, eine ständig wachsende
Einzelstrangschleife. Trifft RecBCD vom 3’-Ende auf die sogenannte Chi-Sequenz (GCTGGTGG) spaltet das
Protein den Strang und erzeugt einen einzelsträngigen Bereich an den das RecA binden kann.
B. Transposition
Transposons oder transponierbare Elemente bewegen Gene von einer Stelle zu einem beliebigen anderen Ort.
Kurzfristig bewirken sie Variationen in der Ausprägung des Phänotyps, langfristig beeinflussen sie die Evolution.
Der Vorgang der Transposition wird als illegitime Rekombination bezeichnet und ist ein höchst ineffizienter
Prozess.
Drei Arten:
1. Insertionssequenzen oder IS-Elemente bestehen in der Regel aus weniger als 2000bp und enthalten
ein Transposase-Gen. Sie sind von kurzen inversen terminalen Repetitionen eingeschlossen, welche
eine essentielle Rolle spielen.
2. Komplexere Transposons enthalten zusätzlich Gene, die nicht am Vorgang der Transposition beteiligt
sind, z.B. Antibiotikaresistenz-Gene. Sie bestehen aus verschiednen Proteinen. Die ortspezifische
Rekombination findet in AT-reichen Bereichen statt, die als interne Auflösungsstellen bezeichnet
werden.
3. Sogenannte zusammengesetzte Transposons bestehen aus einem zentralen codierten Bereich, der von
zwei identischen oder nahezu identischen IS-ähnlichen Modulen flankiert wird.
Mutmasslicher Mechanismus der Transposition (D: 31-50, S.989; E: 24-42, S.808)
1. In der Zielsequenz des Rezipienten-Plasmids werden zwei versetzte Einzelstrangbrüche eingeführt. Auf
ähnliche Weise werden zu beiden Seiten des Transposons die entgegengesetzten DNA-Stränge
geschnitten.
2. An beiden Enden des Transposons entsteht durch Verknüpfung der überhängenden Einzelstrang-Ende
an der Insertionsstelle eine Replikationsgabel.
3. Das Transposon wird repliziert, es entsteht ein Fusionsprodukt.
4. Durch Crossing-over kann das Fusionsprodukt in die beiden Ursprungsplasmide, die nun beide ein
Transposon enthalten, aufgetrennt werden. Katalysiert wird dieser Prozess durch eine im Transposon
codierten Resolvase.
Genetische Umordnungen werden im wesentlichen durch Transposition verursacht
Transposons begünstigen neben eigener Insertion in andere DNA-Regionen auch Inversionen, Deletionen
und Umlagerungen in Wirts-DNA (D: 31-51, S.990; E: 24-43, S.809)
Inversion: Wirts-DNA enthält zwei Kopien eines Transposons in entgegengesetzter Orientierung
Deletion: Wirts-DNA enthält zwei Kopien eines Transposons mit gleicher Orientierung
Umlagerung: Wenn ein Chromosomenabschnitt nach einer Deletion durch unabhängige Rekombination an
einer anderen Stelle integriert wird

Kapitel 25: Transcription und RNA Prozess


Ribosomale RNA, Transfer-RNA und die Boten- RNA werden an DNA-Matrizen synthetisiert; diesen Prozess
nennt man Transcription.

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25-1. RNA-Polymerase
Die RNA-Polymerase ist das Enzym für die DNA gesteuerte Synthese der RNA. Unter Verwendung von DNA-
Matrizen koppelt dieses Enzym die Nucleosidtriphosphate ATP, CTP, GTP und UTP aneinander.
A. Struktur des Enzyms
Das sogenannte Holoenzym der E.coli-RNA-Polymerase besteht aus fünf Untereinheiten 2‘. Bei der
Einleitung der Synthese trennt sich der -Faktor vom Kernenzym (2‘), welches den eigentlichen
Polymerisationsprozess ausführt.
Untereinheit Gen Anzahl Masse (kd) Funktion
 rpo A 2 37 bindet regulatorische Sequenzen
 rpo B 1 151 bindet Phosphodiesterbindungen
‘ rpo C 1 155 bindet DNA-Matrizen
 rpo D 1 70 erkennt den Promoter und initiiert die Synthese
B. Bindung an die Matize
RNA-Synthese wird normalerweise nur an definierter Sequenz (Promotor) der DNA-Matrize begonnen. Der
DNA Strang welcher als Matrize dient wird als antisens oder noncoding strand bezeichnet. Seine Sequenz ist
komplementär zu derjenigen der RNA. Der andere DNA Strang mit der selben Sequenz (ausser U und T) wird
als sense oder coding strand bezeichnet.
Das Holoenzym bindet spezifisch an Promotorsequenzen
Durch die Bindung der RNA-Polymerase an den Promotor, welcher vom entsprechenden -Faktor erkannt wird,
beginnt die Transcription. Der Promotor entspricht einer ca. 40bp lange Sequenz auf der 5’terminalen Seite des
Transcriptionsstartpunkts. Die Transcriptionsgeschwindigkeit für Gene ist von der
Komplexbildungsgeschwindigkeit zwischen Promotor und RNA-Polymerase abhängig.
Initation erfordert die Bildung eines „offenen“ Komplexes
Die Promotorregion im Kontakt mit dem Holoenzym wurden mittels Footprinting (dem schützenden Einfluss des
Enzyms gegenüber analysiert man DNA-alkylierende Substanzen) identifiziert. Die Bindung des Holoenzyms
öffnet die Promotor-DNA auf einer 11bp langen Sequenz (offener Komplex). Der -Faktor ermöglicht bei der
Suche nach der geeigneten Promotorsequenz eine rasche Bewegung entlang des DNA-Strangs. Sobald der -
Faktor abgetrennt ist, bindet sich der Kernenzym-DNA-RNA-Komplex fest an die doppelsträngige DNA
(geschlossener Komplex).
Nach der Abtrennung des -Faktor, kann sich dieser mit einem anderen Kernenzym zu einem neuen
Initiationskomplex verbinden. Die RNA-Synthese kann so durch Zugabe von Kernenzymen explosionsartig
gesteigert werden.
C. Kettenelongation
Das Kettenwachstum erfolgt in 5’ => 3’-Richtung. Bei der RNA-Synthese öffnet sich die doppelsträngige DNA-
Matrize, so dass der sense-Strang in seine komplementäre RNA transcribiert werden kann. Das ungepaarte
DNA-„Auge“ des Startkomplexes bewegt sich anschliessend mit der RNA-Polymerase entlang der DNA. Wobei
sich die RNA-Polymerase geradlinig bewegt, während die DNA rotiert. (D: 29-11, S. 865; E: 25-7; S. 819)
Die Transcription erfolgt rasch und präzise
Transcriptionsgeschwindigkeit: 20 bis 50 Nucleotide/s
Fehlerquote: eine falsche Base pro 104 transcribierten Basen
Diese Quote ist tolerabel, da die meisten Gene mehrfach transcribiert werden, der genetische Code Synonyme
enthält und einzelne Aminosäure-Substitutionen in Proteinen meist keine Auswirkung auf ihre Funktion haben.
D. Kettentermination
Elektronenmikroskopische Aufnahmen deuten auf spezifische Stellen in der DNA hin, an denen die
Transcription aufhört. Bei E.coli haben die Terminationssequenzen die Eigenschaften, dass die Sequenzierung
genau hinter mehreren AT-Paaren endet und dass sich vor dieser Sequenz ein GC-reicher Abschnitt mit
palindromischer Sequenz befindet. Die dazu korrespondierende RNA kann eine selbstkomplementäre
„Haarnadel“-Struktur bilden, die von mehreren U-Resten abgeschlossen wird. (D: 29-12, S.868; E: 25-10, S.821)
Die RNA-Polymerase pausiert an der Haarnadelstruktur und die AT-reiche Region der RNA dissoziiert von der
DNA. Dies führt wahrscheinlich zur Wiederherstellung des DNA-Doppelstrangs und Dissoziation der RNA-
Polymerase.

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25-2. Transcribtion in Eukaryoten

A. Eukaryotische RNA-Polymerase
3 verschiedene RNA-Polymerasen:
Typ Lokalisation Synthese von:
RNA-Polymerase I Nucleoli die Vorläufer der meisten ribosomalen RNAs
RNA-Polymerase II Nucleoplasma die mRNA-Vorläufer
RNA-Polymerase III Nucleoplasma die Vorläufer der 5S ribosomalen RNA, der tRNA und weiteren kleiner,
nucleärer und cytosolischer RNAs
Zusätzlich enthalten Eukaryontenzellen auch mitochondriale und chloroplastische RNA-Polymersen.
B. Eukaryotische Promotor
RNA-Polymerase I-Promotor
Sie bestehen aus gekoppelten Kontrollregionen, welche die RNA-Polymerase an die geeignete Startstelle führt
und welche die sogenannten Transcriptionsfaktoren bindet.
RNA-Polymerase II-Promotor
Sind komplex und mannigfaltig. Sie haben eine GC-Box (Sequenz: GGGCGG). Den Strukturgenen fehlt meist
diese GC-reiche Sequenz sie haben statt dessen eine hochkonservierte AT-reiche Sequenz, die sogenannte TATA-
oder Goldberg-Hogness-Box.
Einige Transcriptions-Kontrollelemente sind weder in Position noch in Orientierung zu den von ihnen
kontrollierten Sequenzen festgelegt. Solche Gensegmente nennt man Enhancer (Verstärker).
RNA-Polymerase III-Promotor
Die Promotoren der Gene, die von RNA-Polymerase III transcribiert werden, können vollständig innerhalb der
transcribierten Gen-Region liegen.

25-3. Posttranscriptionale Modifikation


Die primären Transcripte sind nicht notwendigerweise funktionelle Einheiten und müssen modifiziert werden.
A. Messenger-RNA-Prozessierung
Die Bildung einer eukaryontischen mRNA beginnt mit der Transcription des gesamten strukturellen Gens, dabei
entsteht die Prä-mRNA. Anschliessend wird eine charakteristische, enzymatische Cap-Struktur, welche die
Translations-Startstelle definiert, sowie ein Poly(A)-Schwanz angefügt. Bei dem darauffolgenden Prozess des
Gen-Spleissen werden die Intron (Sequenz ohne „sinnvolle“ Information) exzidiert und benachbarte Exons
(kodierende Bereiche eines Gens) miteinander ligiert, wobei die reife mRNA entsteht.
(D: 29-33, S.887; E: 25-18; S.832)
Das Exon-Spleissen vollzieht sich in zwei Reaktionsschritten (D: 29-35, S.888; E: 25-20, S.834)
1. Das 5’-Ende des Exons wird durch Bildung einer 2’,5’-Phosphodiester-Bindung zwischen einem
Adenosinrest des Introns und seiner 5’-terminalen Phosphatgruppe freigesetzt. Das Intron nimmt damit
eine „Lasso-Struktur“ ein.
2. Das Spleissprodukt wird durch eine Bindung zwischen dem freien 5’-Ende des Exons und dem 3’-
gelegenen Exons, welches mit dem Intron verbunden ist, freigesetzt. Das Intron wird rasch abgebaut.
SnRNP vermittelt den Spleissprozess
SnRNA sind hochkonzentrierte kleine nucleäre RNAs (small nuclear RNA), welche Protein-Komplexe (snRNP)
bilden. Das Spleissosom (Partikel an dem das Spleissen stattfindet) assembliert die prä-mRNA, die snRNP und
andere mRNA bindender Proteine zum vollständigen Spleissosom.
Bei vielen Eukaryonten unterscheidet sich die mRNA von den Genen, von denen sie transcribiert wurden =>
RNA-Editing

B. Prozessierung der ribosomalen RNA


Die anfängliche Prozessierung, die die prä-rRNA liefert, beginnt noch während der Synthese der Primär-
Transcripte. In einem sekundären Prozessierungsschritt werden Enden der prä-rRNA verkürzt und es entsteht die
reife rRNA.

C. Prozessierung der Transfer-RNA


tRNA enthält einen grossen Anteil modifizierter Basen und bildet in einer Sekundärstruktur mit vier
basengepaarten Stielen eine Kleeblattstruktur.