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La leche es un alimento primordial segregado por las glándulas mamarias de los mamíferos
con la finalidad de nutrir las crías en su primera fase de vida. La leche es una compleja mezcla
de distintas sustancias, presentes en suspensión o emulsión y otras en forma de solución
verdadera y presenta sustancias definidas: agua grasa, proteína, lactosa, vitaminas, minerales;
a las cuales se les denomina extracto seco o sólidos totales. Los sólidos totales varían por
múltiples factores como lo son: la raza, el tipo de alimentación, el medio ambiente y el estado
sanitario de la vaca entre otros. [1]
Su principal proteína, la caseína, contiene los aminoácidos esenciales y como fuente de
calcio, fósforo y riboflavina (vitamina B12), contribuye significativamente a los
requerimientos de vitamina A y B1 (tiamina). Por otra parte, los lípidos y la lactosa
constituyen un importante aporte energético. [2]
La caseína es la proteína más abundante, además de ser la más característica de la leche por
no encontrarse en otros alimentos, existen tres tipos de caseínas (α, β y k caseína), en la leche
también se encuentra la albúmina y la globulina. El valor biológico de la caseína en la
alimentación obedece a su contenido en aminoácidos esenciales que se separan de la parte
acuosa por acción de enzimas como la renina o la quimiocina, que son las responsables de la
precipitación de la proteína en la elaboración de quesos
Nutriente
Concepto
(g)
Agua 88
Energía
61
(kcal)
Proteína 3.2
Grasa 3.4
Lactosa 4.7
Minerales 0.72
RESULTADOS Y ANALISIS
Acidificación de la leche y determinación de grasas
La formación de un coagulo en la leche al agregar ácido acético se da gracias a la ionización
de la caseína en la leche, la caseína tiene un punto isoeléctrico aproximado de 5.2 y al estar
por debajo de 4.6 empieza a precipitarse. En ese orden de ideas, se necesita agregar cierta
cantidad de ácido para lograr separar la caseína de la leche, esa cantidad de ácido se llama
acidez libre. Mientras más acidez libre tenga la leche más contenido de grasas tendrá la leche
[7].
Para lograr la coagulación de la caseína de la leche se necesitó 5mL de una solución 1M de
ácido acético.
1𝑚𝑜𝑙 𝐴𝑐. 𝐴𝑐é𝑡𝑖𝑐𝑜 1
0.0024𝐿 × × = 0.016𝑀
1𝐿 (0.1 + 0.05)𝐿
Por medio de la concentración de ácido acético en la solución leche/agua se puede calcular
el pH de ácido acético al que se tuvo que llevar la solución de leche para coagular la caseína.
Una solución 0.0253M de ácido acético tiene un pH de 3.18 el cual está bastante alejado de
4.6, esto quiere decir que había contenido graso en la leche que hizo necesario la adición de
más ácido acético del requerido para coagular la leche.
Cuantificación de la albúmina de la leche
A partir de las soluciones de albúmina preparadas, una densidad aproximada y su peso
molecular, se calculó la concentración molar de la albúmina en las muestras para después
graficar la absorbancia obtenida en el espectrofotómetro.
Tabla 2. Concentración molar de albúmina y absorbancia medida.
Concentración
Absorbancia
(M) [1x105]
0.493 0.057
0.985 0.15
1.493 0.192
1.985 0.236
2.478 0.244
0.17
0.15
0.13
0.11
0.09
0.07
0.05
0.000004 0.000009 0.000014 0.000019 0.000024
Concentración de albúmina (M)
A partir de la curva de calibración podemos obtener la ecuación de la recta, esto es, 𝑦 = 9259𝑥 +
0.0382
La pendiente de la recta corresponde al coeficiente de absortividad molar de la albúmina trabajada en
el laboratorio (111.66); el coeficiente de absortividad molar reportado para la albúmina es de 43824
M-1cm-1 a 280nm [8] por lo que se podría decir las muestras sufrieron algún tipo de modificación que
hicieron que la Ley de Lambert-Beer no aplicara, aun así, el valor de absorbancia máximo para la
albúmina se da a 280nm y a longitudes de onda más grandes la absorbancia tiende a disminuir [8] y
debido a que la longitud de onda trabajada en el laboratorio fue de 595nm, es de esperarse que el
coeficiente de absortividad molar tienda a disminuir de manera significativa mientras más estemos
alejados de 280nm. Otro posible factor que pudo interferir en la lectura de las absorbancias es el
hecho de que la proteína a analizar tiene un tamaño bastante grande haciendo que las soluciones
preparadas en el laboratorio no tienden a estar diluidas (criterio importante para el cumplimiento de
la ley de Lambert-Beer) sino, por el contrario que las soluciones tiendan a estar concentradas dando
como resultado una pequeña desviación en la lectura de las absorbancias.
Por otro lado, la ecuación de la recta obtenida va a ser usada como intermediario para el cálculo de la
concentración de proteínas en las diferentes muestras, aunque el ajuste lineal obtenido no tiene un R2
cercano a 1. Estas concentraciones se calcularán despejando 𝑥 de la ecuación de la recta obtenida del
Gráfico 1.
Tabla 3. Absorbancia y concentración de proteínas de las muestras obtenidas después del centrifugado.
Con el fin de poder comparar la concentración obtenida con la reportada en la bolsa de leche, se hará
el cálculo correspondiente para obtener la concentración en mg/mL.
Tabla 4. Concentración de proteína obtenida en las muestras (mg/ml).
La concentración de proteínas de la leche entera reportada es de 1.5 g/50 mL de leche [9]. Por lo que
el porcentaje de proteínas obtenido en el laboratorio es menor, se puede calcular un error porcentual
de la diferencia de la concentración obtenida y la reportada como sigue:
|1.5 − 0.346|
𝐸% = × 100% ≈ 76.9%
1.95
Este error puede deberse a la desviación del comportamiento de la albúmina frente a la ley de
Lambert-Beer, ya mencionado anteriormente.
Se pudo mejorar el experimento ajustando una longitud de onda más cercana a 280nm y manejado
concentraciones más diluidas de albúmina puede darse una mejor regresión lineal de los datos;
obtener un coeficiente de absortividad molar más cercano al reportado y en consecuencia obtener una
cantidad de proteínas más cercana al esperado.
Punto isoeléctrico de la caseína
Con los datos de absorbancia a diferentes pH se realizó una tabla y posteriormente una gráfica
mostrando todos los puntos evaluados, el punto isoeléctrico se aproxima mirando el punto de mayor
absorbancia en el gráfico pH vs Absorbancia
Tabla 5. pH vs Absorbancia
pH Absorbancia
3.13 0.223
3.61 0.241
3.85 0.395
4.02 0.426
4.21 0.462
4.44 0.417
4.66 0.394
5.23 0.235
5.66 0.219
6.21 0.213
Gráfico 2. pH vs Absorbancia
0.45
Absorbancia
0.4
0.35
0.3
0.25
0.2
3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5
pH
Para determinar el punto isoeléctrico de la caseína se acidifico con ácido acético, el cual
permite que precipite en un pH igual o cercano a su punto isoeléctrico, debido a que la caseína
en la leche está presente como caseinato de calcio y al agregar el ácido se remueve el calcio
y el fosfato de calcio dejando a la caseína aislada. Al estar precipitada la caseína esta
incrementa la carga negativa debido a un proceso de disociación de los iones de calcio en
relación al descenso de pH y después vuelve a descender este por la asociación con iones de
hidrógeno. Por consiguiente, al estar la caseína en precipitación tendrá bastantes moléculas
en suspensión por lo que absorberá una mayor cantidad de luz cuando pase el haz de luz del
espectrofotómetro [10].
La caseína está compuesta por a, b y k-caseína las cuales tienen puntos isoeléctricos
diferentes en un rango de 4.4 a 5.7, en promedio de 4.6 según lo reportado en la literatura,
como se observa en la Gráfica 2, esta posee un valor máximo de absorbancia a un pH 4.2,
por lo que se corrobora el punto isoeléctrico ya que se encuentra en el rango y es cercano al
teórico [11].
Electroforesis
Se utilizó un marcador de gel Tris-Glicina al 15%, a la cual se le midió la distancia recorrida
según el gel por cada peso molecular reportado.
Figura 1. Recorrido de las sustancias en el gel de poliacrilamida.
En el gel de electroforesis solo pudo observarse como las tres siembras corrieron sobre esta,
posiblemente la concentración de las muestras B y C (que fueron más altas que la muestra
A) permitió una mejor lectura y desplazamiento de sus aminoácidos sobre el gel de
poliacrilamida.
Tabla 6. Datos de distancia recorrida en función de peso molecular.
Peso Distancia
Molecular recorrida
(kDa) (cm)
175 0.6
130 1
95 1.6
70 2.1
62 2.7
51 3.4
42 4.4
29 5.6
22 6.8
14 7.5
A partir de los datos obtenidos en la tabla, se procederá a hacer una gráfica con regresión
semilogarítmica como sigue:
Gráfica 3. Distancia recorrida (cm) vs Logaritmo (Peso molecular kDa).
2.1
1.5
1.3
1.1
1 2 3 4 5 6 7 8
Distancia recorrida (cm)
A partir de la curva podemos obtener la ecuación de la recta, esto es, log 𝑦 = −0.136𝑥 +
2.216
Con las medidas de corrido de la muestra B (medido también con una regla), la cual es la
más notoria dentro de la gel es posible calcular un peso molecular aproximado a partir de la
regresión semilogarítmica de la Gráfica No 3.
𝑃. 𝑀 (𝑘𝐷𝑎) = 10−0.136𝑥 + 2.216
Tabla 7. Distancia recorrida de las manchas en el gel de electroforesis y peso molecular (kDa)
Mancha Distancia Peso (kDa)
(cm)
A 5.4 30.31
B 5.7 27.59
C 6.2 23.59
D 7.3 17.25
Primero, la lactoglobulina tiene un peso molecular aproximado de 18.4 kDa y se encuentra
principalmente en el suero de la leche bovina [12], comparando este peso molecular con el
obtenido para la mancha D se pueden ver que son bastante parecidas con un error porcentual
de 6.25%, error bastante pequeño por lo que se podría decir que una de las proteínas extraídas
de la leche de laboratorio es la -lactoglobulina
En segundo lugar, las manchas A, B y C con pesos calculados de 30.31, 27.59 y 23.59 kDa
respectivamente, concuerda en gran medida con las reportadas en el rango de caseínas ( ,
y k-caseina)
Figura 2. Electroforesis de una muestra de leche [13]
Como se puede observar en la Figura 2 no se puede obtener el peso exacto de cada uno de
los 3 tipos de caseínas, pero se puede observar que están entre el rango de 20-30 kDa, rango
que concuerda con el peso calculado de la tabla 7. Así, las manchas A, B y C obtenidas por
electroforesis dan fe de que se logró extraer caseína de la muestra de leche. Aun así, a partir
de datos teóricos se nota lo siguiente: la -caseína tiene un peso molecular entre 25.230 y
27.370 kDa, la -caseína tiene un peso aproximado entre 22.944 y 24.092 y la -caseína
oscila entre 20kDa aproximadamente [14], es decir, en orden de magnitud; la b-caseína
tiene el peso molecular mas grande y la k-caseína el más bajo por lo que, las manchas A, B
y C podrían corresponder a , , y -caseína, proteínas que se presentan en gran
concentración en la leche bovina.
Aunque los pesos moleculares obtenidos no son cercanos a los reportados en la literatura,
hay que tener en cuenta que estos pesos fueron calculados a través de una regresión semi-
logarítmica con un R2 bastante alejado a 1 haciendo que el cálculo a través de la ecuación de
la recta empiece a desviarse del valor real de una manera significativa. Además, la distancia
recorrida es una medida relativa que depende del experimentador, la distancia recorrida tanto
por las muestras como por el marcador pueden ir variando de experimentador en
experimentador, haciendo que el error sistemático creciera por cada medida realizada. Se
pudo mejorar la medición de la distancia recorrida aumentando el número de medidas, así
como el número de experimentadores que realizaran esta medida para hacer una
normalización de ésta.
El tiempo empleado para que todas las muestras junto con el marcador corrieran es un factor
crucial para el buen análisis de la muestra, como se puede notar en la figura 1 no se puede
ver como todos los pesos del marcador son notorios en el gel, además de cómo se puede ver
como las 3 muestras lograron correr sobre el gel, el tiempo empleado para que las proteínas
corran sobre el gel debe ser el estipulado y no el mínimo con el fin de poder cualificar todas
las muestras.
BIBLIOGRAFÍA