Los metodos

Disponible en línea el 10 de mayo de 2019.

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CRISPR / Cas9 como herramienta para analizar las mutaciones del cáncer

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https://doi.org/10.1016/j.ymeth.2019.05.007

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Resumen

El sistema CRISPR / Cas9 está transformando muchas disciplinas biomédicas, incluida la investigación del
cáncer. A través de su flexibilidad de programación y eficiencia para inducir roturas de doble cadena de
ADN, se ha vuelto sencillo introducir mutaciones de cáncer en células in vitro y / o in vivo.. Sin embargo,
no todas las mutaciones contribuyen por igual a la tumorigénesis y distinguir las mutaciones esenciales
para el crecimiento y supervivencia del tumor de las mutaciones biológicamente inertes es engorroso.
Aquí presentamos un método para detectar la relevancia funcional de las mutaciones en el alto
rendimiento en líneas celulares de cáncer establecidas. Empleamos el sistema CRISPR / Cas9 para
investigar las vulnerabilidades del cáncer en una línea celular de carcinoma colorrectal en un intento por
identificar nuevas mutaciones de conductores de cáncer. Diseñamos 100 sgRNA de alta calidad que son
capaces de escindir específicamente las mutaciones presentes en la línea celular de carcinoma
colorrectal RKO. Luego, se generó una biblioteca lentiviral todo en uno que alberga estos sgRNAs y se usó
en una pantalla agrupada para sondear las posibles dependencias de crecimiento de estas mutaciones.
ADN genómico en diferentes puntos de tiempo fueron recolectados, los cassettes sgRNA fueron
amplificados por PCR, Los conteos de sgRNA purificados y se cuantificaron mediante secuenciación
profunda. El análisis reveló que dos sgRNAs dirigidos a la misma mutación (UTP14A: S99delS) se
agotaron con el tiempo en las células RKO. La validación y la caracterización confirmaron que la
inactivación de esta mutación altera el crecimiento celular, nominando a UTP14A: S99delS como una
supuesta mutación impulsora en células RKO. En general, nuestro enfoque demuestra que el sistema
CRISPR / Cas9 es una herramienta poderosa para diseccionar funcionalmente las mutaciones del cáncer
a gran escala. S99delS como una supuesta mutación de controlador en células RKO. En general, nuestro
enfoque demuestra que el sistema CRISPR / Cas9 es una herramienta poderosa para diseccionar
funcionalmente las mutaciones del cáncer a gran escala. S99delS como una supuesta mutación de
controlador en células RKO. En general, nuestro enfoque demuestra que el sistema CRISPR / Cas9 es una
herramienta poderosa para diseccionar funcionalmente las mutaciones del cáncer a gran escala.

Palabras clave

Edición del genomaCáncerMutaciones del conductorMutaciones de pasajerosCRISPR / Cas9

1 . Introducción

El cáncer es una enfermedad genética, como resultado de la acumulación progresiva de mutaciones

capaces de impulsar la transformación celular [1] . Un tumor dado, según su tipo, suele albergar de
cientos a miles de mutaciones. La mayoría de estas mutaciones son una consecuencia colateral de la
inestabilidad genética y no contribuyen a la malignidad. Por lo tanto, se clasifican como mutaciones de
pasajeros [2] . En contraste, las mutaciones del conductor propulsan la transformación de las células y
hasta ahora se han identificado en gran medida debido a sus recurrencias en diferentes muestras de
tumores [3]. Sin embargo, sigue siendo difícil nominar todas las mutaciones que confieren una ventaja
de crecimiento selectivo en una célula cancerosa determinada. Por lo tanto, identificar qué mutaciones
somáticas son conductores y cuáles pasajeros es uno de los obstáculos fundamentales en la investigación
básica del cáncer con un gran potencial para mejorar los diagnósticos y la terapéutica en el futuro [4] .

La rápida aparición del sistema de repeticiones palindrómicas cortas (CRISPR) / Cas9 agrupadas en
intervalos regulares interpoladas como herramienta de edición del genoma ha revolucionado los
estudios del genoma humano [5] , [6] , [7] , [8] . Originalmente descubierto como un sistema de defensa
guiado por ARN procariótico, el sistema CRISPR / Cas9 se ha rediseñado para la edición del genoma
eucariótico [9] , [10] , [11] ). Mecánicamente, el sistema consiste en una molécula de ARN que guía a la
nucleasa Cas9 a través de la complementariedad de la secuencia para inducir una ruptura del dsDNA
(DSB) en un sitio específico; tres pares de bases aguas arriba de una secuencia de motivo adyacente
(PAM) protoespaciador NGG [12] , [13]. Como resultado, se pueden estimular dos tipos principales de
vías de reparación de ADN dentro de una célula huésped, a saber, la unión final no homóloga (NHEJ),
que generalmente crea pequeñas inserciones o deleciones (indels) en el sitio de corte, lo que conduce a
la interrupción de la secuencia de codificación. ; y una reacción de reparación dirigida por homología
(HDR) más conservadora aunque menos frecuente, que comprende el reemplazo genético que incorpora
secuencias de ADN de donante exógenas en el sitio de corte, o el uso de la cromátida hermana como
una plantilla que permite la corrección de elementos disfuncionales [14]. El aprovechamiento de estas
dos vías endógenas hacia la ingeniería genética ha llevado a una gran cantidad de aplicaciones para el
sistema CRISPR-Cas9 donde se explota el HDR para insertar secuencias de ADN exógenas en el genoma,
como marcadores y secuencias correctivas, sin embargo, este enfoque a menudo se ve obstaculizado por
eficiencia de HDR [15] , [16] . Otra estrategia de aplicación popular de la tecnología CRISPR / Cas9
comprende los estudios de Pérdida de función con reparación de NHEJ indeleible con un espectro de
deleción típico de 1–10 pares de bases que conduce a mutaciones de desplazamiento de marco para
inducir la inactivación de genes [17] , [18]. Dada la simplicidad y la gran versatilidad del sistema,
numerosos laboratorios han adoptado la vía mediada por NHEJ para seleccionar genes esenciales donde
todos los sgRNAs que comprenden una biblioteca se sintetizan, clonan y suministran a una población de
células agrupadas. Posteriormente, las células editadas con el cambio fenotípico seleccionado se pueden
separar de toda la población agrupada mediante una selección positiva o negativa. En consecuencia, se
han generado varias bibliotecas a escala genómica para pantallas CRISPR agrupadas que permiten
estudios de alto rendimiento y / o multi loci [19] , [20] , [21] . En general, la mayoría de pantallas de
CRISPR agrupados se han centrado en la inactivación de genes para in vitro y in vivo aplicaciones[22] ,
[23] , [24] , [25] , [26] , [27] , [28] , [29] , [30] , [31] , [32] , [33] , [34 ] , [35] .

Los avances recientes en las tecnologías de secuenciación del genoma proporcionan los medios para
identificar todas las mutaciones presentes en las células tumorales. A veces, esta información puede
ayudar a predecir el mejor régimen de tratamiento para un paciente. Sin embargo, en muchos casos, las
mutaciones más importantes del controlador no son obvias, lo que hace que las decisiones sobre la
mejor opción de tratamiento no sean efectivas. Tener un sistema que pueda probar funcionalmente la
relevancia de mutaciones particulares para el crecimiento y la viabilidad de las células cancerosas sería,
por lo tanto, un avance importante en el campo. En este estudio, nuestro objetivo es identificar nuevas
mutaciones que impulsan el cáncer en líneas celulares de cáncer establecidas ( Fig. 1). Usamos la base de
datos de mutaciones más grande hasta la fecha, el catálogo de mutaciones somáticas en el cáncer
(COSMIC) para exportar datos mutacionales para líneas celulares de cáncer humano, seguido del diseño
de la biblioteca de sgRNA para detectar mutaciones en la línea celular de carcinoma colorrectal RKO.

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Figura 1 . Presentación gráfica de la tubería de la pantalla. Los pasos importantes están indicados por
flechas.

2 . Los metodos

2.1 . Extraer mutaciones en una línea celular de la base de datos COSMIC

La base de datos COSMIC (http://www.sanger.ac.uk/cosmic/) contiene información completa, curada,

sobre mutaciones somáticas en el cáncer humano. El proyecto de líneas celulares COSMIC proporciona
datos mutacionales de la secuenciación completa del exoma de más de 1,000 líneas celulares utilizadas
en la investigación del cáncer. Usamos la versión v80 (desde el 13 de febrero de 2017) disponible
públicamente desde el sitio FTP de COSMIC (ftp://ftp.sanger.ac.uk/pub/CGP/cosmic/) para nuestros
análisis. Para cada línea celular, los archivos descargables incluyen datos completos de mutación con
coordenadas genómicas, variantes no codificantes y datos de expresión génica.

3 . Diseño de sgRNAs

Usando un conjunto de mutaciones somáticas reportadas por la base de datos COSMIC en células RKO,
extrajimos secuencias genómicas empleando bedtools ver. 2.17.0 utilizando hg19 como conjunto de
genoma de referencia con cada sitio de mutación flanqueado por 30 pb en ambos lados. Luego, las
secuencias se modificaron para contener las secuencias mutadas y se buscaron posibles sitios objetivo
de Cas9 utilizando el algoritmo Azimuth 2.0 implementado por Doench et al . [36]

[37] . Todos los sgRNAs con una coincidencia perfecta en el genoma hg19 de tipo salvaje se descartaron
de pasos de análisis adicionales. Se realizó una búsqueda fuera del objetivo para sgRNAs largos de 20 pb
obtenidos utilizando un alineador de secuencia corta exhaustivo GEM ver. 1.376 [38], con los parámetros
configurados para informar todas las alineaciones con hasta 4 desajustes. Cabe destacar que los
complejos Cas9-sgRNA pueden tolerar de 1 a 5 pares de bases no coincidentes entre el sgRNA y la
secuencia objetivo, lo que depende en gran medida de la posición de la falta de coincidencia y la
complejidad de la secuencia. Por lo tanto, aplicamos criterios más estrictos para maximizar la división en
el objetivo y reducir el potencial fuera del objetivo. Esto se hizo filtrando cualquier sgRNA con hasta 2
desajustes con el genoma de referencia, especialmente aquellos que residen fuera de la región de la
semilla. Además, excluyendo los sgRNAs con tramos de al menos 4 nt de la misma identidad, así como
también limitando el contenido de% GC en el protospacer 20nt a 20% -80%.

4 . Pantalla de la biblioteca

Nuestra biblioteca de sgRNA consistió en 100 sgRNAs, además de 5 sgRNAs dirigidos al protooncogén
MYC, una subunidad de polimerasa y proteínas ribosómicas esenciales como controles positivos, así
como 5 sgRNAs dirigidos a LUC y LacZ como controles negativos no dirigidos. Transducción de líneas
celulares a baja multiplicidad de infección (MOI = 0,3) para garantizar que la mayoría de las células
reciban una copia del complejo Cas9-sgRNA que se dirige a la secuencia mutante, junto con GFP como
marcador de transducción. La clasificación de las células positivas para GFP tres días después de la
infección fue seguida por el aislamiento del ADN genómico para el punto de referencia del punto de
referencia. Los sedimentos celulares se recogieron de la población clasificada cada tres días a lo largo del
transcurso de la pantalla. El número de células en cultivo se mantuvo en 1 millón de células para
representar completamente la diversidad de la biblioteca, que excede la cobertura recomendada de
100x (en nuestro caso 10,000x). Al igual que con cualquier transducción, la calidad del ADN plasmídico
es primordial. Recomendamos los kits de plásmidos maxiprep que proporcionan ADN a nivel de
transfección. La cantidad de ADN utilizado para la producción de virus también es un parámetro
importante, ya que una mayor eficiencia de transducción y dosificación generalmente producen un virus
de mejor calidad y una mayor eficiencia de focalización del genoma. Cuando se usa una nueva línea
celular por primera vez, la cantidad de virus necesaria para infectar el 10% -30% de las células debe
determinarse por titulación. ya que una mayor eficiencia de transducción y dosificación generalmente
producen un virus de mejor calidad y una mayor eficiencia de focalización del genoma. Cuando se usa
una nueva línea celular por primera vez, la cantidad de virus necesaria para infectar el 10% -30% de las
células debe determinarse por titulación. ya que una mayor eficiencia de transducción y dosificación
generalmente producen un virus de mejor calidad y una mayor eficiencia de focalización del genoma.
Cuando se usa una nueva línea celular por primera vez, la cantidad de virus necesaria para infectar el
10% -30% de las células debe determinarse por titulación.

5 . Plásmidos

Para la expresión de Cas9 y sgRNAs de vectores lentivirales, optimizamos la secuencia de pL-

CRISPR.EFS.GFP (plásmido de Addgene # 57818, [39] ), donde se modificó la secuencia tracr para
aumentar la estabilidad del sgRNA y mejorar su ensamblaje con la proteína Cas9 [40]. Streptococcus
pyogenes Cas9 y eGFP se unieron a través de P2A y se expresaron a partir del promotor de EFS, mientras
que los sgRNAs se expresaron a partir del promotor U6 pol III humano. Los protoespaciales, ya sean
mutaciones dirigidas, WT UTP14A o no dirigidas, se clonaron en pL-CRISPR.EFS.GFP clonando
oligonucleótidos complementarios en el vector. Si es necesario, se agrega una G adicional en el extremo
5 '. Los oligos (Metabion, Planegg / Steinkirchen, Alemania) se recocieron, se fosforilaron y se ligaron en
pL-CRISPR.EFS.GFP utilizando sitios BsmBI. Las ligaduras se transformaron en E. coli.DH5α y las células se
cultivaron 2 veces durante la noche en 2,0 ml de placas DeepWell (termofisher 278743) a 37ºC con
agitación constante. El ADN plasmídico se purificó individualmente primero utilizando el kit QIAGEN
Plasmid Plus 96 Miniprep (número de catálogo: 960241), luego se agruparon las proporciones
equimolares, se transformaron y se purificaron mediante Maxiprep (Qiagen, 16181) de acuerdo con el
protocolo del fabricante. El ADN se resuspendió a 1 µg / ul y se almacenó a -20 ° C.

Secuencias de tracr utilizadas:

nuevo:

GTTTAAGAGCTATGCTGGAAACAGCATAGCAAGTTTAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCG
AGTCGGTGCTTTTTTTT

Clonación siguiendo el protocolo [41] Recociendo Oligos:

Agua 4,5ul
10x T4 Buffer de ligadura 1ul

50 um de Oligo-Top 2ul

50 um de oligo inferior 2ul

T4 PNK (10U / ul, térmico) 0,5ul

Protocolo Cycler:

37 ° 30min

95 ° 5min

rampa a 25 ° a 0,1 ° C / min

Protocolo de Golden Gate: ∑ 10µl

Agua 4,65ul

10x Buffer de Tango 1ul

ATP (1 mM final, 100 mM Stock) 0,1ul

10mM DTT 0,5ul

pL.CRISPR.EFS.GFP.newtracr (50ng) 1ul

Oligos recocidos (1: 250 diluidos) 2 ul.

BsmBI (Esp3I) (NEB, 10U / ul) 0,5ul

T4 Ligasa (NEB) 0,25ul

Protocolo Cycler:

Ciclo de ejecución: 6x (37 ° C / 5min + 23 ° C / 5min) + 37 ° C / 15min + 80 ° C / 5min

Transformación en bacterias (DH5α, -80 congelador):

- Descongele las células bacterianas en hielo durante ∼10 '

- Añada 2,5 ul de producto de ligadura en 50 ul de solución celular competente (50-100 ng para la

transformación de plásmidos).
- Mezclar moviendo el tubo y mantener los tubos en hielo durante 30 minutos.

- Incubar el tubo a 42 ° C (termomezclador) durante 90 segundos, luego en hielo durante 2 minutos.

- Agregue 950ul LB medio o SOC (sin antibiótico) por tubo

- Incubar los tubos a 37 ° C durante 45 '(termomezclador)

- Placa 250ul en placas de ampicilina O transferir 1 m al matraz con 100 ml de LB-Amp (concentración
final de 50 µg / ml) e incubación ON a 37 ° C, agitador a 200 rpm

6 . Cultivo de células

Las células HeLa, RKO, HCT116 y HEK293T se mantuvieron en DMEM (alto contenido de glucosa,
GlutaMAX TM , piruvato, Gibco, Carlsbad, CA) suplementado con FBS (Gibco) al 10% (v / v) y antibióticos
(100 U / mL de penicilina, 100 µg / mL de estreptomicina, Gibco), en adelante denominada medio
completo. Para todas las líneas celulares utilizadas, se permitió que las células se recuperaran después
de descongelar durante al menos una semana, antes de realizar experimentos. Las líneas celulares
mencionadas anteriormente requieren un tiempo comparable para las duplicaciones de la población y se
pasaron cada 2-3 días (relación de división 1: 8).

Para pases (en matraz estándar T75):

Retirar el medio viejo con una pipeta de vidrio mediante aspiración al vacío.

Enjuague las células con 10 ml de PBS estéril a temperatura ambiente, agregue cuidadosamente a los
lados para evitar el desprendimiento de las células, distribuya las células y luego retírelas por aspiración
al vacío.
Agregue 1 ml al 0,05% de tripsina-EDTA (Life Technologies, 25300-054) directamente a las células y gire
suavemente el matraz para cubrir toda la superficie. Vuelva a colocar el matraz en la incubadora de
cultivo de tejidos durante 3-5 minutos.

Usando un microscopio de luz, verifique brevemente si las células se desprenden de la superficie, golpee
suavemente el lado del matraz si es necesario.

Agregue 9 ml de medio lleno a 37 ° C a las células, pipetee varias veces hasta obtener una solución
homogénea. Recolectar la solución en un tubo de halcón, centrifugar durante 5 minutos a 300 g
(Eppendorf 5810), luego aspirar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en 1 ml de medio
completo.

Para el pasaje, transfiera 125 ul a un nuevo matraz con 10 ml de medio completo, distribúyalo de manera
uniforme y vuelva a colocarlo en la incubadora de cultivo de tejidos.

Transfiera 10 ul de la suspensión celular a un tubo eppendorf, tiñe las células con un colorante azul
tripán (1: 1) y cuente utilizando la condesa. Sembrar en consecuencia para experimentos posteriores.

7 . Producción de virus

Un día antes de la transfección, sembrar células HEK293T según el formato:

Placa de 6 pocillos: 1.2-1.5 millones (en 3 ml de medio completo)

8 . plato cm - 6-7 millones (en 5 ml de medio completo)

Matraz T-175 - 15-20 millones (en medio completo de 20 ml)

Se describe a continuación el protocolo de transfección de una placa de 10 cm para un vector de

transferencia:
El día de la transfección, asegúrese de que las células HEK293T tengan una confluencia de
aproximadamente el 80%

Retire el medio del plato, lave cuidadosamente las células con PBS, aspire PBS.

Prepare la solución plasmídica: Por transfección: Mezcle 10 µg del vector de transferencia con 6 µg de
psPAX2 y 2 µg p.MD2.G en 1 ml de medio en blanco (no suplementado con FBS o antibióticos). Ajuste la
cantidad en diferentes formatos, sin embargo, mantenga la proporción entre la expresión:
empaquetado: plásmidos de envoltura a 10: 6: 2.

Prepare la solución de polietilenimina (PEI): Por transfección: stock de PEI filtrado (1 mg / ml): Diluya 45
ul de stock de PEI en 955 ul de medio blanco.

Añadir 1 ml de solución de PEI gota a gota a 1 ml de solución de plásmido e incubar 30 minutos a

temperatura ambiente.

Mientras tanto, aspire el medio antiguo de los platos y agregue con cuidado DMEM complementado con
FBS al 20%, luego agregue la solución de transfección, agite suavemente y luego coloque las células en la
incubadora de cultivo de tejidos.

24 horas después, aspire el medio de transfección (procedimiento S2) y añada 5 ml de medio completo
recién calentado. Si el vector de transferencia expresa una proteína fluorescente como GFP, la eficiencia
de la transfección podría inferirse midiendo el porcentaje de células GFP + HEK293T.

horas más tarde, se extrajo el sobrenadante del cultivo de células ( ∼5 ml), se centrifuga brevemente
durante 5 minutos a 300 g, se filtra a través de 0,45 um, se reparte alícuota y se congela a -80ºC.

Concentración de virus (> 100x)

Cuando se requieren títulos altos, la ampliación del número de transfecciones (hasta 7 placas de 10 cm)
seguidas de ultracentrifugación y alícuotas de virus se podría hacer de la siguiente manera:

El día de la cosecha, recoja 35 ml del sobrenadante que contiene el virus de 7 platos en un tubo de
halcón, gírelo durante 5 minutos a 300 g.

Filtre a través de filtros de 0,45um en un tubo estéril de policarbonato de pared gruesa con cubierta
abierta, compatible con el rotor JS-24.38 para ultracentrifugación (Beckman Coulter).

Coloque los tubos de policarbonato etiquetados que contienen el sobrenadante viral en los cubos de
aluminio.

Pese los cubos con alta precisión (a una centésima de gramo). Balancear los cubos 1-4, 2-5 y 3-6.

Para la ultracentrifugación, use el rotor JS 24.38 en la centrífuga Avanti JXN-30 (Beckman Coulter).
Centrifugar durante 1 hora a 100.000 g a 4C, con aceleración / desaceleración lenta.

Después de la centrifugación, decante cuidadosamente el sobrenadante y mantenga los tubos boca

abajo para drenar el medio en un tejido libre de fibra durante 10 minutos.

Agregue suavemente 300 ul de PBS a la pared del tubo interno, sin resuspensión, colóquelo en el
agitador en la habitación 4C durante al menos 4 horas.

Alícuota 50 ul en crioviales etiquetados. Adicionalmente, vial de 10ul para el análisis de títulos.

Almacenar en -80.

9 . Titulación del virus

Siembre las células diana un día antes, 50,000 células / pocillo en una placa de 96 pocillos.
Descongele el virus en hielo. Prepare 100 ul de diluciones de virus 1:10 y 1: 100 en medio completo,
luego agregue diluciones en serie para que las diluciones finales de virus 1: x sean 80, 400, 2000, 4000 y
20000, así como el control no transducido.

Prepare la dilución de protamina con 50 ug / ml de material de trabajo, luego agregue 20 ul / pocillo.

Llene cada pocillo hasta 200 ul con medio completo, luego coloque la espinoculación en una centrífuga
de placa durante 1 hora a 1000 g a 37 ° C y vuelva a colocar en la incubadora de cultivo de tejidos.

24 horas más tarde, (procedimiento S2) aspirar el medio que contiene el virus, lavar dos veces con PBS,
luego agregar medio completo precalentado 200 ul / pocillo.

24 horas más tarde, las células se tripsinizan y la señal de GFP se mide mediante citometría de flujo, la
estrategia de activación, después de la exclusión de residuos y dobletes, se basan en el control no
transducido.

Calcule el título y la multiplicidad deseada de infección (MOI): La fracción promedio de células que se
infectarán (por agentes infecciosos n ) luego de una inoculación con un MOI de m viene dada por:

10 . Clonación TA

La clonación de TA se realizó utilizando el kit TA Cloning® utilizando el vector pCR ™ 2.1 (Thermofisher).
Los amplicones se separaron usando electroforesis en gel de agarosa y las bandas diana se extrajeron y
se purificaron usando un kit de purificación de extracción en gel (Bioline). La concentración de ADN se
midió con un espectrofotómetro Nanodrop. Para la ligadura de clonación de TA, se mezclaron 0,1–0,3
pmol de fragmentos de ADN con el vector pCR ™ 2.1 de acuerdo con el protocolo del fabricante y se
incubaron a 16 ° C durante 1 h. El producto de ligación se transformó en E. Coli DH5α competente
empleando un cribado azul / blanco. Las colonias blancas se seleccionaron al día siguiente y el ADN del
plásmido se extrajo a través de Mini-prep (QIAprep Spin Miniprep Kit, Qiagen). Finalmente, se realizó
una PCR utilizando un cebador directo e inverso M13 seguido de secuenciación del ADN.

11 . Análisis de FACS
72 horas después de la transducción, las células se tripsinizaron y se recogieron para el análisis de
citometría de flujo activada por fluorescencia. El análisis se llevó a cabo utilizando un analizador de
células Calibur BD FACS (BD Biosciences). Usando el software de flujo BD FACSDiva, las células
individuales viables se activaron primero usando la dispersión hacia adelante y hacia el lado lateral y las
señales de fluorescencia eGFP se midieron usando un láser de 488 nm y se recolectó el área de registro
de la señal. La clasificación FACS se llevó a cabo utilizando un clasificador de células Aria BD FACS (BD
Biosciences). Para usar el lector de placas de 96 pocillos (BD High Throughput Sampler, HTS), agregue el
experimento de la placa y elija los pocillos a muestrear, la tasa de flujo y el volumen de la muestra. Por lo
general, utilizamos una velocidad de flujo de 1.0 μL / sy una muestra de 50 μL de la muestra de 100 μL
para evitar que se bombee aire al sistema. Los ensayos se realizaron por triplicado.

Brevemente, los experimentos del curso del tiempo se llevaron a cabo en placas de 96 pocillos, para cada
placa:

Aspire el medio completamente con una pipeta multicanal. Lave cuidadosamente las células con 200 ul
de PBS estéril y luego aspire las puntas de cambio entre cada réplica. Disocie las células agregando 30
ul / pocillo de tripsina lo suficiente para cubrir la capa adherente de las células. Incubar durante 5 min a
37 ° C.

Agregue 170 ul de medio completo directamente en las células, homogeneice la solución de células
pipeteando arriba y abajo vigorosamente 10 veces. Transfiera 30 ul ( ∼1: 8) a una nueva placa de 96
pocillos, agregue 170 ul de medio completo precalentado y vuelva a colocarla en la incubadora para su
posterior adquisición durante el transcurso del tiempo.

De la solución restante de 170 ul de células, tome 50 ul para la adquisición de FACS. Gire los 130 ul
restantes para el aislamiento del ADN, verifique los DSB y / o la congelación.

12 . Análisis de datos utilizando FlowJo (Tree Star, Ashland, OR)

Dibuje la primera puerta en FSC-A vs SSC-A para excluir los escombros y las células muertas. Para
eliminar dobletes, dibuje la segunda puerta en SSC-W vs SSC-H para celdas individuales. Además, aplique
la misma estrategia para el FSC-W vs FSC-H.
Las puertas fluorescentes (GFP y tRFP) se basan en la comparación de muestras experimentales con
controles no transducidos. Establezca el umbral en las células no transducidas, permitiendo una señal
positiva de <1% para minimizar los falsos negativos dentro de la población transducida. Exportar los
datos gated como una tabla.

13 . Preparación de la biblioteca para la secuenciación de nanoporos.

La secuenciación MinION se realizó en una celda de flujo MinION R9.4.1 siguiendo el protocolo del
fabricante para el amplicón 1D por ligadura (Oxford Nanopore technologies, SQK-LSK108, versión:
ADE_9003_v108_revT_18Oct2016). Brevemente, se aisló ADN genómico de células RKO tratadas con
sgRNA dirigido al mutante UTP14A cinco días después de la infección. A continuación, el locus UTP14A
que abarca la mutación se amplificó utilizando Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase (M0530), seguido
de purificación por PCR con un kit de purificación por PCR GeneJET (Thermo Scientific), siguiendo el
protocolo del fabricante. Luego se realizaron reparaciones finales y dA-tailing (Módulo NEBNext Ultra II
End-Repair / dA-tailing) en 200 fmol de entrada de ADN agregando 7 μl de tampón Ultra II End-Prep, 3 μl
de mezcla de enzimas Ultra II End-Prep y 5 μl de agua libre de nucleasas. La mezcla se incubó a 20 ° C
durante 5 minutos y 65 ° C durante 5 minutos. Se realizó una limpieza de AMPure XP con un volumen de
1 x (60 μl) y el ADN se eluyó en 31 μl de agua libre de nucleasas. Se cuantificó una alícuota de 1 μl
mediante fluorometría (Qubit) para garantizar que se retuviera un ≥70% de entrada de ADN.

Posteriormente, se realizó la ligadura mediante la adición de 20 μl de mezcla adaptadora (SQK-LSK108

Ligation Secuenciation Kit 1D, Oxford Nanopore Technologies) y 50 μl de NEB Blunt / TA Master Mix
(NEB, nº de cat. M0367) a 30 μl de ADN de cola dA , mezclando suavemente e incubando durante 10 min
a temperatura ambiente. El ADN ligado con el adaptador se limpió agregando 60 µl de perlas AMPure XP,
incubando durante 5 minutos a temperatura ambiente y resuspendiendo el sedimento dos veces en 140
µl de ABB (SQK-LSK108). El ADN ligado purificado se resuspendió agregando 25 µl de tampón de elución
(SQK-LSK108) y resuspendiendo las perlas, incubando a temperatura ambiente durante 10 min,
volviendo a sedimentar las perlas y transfiriendo el sobrenadante (mezcla de pre-secuenciación) a un
nuevo tubo. . Se cuantificó una alícuota de 1 μl mediante fluorometría (Qubit) para garantizar que se
retuviera el ≥43% del ADN de entrada.

Los datos de secuenciación de Nanopore de sg-UTP14A se adquirieron con MinKNOW 1.15.1 (Oxford
Nanopore Technology) y se denominaron de base con Albacore 2.2.7 (Oxford Nanopore Technology).
Para la visualización de datos de secuencia, alineamos las secuencias en la referencia de transcripción
UTP14A (Ensemble ID: ENST00000394422.7) con minimap2 versión 2.12 [76] y mostramos la alineación
con la tableta 1.17.08.17 [77] . Para cuantificar los tamaños de eliminación e inserción causados por el
tratamiento CRISPR / Cas9 alineamos los datos de secuencia en un transcrito UTP14A modificado que
contiene la eliminación TCT en la posición X: 129911061-129911063. Del archivo de alineación de sam
resultante, se leyeron los valores de CIGAR para las eliminaciones e inserciones en el sitio objetivo del
sgRNA X: 129911061 de 100000 lecturas alineadas hacia adelante usando R [78]y graficado utilizando el
paquete R ggplot2 [79] .

14 . Secuenciación profunda

Se recogieron células RKO y HCT116 en PBS antes de la extracción de ADN genómico utilizando el
QIAamp ® DNA Mini y kit Blood (Qiagen), siguiendo el protocolo del fabricante (Qiagen). El ADN
genómico se usó como plantilla para el análisis de PCR, siguiendo el protocolo de la polimerasa de ADN
rojo MyTaq utilizando el programa de PCR que se muestra a continuación, empleando cebadores
específicos de U6-sgRNA. Posteriormente, los productos de PCR se purificaron utilizando un kit de
purificación de PCR GeneJET (Thermo Scientific), siguiendo el protocolo del fabricante. Los cebadores de
PCR fueron diseñados para amplificar el sgRNA de U6 en el esqueleto lentiviral que contiene sgRNA
( Tabla 1 ). Los cebadores para la segunda PCR contienen "colas" universales que permiten una segunda
etapa de amplificación para incorporar secuencias adaptadoras de Illumina así como códigos de barras
específicos de la muestra. 6ug / ul en 10ul se presentaron para la secuenciación de la próxima
generación. Los conteos de sgRNAs se determinaron a través de la alineación de lecturas de extremos
pareados y la evaluación programática de variantes en relación con nuestra muestra de referencia.

Tabla.1 . Imprimaciones utilizadas en este estudio.

Cebador Secuencia

UTP14A - Delantero 5'- AGGGTCATGACATGCTGTGG -3 '

UTP14A - Reverso 5'- ATCTGAAGCAGGCAAGGCAT -3 '

DeepS-PCR1-S1-L 5'- GTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCA -3 '

DeepS-PCR1-S1-R 5'- ATTGTGGATGAATACTGCCATTTG -3 '

DeepS-PCR2-L 5'- ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGGCTTTATATATCTCTGTGGAAAGG -3 '

DeepS-PCR2-R 5'- GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCAAGTTGATAACGGACTAGCC -3 '

15 . Ensayo T7E1 para la tasa de mutación mediada por NHEJ

72-120 horas después de la infección, se aisló el ADN genómico a partir de células transfectadas /
transducidas con vectores Cas9-sgRNA utilizando QIAamp ® DNA Mini y kit Blood (Qiagen) según las
instrucciones del fabricante.
Diseñar cebadores que abarquen el sitio de mutación utilizando la herramienta en línea Primer 3 Plus
(www.primer3plus.com). Valide la especificidad de los cebadores en Primer-BLAST
(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/). Los tamaños de los productos de PCR deben oscilar
entre 500 bp y 2kb.

Realice myTaq red PCR para amplificar loci endógenos durante 35 ciclos de acuerdo con las instrucciones
del fabricante. Algunos cebadores pueden necesitar optimización para las temperaturas de recocido, la
concentración de la plantilla de ADN de entrada y / o MgCl2.

Purifique los fragmentos de PCR utilizando un kit de purificación de PCR GeneJET (Thermo Scientific) de
acuerdo con las instrucciones del fabricante. Eluir en 30 µl de agua libre de nucleasas. Cuantifique el
ADN utilizando un Nanodrop (Thermo Scientific).

Mezcle 500 ng de producto de PCR purificado con 2 µl de NEBuffer 2 y agua hasta un volumen total de
19 µl. Prepare esto dos veces para cada muestra (una muestra tratada con enzimas (+) y un control
negativo (-) luego hibride utilizando un termociclador con el siguiente protocolo ( ∼16 min):

Calentar la tapa hasta 110 ° C.

95 ° C, 5 min

Rampa 95-85 ° C a -2 ° C / s

Rampa 85-25 ° C a -0.1 ° C / s

Mantener a 4 ° C

Agregue 1 µl de enducleasa T7 (NEB) a la reacción (+) e incube a 37 ºC durante 20 min.

Agregue 4 µl de colorante de carga 6x a la muestra y cargue 12 µl al análisis de electroforesis en gel de
agarosa (use un gel de agarosa al 2% y ejecute 30–50 minutos a 60 V).

Temperatura Hora Ciclos

Tapa 110 ° C ∞

Desnaturalización 95 ° C 3 minutos 1x

Desnaturalización 98 ° C 15 segundos 20x

Recocido 60 ° C / 62 ° C 15 segundos

Alargamiento 72 ° C 10 segundos

Alargamiento 72 ° C 5 minutos 1x

Almacenamiento 8°C ∞ 1x

16 . Programa de ciclador de PCR para PCR anidada para secuenciación profunda.

Materiales

Reactivos y kits

ADN polimerasa MyTaq con 5x de tampón MyTaq (Bioloine, BIO-21105)

Phusion ® polimerasa de ADN de alta fidelidad (NEB M0530)

Mezcla de solución de dNTP, 25 mM cada una (Enzymatics, n.º de cat. N205L)

MgCl2, 25 mM (Thermo Scientific, nº de cat. R0971)

Escalera de ADN Plus de 1 kb (Life Technologies, n.º de cat. 10787-018)

Tinte de carga de gel, púrpura (6X) (New England BioLabs, n.º de cat. B7024S)

Fast Digest BbsI (Thermo Scientific, n. ° de catálogo FD1014)

BsmBI (New England BioLabs, nº de cat. R0580S)

10x tampón de tango (Thermo Scientific, nº de cat. BY5)

TDT (Thermo Scientific, nº de cat. R0862)

ADN ligasa de T4 con tampón de ligadura 10x (New England BioLabs, n.º de cat. B0202S

Polinucleótido quinasa T4 (New England BioLabs, n.º de cat. M0201S)

Adenosina 5'-trifosfato, 10 mM (New England BioLabs, n. ° de catálogo P0756S)

E. coli One Shot Stbl3 químicamente competente (Life Technologies, n. ° de catálogo C7373-03)

Eficiencia de la biblioteca DH5 alfa Células competentes (Invitrogen 18263012).

Medio SOC (New England BioLabs, nº de cat. B9020S)

Medio LB (Sigma, nº de cat. L3022)

Ampicilina, 100 mg ml - 1, filtrada estéril (Sigma, nº de cat. A5354)

Reactivo de transfección Lipofectamine 2000 (Life Technologies, n.º de cat. 11668027)

QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen 28106).

QIAGEN Plasmid Mini Kit (Qiagen 12123).

QIAGEN Plasmid Plus Maxi Kit (Qiagen 12963)

Kit de extracción de gel QIAquick (Qiagen, n.º de cat. 28704)

QIAGEN Plasmid Plus 96 Miniprep Kit (Cat No: 960241)

Kit de purificación de PCR GeneJET (Thermo Scientific, K0701)

Kit de secuenciación de ligado 1D (SQK-LSK108)

Kit de bolas de carga de la biblioteca (EXP-LLB001)

NEBNext Fin de la reparación / dA-tailing Module (E7546)

NEB Blunt / TA Ligase Master Mix (M0367)

Perlas Agencourt AMPure XP

16.1 . ml tubos de PCR de pared delgada

Agua sin nucleasas (p. Ej., ThermoFisher, nº de cat. AM9937)

16.2 . ml tubos Eppendorf ADN LoBind

NEB Blunt / TA Ligase Master Mix (M0367)

Qubit ™ dsDNA HS Assay Kit (termofisher, Q32854)

El fluorómetro Qubit® 2.0 (termofactor, Q32866)

Cultivo de células de mamífero

Celdas HEK 293T, HCT116, RKO y HeLa (Life Technologies, n.º de cat. R700-07)

DMEM, glutamax (Life Technologies, nº de cat. GIBCO 10829018)

FBS, calificado (Invitrogen 10108165)

0.05% de tripsina-EDTA (GIBCO 25300054).

Medio de suero reducido Opti-MEM I (Life Technologies, 11058-021)

Penicilina-estreptomicina, 100 × (GIBCO 15070063)

Clorhidrato de puromicina (Life Technologies, nº de cat. A11138-03)

Antibiótico líquido selectivo de geneticina (Invitrogen 10131-027).

Dimetilsulfóxido (DMSO, Sigma D2650)

17 . Placas de cultivo de tejidos de cm de diámetro (Corning 430167).

Placa de cultivo de tejidos de fondo redondo de 96 pocillos (Corning 3790).

Placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos (Corning 3524).

Tubos de halcón, polipropileno, 15 ml (BD Falcon, n.º de cat. 35209)

Tubos de halcón, polipropileno, 50 ml (BD Falcon, n.º de cat. 352070)

Equipo:

Termociclador con función de escalonamiento de temperatura programable.

Microcentrífugas de escritorio (p. Ej., Eppendorf, n. ° de cat. 5424 y 5804). Centrifugadora (Eppendorf
5810).

Sistema de imagen digital en gel.

Transiluminador de luz azul y gafas naranjas (SafeImager 2.0; Invitrogen, n.º de cat. G6600)
Espectrofotómetro UV (NanoDrop 2000c, Thermo Scientific)

18 . Resultados y discusión

18.1 . biblioteca sgRNA dirigida a mutaciones específicas de líneas celulares de cáncer

Nos propusimos probar la viabilidad del uso del sistema CRISPR / Cas9 para perfilar funcionalmente las
mutaciones en una línea celular de cáncer. Utilizamos la línea celular de carcinoma colorrectal RKO y
descargamos por primera vez las 4.762 mutaciones informadas, de las cuales 4.410 son mutaciones de
secuencia codificante, de la base de datos COSMIC (https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic). Luego
extrajimos 30 pb de secuencia en sentido ascendente y descendente de las mutaciones informadas e
identificamos sgRNAs potenciales en sentido y orientación antisentido utilizando el algoritmo de sgRNA
Designer de Doench et al. [36]

[37] . La mayoría de los sgRNA diseñados se dirigen a mutaciones puntuales, mientras que 190 sgRNA se
dirigen a pequeñas mutaciones indel. Nombramos 100 sgRNAs con la mejor puntuación para mutaciones
indel para la generación de nuestra biblioteca. Además, diseñamos sgRNAs dirigidos a cinco genes
esenciales y un oncogen conocido como controles positivos, así como cinco sgRNAs no dirigidos como
controles negativos ( Tabla complementaria 1 ). Los sgRNAs se clonaron en un vector de expresión Cas9
lentiviral todo en uno modificado que también lleva un casete de expresión de GFP [39]. El casete GFP
permite una evaluación simple de la tasa de infección y se puede utilizar como una lectura fenotípica
directa (ver 3.3). El conjunto representativo de todos los vectores se transfectó junto con los plásmidos
de envoltura / envoltura en células HEK293 para producir partículas virales ( Fig. 1 ).

Es de destacar que las mutaciones para las cuales el diseño de un sgRNA no fue posible aún podrían ser
abordadas por otras nucleasas programables. Por ejemplo, se han identificado sistemas CRISPR de
diferentes cepas bacterianas que incluyen proteínas Cas que reconocen diferentes secuencias PAM (por
ejemplo, saCas9, Cpf1, CasX) [42] , [43] , [44] , [45] , [46] , [47] ] , [48] . Además, se han generado
mutantes de SpCas9 que reconocen secuencias de PAM alternativas [49] , [50] , [51] .

Una consideración importante para las pantallas de inactivación de mutación basadas en CRISPR es la
especificidad de la división de Cas9. Las mutaciones puntuales pueden ser más difíciles de identificar, ya
que solo difieren en un solo nucleótido de la secuencia de tipo salvaje. Por lo tanto, la secuencia de tipo
salvaje también puede dividirse, lo que dificulta la interpretación de los datos obtenidos. Sin embargo, la
especificidad de los sgRNA individuales se puede evaluar a priori. Por ejemplo, se sabe que las
diferencias de nucleótidos en la región de la semilla cerca de la secuencia PAM mejoran la división
selectiva [52] , [53] , [54] , [55]. Por lo tanto, la elección de secuencias de sgRNA que contienen la
secuencia de PAM cercana a la mutación podría ser preferible a sgRNAs donde la mutación está muy
lejos de la secuencia de PAM. Además, los sgRNA más cortos pueden mejorar la especificidad de escisión
del sistema CRISPR / Cas9 [56] . Además, la ingeniería de proteínas reciente de Cas9 ha revelado enzimas
mutantes con especificidades más altas [57] . Estas enzimas pueden ser ventajosas en pantallas donde se
deben distinguir las diferencias de un solo nucleótido. Finalmente, para probar la selectividad de un
sgRNA dado experimentalmente, el llamado sistema indicador de semáforo [58] se puede emplear para
probar sgRNAs en la secuencia de tipo salvaje frente a la secuencia mutante.

18.2 . Pantalla lentiviral combinada para identificar mutaciones de conductores de cáncer

To perform the screen to identify possible vulnerability mutations, we infected RKO cells as well as
another CRC cell line (HCT116) with the lentiviral sgRNA library at an MOI of 0,3. This low infection rate
was chosen to make sure that most cells were infected with a single sgRNA virus, making it possible to
investigate the inactivation of individual mutations. HCT116 cells do not carry the same mutations
present in RKO cells and therefore served as the negative control (Fig. 1). Three days post infection, cells
were split and genomic DNA was collected from 50% of the cells. These samples were used as the base-
line to quantify sgRNA abundance at the beginning of the experiment. After 15 days of continuous
culture, genomic DNA was collected again from both cell lines, the sgRNA cassettes were PCR amplified
and sgRNA counts were quantified by means of deep sequencing (Fig. 1).

Como se esperaba, el análisis comparativo mostró que los sgRNA de control positivo se agotaron con el
tiempo en ambas líneas celulares, mientras que la abundancia relativa de los controles negativos no
cambió significativamente con el tiempo ( Fig. 2 ). Además de los controles positivos, dos sgRNAs
dirigidos a la misma mutación se agotaron en las células RKO, lo que sugiere que la escisión de la
mutación perjudica el crecimiento y / o la viabilidad de RKO ( Fig. 2 ). Es importante destacar que las
lecturas de estos sgRNAs no se agotaron en las células HCT116, lo que demuestra que la mutación es
selectivamente importante en las células RKO.

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Figura 2 . Resultados de la pantalla de sgRNA en células RKO y HCT116. Las gráficas muestran los
resultados de las células de control RKO (izquierda) y HCT116 (derecha) de 100 sgRNA seleccionados y
sgRNA de control positivo (círculos rellenos). Los sgRNA de control no dirigidos se muestran como
círculos sin relleno. Dos sgRNAs independientes dirigidos a UTP14A: S99delS se muestran en rojo.
El análisis reveló recuentos empobrecidos de dos sgRNAs dirigidos a una mutación encontrada en el gen
homólogo A de la proteína 14 asociada al ARN nuclear pequeño U3 (UTP14A: S99delS) selectivamente
en células RKO ( Fig . 2 ). Esta mutación refleja una eliminación de tres nucleótidos en el marco en la
parte N-terminal del gen. UTP14A se encuentra en el cromosoma X y codifica un componente de un gran
complejo de ribonucleoproteínas implicado en la biogénesis del ARNr 18S que está involucrado en vías
como el procesamiento del ARNr en el núcleo y el citosol, la biogénesis del ribosoma y la expresión
génica [59] , [60] . Curiosamente, UTP14A se ha identificado recientemente como un gen de centro
crítico en células de carcinoma colorrectal [61]lo que sugiere que el gen juega un papel importante
durante el proceso de transformación de este tipo de tumor. Por lo tanto, decidimos investigar la
mutación UTP14A: S99delS con más detalle.

18.3 . Validación y caracterización de la mutación UTP14A: S99delS en células RKO

Para la validación, los dos sgRNAs dirigidos a la mutación UTP14A: S99delS y los sgRNA de control se
seleccionaron para la producción de virus fresco y se transdujeron nuevamente en células RKO y HCT116.
No se observó ningún cambio significativo de células positivas para GFP a lo largo del tiempo en células
HCT116 transducidas con el control negativo o con el sgRNA dirigido a la mutación UTP14A: S99delS
( Fig. 3 A). En contraste y en línea con los resultados de la pantalla, el porcentaje de células positivas para
GFP disminuyó progresivamente con el tiempo en las células RKO transducidas con el sgRNA dirigido a la
mutación UTP14A ( Fig. 3A ), lo que apoya la idea de que UTP14A: S99delS podría ser una mutación
impulsora en RKO. Para demostrar la división selectiva del ADN en células RKO, realizamos un ensayo de
la endonucleasa I T7 (T7E1, [62]). La eficiente división específica de mutantes de UTP14A fue evidente
solo en las células RKO ( Fig. 3 .B), lo que demuestra que los indeles se introducen en el sitio de la
mutación UTP14A: S99delS después de la división. De hecho, la secuenciación de nanoporos confirmó la
presencia de numerosos indeles en la muestra que se trató con el sgRNA dirigido a UTP14A: S99delS ( Fig
. 3 C, D).

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Figura 3 . Validación de UTP14A: S99delS como una supuesta mutación de controlador en RKO. A) Se
muestran las abundancias relativas de células tratadas con sgRNA indicado a lo largo del tiempo. Las
barras de error muestran SEM de experimentos realizados por triplicado. Es de destacar que la
orientación de la mutación UTP14A: S99delS con otro sgRNA reveló un fenotipo similar (datos no
mostrados). B) Ensayo de enducleasa I T7 (T7E1) para demostrar la escisión del sgRNA utilizado en el
panel A. El ADN genómico se aisló 5 ppp de las líneas celulares indicadas con (+) o sin (-) la expresión del
sgRNA. La flecha marca el producto de escisión. Se muestra el marcador de tamaño (M). C) Visualización
de alineación de los datos de secuenciación de Nanopore de células RKO tratadas con sgUTP14A y
control. Los análisis muestran la eliminación de TCT en el RKO wtCélulas (izquierda) y deleciones de
tamaño variable en la línea celular RKO tratada con sgUTP14A (derecha). La primera fila muestra la
secuencia de referencia y las desviaciones de esta secuencia se resaltan con una estrella roja sobre fondo
gris. Es de destacar que las alteraciones aleatorias en ambas muestras se deben a la precisión
relativamente baja de la tecnología de secuenciación de Nanopore. D) Se muestra la distribución de las
mutaciones de eliminación (parte superior) e inserción (parte inferior) de las células tratadas con
sgUTP14A. En total, se detectaron 26974 deleciones y 1410 inserciones.

Para caracterizar mejor la mutación UTP14A: S99delS en células RKO, amplificamos por PCR un
fragmento de ADN que abarca la mutación, clonamos los fragmentos en un vector de clonación TA y
secuenciamos el inserto de 40 clones independientes. De manera inconsistente con la base de datos
COSMIC que informó que la mutación era heterocigótica, encontramos que las 40 colonias secuenciadas
portaban la mutación delTCT (datos no mostrados). Además, la secuenciación del producto de PCR
purificado también reveló que todas las lecturas contienen la mutación delTCT (Fig. 4 A), lo que sugiere
que este alelo está efectivamente presente como una mutación homocigótica en células RKO.

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Figura 4 . Caracterización de UTP14A en diferentes líneas celulares. A) Lecturas de secuenciación de

Sanger a partir de los productos de PCR purificados del locus UTP14A en las líneas celulares indicadas. La
eliminación de TCT en las celdas RKO está marcada por una flecha roja. En LoVo, U2OS y OCI-AML3, la
secuencia TCT se resalta con un recuadro azul. B) Abundancia relativa de células tratadas con dos sgRNA
diferentes que se dirigen al exón 1 (superior) UTP14A de tipo salvaje y al exón 2 (inferior) a lo largo del
tiempo en las líneas celulares indicadas. Las barras de error muestran SEM de experimentos realizados
por triplicado. DO)Ensayo de enducleasa I T7 (T7E1) para investigar la escisión de los dos sgRNAs
dirigidos al exón1 y exon2 utilizados en el panel A. El ADN genómico se aisló 5 ppp para los sgRNA
indicados con (+) o sin (-) expresión de los sgRNAs. La flecha marca los productos de escisión. Se muestra
el marcador de tamaño (M).

Para apoyar el descubrimiento de que UTP14A: S99delS es en realidad una mutación de cáncer y no un
polimorfismo humano natural, buscamos esta secuencia en la base de datos de variación genética
humana (

[63] , http://www.hgvd.genome.med.kyoto-u.ac.jp/), así como en datos de secuenciación del genoma

humano a gran escala publicados recientemente [64] , [65] . UTP14A: S99delS no se ha informado en
ninguno de estos informes, ni siquiera en un estado heterocigoto, lo que hace que sea altamente
improbable que se trate de una alteración polimórfica humana natural.

A continuación, investigamos el papel de UTP14A de tipo salvaje en la proliferación celular. No se ha

informado de que UTP14A sea un gen esencial en la mayoría de las pantallas CRISPR de todo el genoma
compiladas recientemente, en particular no en las células RKO y Hela [66] . Para confirmar que UTP14A
es prescindible para el crecimiento y / o la viabilidad, diseñamos dos sgRNA diferentes dirigidos a
UTP14A de tipo salvaje e RKO infectado, HCT116 y células Hela con vectores lentivirales que expresan
estos sgRNAs junto con Cas9 y GFP. Sorprendentemente, el porcentaje de células positivas para GFP
disminuyó con el tiempo en las tres líneas celulares para ambos sgRNAs ( Fig. 4ANTES DE CRISTO). Este
sorprendente hallazgo indica que las pantallas CRISPR a gran escala actuales no son lo suficientemente
sensibles como para nominar a todos los genes esenciales. Más importante aún, llegamos a la conclusión
de que las células knockout UTP14A tienen una desventaja de crecimiento en líneas celulares cultivadas.

Este hecho hace que sea más difícil concluir que el UTP14A: S99delS es una mutación causada por el
cáncer. Para probar esta posibilidad, introdujimos UTP14A de tipo salvaje en el fondo mutante por medio
de BAC Transgenomics [67] ( Fig . 5 A). Transfectamos células RKO con una construcción BAC humana que
lleva el gen UTP14A de tipo salvaje etiquetado con GFP y confirmamos la expresión estable de la
expresión de UTP14A de tipo salvaje en estas células ( Fig. 5SEGUNDO). A continuación, infectamos las
células RKO originales y modificadas con BAC con los vectores sgRNA que dividen la mutación UTP14A:
S99delS. Si UTP14A: S99delS no es una mutación impulsora, esperábamos que la expresión de UTP14A
de tipo salvaje rescatara la deficiencia de crecimiento específicamente en las células transgénicas BAC.
Sorprendentemente, ambas líneas celulares fueron igualmente sensibles a la inactivación de la mutación
UTP14A: S99delS ( Fig. 5 C), inconsistente con la idea de que UTP14A: S99delS es una mera mutación del
pasajero.

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Figura 5 . La expresión de UTP14A de tipo salvaje no rescata el fenotipo de escisión UTP14A: S99delS en
células RKO. A) Esquema del experimento de rescate UTP14A-BAC. Los pasos importantes se resaltan con
flechas. B) Se muestran imágenes (campo claro, DAPI, GFP y fusionadas) de células UTP14A-GFP BAC
transgénicas RKO (barra de escala = 25 μm). Obsérvese la localización nucleolar esperada de la proteína
de fusión. C) Se muestra la abundancia relativa de células tratadas con sgRNAs indicados en RKO WT y en
la línea BAC-transgénica que expresa UTP14A-GFP. Las barras de error muestran SEM de experimentos
realizados por triplicado.
19 . Conclusiones y declaraciones a futuro.

Los datos presentados demuestran que las pantallas de inactivación mediadas por CRISPR / Cas9 de las
mutaciones del cáncer en líneas celulares establecidas son posibles y que las mutaciones que impulsan
el cáncer pueden ser nominadas con este oleoducto. La anotación completa de las mutaciones del
cáncer en las líneas celulares establecidas hace que el diseño del sgRNA en una línea celular específica
sea sencillo. La última versión de la base de datos COSMIC reporta más de 5 millones de mutaciones de
codificación [68]Proporcionar un rico recurso para iniciar pantallas para probar la vulnerabilidad de las
células cancerosas tras la inactivación de las mutaciones del cáncer. Sin embargo, el recurso no está
exento de advertencias y se debe tener cuidado al diseñar las bibliotecas. En el caso descrito en este
manuscrito, encontramos que la mutación UTP14A: S99delS estaba presente en el estado homocigoto,
en lugar del estado heterocigoto informado en la base de datos. Para otro ejemplo (una mutación en el
gen MRPS30 (E134_P135delEP)), encontramos que esta mutación no es una mutación de cáncer, sino un
polimorfismo frecuente en la población humana (datos no mostrados). Este problema requiere atención
especial para las líneas celulares de cáncer ya establecidas, ya que para estas células un "control
somático" generalmente no está disponible y las mutaciones se llaman frecuentemente en comparación
con un genoma de referencia. Por lo tanto, Un tema que debe tenerse en cuenta es la variación genética
humana del "genoma de referencia" que impone una necesidad urgente pero ardua de etiquetar estas
variantes en las bases de datos de mutación del cáncer. En este sentido, la aplicación del método a las
muestras primarias del paciente tendría la ventaja de que las mutaciones del cáncer se validan con
frecuencia mediante la secuenciación de un control somático del mismo paciente como control. La
obtención de material suficiente y el establecimiento de protocolos de transducción eficientes son
probablemente los desafíos para transferir este método a las células cancerosas primarias, aunque un
rápido progreso en el cultivo de células cancerosas primarias como organoides la aplicación del método
a las muestras primarias del paciente tendría la ventaja de que las mutaciones del cáncer se validan
frecuentemente mediante la secuenciación de un control somático del mismo paciente como control. La
obtención de material suficiente y el establecimiento de protocolos de transducción eficientes son
probablemente los desafíos para transferir este método a las células cancerosas primarias, aunque un
rápido progreso en el cultivo de células cancerosas primarias como organoides la aplicación del método
a las muestras primarias del paciente tendría la ventaja de que las mutaciones del cáncer se validan
frecuentemente mediante la secuenciación de un control somático del mismo paciente como control. La
obtención de material suficiente y el establecimiento de protocolos de transducción eficientes son
probablemente los desafíos para transferir este método a las células cancerosas primarias, aunque un
rápido progreso en el cultivo de células cancerosas primarias como organoides[69] , [70] podría facilitar
este proceso.

Nuestros resultados nominan a UTP14A: S99delS como una supuesta mutación de controlador en células
RKO. Curiosamente, esta mutación no se ha encontrado en ninguna otra línea celular de cáncer y
tampoco se ha encontrado en la población humana. Por lo tanto, UTP14A: S99delS es una mutación RKO
única que podría ser importante para el crecimiento y la viabilidad específicamente para esta línea
celular. Esto plantea la posibilidad interesante de que mutaciones únicas pueden ser mutaciones
causantes de cáncer. Si esto fuera cierto, entonces el número de mutaciones del controlador podría ser
mucho mayor que el previsto actualmente. Sin embargo, se requiere más trabajo para demostrar
completamente que UTP14A: S99delS es, de hecho, una mutación de conductor de hueso. Sin embargo,
incluso si UTP14A: S99delS no es una mutación impulsora, este hallazgo aún ofrecería una nueva e
interesante vía para abordar las células cancerosas.

Hasta ahora, la mayoría de los esfuerzos se han centrado en la caracterización de las mutaciones del
cáncer en los genes de codificación de proteínas. Sin embargo, informes recientes sugieren que las
mutaciones no codificantes pueden ser importantes para el crecimiento de las células cancerosas [71] ,
[72] . La inactivación de estas mutaciones también debería ser factible a través de la escisión mediada
por CRISPR / Cas. Por lo tanto, sería interesante extender este enfoque de detección a las mutaciones no
codificantes que se encuentran en las células cancerosas. Otra extensión interesante de este método
sería investigar posibles sinergias de ciertas mutaciones. En línea con las pantallas de interacción
genética en células de mamíferos [73] , [74] , [75]Creemos que podría ser posible que se observen
efectos de epistasis similares entre diferentes mutaciones de cáncer. Por lo tanto, sería interesante
desactivar diferentes mutaciones de cáncer en combinación e investigar si tienen efectos de mejora o de
amortiguamiento.

Expresiones de gratitud

Los autores desean agradecer al centro Dresden Genome por el excelente servicio de secuenciación ya
todos los miembros del laboratorio de Buchholz por sus fructíferos debates. Los esquemas gráficos
fueron creados con Biorender.

Fondos

El proyecto fue apoyado por subvenciones de la Deutsche Krebshilfe (SyTASC / 70111969), el programa
interno de financiación DKTK de Dresde 2018 y el Centro Nacional de Enfermedades Tumorales de
Dresde (Nombres de las subvenciones: "Desarrollo de la tecnología CRISPR / Cas9 para una atención
oncológica personalizada y precisa ”Y“ Estratificación molecular y biomarcador en cáncer:
descubrimiento de biomarcadores de cáncer con herramientas CRISPR de próxima generación ”).