KAPITEL 5 : TECHNIKEN DER PROTEINREINIGUNG

Für die Charakterisierung müssen die Proteine in reiner Form vorliegen. Schwierig, da eine Zelle tausend verschiedene Substanzen
enthält, die sich in ihren physikalischen und chemischen Eigenschaften stark ändern. Substanz kann auch instabil sein oder in
verschwindend kleinen Mengen vorliegen.

1. Protein-Isolierung

Verschiedene Techniken werden angewandt. Es gilt: der Aufwand für die Reinigung einer Substanz ist umso höher, je niedriger die
Ausgangskonzentration ist.

A.) Auswahl der Proteinquelle

Isolierung kann durch überlegte Auswahl der Proteinquelle vereinfacht werden.

1. Leichte Erhältlichkeit und ausreichende Menge des Gewebes, aus dem Prot. isoliert werden soll (Klonierte Prot.
sind weitaus leichter zu isolieren, als aus ihren Herkunftsorganismen.
2. Konzentration des gewünschten Prot. im Gewebe möglichst hoch
3. Eigenschaften des gewählten Proteins, die bei seiner Stabilisierung und Isolierung hilfreich sein könnten

Oft verwendete Gewebe : Huhn, Rind, Schwein, Ratte, E.Coli, Hefe

B) Methoden der Solubilisierung

Prot. muss erst einmal aus der Zelle freigesetzt werden (Solubilisierung). Methode der Wahl richtet sich nach den mechanischen
Eigenschaften des Herkunftsgewebes sowie der Lokalisation des gesuchten Prot. in der Zelle.

1. Lyse : Wird angewendet , wenn Prot. im Cytosol der Zelle liegt.

Bsp: osmotische Lyse: Zellen werden in hypotonische Lösung gebracht, deren Gesamtkonzentration an gelösten
Stoffen geringer ist als die der Zelle : Durch Osmose diffundiert Wasser in die höher konzentrierte intrazelluläre
Lösung, Zelle schwillt an und platzt schliesslich.
Nachteil: lässt sich fast nur auf tierische Zellen anwenden, bei pflanzlichen Zellen, deren Zellwände stark und robust
sind, könnte Verwendung von Lysozymen (=Enzyme die Zellwände chemisch abbauen) erfolgreicher sein.

Viele Zellen jedoch müssen mechanisch aufgeschlossen werden :

1. Zerreiben mit Sand/Erde

2. Hochgeschwindigkeitsmixer
3. Homogenisator
4. French-Press
5. Beschallung

Lysat wird gefiltert od. zentrifugiert um Zelltrümmer zu entfernen.

Ist Prot. aber Bestandteil subzellulärer Einheiten ( Membranen, Mitochondrien) , werden diese vom restlichen zellulären Material
trennen, sog. Differentielle Zentrifugation:

1. Zentrifugation mit Geschwindigkeit bei der nur Zell-Komponenten (Membranen, Mitochndr.) sedimentiert werden
2. Geschwindigk. wird erhöht und erneut zentrifugiert, s.d. gewünschte Komponente sedimentiert.
3. Protein wird mit Hilfe von Extraktion von der angereicherten subzellulären Komponente getrennt.

C). Stabilisierung der Proteine

Vielen Gefahren können Prot. irreversibel beschädigen, somit muss Prozess der Reinigung ständig auf diese kontrolliert werden:

1. pH-Schäden: Struktur der Prot. ist pH-abhängig, da viele Säure-Base Gruppen vorhanden sind. Lösung  Aufnahme
der Prot. in eine Pufferlösung, die auf einen pH-Bereich eingestellt ist, was dem Prot. einen mobilen Zustand verleiht.

2. Temperatur: Prot. können bei unangepasster Temp. denaturieren. (oberhalb von 25°C denaturieren die meisten).
Reinigung im Normalfall bei 0°C. Dies kann aber auch ein Vorteil sein, warum? Hoher Reinigungseffekt kann erzielt
werden, wenn Eigenschaft der thermischen Stabilität eines Proteins können ausgenützt wird, indem das gesuchte z.B. ein
hitzestabiles Prot. ist. Die Mischung in der es vorkommt kann kurzzeitig erhitzt werden, s.d. die meisten anderen Prot.
denaturieren und ausfallen und das gesuchte intakt in Lösung bleibt.

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 3. Proteasen: (=Enzyme, die Peptidbindungen spalten) Solche und andere proteinschädigende Enzyme entfernen oder
inaktivieren. Beispielsweise mittels pH- oder Temp.-Aenderung, die für unser Prot. unbedenklich sind, oder aber
chemisch angreifen.
Alternative dazu, die sog. Autoprotolyse: Hierbei wird die Resistenz der Prot. gegenüber diesen Proteasen ausgenützt. Es
gibt Prot., die resistenter sind als andere. Falls gesuchtes Prot. ziemlich resistent ist, kann einfacher gereinigt werden,
wenn man das Rohextrakt zuvor mit den vorhandenen Proteasen vorinkubiert, s.d. unerwünschte Prot. vorzeitig abgebaut
werden und unser Prot. zurück bleibt.
Weitere Gefahren: Oxidation der Cystein-Reste unter Ausbildung von Disulfidbrücken, Verseuchte Schwermetalle, die
irreversibel an Prot. binden.

Es muss auch stets eine gewisse Salzconc. und Polarität des Lösungsmittel, die im Stabilitätsbereich des Prot. ist, gehalten
werden.

D) Protein-Nachweis

Voraussetzung für die Reinigung einer Substanz:

1. quantitativer Nachweis mittels geeigneter Methoden

2. Nachweise müssen für das zu reinigende Prot. spezifisch und empfindlich sein
3. Test sollte einfach und beliebig durchführbar sein, damit er auf jeder Stufe des Reinigungsprozesses eingesetzt werden
kann

Methoden:

1. Enzymtest: Sie katalysieren Reaktionen mit leicht nachweisbaren Produkten, d.h. diese haben oft eine charakteristische,
spektroskopisch messbare Absorption oder Fluoreszenz. Oder aber auch: Enzymatische Reaktion kann Säure verbrauchen
oder freisetzen, s.d. das Enzym durch Säure-Base-Titration nachgewiesen werden kann.

Ist Produkt aber nicht leicht nachweisbar ist eine gekoppelte enzymatische Reaktion nötig, bei der das Produkt des gesuchten Enzym
durch ein zweites Enzym in eine leicht nachweisbare Substanz überführt wird.

2. Immunchemische Methoden : können kleine Mengen eines spezifischen, hochempfindlichen Proteins einfach
nachweisen: Unter Verwendung von ANTIKÖRPER

Probelm : AK ist monoklonal, d.h nicht beliebig teilbar . Lösung AK +Myelomzelle (Tumorzelle des Immunsystem) ergibt eine
unbegrenzt teilungsfähige Hybridom-Zelle. Kultivierung des AK möglich

3..Radioimmunassay: Alternative, indirekte Nachweisart v. Prot., bei der man das gesuchte Prot. mit einem radioaktiven
Standard um die Bindung an den AK konkurrieren lässt.

4.ELISA: (= Enzyme-linked-immunosorbant-assay), ein enzymgekoppelter Immunnachweis läuft so ab:

1. AK gegen gesuchtes Prot. auf Festplatte verankern

2. Lösung mit gesuchtem Prot. auf Festplatte mit AK, binden aneinander, es entsteht ein Protein-AK-Komplex
3. Ein zweiter proteinspezifischer AK2 auf Prot-AK-Komplex, inkubieren. AK2 ist kovalent mit einem leicht
nachweisbaren Enzym verknüpft (= AK-Enzym-Konjugat)
4. Enzym des fixierten AK-Prot.-AK2-Enzymkomplex wird nachgewiesen, und somit kann Menge gebundener Prot.
berechnet werden ( siehe Abb. 5-1, s. 75, D)
(So werden Schwangerschaftstest ausgeführt.)

E) Strategien der Protein-Reinigung

Prot. werden mittels Fraktionierungsverfahren in mehreren unabhängiger Schritten getrennt, unter Ausnutzung seiner physikalischen
und chemischen Eigenschaft . Ziel Das Vorliegen in reiner Form des gesuchten Prot.

Charakteristika der Prot., auf denen die verschiedenen Trennverfahren basieren:

1. Löslichkeit
2. Ionenladung
3. Molekülgrösse
4. Adsorbtionseingeschaften
5. Bindungsaffinität für andere Biomoleküle

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2. Löslichkeit von Proteinen

Da viele Säure-Base Gruppen vorhanden, ist Löslichkeit von einigen Faktoren abhängig:
1. Konzentration gelöster Salze
2. Polarität des Lösungsmittel
3. pH-Wert
4. Temperatur

A ) Einflüsse der Salzconzentration: Löslichkeit eines Prot. im wässrigen Milieu ist von Konzentration gelöster Salze abhängig, die
sogenannte Ionenstärke I

I = 0.5  ci (zi)2

wobei, ci = molare Konz. der i-ten ionischen Spezies und zi =Ionenladung

Es wird gezeigt, dass die Löslichkeit bei gegebener Ionenstärke mit dem Ionentyp variiert ( siehe Abb. 5-2, 3, s. 76)
Die Löslichkeit bei geringer Ionenstärke steigt i.a. mit der Salzconz. = Einsalz-Effekt

Erklärung: Bei steigender Salzconc. stehen zunehmend „Gegen-Ionen“ für die Abschirmung der Ionenladung in den Proteinen zur
Verfügung Löslichkeit wird erhöht.

Bei hoher Ionenstärke sinkt die Löslichkeit  Aussalz-Effekt

Erklärung: Ist das Ergebnis der Konkurrenz zwischen Salz-Ionen und anderen gelösten Stoffen um die solvatisierenden Moleküle. Bei
höheren Salzconc. werden viele zugegebenen Ionen solvatisiert, s.d. der zur Verfügung stehenden Lösungsmittelvorrat nicht mehr
aussreicht andere Subtstanzen in Lösung zu halten. Resultat  Wechselwirkung zwischen den gelösten Substanzen untereinander
stärker als zwischen gelösten Substanzen und Lösungsmittel. Folge: Die gelösten Proteine fallen aus. Dies kann bei
Reinigungsmethoden folglich so ausgenützt werden:

Wird Salzconc. einer Proteinlösung gerade unterhalb des Präzipitaionspunktes (Ausfällungspunkt) des gewünschten Prot. eingestellt,
können andere Prot. und Substanzen aus der Lösung entfernt werden Präzipitat wird abgetrennt und Salzconc erneut gerade soweit
erhöht, s.d. gesuchte Prot. ausfällt. Folglich ist das Aussalzen der 1. Schritt eines Reinigungsverfahren. (Häufig gebraucht zum
Aussalzen: Ammoniumsulfat, da dies gut in Wasser gut löslich ist und hohe Ionenstärke ermöglicht.

B ) Einflüsse organischer Lösungsmittel: Sie sind i.a. sehr gute Fällungsreagenzien für Prot. da niedrige Dielektrizitätskonstante die
Solvatationskraft der Prot. herabsetzt.

C )Bedeutung des pH-Werts: Da Prot. viele ionisierbare Gruppen aufweist, die unterschiedliche pK-Werte haben, besitzt jedes Prot.
einen charakteristischen pH-Wert, bei dem positive und negative Ladungen ausgeglichen sind, man nennt diesen pH = Isoelektrischer
Punkt, pI (siehe Abschn. 4-1D) Löslichkeitsverhalten (siehe Kurven Abb. 5-4, s.77) der meisten Prot. zeigt, dass viele Prot. bei
ihrem pI eine Minimum aufweisen und Kurve mit verändertem pH symmetrisch um pI ansteigt. Warum?  Löslichkeits-
Eigenschaften ungeladener Moleküle sind unabhängig von Salsconc.

Da sich alle Prot. in ihrer Aminsäure-Zusammensetzung unterscheiden und auch in ihrem pI (siehe Tab. 5-1, s.78) gibt es ein
Reinigungsverfahren, isoelektrische Präzipitation, bei dem der pH- Wert eines Proteingemischs auf den pI-Wert des zu isolierenden
Prot. eingestellt um somit selektiv seine Löslichkeit zu minimieren.

D) Kristallisation : Nach der Reinigung können Prot. evtl. kristallisieren, Man stellt die Proteinlösung mit Fällungsreagenzien
oberhalb ihres Sättigungspunktes ein. Durch Erhöhung der Konzentration des präzipitierender Substanz fällt das Prot. in kristalliner
Form aus. Das kann u.U. für die Röntgenstrukturanalyse geeignet sein.

3.Chromatographische Trennverfahren

Das zu trennende Substanzgemisch wird in einer Flüssigkeit (mobile Phase) gelöst. Dies resultierende Lösung lässt man durch eine
Säule (stationäre Phase) sickern, welche meist aus einer festen, porösen Matrix (es gibt stationäre Phasen mit immobilisierten
flüssigen Oberflächenfilm.
Die Wechselwirkungen, der gelösten Bestandteile mit der stationären Matrix verzögern die Wanderungsgeschwindigkeit durch die
Matrix in substanzspezifischer Weise. Es bildet sich zu Beginn ein schmales Band; während der Wanderung durch die Säule wirken
auf jede Komponente unterschiedliche Verzögerungskräfte ein, die eine differentielle Wanderungsgeschwindigkeit für jede
Komponente bewirken ; auf diese Weise wird Mischung im Idealfall in separate Banden reiner Substanzen aufgetrennt. Dies ein
kontinuierlicher Prozess, der ständig wiederholt werden musst, jedoch hoher Reinigungseffekt erzielt.

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Verschiedene chromatographische Methoden:

1. Gas-Flüssigkeits-Chromatographie (mobile Ph. =gasförmig, stationäre Ph. = flüssig)

2. Flüssigkeits-Flüssigkeits-Chromatographie ( nichtmischbare Flssg. eine davon inert an Fest platte gebunden.)
3. Ionenaustauschchromatographie (WW zwisch. stationärer Ph. und zu trennende Substanz)
4. Adsorptionschormatographie (Retardation durch Adsorption der gelösten Substanzen an die stationäre Ph.

A ) Ionenaustauschchromatographie
Hier werden Ionen, die elektrostatisch an eine unlösliche und chemisch inerte Matrix gebunden sind, reversibel durch Ionen
des Lösungsmittels verdrängt

R+ A- + B-  R+ B- +A-

R+ =Anionenaustauscher, der A- bindet, B- sind Anionen in der Lösung. Kationenaustauscher tragen entsprechend negativ
geladene Gruppen, die reversible Kationen binden.
Prot. (Polyelektrolyte d.h. pos. und neg. Ladungen tragend) können sowohl an Kationen- als auch Anionenaustauscher
binden. Affinität (Bindungsstärke) ist von Eigenschaften und Konzentrationen der übrigen Ionen, mit denen er um die
Bindungsstellen des Ionenaustauschers konkurriert abhängig. Bindungsaffinität von Polyelektrolyten ist stark pH-abhängig,
denn Nettoladung variiert mit pH-Wert.
PH-Wert, Salzconc. und Ionenaustauscher i.a. so wählen, dass das zu isolierende Prot. an den Ionenaustauscher bindet.
Gesuchtes Prot. vom Ionenaustauscher mit einer Pufferlösung eluieren ( ihr pH-Wert und Salzconc. setzt Affinität des Prot.
für Ioneneaustauscher herab.) Eine sogenannte Batch method (Schubweise). Am besten wird Ionenaust. in eine Säule
gepackt. (siehe Abb. 5-6, s. 80). Prot. binden an Ionenaust. mit unterschiedlichen Affinitäten. Wird Säule nun eluiert,
bewegen sich Prot. mit geringer Affinität zum Ionenaust. schneller durch die Säule als Prot. mit höherer Affinität, d.h. Je
größer Bindungsaffinität eines Prot. um so geringer seine Wanderungsgeschwindigkeit.

Gradienten-Elution verbessert die chromatographische Trennleistung : Dabei wird Salzconc. oder pH-Wert während der
Säulen-Elution kontinuierlich variiert, s.d. eine sequentielle Ablösung der an den Ionenaust. gebundenen Prot. entsprechend
der Reihenfolge ihrer Affinität stattfindet. z.B. Linearer Gradient, bei dem sich Salzconc. linear mit dem applizierten
Volumen des Elutionsmittels ändert. (siehe Abb. 5-7, s.81)

Typen von Ionenaustauscher : bestehen aus geladenen Gruppen, die kovalent an eine feste Matrix gebunden sind.

1. Harze
2. Cellulose (am häufigsten verwendet)
3. Polyacrylamid –oder Polydextran-Gele

(siehe Abb. 5-8, s.81 und Tab. 5-2, s. 82)

Häufigste Anionenaustauscher auf Cellulose-Basis ist Diethylaminoethyl (DEAE)-Cellulose, während Caroxymethyl –

(CM)-Cellulose der häufigst benutzte Kationenaustauscher ist.

Vorteil gegenüber Harz : größere Permeabilität für makromolekulare Elektrolyte und relativ geringe Dichte der geladenen
Gruppen, was Eluierung großer Polyelektrolyte unter milden Bedingungen zulässt.
Nachteil : Beladungskapazität beschränkt.
Vorteile von Ionenaustauschergele gegenüber Cellulose –Ionenaustauscher : poröse Struktur erlaubt einen hohen
Substitutionsgrad, s.d. sie größere Beladungskapazität besitzen.

B ) Papierchromatographie

leicht anwendbare Analysetechnik mit einfacher Ausstattung (oft verwendet bei Trennung von Aminosäuren)
Wenige Tropfen einer Lösung, die die zu trennende Substanzen enthält, auf unteren Rand eines Filterpapier als Fleck
(Startpunkt) aufgetragen. Anschließend Papierende in Lösungsmittelgemisch getaucht. (wässrige und organische
Komponente). Lösungsmittel wird durch Kapillarkräfte vom Papier aufgesogen. Der Lösungsmittelfluss kann aufwärts oder
abwärts gerichtet sein. (siehe Abb. 5-9, s.83).
Wässrige Komponente und Cellulose sind hier gelartige stationäre Phase, organische Komp. wandert und bildet somit
mobile Phase. Wanderungsgeschwindigkeit ist bestimmt durch rel. Löslichkeit der zu trennende Substanz in der polaren
stationären Phase und der unpolaren mobilen Phase.
Verteilung eines gelösten Stoffes zwischen mobiler und stationärer Phs. wird durch Verteilungskoeffizient Kp ausgedrückt.

[stationäre Phs.] = conc.

Kp = -------------------------
[mobil. Phs. ] = conc.

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 Moleküle werden deshalb gemäss ihrer Polarität getrennt, wobei unpolare Moleküle schneller wandern als polare.
Chromatogramm anschließend getrocknen. Sind Substanzen farblos (z.B. Pigmente) können sie folgendermaßen
nachgewiesen werden :

1. Radioaktiv markieren und durch Autoradiographie oder Radiodetektionsmethoden lokalisieren

2. Fluoreszieren und im UV-Licht sichtbar machen
3. Chromatogramm mit Reagenzlösungen besprühen, die mit gesuchten Substanzen gefärbte Produkte bilden. (z.B
reagieren -AS mit Ninhydrid unter Bildung einer intensiv violett gefärbten Verbindung (Abb.5-10 und OC-
Buch, Kapitel Aminosäuren)

Wanderungsgeschwindigkeit wird mit Rf ausgedrückt :

zurückgelegte Entfernung der Substanz

Rf= ----------------------------------------------------
zurückgelegte Entfernung der Lösungsmittelfront

Zweidimensionale Papier-Chromatographie (s.Abb. 5-11, s. 84 und Praktikum AC): nach dem normalen obenbeschriebenen Verlauf
wird Chromatogramm um 90° gedreht und in einem zweiten Lösungsmittelsystem wiederholt.

C) Gelfiltrations-Chromatographie (Ausschluss-Chromatographie, Molekularsieb-Chrom.)

Moleküle werden nach ihrer Größe und Form getrennt.

Stationäre Phase  Kügelchen eines gelartigen hydratisierten Materials mit konstanter molekularen Porenweite. Wenn wässrige
Lösung, die Moleküle verschiedener Größe enthält, durch eine derartige Säule mit „Molekularsieben“ sickert, werden Moleküle,
deren Größe die Porenweite überschreitet, vom Lösungsvolumen in den Gelkügelchen ausgeschlossen. Größere Moleküle
durchwandern Säule deshalb schneller, d.h. mit geringerem Elutionsvolumen als kleinere Moleküle, die in die Poren dringen und
dadurch zurückgehalten werden (siehe Abb. 5-12, s.85)

Ausschlussgrenze = Grenze der molaren Masse des kleinsten Molekül , das gerade nicht mehr die Poren des Gels durchdringen kann.
Sphärische Moleküle durchdringen solche Poren besser als gestreckte Moleküle.

Verhalten eines Moleküls in einer Gelsäule:

Vt = Vx+Vo

Vx = Volumen der Gelperlen

Vo = Durchbruchsvolumen („void volume“), d.h. Volumen des umgebenden Lösungsmittel
Vt = gesamte Säulenbettvolumen

(Vo ca. 35% von Vt)

Ve = Elutionsvolumen, d.h. ist erforderliche Volumen zur Elution einer aufgetragenen Substanz von der Säule.

Moleküle, deren molare Massen unterhalb der Ausschlussgrenze des Gels liegen, werden mit abnehmender Molekülgröße vom Gel
eluiert, d.h. die größten Moleküle erscheinen zuerst. Durch Variation der Porengröße eines Gels innerhalb enger Grenzen steht
größeren Molekülen weniger von dem inneren Volumen des Gels zur Verfügung als den kleineren. Sie erlaubt die Abschätzung
molarer Massen. Es besteht eine lineare Beziehung zwischen dem relativen Elutionsvolumen V e einer Substanz und dem Logarithmus
seiner molaren Masse ( siehe Abb. 5-13, s. 86)

Geltypen: (siehe Tab. 5-3, s.86)

1. Dextran ein hochmolekulares Glucose-Polymer

2. Agarose lineares Polymer
3. Polyacrylamid

Dextran und Polyacrylamidgele können mit ionisierbaren Gruppen wie DEAE und CM (siehe oben) derivatisiert werden und damit
als Ionenaustauschergele eingesetzt werden (Abschn. 5-A)

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Dialyse : ist ein Trennverfahren (keine Chromatographie), das mittels semipermeabler Membranen Moleküle gemäss ihrer Grösse
trennt; die Größe der Membranporen liegt dabei unterhalb makromolekularer Abmessungen. (siehe Abb. 5-14,s.87)

Ultrafiltration ebenfalls zur Konzentrierung makromolekularer Lösungen angewandte Technik. Hier wird diese Lösung unter Druck
durch einen semipermeablen, membranartigen Filter gepresst. Lösungsmittel und kleiner Substanzen passieren Membran und es bleib
eine konzentrierte Lösung zurück.

D) Affinitäts-Chromatographie

Auf dem Prinzip, dass viele Prot. Fähigkeit haben, feste, nicht-kovalente und reversible Bindungen mit anderen Molekülen
einzugehen, beruht diese Technik zur Reinigung biologisch aktiver Prot. (siehe Abb. 5-15, s.88)

Hier wird ein sog. Ligand – ein Molekül, das von dem gewünschten Prot spezifisch gebunden wird- kovalent an eine inerte und
poröse Matrix (Affinitätsgel) gebunden.
Wird eine ungereinigte Proteinlösung über das Affintätsgel geschickt, bindet an das gewünschte Protein an den fixierten Ligand,
wogegen andere Substanzen mit dem Puffer von der Säule eluiert werden. Gesuchte Prot. kann nun in angereicherter, oft
hochgereinigter Form isoliert werden.

Vorteil : Möglichkeit besteht, spezifische biochemische Eigenschaften des jeweiligen Proteins auszunutzen. (nicht physikalisch-
chemische Eigenschaft.)
Vorraussetzung: Matrix muss chemisch inert und porös sein, über viele funktionelle Gruppen verfügen, die den Ligand kovalent
binden können. (Agarose erfüllt Kriterien sehr gut, viele freie Hydroxygruppen)

1. Agarose wird durch Reaktion mit Bromcyan „aktiviert“ , stabiles Zwischenprodukt

2. Ligand reagiert mit der aktivierten Agarose unter Ausbildung einer kovalenten Bindung.

Prot. können wegen sterischer Behinderung keine Liganden binden, die über BrCN an die Matrix gebunden sind. Lösung des
Problems Ligand über flexiblen „Arm“ (engl. spacer) an die Agarose verknüpfen. (Abb. 5-17,s.89)

Zur Elution der an der Affinitätsmatrix gebundenen Prot. können verschieden Elutionsmittel eingesetzt werden.
1. Freie Liganden oder Substanzen, die eine höhere Affinität für die Proteinbindungsstelle besitzen als der immobilisierte
Ligand.
2. Veränderung der Eigenschaften der mobilen Phase, z.B. durch Veränderung des pH-Werts, der Ionenstärke oder der Temp. so
dass Protein-Ligand-Komplex instabil und dissoziert wird. Achtung Vorsicht , sonst denaturiert Prot.

Affinitäts-Chromatographie wird verwendet um Enzyme, Antikörper, Transportproteine, Hormonrezeptoren und Membranen, ja ganze
Zellen zu isolieren. Hohe Trennleistung.

Weitere Affinitätschromatographietypen:

1. Immunaffinitäts-Chr.  basiert auf der Antikörper-Spezifität. Kopplung monoklonaler AK an ein geeignetes

Säulenmaterial liefert ein Affinitätsgel, das ausschließlich das zur Immunisierung verwendete Protein bindet. Vorteil, sehr
hohe Reinigungseffekt, Nachteil zu kompliziert und aufwendig
2. Adsorbtions-Chr.  trennt unpolare Substanzen, basiert auf der Verteilung der verschiedenen Substanzen zwischen dem
polaren Säulenmaterial und dem unpolaren Lösungsmittel. Moleküle werden physikalisch an die Oberfläche unlöslicher
Substanzen gebunden (z.B. Aluminiumoxid, Aktivkohle, Diatomeen-Erde (Kieselgur) od. Silicalgel. Bindung erfolgt über
Van der Waalskräfte und Wasserstoffbrücken.
3. Hydroxyapatit-Chr.  Prot. werden von der kristallinen Hydroxyapatit-Matrix adsorbiert.
4. DC  (siehe Praktikum AC). Vorteil : bequeme Handhabung, Schnelligkeit und hohe Auflösung, routinemäßige Analyse
möglich (ähnlich wie Papier-Chr.)
5. Reverse-Phase-Chr.  trennt unpolare Substanzen. (Flüssigkeits-Flüssigkeits-Verteilungs-Chromatogr.) Polarität der
beiden Phasen genau umgekehrt wie bei DC: Stationäre Phs : unpolare Flüssigkeit, die als Film auf Festplatte immoblisiert
wird. Mobile Phs : polare Flüssigkeit.

6. Hochdruckflüssigkeits-Chr. Mobile Phase mit Drücken bis zu 400 bar durch die dicht gepackte Säule gepresst 
Verkürzte Analysezeiten

Vorteile : Hohe Auflösung, routinemäßiges reinigen möglich, kurze Zeiten, hohe Empfindlichkeit, die quantitative Aussagen über die
Substanzmassen im subpicomolaren Bereich erlauben, Automatisierung möglich.

Nachteile : geringe Beladungskapazität d.h. schränkt Reinigungen ein, teuer.

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 7. Gas-Flüssigkeits-Chr. Stationäre Phs: inerter Feststoff z.B. Kieselgur in einer schmalen Säule gepackt, die bei 200°C
betrieben wird (Temp. variierbar). Mobile Phs : inerter Gasstrom (Ar,He,N2). Probe muss rasch verdampft werden.
Wanderungsgeschwindigkeit einer Verbindung ist durch ihre differentielle Löslichkeit in der mobilen bzw. stationären Phs.
bestimmt. Nachweis: Einzelnen Komponenten der Probe werden im austretenden Gasstrom aufgrund physikalischer
Parameter ( thermische Leitfähigkeit, Ionisierbarkeit) nachgewiesen. Oder aber durch direkte Kopplung an ein
Massenspektrometer.
Vor. : Substanzen müssen flüchtig und hitzestabil sein (beschränkt den Einsatz auf Verbindungen mit relativ niedriger
molarhehr Masse. Lösung Derivatvisierung, so können Substanzen in flüchtige Verb. überführt werden.
8. Hydrophobe Wechselwirkungs-Chor. (HIC)
Proteine können unter geeigneter Bedingungen mit unpolaren Gruppen einer immobilvisierten Matrix hydrophob
wechselwirkend. Auch Reverse-Phase-Chr. basiert auf diesem Prinzip (siehe oben). Vorteil gegenüber Reverse-Chr. ist, dass
der HIC relativ schwache hydrophobe Kräfte zugrundeliegen, d.h. Proteine bleiben in der Struktur erhalten, bei RPC können
sie u.U. denaturieren. Mit Hilfe von wässrigen Puffern mit abnehmender Salzkonzentration können Elutionsmittel und
Gradient diese schwachen hydrophoben Kräfte reduzieren. (hydrophobe WW nehmen mit wachsender Ionenstärke zu)

4. Elektrophorese

Bedeutet : Wanderung eines Ions in einem elektrischen Feld. Es gilt nach Gesetzt der Elektrostatik:

Felektr. = qE

Es resultiert eine Bewegung, ist einer Reibungskraft entgegengerichtet:

Freib. = vƒ

Hierbei sind v = Wanderungsgeschwindigkeit, f = Reibungskoeffizient, er ist Mass für den Widerstand, den eine Lösung dem
wandernden Ion entgegensetzt und abhängig von Grösse, form und Solvatisierungsgrad des Ions aber auch von Viskosität der
Lösung.
Ist das elektr. Feld konstant sog gilt:  Jedes Ion bewegt sich nun mit einer konstanten und charakteristischen
Geschwindigkeit, die sog. elektrophoretische Beweglichkeit , wobei gilt:

 = (v/E) =(q/f) (siehe Tab. 2-2, s.34).

Verschiedene Elektrophorese –Typen (EP):

1.EP mit beweglicher Front (moving boundary electrophoresis)

Proteinlösung in U-förmigem Rohr. An beiden Enden eine proteinfreie Pufferlösung aufschichten. 2 Elektroden in diese Pufferlösung
eintauchen. Anlegen eines elektr. Feldes  Wanderung der geladenen Moleküle zur Elektrode mit entgegengesetzter Polarität. (Abb.
5-19, s.93) Verschiedene Proteine wandern aufgrund ihrer unterschiedlichen Ladungen, Reibungskoeffizienten und
Geschwindigkeiten, s.d. die Grenzflächen jeder Proteinzone bewegliche „Fronten“ in der Pufferlösung bilden (moving boundray)

2. Zonen-EP

Wanderung der Probe in einem festen Medium, wie z.B. Filterpapier, Cellulose oder Gel. Konvektive Mischung der Probe wird somit
verhindert und somit Auflösung verbessert.

3. Papier -EP

Probe auf einen mit Pufferlösung befeuchteten streifen aus Filterpapier oder Cellulose-Acetat auftragen. Die beiden Enden des
Papierstreifens in getrennte Pufferreservoirs, in denen Elektroden sind. (Abb. 5-20, s. 93). Ein Gleichstrom wird erzeugt : Wanderung
der Ionen zur Elektrode entgegengesetzter Polarität mit charakterist. Geschwindigkeiten. Es bilden sich Banden oder Flecken.
Wanderungsgeschwindigkeit des Ions wird durch WW mit seinem Trägermaterial bestimmt. Nachweis mit Papier-Chromatographie.

Unterschied zur Papierchr. Papier –EP trennt Ionen nach ihrer Ladung, die Papier-Chr. trennt Moleküle nach ihrer Polarität.
Kombination der beiden Methoden = Fingerprinting

4. Gel -EP

Sehr effektive Trennmethode, welche nach Molekülgröße und nach elektrophoretischer Beweglichkeit erfolgt. Bewirkt einen
netzartigen Siebeffekt, die die Wanderung größerer Moleküle stärker behindert als die kleineren Moleküle. Gele meistens aus
Acrylamid oder Agarose

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Bei der Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) wird Gel in einer radikalischen Polymerisation aus Acrylamid und N, N’-
Methylenbisacrlyamid hergestellt. (Abb.5-21, s.94).
Trennmethode: 10cm langes Rohr, in der Gel polymerisiert wird, vertikal zwischen ein oberes und unteres Pufferreservoir setzten.
(Abb. 5-22, s.95). Jede Probe, die nur 10g des makromolekularen Materials zu enthalten braucht, ist in einem minimalen Volumen
einer relativ dichten Glycerin-oder Saccharose –Lösung aufgelöst. Vermischung mit Reservoirpuffers wird minimiert. Probe wird auf
der kathodischen (oberen) Seite des Gels aufgetragen ( Abb. 5-23, s.95). Gleichstrom wird angelegt. Auftrennung der Komponenten
in diskrete Banden, die nachher mit geeigneter Methode sichtbar gemacht werden.

5. Disc-EP (diskontinuierliche pH-EP)

Liefert verbesserte Auflösung, d.h. schärfere Banden sichtbar. Erfordert 2 Gelsysteme und mehrere Puffer. ( Abb. 5-24, s.95).
Wanderung der Ionen als Stapel schmaler Banden oder Scheibchen (discs) entsprechend ihrer elektrophoretischen Beweglichkeit auf
das Trenngel zu.
Die so entstehenden Gelbanden können durch Anfärben oder Radioaktivitätsmessungen nachgewiesen werden auch mit Hilfe von
UV- Spektroskopie. Andere Methode ist Photographie der Banden (Abb. 5-25, s.96). Geeignete Färbermaterialien:
1. Coomasie Brilliant Blue (saure alkoholische Farbstofflösung)
2. Silberfärbung (kleine Proteinmenge, empfindlicher)
3. Fluorescamin

6. SDS-PAGE: ( Natriumdodecylsulfat =SDS)

Natriumdodecylsulfat ist ein Detergens, das amphiatisch ist und fest an Proteine bindet und sie in eine stabähnliche Form zwingt. EP
von Proteinen in einem SDS-haltigen Gel trennt Moleküle aufgrund der Siebeffekte in der Reihenfolge ihrer molaren Massen. (Abb.
5-26, s.97) Hohe Auflösung und Reproduzierbarkeit. Molare Masse somit bis 5-10%-iger Genauigkeit bestimmbar. Mobilitäten der
Proteine im SDS-Gel sind linear mit dem Logarithmus ihrer molaren Massen korreliert. ( Abb. 5-27, s.98)

7. Isoelektrische Fokkussierung

Protein trägt geladene Gruppen beider Polaritäten  besitzt somit pI (isoelektrischer Punkt) bei welchem es in einem elektr. Feld
nicht mehr wandert. Führt man jetzt mit Proteingemisch eine EP in einer Lösung durch, die einen stabilen pH-Gradienten von der
Anode zur Kathode aufweist, wird jedes Protein zur Position im pH-Gradienten wandern, die seinem pI entspricht.
Kann mit SDS-PAGE kombiniert werden was eine hohe Trennleistung erzielt.

8. Kapillar –EP (CE)

Da eine Gel –EP bis zu mehreren Stunden dauern kann und schwer zu automatisieren ist, eignet sich Kapillar –EP besser. Dünne
Kapillaren (Röhrchen) verteilen Wärme rasch und man kann somit mit hohen Feldstärken arbeiten. (10 mal soviel). Trennzeiten nur
einige Minuten und sehr deutliche Trennbanden.

5.Ultrazentrifugation

Behälter mit Sand und Wasser, der geschüttelt wird lässt eine Sedimentation von Sand am Grund des Behälter zurück. (Schwerkraft).
Makromoleküle in Lösung, die demselben Gravitationsfeld ausgesetzt sind, zeigen jedoch keine Sedimentation. (Brown’sche
Bewegung verteilt sie gleichmäßig). Nur wenn sie sehr großen Beschleunigungen ausgesetzt werden, beginnt das
Sedimentationsverhalten von Makromolekülen.

A ) Sedimentation

Fsed = m 2 r-Vp  2 r
Sedimentationsgeschwindigkeit eines Partikels in der Ultrazentrifuge ist von seiner Masse abhängig. Die Sedimentationskraft die auf
den Partikel der Masse m wirkt, das sich mit der Winkelgeschwindigkeit  im Abstand r um das Rotationszentrum bewegt, ist die
Differenz aus Zentrifugalkraft ( m 2 r), die auf das Partikel wirkt, und der Auftriebskraft (Vp  2 r), die von der Lösung ausgeübt
wird. ( Vp = Teilchenvolumen und  = Dichte der Lösung).
Auch hier (wie bei EP) wirkt der Bewegung der Teilchen eine Reibungskraft entgegen :

Freib = v ƒ

Unter dem Einfluss der Gravitations- –(Zentrifugal)Kraft wird das Partikel solange beschleunigt, bis sich die auf ihn wirkende Kräfte
im Gleichgewicht sind.

m = (M/N) und Vp = Vm = ((VM)/N)

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V ist das partielle spezifische Volumen des Partikels d.h. Volumenänderung, die eintritt, wenn 1g des Materials in einem unendlich
grossen Volumen des Lösungsmittels aufgelöst wird. (siehe Tab. 5-5). Ein Partikel kann durch seine Sedimentationsgeschwindigkeit
charakterisiert werden.

Es ergibt sich aus obigen Gleichungen durch Substitution folgendes:

M (1-V ) 2 r
v ƒ = ------------------------
N

Daraus folgt ein Sedimentationskoeffizient s (siehe Formel, s. 100 unten). Er ist eine Größe, die der elektrophoretischen
Beweglichkeit änlich ist, da es sich hierbei auch um eine Geschwindigkeit pro Krafteinheit handelt. Masse m des Partikels kann somit
durch Messung seines Sedimentationskoeffizienten berechnet werden. (Abb. 5-30, s. 101)
Makromolekulare Massenbestimmung erfolgen mit des sogenannten analytischen Zentrifugation

B ) Präparative Ultrazentrifugation

Präparative Ultrazentrifugen dienen der Probenaufbereitung, haben jedoch keine Detektionsgeräte. Präparative Rotoren enthalten
parallel angeordnete zylindrische Proberöhrchen, die je nach dem in einem Winkel oder senkrecht zur Rotationsachse ausgerichtet
sind ( Abh. 5-31, s. 102). Dichtegradienten erhöhen die Auflösung der Ultrazentrifugation ganz erheblich. Von Letzteren gibt es zwei
verschieden:

1. zonale Ultrazentrifugation (siehe Abb. 5-32, s. 102), trennt Partikel nach ihren Sedimentationskoeffizienten

Lösung von Makromolekülen vorsichtig auf die Oberfläche eines Dichtegradienten bringen (siehe Bild), welcher mit die in Abb 5-7
gezeigten Anordnung hergestellt werden kann. Der Dichtegradient ermöglicht „glatte“ Wanderung der verschiedenen
makromolekularen Zonen und schliesst Durchmischung der Lösung durch Konvektion aus. ( oft Saccharose als D.Gradient). Es wird
gezeigt, dass Sedimentationsgeschwindigkeit eines Makromoleküls stärker von der Molekülgrösse als von der Dichte abhängt. Daraus
folgt, dass die zonale Ultrazentrifugation Makromoleküle auf der Basis ihrer molaren Massen trennt.
Abb. 5-32, s.102 zeigt, dass jedes molekulare Teilchen während der Zentrifugation mit einer spezifischen Geschwindigkeit durch
Gradienten wandert und dass es so auf diese Weise zur Ausbildung getrennter Zonen kommt. Durch Fraktion der einzelnen Zonen
werden sie zur weiteren Analyse getrennt gesammelt.

2. Gleichgewichtszentrifugation (Isopyknische Ultrazentrifugation) im Dichtegradienten, trennt Partikel nach ihrer Dichte

Hier wird Probe in einer konzentrierten Lösung, schnell diffundierenden Substanz, wie CsCl oder Cs2SO4 aufgelöst und bei hoher
Geschwindigkeit zentrifugiert, bis Lösung im Gleichgewicht ist. Unter der Wirkung des starken Zentrifugalfeldes bildet die gelöste
niedermolekulare Substanz einen steilen Dichtegradienten aus (Abb. 5-33), wobei die Komponenten der Probe an die Position
wandern, wo ihre Dichte der der Lösung entspricht. Salzkonzentration und somit Dicht der Lösung kann mit Hilfe von Abbé-
Refraktometer (optisches Instrument) gemessen werden. Dichtegradienten-Zentrifugation ist häufig die Methode der Wahl zur
Trennung von komplexen Gemischen, deren Einzelkomponenten unterschiedliche Dichten besitzen (z.B. Nucleinsäuren, Viren und
subzelluläre Organellen)

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