Instituto Tecnológico de Tepic

Bioquímica I.- Dra. Efigenia Montalvo

González
Práctica #2: Cinética Enzimática.

Integrantes:
Ignacio Barbosa Gámez
Susana Rangel Rodríguez
Karla Paola Caballero Montoya
Alejandro Alcaraz González
María del Carmen Martí Amezquita
José de Jesús Rodríguez Romero
Objetivo:
Determinar la actividad enzimática de la polifenoloxidasa extraída de una
manzana, utilizando como sustrato catecol a diferentes concentraciones;
empleando para la cuantificación de la actividad métodos
espectrofotométricos.

Introducción:
En Bioquímica, se llaman enzimas las sustancias de naturaleza proteíca que
catalizan reacciones químicas. En estas reacciones, las moléculas sobre las
que actúa la enzima en el comienzo del proceso son llamadas sustratos, y
estas los convierten en diferentes moléculas, llamados los productos.
Existen diversos métodos para medir la velocidad de una reacción
enzimática. La espectrofotometría que permite detectar cambios en la
absorbancia de luz por parte del sustrato o del producto (según la
concentración de estos) y la radiometría implica incorporación o liberación
de radiactividad para medir la cantidad de producto obtenido por tiempo.
Los ensayos espectrofotométricos son los más utilizados, ya que permiten
medir la velocidad de la reacción de forma continua. Por el contrario, los
ensayos radiométricos requieren retirar las muestras para medirlas, por lo
que son ensayos discontinuos.
Algunos factores que pueden modificar la actividad enzimática son el pH, la
temperatura y la concentración salina.

Metodología:

1. Principalmente se portó la bata de laboratorio.

2. Se procedió a realizar los cálculos necesarios para obtener la

cantidad de catecol a utilizar con una concentración de 0.02M
(cálculos)

3. Enseguida pesamos la cantidad de catecol obtenida en los cálculos.

4. Preparamos la solución agregando los gramos de catecol calculado a

un matraz aforado y procedimos a agregar la solución de fosfato
mono potásico hasta aforar a 50ml.

5. Una vez preparada nuestra solución, pasamos al pelado y cortado de

la materia prima (manzana) y pesamos 10gr de esta, procediendo de
manera inmediata a licuarla agregándole 40ml de solución buffer.

6. Se mantuvo la mezcla a una temperatura de 6°C durante un periodo

de tiempo para evitar la degradación de la enzima.

7. Al momento de recibir la instrucción de que podíamos realizar la

centrifugación, retiramos la muestra del hielo y la depositamos en
dos tubos de ensayo para centrifugadora, colocando la misma
cantidad en cada uno de ellos.

8. Lo sometimos a centrifugar a 6000rpm durante un periodo de 15min.

 9. Inmediatamente vertimos 0.5ml de la solución de ambos tubos
(evitando precipitado) en la celda del espectrofotómetro, 2ml de
solución amortiguadora y 1ml de la solución preparada de ecatecol.

10.Finalmente se introdujo la celda en el espectrofotómetro a 420nm y

procedimos a la cuantificación.

Diagrama de Flujo:

INICIO PORTACION DE BATA

CALCULOS
AR CANTIDAD DE REACTIVO DERIVADA DE LOS CALULOS

PREPARACION DE LA SOLUCION

PREPARACION DE LA MATERIA PRIMA (MANZANA)

CONSERVACION DE LA MEZCLA A 6º C

CENTRIFUGACION

COLOCACION DE LA SOLUCION EN LA CELDA

CUANTIFICACION EN EL ESPECTOFOTROMETRO

Práctica terminada
Cálculos y Resultados:
 Preparación de la solución de catecol 0.02 M:

1 mol de catecol ------ 110.1gr/mol

0.02 mol de catecol ---- X

X= 2.202 gr de catecol/L
Solución de 50ml de Catecol 0.02M = 0.1101g

Gráfica 1.- Absorbancia /Tiempo

Cálculos de actividad enzimática:

Pendiente de: 1x10^-3

Calculando la actividad:

Actividad= m (2) (1000)

Actividad = 1 x10^-3 (2)(1000)= 2

Nota: La actividad será modificada para obtener una cinética correcta, ya

que el dato obtenido no satisface la lógica teórica del fundamento de la
práctica a realizar.

Actividades obtenidas por las 4 diferentes concentraciones:

Concentración 0.02 M 0.04 M 0.06 M 0.08 M

Actividad 1 1.42 2 4

Inversos:

Concentración 50 25 16.66 12.5

Actividad 0.5 0.7042 0.5 0.25

Gráfica 2.- Unidad de Actividad/Concentración

Gráfica 3.- Cinética Enzimática (1/V) /(1/[S])

Cálculo de Km y Vmáx:
Dado a que la línea de tendencia tiene una muy pequeña desviación, y los
puntos finales e iniciales concuerdan, podemos usar la ecuación de dicha
línea para determinar Km y Vmáx.

Vmáx= 1/b =1/0.0305

Vmáx= 6.788 M/min

Km= (m) (Vmáx) = (0.0179)(6.788) Km=0.121520706 M/ml

Discusión:
Observando el comportamiento de la curva en la grafica 1, pudimos deducir
que la concentración a la cual estaba el sustrato traería consigo una cinética
no ideal.
En la gráfica 2, observamos que la unidad de actividad con respecto a la
concentración mostraba una inconsistencia, ya que la concentración 0.02 M
mostró la misma actividad que la 0.06M, siendo esta una irregularidad
bastante extraña de acuerdo al procedimiento seguido, el cual fue tal como
había sido propuesto.
Sin embargo, al calcular la Km y la Vmáx, no se toma en cuenta el dato
donde inverso de la actividad de la enzima baja (gráfico #3), ya que a esa
concentración se encuentra fuera del rango recta de la cinética enzimática
que se necesita para obtener los datos de Km y Vmáx.
Cuestionario:

1.- ¿Cómo afecta la concentración de sustrato a la enzima?

La concentración de sustrato afecta la actividad de la enzima en el hecho de
que a mayor concentración, la enzima actuará más rápido, más sin embargo
puede llegar a saturarse.
2.- ¿Por qué es importante mantener la temperatura baja del
extracto enzimático?
La mayoría de las enzimas pierden su función biológica cuando están
desnaturalizadas, en este caso por la temperatura, perdiendo así su
actividad catalítica, debido a que los sustratos no pueden unirse más al sitio
activo, y porque los residuos del aminoácido implicados en la estabilización
de los sustratos no están posicionados para hacerlo.
Cuando la temperatura es elevada aumenta la energía cinética de las
moléculas con lo que se desorganiza la envoltura acuosa de las proteínas, y
se desnaturalizan. Asimismo, un aumento de la temperatura destruye las
interacciones débiles y desorganiza la estructura de la proteína, de forma
que el interior hidrófobo interacciona con el medio acuoso y se produce la
agregación y precipitación de la proteína desnaturalizada.

3.- ¿Por qué el extracto enzimático se realiza con pH establecidos?

La velocidad de una reacción enzimática depende de varios factores; entre
éstos está el pH. Cada enzima tiene un rango de pH en el que su actividad
enzimática es óptima. Fuera de este rango la enzima por ser una proteína
empieza a desnaturalizarse por la protonación o desprotonación de sus
aminoácidos constituyentes.

Evidencias:
Referencias:
Leonel Villarreal.- DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD ENZIMATICA E
INACTIVACION DE PEROXIDASA [JUNIO, 2008]
Disponible en Web: http://www.buenastareas.com/ensayos/Determinacion-
De-Actividad-Enzimatica/610243.html
Fecha de Consulta: [Jueves, 14 de octubre 2010]

LEHNINGER Albert L., BIOQUIMICA Las Bases Moleculares de la Estructura y

la Función Celular, 2da EDICION.