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TRABAJO DE GRADO
Requisito parcial para optar al título de Tecnólogo Químico
Presentado por:
1
GRUPO POLIFENOLES
TRABAJO DE GRADO
Requisito parcial para optar al título de Tecnólogo Químico
Presentado por:
Director
Asesor
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GRUPO POLIFENOLES
Presentado por:
El suscrito director y jurados del presente trabajo de grado, una vez revisada la
versión escrita y presenciado la sustentación oral, decidimos otorgar la nota de:
______________________
_____________________________
El director: _________________________________
Francisco Javier Jiménez González
Jurado: _______________________________
Dr. Oscar Marino Mosquera
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DEDICATORIA
A mi abuelita que aunque ya no está conmigo fue uno de mis motivos para seguir
adelante ¡SIEMPRE ESTARAS EN MI CORAZÓN!
A mi madre Liliana Osorio, quien me ha brindado el mejor ejemplo para ser una mujer
virtuosa, por sus consejos de aliento y por tantas noches de insomnio a mi lado. A mi
padre José Fernando Salazar, por siempre brindarme su apoyo e inculcarme el amor de
Dios, a mi abuela Nubia Ramírez, por alimentarme con el amor más puro que pueda
existir y por enseñarme con dulzura lo que significa la palabra disciplina.
A toda mi familia, por la cual siento un gran orgullo y agradecimiento, aquí incluyo a mi
amigo del alma Jhon Fredy Sánchez, por todos los momentos que vivimos juntos.
Y a Natalia Cardona, por ser una excelente compañera y apoyarme cuando más la
necesite.
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AGRADECIMIENTOS
Por último al grupo Polifenoles por darnos la oportunidad de desarrollar este trabajo en
sus instalaciones y prestarnos todos sus servicios.
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TABLA DE CONTENIDO
Pág.
RESUMEN ...................................................................................................................... 13
INTRODUCCIÓN ........................................................................................................... 15
1. ANTECEDENTES...................................................................................................... 17
1.1 SURGIMIENTO DEL PROBLEMA ................................................................ 20
1.2 FORMULACIÓN DEL PROBLEMA ................................................................... 21
1.3 OBJETIVOS .......................................................................................................... 21
1.3.1 Objetivo general .............................................................................................. 21
1.3.2 Objetivos específicos ....................................................................................... 21
1.4 JUSTIFICACIÓN .................................................................................................. 22
2. MARCO TEÓRICO .................................................................................................... 23
2.1. Descripción y distribución de la familia melastomataceae ................................... 23
2.1.1 Farmacognosia de la familia melastomataceae ............................................... 23
2.2 Descripción y componentes químicos del género Henriettella y la especie
Henriettella trachyphylla ............................................................................................. 24
2.2.1 Henriettella Naudin ......................................................................................... 24
2.2.2 Henriettella trachyphylla Triana. .................................................................... 25
2.3 Aleloquímicos ........................................................................................................ 25
2.3.2 Germinación .................................................................................................... 27
2.4 Actividad antibacteriana......................................................................................... 29
2.4.1 Descripción de bacterias empleadas ................................................................ 29
2.4.2 Descripción de antibióticos empleados ........................................................... 31
2.5 Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia (HPLC) ............................................... 32
3. SECCIÓN EXPERIMENTAL ..................................................................................... 34
3.1 Materiales y reactivos ............................................................................................ 34
3.2 Disolventes ............................................................................................................. 34
3.3 Equipos ................................................................................................................... 34
3.4 Material vegetal ...................................................................................................... 34
3.5 Prueba preliminar para selección de semillas de lechuga o tomate ....................... 36
3.5.1 Semillas ........................................................................................................... 36
3.5.2 Agua pretratada ............................................................................................... 36
3.5.3 Lavado ............................................................................................................. 36
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Índice de Tablas
Pág.
Tabla 1. Desviaciones y media de la fracción F1-C……………………….……………54
Tabla 2. Desviaciones y media de la fracción F1-D.……………………….…...………55
Tabla 3. Desviaciones y media de la fracción F1-F……………………………….……55
Tabla 4. Resultados actividad antibacteriana……………………………………...……57
Tabla 5. Pruebas para caracterización química………………………………...……….58
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Índice de Figuras
Pág.
Figura 1. Estructuras químicas de agentes alelopáticos presentes en diferentes plantas. 18
Figura 2. Compuestos aisladas de H. fascicularis ........................................................... 25
Figura 3. Etapas de la germinación en dicotiledóneas (Jean-Yves et al., 2006). ............. 28
Figura 4. Escherichia coli ................................................................................................ 30
Figura 5. Pseudomonas aeruginosa ................................................................................. 30
Figura 6. Amoxicilina ...................................................................................................... 31
Figura 7. Ampicilina ........................................................................................................ 32
Figura 8. Equipo HPLC ................................................................................................... 33
Figura 9. Procedimiento de extracción de las hojas de Henriettella trachyphylla (Isaza et
al., 2005). ......................................................................................................................... 36
Figura 10. Lavado de semillas ......................................................................................... 37
Figura 11. Germinación de semillas en agua ................................................................... 37
Figura 12. Germinación de semillas en DMSO ............................................................... 38
Figura 13. Control con glifosato ...................................................................................... 38
Figura 14. Esterilización de semillas de Lechuga............................................................ 39
Figura 15. Diluciones para la preparación de antibióticos............................................... 41
Figura 16. Diluciones para la preparación de fracciones ................................................. 42
Figura 17. Diagrama de siembra en profundidad ........................................................... 43
Figura 18. Diagrama de distribución y elaboración de los pozos .................................... 44
Figura 19. Diagrama de medición del halo de inhibición. ............................................... 45
Figura 20. Reacción de cloruro férrico ............................................................................ 45
Figura 21. Reacción con solución de acetato de plomo .................................................. 46
Figura 22. Reacción del anillo benzopirona en presencia de ácido clorhídrico y
magnesio .......................................................................................................................... 46
Figura 23. Reacción de la prueba con gelatina-sal .......................................................... 47
Figura 24. Estructuras de los componentes de un tanino hidrolizable............................. 47
Figura 25. Reacción coloreada para taninos condensados ............................................... 48
Figura 26. Separación cromatográfica de la fracción F1-F ............................................. 50
Figura 27. Germinación de semillas de lechuga con agua ............................................... 51
Figura 28. Germinación de semillas de tomate en agua .................................................. 52
Figura 29. Germinación de semillas de tomate con glifosato .......................................... 52
Figura 30. Porcentaje germinación para de la fracción F1-C .......................................... 54
Figura 31. Porcentaje germinación para de la fracción F1-D .......................................... 54
Figura 32. Porcentaje germinación para de la fracción F1-F ........................................... 55
Figura 33. Evaluación de antibióticos frente a microorganismos de prueba ................... 57
Figura 34. Cromatograma fracción F1-C a 260 nm ......................................................... 59
Figura 35. Cromatograma fracción F1-D a 260 nm......................................................... 59
Figura 36. Cromatograma fracción F1-F a 260 nm ......................................................... 59
Figura 37. Cromatograma fracción F1-C a 330 nm ......................................................... 60
Figura 38. Cromatograma fracción F1-D a 330 nm......................................................... 60
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Índice de Anexos
Pág.
ANEXO 1. Tablas primer ensayo germinación de semillas de lechuga. ......................... 79
ANEXO 2. Tablas primer ensayo de germinación semillas de tomate ........................... 87
ANEXO 3. Antibiograma ................................................................................................ 95
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RESUMEN
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ABSTRACT
In this study, were evaluated allelopathic and antibacterial activity of polar fractions F1-
C, F1-D and F1-F obtained from Henriettella trachyphylla Triana, belonging to
melastomataceous family against lecttuce (Lactuca sativa L.) seeds and Gram negative
strain bacterias Escherichia coli (ATCC 25922) and Pseudomonas aeruginosa (ATCC
27853), respectively.
F1-F fraction was separated on chromatography column packed with Toyopearl HW-
40C, obtained seven fractions, which were monitored by reverse phase plate TLC,
namely as F1-F1 to F1-F7.
F1-F5 fraction showed blue color spots, which were collected after separated by
preparative plate on silice gel reverse phase, namely as F1-F5-A to F1-F5-G. F1-F5-E,
F1-F5-F and F1-F5-G fractions were purified and carried to GC/MS and proton-carbon
NMR structural determination.
Allelopathic activity against to lecttuce (Lactuca sativa L.) seeds germination from F1-C
fractions presented percentage germination (75,56%) to 0,05 mg/mL concentration, F1-
D fraction presented germination percentage (31,11%) to 0,8 mg/mL concentration, and
the F1-F fraction at a concentration of 0.8 mg/mL had the lowest value (44.44%) of
germination, which suggests that this fraction can act better as promotor agent. This
assay was presented at 36 hours into the test.
The evaluation of the antibacterial activity F1-C, F1-D and F1-F fractions weren´t
showed inhibition against the growth of E. coli and P. aeruginosa to 1000, 500, 250, 125
and 62.5 mg/mL concentrations.
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INTRODUCCIÓN
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1. ANTECEDENTES
En los últimos años la actividad alelopática se ha presentado como una alternativa viable
para incrementar los niveles de producción por cosecha y prevenir el uso indiscriminado
de herbicidas sintéticos, los cuales generan costos elevados en la producción y conllevan
a problemas de contaminación por residuos de los mismos en el producto recolectado, o
como en otras ocasiones contaminación cruzada a otros cultivos y ríos cercanos en áreas
de actividad agrícola (Macías et al., 2000).
La manipulación adecuada de los cultivos, utilizando la alelopatía para la mejora de la
productividad de los mismos, ayuda a la protección del medio ambiente a través del eco-
amigable control de malezas y plagas, la conservación de nitrógeno en la tierra de
cultivo y la síntesis de nuevos productos agroquímicos a base de productos naturales,
han ganado la atención prominente del científico dedicado a esta investigación (Sang-Uk
et al., 2005).
Se ha confirmado que los metabolitos secundarios constituyen una fuente de productos
naturales con actividad biológica diversa, comprobándose su actividad antibacteriana,
antifúngica, antiviral, antineoplásica, anticancerígena, anticoagulante, citotóxica entre
otras. Esta gama de propiedades, permite a estos compuestos tener un gran potencial de
aplicación, ya sea aislados o usando directamente el extracto o infusión del compuesto al
que se le ha detectado una actividad biológica específica, empleándose como precursor
en la síntesis de compuestos orgánicos o para caracterizar la estructura de sus centros
activos con el fin de modelar nuevas sustancias con propiedades prestablecidas.
El creciente interés por el estudio de los metabolitos secundarios ha dado origen a la
descripción de un gran número de compuestos. Esto ha sido motivado por inquietudes
farmacológicas en un principio y, posteriormente, por conocer el rol que estos
metabolitos desempeñan durante el ciclo vital de los organismos que los sintetizan, así
como, llegar a comprender cómo estos compuestos contribuyen al funcionamiento de los
sistemas ecológicos (Organization for Tropical Studies).
La naturaleza química de los agentes alelopáticos es muy variada. (Rivenshield, 2008)
Según estudios, los compuestos fenólicos tales como los ácidos ferúlico (Fig. a) y
caféico (Fig. b) identificados en los tejidos de las plantas y en los exudados de raíces de
tomate, pepino, alfalfa, arroz y avenilla pueden inducir efectos fitotóxicos en tomate,
lechuga y pepino (Loffredo et al.,2005).
Un compuesto que causa inhibición del crecimiento ha sido recientemente aislado de los
exudados de arroz, y su estructura química fue determinada por los datos espectrales
como momilactona B (Fig. c), la cual impidió el crecimiento de plántulas de berro y de
lechuga a concentraciones superiores de 3 y 30 mmol/L respectivamente (Kato-Noguchi
et al.,2005).
Un estudio más reciente, sugiere que la radiación UV no sólo aumenta la concentración
de la momilactona B en las semillas de arroz, sino también su secreción a la rizósfera,
proporcionándole una ventaja competitiva a través de la inmovilización local de los
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O OH O OH
CH3 HO
O OH
O
CH3 CH3 O
(a) (b) (c)
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1.3 OBJETIVOS
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1.4 JUSTIFICACIÓN
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2. MARCO TEÓRICO
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GRUPO POLIFENOLES
O CN
O
HO
HO
OH
OH HO
Taxyphyllin -sitosterol
a. b.
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GRUPO POLIFENOLES
CH3
COOH
HO O HO
H3C
OH O
OH
4´,5,7-trihidroxi-6,8-dimetilisoflavona ácido sesterterpenoico
c. d.
Figura 2. Compuestos aisladas de H. fascicularis
2.3 Aleloquímicos
Los aleloquímicos son en gran parte clasificados como metabolitos secundarios de
lasplantas, que juegan un papel importante en interacciones o defensas en las plantas y
en mecanismos ecológicos. Los aleloquímicos están presentes prácticamente en todos
los tejidos vegetales, incluyendo hojas, flores, frutos, tallos, raíces, rizomas, las semilla y
el polen. Pueden ser liberados de las plantas al medio ambiente a través de
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por lo cual se deben plantear nuevas alternativas de control (Nivia, 2000; Cuenca et al.,
2004).
Los extractos vegetales con propiedades alelopáticas son de fácil degradación en el
control de las arvenses y se pueden obtener de tal manera que sean selectivos dentro de
los cultivos, lo cual regula las cantidades demandadas por el mismo. La importancia de
avanzar en el estudio de la actividad alelopática de extractos vegetales, se manifiesta en
la disminución de los costos de mantenimiento de los cultivos y en la reducción del
impacto ambiental que causa el uso de herbicidas (Macías et al.,2000).
Las estrategias alelopáticas apuntan a la reducción de la polución ambiental y a
mantener un balance ecológico en la flora y la fauna, con la disminución en el uso de
pesticidas (insecticidas, fungicidas, nematicidas y herbicidas) sustituyendo estos por
compuestos naturales (plantas y microorganismos); los aleloquímicos y fitoquímicos
están libres de todos estos problemas asociados con la presencia de pesticidas. Por esto
la alelopatía es un área prioritaria de investigación en la mayoría de los países del mundo
(Min et al., 1997).
2.3.2 Germinación
Durante las dos últimas décadas, la ciencia de la alelopatía ha atraído un gran número de
investigadores. Esto ha sido en gran medida, por las perspectivas de que la alelopatía es
válida en la agricultura y la calidad en la producción de alimentos para humanos. En
reducir los daños ambientales por la dependencia a los herbicidas sintéticos y los riesgos
generados, en ocasiones por contaminación cruzada a otros cultivos y ríos cercanos en
áreas de actividad agrícola (An et al., 2003).
Compuestos que inhiben la germinación son llamados fitotóxicos, producidos por
plantas que tienen relación específica e inter-específica para la competición por
nutrientes del medio. La búsqueda de aleloquímicos es un campo de investigación
creciente, en relación a que dichos compuestos pueden ser desarrollados como
herbicidas en la agricultura. Uno de los bioensayos más comunes para aleloquímicos es
usar semillas de lechuga (Lactuca sativa L.) en la prueba de germinación en cajas de
Petri, como esta es generalmente una especie sensible a los aleloquímicos, es de fácil
adquisición y su germinación es rápida y uniforme. El aislamiento de los compuestos
bioactivos es usualmente a partir del fraccionamiento de un extracto.
Para que el proceso de germinación ocurra es necesario que la semilla pase por tres fases
(Jean-Yves et al., 2006) la fase de hidratación, la fase de germinación y la fase de
crecimiento. La fase de hidratación, es donde todos los tejidos internos absorben agua y
la semilla aumenta su proceso respiratorio. En la fase de germinación, se producen
transformaciones bioquímicas y fisiológicas internas y se reduce el consumo de agua;
dentro de esta fase se encuentran cuatro etapas como se ilustra en la (Fig. 3), desde el
brote de la radícula hasta la formación de la primera hoja.
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propiedades que pueden acelerar o retardar los procesos de crecimiento de las semillas
(Bertín et al., 2011).
2.4.1.1 Estructura
Constan de un citoplasma y un material nuclear. Están separadas del exterior por una
membrana citoplasmática, que está rodeada por una pared celular. No posee membrana
nuclear, ni organelas celulares y el citoplasma está lleno de ribosomas. La membrana
citoplasmática es el lugar de obtención de energía por respiración o fotosíntesis; toda la
información genética del procariota se encuentra en un solo filamento de DNA. Esta
molécula de DNA se presenta como una hebra circular y cerrada; su contorno mide de
0,25 mm a 3 mm. En muchas bacterias se ha encontrado DNA extra cromosómico; los
cuales son moléculas pequeñas, igualmente circulares y cerradas, que se denominan
plásmidos (Schiegel et al., 1997).
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2.4.2.1 Amoxicilina
La amoxicilina (Fig. 6) es un antibiótico semisintético derivado de la penicilina. Se trata
de una amino penicilina. Actúa contra un amplio espectro de microorganismos, tanto
Gram positivos como Gram negativos. Por esto se emplea a menudo como primer
remedio en infecciones de diferente gravedad, tanto en medicina humana como también
en veterinaria. Se utiliza por vía oral o parenteral, aunque la forma parenteral
(intramuscular ointravenosa) no está aprobada en todos los países debido a su
comprobado daño al sistema auditivo y renal, causando en algunos casos sordera.
Como las demás penicilinas la amoxicilina impide en las bacterias la correcta formación
de las paredes celulares. Concretamente inhibe la conexión entre las cadenas
peptidoglicáneas lineares que forman la mayor parte de las paredes de los
microorganismos Gram positivos. Al impedir que la pared celular se construya
correctamente, la amoxicilina ocasiona, en último término, la lisis de la bacteria y su
muerte.
HO
O
H H
S CH3
N
NH2 H N
CH3
O
COOH
Figura 6. Amoxicilina
2.4.2.2 Ampicilina
La ampicilina (Fig. 7) es un antibiótico penicilínico semisintético, de amplio espectro y
activo por vía oral. Aunque es más activo que las penicilinas naturales no estable frente
a las beta-lactamasa producidas por bacterias Gram positivas o Gram negativas. La
ampicilina se utiliza para el tratamiento de infecciones debidas a organismos
susceptibles como la otitis media, la sinusitis y las cistitis. Debido al aumento de
resistencias ya no se recomienda la ampicilina para el tratamiento de la gonorrea.
Los antibióticos beta-lactámicos como la ampicilina son bactericidas. Actúan inhibiendo
la última étapa de la síntesis de la pared celular bacteriana uniéndose a unas proteínas
específicas llamadas PBPs (Penicillin-Binding Proteins) localizadas en la pared celular.
Al impedir que la pared celular se construya correctamente, la ampicilina ocasiona, en
último término, la lisis de la bacteria y su muerte.
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GRUPO POLIFENOLES
NH2 H
S CH3
NH
N
CH3
O
O
OH
O
Figura 7. Ampicilina
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GRUPO POLIFENOLES
Horno
Sistema de elución
Bomba
Columna
Automuestreador inteligente
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GRUPO POLIFENOLES
3. SECCIÓN EXPERIMENTAL
3.2 Disolventes
Tanto en las separaciones cromatográficas, como en las cromatografías se utilizaron
disolventes grado analítico (Merck). Para HPLC, estos se filtraron y sometieron a
ultrasonido.
3.3 Equipos
Se utilizó un equipo de ultrasonido Fisher Scientific FS60H, balanza analítica OHAUS
Advance, rotaevaporador Heidolph Laborota 4003-control, cámara de revelado UV
Camag, incubadora Velp scientific FOC 225i y un espectrofotómetro UV/Vis Shimadzu
UV-1700 PharmaSpec (laboratorio de Fitoquímica).
Para el análisis por HPLC, se empleo un equipo Jasco HPLC 2000 Plus. Sistema
equipado con bomba de gradiente cuaternario PU-2089 Plus, automuestreador
inteligente AS-2059 Plus, horno para columna CO-2065 Plus, columna Cromolith
Performance RP-18 endcapped (100-4,6 mm), detector inteligente de arreglo de diodos
MD-2015 Plus y LC Net II/ADC, controlado por el Software EZChrom Elite.
Sistema de elución isocrático con ácido fosfórico 0.05%-isopropanol (95:5), flujo 0.5
µL/min, volumen de inyección 15 µL, presión (0-250) bar, temperatura del horno 35 °C,
tiempo de corrido 10 minutos.
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GRUPO POLIFENOLES
Figura 9. Procedimiento de extracción de las hojas de Henriettella trachyphylla (Isaza et al., 2005).
3.5.1 Semillas
Las semillas de lechuga (Lactuca sativa L.) y tomate (Lycopersicum esculentum Mill.)
fueron compradas a Fercon Ltda, estas se mantuvieron y trataron a condiciones de
laboratorio (laboratorio de Fitoquímica).
3.5.3 Lavado
Las semillas de lechuga y tomate se lavaron con agua pretratada (Fig. 10).
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GRUPO POLIFENOLES
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GRUPO POLIFENOLES
Después de tener las semillas en caja Petri para su germinación en agua, DMSO y
glifosato se dejaron germinar durante 5 días (120 horas) a condiciones ambiente del
laboratorio y privadas de la luz solar.
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GRUPO POLIFENOLES
3.6 Ensayo de germinación para semillas de lechuga frente a las fracciones F1-C,
F1-D y F1-F
Agua pretratada
3.6.3 Germinación
Las soluciones preparadas a concentraciones de 0,05 mg/mL, 0,1 mg/mL, 0,5 mg/mL,
0,8 mg/mL. Se adicionaron sobre dos hojas de papel filtro colocadas dentro de una caja
de Petri. Posterior a esto se mantuvieron en cámara de flujo laminar 25 °C hasta
sequedad. Luego se adiciono a cada caja de Petri 4 mL de Tween 20 al 0.05%. El Tween
20 es utilizado a concentraciones menores de 0,05% en volumen en ensayos de actividad
alelopática, sin que se presente alguna acción inhibitoria o promotora de germinación
sobre las semillas de prueba. Por último se procedió a colocar 15 semillas bien
distribuidas por caja, estas se dejaron en oscuridad por 36 horas a temperatura ambiente.
Este ensayo se realizo por triplicado. Después de esto se contaron las semillas
germinadas y se tomó el registro para su análisis posterior (Kato-Noguchi et al., 2005).
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GRUPO POLIFENOLES
acumulado de semillas por horas con cero (0). Los datos obtenidos se trataron con
estadística clásica para determinar porcentaje de germinación y desviación estándar, así
como las gráficas en las que se muestra la información será llevado a cabo por medio del
programa GraphPad Prism versión 6.00 (Trial), versión libre para descarga en la página
web: http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/
3.7.1 Microorganismos
Para la actividad antibacteriana se usaron cepas liofilizadas, replicadas en BHI, de los
microorganismos Escherichia coli (ATCC 25922) y Pseudomonas aeruginosa (ATCC
27853).
3.7.2 Antibiograma
Se evaluó por el método de difusión en agar (Ramírez y Díaz, 2007) frente a los
antibióticos: ampicilina sódica y amoxicilina a concentraciones recomendadas de 1000,
500, 250, 125 y 62,5 ppm, y un blanco de una solución de DMSO al 5%.
Con este ensayo se determina la sensibilidad o resistencia de los microorganismos frente
a los antibióticos de prueba, tomando como base el promedio de las réplicas de medición
del halo de inhibición a la menor concentración. Según este criterio de selección, las
fracciones que presenten halos de inhibición mayores en relación al antibiótico de
prueba se tomarán como fracción activa frente a los microorganismos.
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GRUPO POLIFENOLES
3.7.6 Controles
Para la actividad antibacteriana se utilizo como control amoxicilina y ampicilina anhídra
sódica, y como blanco DMSO al 5% (Wadhwani et al., 2009)
1000 ppm 500 ppm 250 ppm 125 ppm 62,5 ppm
41
GRUPO POLIFENOLES
de 1000 ppm, y a partir de estas se realizaron las diluciones respectivas (Fig.16) hasta
llegar a concentraciones de 500, 250, 125 y 62,5 ppm.
1000 ppm 500 ppm 250 ppm 125 ppm 62,5 ppm
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GRUPO POLIFENOLES
100 uL de cultivo
0,1 de abs a 540 nm
25 mL de agar
a 45 °C
Homogenizar en forma de 8 y
dejar solidificar
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GRUPO POLIFENOLES
1 2
1: Control
2: Blanco DMSO
5
3: Fracción C: 1000 ppm
4: Fracción D: 1000 ppm
3 4 5: Fracción F: 1000 ppm
15 uL de agar a 45 °C
en cada pozo dejar enfriar
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GRUPO POLIFENOLES
OH
O-
+ FeCl3 Fe + 3HCl
Complejo coloreado
Figura 20. Reacción de cloruro férrico
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GRUPO POLIFENOLES
OH O-
+ (CH3COO-)2Pb Pb
OH
OH
OH
OH
OH O
OH O+
Mg/HCl
OH O
OH
Figura 22. Reacción del anillo benzopirona en presencia de ácido clorhídrico y magnesio
A 1 mL del extracto etanólico en un tubo de ensayo se agregó magnesio en polvo y gotas
de ácido clorhídrico. Se utilizó como patrón de reacción el extracto etanólico de las
hojas de Rosácea.
46
GRUPO POLIFENOLES
OH
-O
OH
HO CO2
R-CO-NH-R'-CO-NH-R´´+RCO-NH-R´-CO-NH-R''
HO CO2-
HO
-O
OH
HO O2C
HO
CO2-
OH OH
HO OH HO
HO COOH
Taninos hidrolizables
COOH HOOC OH
Ácido gálico
OH
OH
Ácido elágico
A una gota de la muestra se le adiciono 3 gotas de etanol, luego una poca cantidad de
nitrito de sodio, y por último unas gotas de ácido acético.
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GRUPO POLIFENOLES
OH
OH
HO O
Subunidades de extensión
OH
OH
OH
OH
HO O
n
R1
OH
OH
OH
HO O
R2
Subunidad terminal
OH
OH
R1
HCl-n-butanol Calor
OH
HO O
R2
OH
OH
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GRUPO POLIFENOLES
3.9.1.1 Revelado UV
Al emplear una lámpara ultravioleta, cualquier sustancia orgánica que contenga un
grupo cromóforo (una parte de la molécula que absorbe la radiación UV) aparecerá
sobre la placa como una mancha oscura sobre un fondo luminoso. La mayoría de los
adsorbentes en CCD contiene un compuesto fluorescente, que cuando se expone a la
radiación UV aparece como un fondo luminoso. Teniendo en cuenta que el material
orgánico se deposita sobre la superficie del adsorbente (Durst y Gokel, 1985).
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CC-Toyopearl HW40C
MeOH- Agua (10-90 hasta 80-20)
Agua- i-PrOH (5-95 hasta 40-60)
50
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4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
13%
0
38
47
63
72
0
11
12
Tiempo (Horas)
51
GRUPO POLIFENOLES
30
Acumulado semillas germinadas
Semillas germinadas
83% en horas (por todas las cajas)
73%
Semillas germinadas en horas
20 por cada caja
47%
10 27%
0
38
47
63
72
Tiempo (Horas)
Por el contrario, al someter las semillas a germinación frente a una solución de DMSO
al 0,33% v/v (ver anexos 1 y 2, cajas 1a, 1b y 1c), el cual se utiliza para disolver los
metabolitos que difícilmente se solubilizan en agua, marca una tendencia de inhibición
de la germinación en ambas especies receptoras durante las 120 horas del ensayo. Por
este motivo, se decide utilizar Tween 20 al 0,05% como medio para solubilizar las
fracciones a evaluar (Kato-Noguchi & Macías, 2005).
Al utilizar glifosato como control de inhibición de la germinación en ambas especies a la
concentración de 3,7x10-2 M (ver anexos 1 y 2, cajas 3a, 3b y 3c), evidenció una
tendencia de inhibición de germinación para las semillas de lechuga, pero en las semillas
de tomate potenció la germinación (Fig. 29), siendo un resultado promisorio para este
estudio.
El resultado obtenido con el glifosato muestra como hay una germinación atribuible
posiblemente a que el glifosato en bajas concentraciones actúa como potenciador de
germinación y crecimiento en plántulas de distintas especies.
50%
10 27%
0
63
72
0
11
12
Tiempo (Horas)
52
GRUPO POLIFENOLES
Con este ensayo se demuestra como algunas especies receptoras son sensibles frente a
algunos herbicidas, los cuales a muy bajas concentraciones funcionan como
potenciadores de la germinación o crecimiento en especies receptoras. Los bioensayos
de germinación son probablemente los más comunes al momento de evaluar
aleloquímicos. La germinación (usualmente definida como la emergencia de la radícula),
como en este caso es determinada a intervalos de tiempo expresados como el porcentaje
de germinación de las semillas a un periodo o valor de germinación.
Aunque según Williams y Hoagland, debido a la solubilidad limitada en agua de algunos
aleloquímicos, sugieren la disolución de cantidades adecuadas de estas sustancias
inicialmente en DMSO, y luego diluir en agua hasta la concentración deseada (Macías et
al., 2003). Contenidos de 0,05% v/v de DMSO no tendrían efectos sobre la germinación.
Según esto, se deben realizar ensayos preliminares de germinación en una solución de
DMSO para determinar la concentración adecuada para la disolución de los
aleloquímicos.
De igual manera, el glifosato a concentraciones de entre 10-2 y 10-3 M no ocasionaría
falsos resultados en la germinación o crecimiento de plántulas. Aunque es posible, que
efectos aditivos o sinérgicos entre testigos de los ensayos pueden evaluarse usando
combinaciones de varios aleloquímicos.
4.2 Ensayo de germinación para semillas de lechuga frente a las fracciones F1-C,
F1-D y F1-F.
Después de elegidas las semillas de lechuga como especie receptora, se procedió a
realizar la evaluación de la germinación a las 36 horas después de iniciado el ensayo.
Las fracciones se disolvieron en metanol hasta alcanzar concentraciones finales de 0,05,
0,1, 0,5 y 0,8 mg/mL, esta solución se añadió sobre dos hojas de papel de filtro en caja
de Petri. El metanol se evaporo en cámara de flujo laminar, posteriormente el papel filtro
se humedeció con 4 mL de Tween 20 al 0,05% (v/v). El Tween 20 se utiliza como
tensoactivo y no causa ningún efecto tóxico ( Pokclai & Noguchi, 2011). Como control
de germinación se utilizó glifosato a una concentración de 3,7x10-2 M. Este ensayo se
realizó por triplicado.
Las cajas de Petri que contienen las diluciones de prueba y las semillas (15 semillas por
caja) se incubaron bajo la oscuridad a 25 °C, con lectura de la germinación a las 36
horas de iniciado el ensayo.
Con la información obtenida se construyeron las curvas de porcentaje de germinación de
semillas en función de las concentraciones evaluadas.
Los resultados obtenidos señalan que las fracciones F1-C, F1-D y F1-F (Fig. 29, 30 y
31) presentan a una concentración de 0,05 mg/mL una tendencia de germinación mayor
que a las demás concentraciones evaluadas. De esta manera a bajas concentraciones las
fracciones actúan como agentes promotores de la germinación, y por el contrario, altas
concentraciones actúan como inhibidores leves de la germinación.
53
GRUPO POLIFENOLES
100
% d e g e r m in a c ió n
80
60
40
20
0
0 .0 0 .2 0 .4 0 .6 0 .8 1 .0
c o n c e n t r a c ió n ( m g /m L )
CONCENTRACIÓN DS X
Para la fracción F1-D (Fig. 31) el resultado del porcentaje de germinación a una
concentración de 0,05 mg/mL es 64,44% y el obtenido a una concentración de 0,8
mg/mL corresponde a 31,11%.
80
% d e g e r m in a c ió n
60
40
20
0
0 .0 0 .2 0 .4 0 .6 0 .8 1 .0
c o n c e n t r a c ió n ( m g /m L )
54
GRUPO POLIFENOLES
CONCENTRACIÓN DS X
Para la fracción F1-F (Fig. 32), evaluada a una concentración de 0,05 mg/mL el
porcentaje de germinación corresponde al 75,56% y un porcentaje de germinación del
44,44% a una concentración de 0,8 mg/mL.
100
% d e g e r m in a c ió n
80
60
40
20
0
0 .0 0 .2 0 .4 0 .6 0 .8 1 .0
c o n c e n t r a c ió n ( m g /m L )
CONCENTRACIÓN DS X
De esta forma, se puede deducir que para las tres fracciones en estudio, la mejor
concentración evaluada para obtener altos porcentajes de germinación fue de 0,05
mg/mL. Por el contrario si se desea obtener bajos porcentajes de germinación, es decir
buenos agentes inhibitorios, se deben usar altas concentraciones, para este estudio la
mayor fue de 0,8 mg/mL.
55
GRUPO POLIFENOLES
De aquí se toman las fracciones F1-C y F1-F como promisorias para su fraccionamiento
en columna, aunque debido a su mayor rendimiento en masa se elige la fracción F1-F
como promisoria para separación cromatográfica en columna empacada sobre Toyopearl
HW40C.
De igual forma, al examinar el efecto de las fracciones evaluadas sobre las semillas de
lechuga se detecta una sensibilidad significativa (a concentraciones conocidas), pues las
variaciones en los porcentajes de germinación son pequeños. Un inconveniente común
en este bioensayo de germinación sugiere que algunas variedades de especies receptoras
no son tan sensibles a los metabolitos presentes en los extractos de las plantas o
fracciones de interés. Estos ensayos pueden llevarse a cabo bajo la oscuridad, en
condiciones que permiten un alargamiento del tallo más rápido, aumentando su
sensibilidad. Si la germinación de las semillas es retardada por los aleloquímicos, esto
refleja un retraso en el desarrollo de la plántula, generando un efecto directo negativo
sobre la especie receptora atribuido al compuesto activo.
56
GRUPO POLIFENOLES
E. Coli - Ampicilina
40
P. Aeroginosa - Ampicilina
30 P. Aeroginosa - Amoxicilina
20
10
00
5
0
.5
12
25
50
62
10
Concentración de antibióticos (mg/mL)
Concentración 1000 ppm 500 ppm 250 ppm 125 ppm 62,5 ppm
Amoxicilina + + + + -
Escherichia coli
Ampicilina + + + + -
F1-C - - - - -
F1-D - - - - -
F1-F - - - - -
Pseudomonas aeruginosa
Amoxicilina + + + + -
Ampicilina + + + + +
F1-C - - - - -
F1-D - - - - -
F1-F - - - - -
57
GRUPO POLIFENOLES
F1-C - - - - - -
F1-D + (verde) - - - - -
F1-F + (verde) - - - - -
58
GRUPO POLIFENOLES
4.5 Análisis cromatográfico por HPLC de las fracciones F1-C, F1-D y F1-F
59
GRUPO POLIFENOLES
60
GRUPO POLIFENOLES
C D F C D F C D F
C D F C D F
(d) (e)
Figura 40. Cromatoplacas de la fracción F1-F obtenidas con el sistema H2O–i-PrOH (6:4)
61
GRUPO POLIFENOLES
Los resultados obtenidos de los espectros realizados muestran poca información frente a
cada uno de los reactivos de desplazamiento. Aunque se muestra un leve desplazamiento
en las fracciones F1-D y F1-F figuras 48 y 52, respectivamente, al realizar el ensayo con
cloruro de aluminio. Esto puede ser debido a la presencia de compuestos de tipo fenolico
al ser evaluadas las mismas fracciones frente al reactivo de cloruro férrico.
Figura 41. Espectro fracción Figura 42. Espectro fracción F1-D Figura 43. Espectro fracción
F1-C en MeOH en MeOH F1-F en MeOH
Figura 44. Espectro fracción Figura 45. Espectro fracción F1-D Figura 46. Espectro fracción F1-F
F1-C con CH3ONa con CH3ONa con CH3ONa
Figura 47. Espectro fracción Figura 48. Espectro fracción F1- Figura 49. Espectro fracción F1-F
F1-C con CH3COONa D con CH3COONa con CH3COONa
62
GRUPO POLIFENOLES
Figura 50. Espectro fracción Figura 51. Espectro fracción F1-D Figura 52. Espectro fracción F1-F
F1-C con AlCl3 con AlCl3 con AlCl3
F-1F 2 4 6 8 10 12 14 16 18
Figura 53. Cromatoplaca #1 de las fracciones obtenidas del fraccionamiento de la fracción F1-F
63
GRUPO POLIFENOLES
20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50 52 54 56
Figura 54. Cromatoplaca #2 de las fracciones obtenidas del fraccionamiento de la fracción F1-F
Teniendo en cuanta la cromatoplaca anterior (Fig. 54) se decidió juntar las fracciones de
la 8 y 28 puesto a que no se evidencia ningún compuesto, convirtiéndose esta en la
fracción F1-F4 (7,0 mg), por lo contrario de la 29 y 38 al revelar en luz UV a 254 y 366
nm se observaron compuestos de interés (manchas de color azul), y se juntaron
convirtiéndose en la fracción F1-F5 (22,0 mg), y de la 39 y 52 F1-F6 (20,0 mg) , de la
54 y 94 (Fig. 54) es la fracción F1-F7 (8,0 mg).
58 60 62 64 66 68 70 72 74 76 78 80 82 84 86 88 90 92 94
Figura 55. Cromatoplaca #3 de las fracciones obtenidas del fraccionamiento de la fracción F1-F
Posterior a esto se procedió a tomar los siguientes espectros UV para cada fracción final,
adicionalmente se muestran las cromatoplacas respectivas:
64
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Rf = 3,7cm
Rf = 3,4cm
Rf = 2,9cm
65
GRUPO POLIFENOLES
Rf = 2,8cm
Rf = 1,6cm
Rf = 1,9cm
Rf = 2,5cm
66
GRUPO POLIFENOLES
Rf = 1,9cm
50
% d e r e n d im ie n t o
40
30
20
10
0
1
7
F
F
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
F
F r a c c io n e s
67
GRUPO POLIFENOLES
F1-F3 e Rf =8,2cm
F1-F3 d Rf =7,4cm
F1-F3c Rf =5,4cm
F1-F3 b Rf =4,1cm
F1-F3 a Rf =2,7cm
F1-F4 e Rf =8,1cm
F1-F4 d Rf =7,9cm
F1-F4 c Rf =5,2cm
F1-F4 b Rf =3,9cm
F1-F4 a Rf = 2,2cm
68
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F1-F5 g Rf =8,4cm
F1-F5 F Rf =7,5cm
F1-F5 e Rf =7,7cm
F1-F5 d Rf =5,0cm
F1-F5 c Rf =3,4cm
F1-F5 b Rf =2,4cm
F1-F5 a Rf = 1,6cm
Cuando se rasparon las manchas, se coloco cada una en un viales, se les adicionó
metanol y el sobrenadante se paso a otro vial, antes de evaporar el metanol se tomaron
placas en fase reversa (Fig. 67, 68, 69) y en un sistema agua-i-PrOH (6:4) de las tres
fracciones, las cuales se revelaron con luz UV a longitudes de onda de 254 nm y 366
nm.
Las placas se muestran a continuación:
F-1F3
1 2 3 4 5
69
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F-1F4
Rf =2,9cm
Rf =2,5cm
1 2 3 4 5
F-1F5
Rf =1,8cm
1 2 3 4 5 6 7
Como se puede observar en las placas anteriores (Fig. 68, 69) solo se evidencia
desplazamiento por parte de los compuestos en las placas F1-F4 y F1-F5, los cuales
muestran manchas de color azul, estas manchas se pueden observar mejor en la fracción
F1-F5, como se muestran a continuación:
F-1F5
Rf =1,8cm
1 2 3 4 5 6 7
70
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1 13
posterior análisis por RMN unidimensional de protón H y carbono C, y
bidimensional HSQC.
71
GRUPO POLIFENOLES
5. CONCLUSIONES
72
GRUPO POLIFENOLES
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RECOMENDACIONES
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ANEXOS
Los resultados de la germinación ubicados en las tablas de los anexos 1 y 2, que tienen
el signo (-) representan las semillas que no germinaron, el signo (+) las semillas que
germinaron, y el (0) se coloca como valor acumulado de las semillas ya germinadas en
la hora anterior.
H ora 3 Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Caja 1a - - - - - - - - - -
Caja 1b - - - - - - - - - -
Caja 1c - - - - - - - - -
Caja 2a - - - - - - - - - -
Caja 2b - - - - - - - - - -
Caja 2c - - - - - - - - - -
Caja 3a - - - - - - - - - -
Caja 3b - - - - - - - - - -
Caja 3c - - - - - - - - - -
79
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Hora 6 Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Caja 1a - - - - - - - - - -
Caja 1b - - - - - - - - - -
Caja 1c - - - - - - - - - -
Caja 2a - - - - - - - - - -
Caja 2b - - - - - - - - - -
Caja 2c - - - - - - - - - -
Caja 3a - - - - - - - - - -
Caja 3b - - - - - - - - - -
Caja 3c - - - - - - - - - -
Hora 9 Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Caja 1a - - - - - - - - - -
Caja 1b - - - - - - - - - -
Caja 1c - - - - - - - - - -
Caja 2a - - - - - - - - - -
Caja 2b - - - - - - - - - -
Caja 2c - - - - - - - - - -
Caja 3a - - - - - - - - - -
Caja 3b - - - - - - - - - -
Caja 3c - - - - - - - - - -
80
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Hora 13 Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Caja 1a - - - - - - - - - -
Caja 1b - - - - - - - - - -
Caja 1c - - - - - - - - - -
Caja 2a - - - - - - - - - -
Caja 2b - - - - - - - - - -
Caja 2c - - - - - - - - - -
Caja 3a - - - - - - - - - -
Caja 3b - - - - - - - - - -
Caja 3c - - - - - - - - - -
Hora 16 Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Caja 1a - - - - - - - - - -
Caja 1b - - - - - - - - - -
Caja 1c - - - - - - - - - -
Caja 2a - - - - - - - - - -
Caja 2b - - - - - - - - - -
Caja 2c - - - - - - - - - -
Caja 3a - - - - - - - - - -
Caja 3b - - - - - - - - - -
Caja 3c - - - - - - - - - -
81
GRUPO POLIFENOLES
Hora 20 Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Caja 1a - - - - - - - - - -
Caja 1b - - - - - - - - - -
Caja 1c - - - - - - - - - -
Caja 2a - - - - - - - - - -
Caja 2b - - - - - - - - - -
Caja 2c - - - - - - - - - -
Caja 3a - - - - - - - - - -
Caja 3b - - - - - - - - - -
Caja 3c - - - - - - - - - -
Hora 22 Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Caja 1a - - - - - - - - - -
Caja 1b - - - - - - - - - -
Caja 1c - - - - - - - - - -
Caja 2a - - - - - - - - - -
Caja 2b - - - - - - - - - -
Caja 2c - - - - - - - - - -
Caja 3a - - - - - - - - - -
Caja 3b - - - - - - - - - -
Caja 3c - - - - - - - - - -
82
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Hora 24 Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Caja 1a - - - - - - - - - -
Caja 1b - - - - - - - - - -
Caja 1c - - - - - - - - - -
Caja 2a - - - - - - - - - -
Caja 2b - - - - - - - - - -
Caja 2c - - - - - - - - - -
Caja 3a - - - - - - - - - -
Caja 3b - - - - - - - - - -
Caja 3c - - - - - - - - - -
Hora 30 Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Caja 1a - - - - - - - - - -
Caja 1b - - - - - - - - - -
Caja 1c - - - - - - - - - -
Caja 2a - - - - - - - - - -
Caja 2b - - - - - - - - - -
Caja 2c - - - - - - - - - -
Caja 3a - - - - - - - - - -
Caja 3b - - - - - - - - - -
Caja 3c - - - - - - - - - -
83
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Hora 38 Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Caja 1a - - - - - - - - - -
Caja 1b - - - - - - - - - -
Caja 1c - - - - - - - - - -
Caja 2a - - - - - - - - - -
Caja 2b - - - - - - + - + -
Caja 2c - - + + - - - - - -
Caja 3a - - - - - - - - - -
Caja 3b - - - - - - - - - -
Caja 3c - - - - - - - - - -
Hora 47 Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Caja 1a - - - - - - - - - -
Caja 1b - - - - - - - - - -
Caja 1c - - - - - - - - - -
Caja 2a - - - - + + + - + -
Caja 2b - - - - - + 0 + 0 +
Caja 2c - - 0 0 - - - - - -
Caja 3a - - - - - - - - - -
Caja 3b - - - - - - - - - -
Caja 3c - - - - - - - - - -
Caja 3c - - - - - - - - - -
84
GRUPO POLIFENOLES
Hora 63 Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Caja 1a - - - - - - - - - -
Caja 1b - - - - - - - - - -
Caja 1c - - - - - - - - - -
Caja 2a - - - - 0 0 0 - 0 -
Caja 2b - - - - - 0 0 0 0 0
Caja 2c - + 0 0 - + - - - -
Caja 3a - - - - - - - - - -
Caja 3b - - - - - - - - - -
Caja 3c - - - - - - - - - -
Hora 72 Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Caja 1a - - - - - - - - - -
Caja 1b - - - - - - - - - -
Caja 1c - - - - - - - - - -
Caja 2a - - + - 0 0 0 - 0 -
Caja 2b + - + - - 0 0 0 0 0
Caja 2c 0 0 0 - 0 - + - -
Caja 3a - - - - - - - - - -
Caja 3b - - - - - - - - - -
Caja 3c - - - - - - - - - -
85
GRUPO POLIFENOLES
Hora Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla
111 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Caja 1a - - - - - - - - - -
Caja 1b - - - - - - - - - -
Caja 1c - - - - - - - - - -
Caja 2a - + 0 + 0 0 0 - 0 -
Caja 2b 0 + 0 + + 0 0 0 0 0
Caja 2c + 0 0 0 - 0 + 0 + -
Caja 3a - - - - - - - - - -
Caja 3b - - - - - - - - - -
Caja 3c - - - - - - - - - -
Hora Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla
120 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Caja 1a - - - - - - - - - -
Caja 1b - - - - - - - - - -
Caja 1c - - - - - - - - - -
Caja 2a - 0 0 0 0 0 0 - 0 +
Caja 2b 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Caja 2c 0 0 0 0 + 0 0 0 0 +
Caja 3a - - - - - - - - - -
Caja 3b - - - - - - - - - -
Caja 3c - - - - - - - - - -
Caja 1 DMSO
Caja 2 Blanco
Caja 3 Glifosato
86
GRUPO POLIFENOLES
Hora 3 Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Caja 1a - - - - - - - - - -
Caja 1b - - - - - - - - - -
Caja 1c - - - - - - - - - -
Caja 2a - - - - - - - - - -
Caja 2b - - - - - - - - - -
Caja 2c - - - - - - - - - -
Caja 3a - - - - - - - - - -
Caja 3b - - - - - - - - - -
Caja 3c - - - - - - - - - -
Hora 6 Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Caja 1a - - - - - - - - - -
Caja 1b - - - - - - - - - -
Caja 1c - - - - - - - - - -
Caja 2a - - - - - - - - - -
Caja 2b - - - - - - - - - -
Caja 2c - - - - - - - - - -
Caja 3a - - - - - - - - - -
Caja 3b - - - - - - - - - -
Caja 3c - - - - - - - - - -
87
GRUPO POLIFENOLES
Hora 9 Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Caja 1a - - - - - - - - - -
Caja 1b - - - - - - - - - -
Caja 1c - - - - - - - - - -
Caja 2a - - - - - - - - - -
Caja 2b - - - - - - - - - -
Caja 2c - - - - - - - - - -
Caja 3a - - - - - - - - - -
Caja 3b - - - - - - - - - -
Caja 3c - - - - - - - - - -
Hora 13 Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Caja 1a - - - - - - - - - -
Caja 1b - - - - - - - - - -
Caja 1c - - - - - - - - - -
Caja 2a - - - - - - - - - -
Caja 2b - - - - - - - - - -
Caja 2c - - - - - - - - - -
Caja 3a - - - - - - - - - -
Caja 3b - - - - - - - - - -
Caja 3c - - - - - - - - - -
88
GRUPO POLIFENOLES
Hora 16 Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Caja 1a - - - - - - - - - -
Caja 1b - - - - - - - - - -
Caja 1c - - - - - - - - - -
Caja 2a - - - - - - - - - -
Caja 2b - - - - - - - - - -
Caja 2c - - - - - - - - - -
Caja 3a - - - - - - - - - -
Caja 3b - - - - - - - - - -
Caja 3c - - - - - - - - - -
Hora 20 Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Caja 1a - - - - - - - - - -
Caja 1b - - - - - - - - - -
Caja 1c - - - - - - - - - -
Caja 2a - - - - - - - - - -
Caja 2b - - - - - - - - - -
Caja 2c - - - - - - - - - -
Caja 3a - - - - - - - - - -
Caja 3b - - - - - - - - - -
Caja 3c - - - - - - - - - -
89
GRUPO POLIFENOLES
Hora 22 Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Caja 1a - - - - - - - - - -
Caja 1b - - - - - - - - - -
Caja 1c - - - - - - - - - -
Caja 2a - - - - - - - - - -
Caja 2b - - - - - - - - - -
Caja 2c - - - - - - - - - -
Caja 3a - - - - - - - - - -
Caja 3b - - - - - - - - - -
Caja 3c - - - - - - - - - -
Hora 24 Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Caja 1a - - - - - - - - - -
Caja 1b - - - - - - - - - -
Caja 1c - - - - - - - - - -
Caja 2a - - - - - - - - - -
Caja 2b - - - - - - - - - -
Caja 2c - - - - - - - - - -
Caja 3a - - - - - - - - - -
Caja 3b - - - - - - - - - -
Caja 3c - - - - - - - - - -
90
GRUPO POLIFENOLES
Hora 30 Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Caja 1a - - - - - - - - - -
Caja 1b - - - - - - - - - -
Caja 1c - - - - - - - - - -
Caja 2a - - - - - - - - - -
Caja 2b - - - - - - - - - -
Caja 2c - - - - - - - - - -
Caja 3a - - - - - - - - - -
Caja 3b - - - - - - - - - -
Caja 3c - - - - - - - - - -
Hora 38 Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Caja 1a - - - - - - - - - -
Caja 1b - - - - - - - - - -
Caja 1c - - - - - - - - - -
Caja 2a - - - - - - - - - -
Caja 2b - - - - - - - - - -
Caja 2c - - - - - - - - - -
Caja 3a - - - - - - - - - -
Caja 3b - - - - - - - - - -
Caja 3c - - - - - - - - - -
91
GRUPO POLIFENOLES
Hora 47 Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Caja 1a - - - - - - - - - -
Caja 1b - - - - - - - - - -
Caja 1c - - - - - - - - - -
Caja 2a - - - - - - - - - -
Caja 2b - - - - - - - - - -
Caja 2c - - - - - - - - - -
Caja 3a - - - - - - - - - -
Caja 3b - - - - - - - - - -
Caja 3c - - - - - - - - - -
Hora 63 Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Caja 1a - - - - - - - - - -
Caja 1b - - - - - - - - - -
Caja 1c - - - - - - - - - -
Caja 2a - + + - - - - - + -
Caja 2b + - - - - - - - + -
Caja 2c - + - - + + - - - -
Caja 3a - + - - - - - - - -
Caja 3b + + + + + - - - - -
Caja 3c - - + - + - - - - -
92
GRUPO POLIFENOLES
Hora 72 Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Caja 1a - - - - - - - - - -
Caja 1b - - - - - - - - - -
Caja 1c - - - - - - - - - -
Caja 2a + 0 0 - - + - - 0 -
Caja 2b 0 - + + - - - - 0 -
Caja 2c - 0 + - 0 0 0 + - -
Caja 3a + 0 - + - + 0 - - +
Caja 3b 0 0 0 0 0 - - - - -
Caja 3c + - 0 - 0 - + - + -
Hora Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla
111 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Caja 1a - - - - - - - - - -
Caja 1b - - - - - - - - - -
Caja 1c - - - - - - - - - -
Caja 2a 0 0 0 + + 0 - + 0 +
Caja 2b 0 - 0 0 0 + - - 0 -
Caja 2c - 0 0 + 0 0 0 0 + +
Caja 3a 0 0 - 0 + 0 0 + - 0
Caja 3b 0 0 0 0 0 + + + - +
Caja 3c 0 - 0 + 0 - 0 + + +
93
GRUPO POLIFENOLES
Hora Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla
120 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Caja 1a - - - - - - - - - -
Caja 1b - - - - - - - - - -
Caja 1c - - - - - - - - - -
Caja 2a 0 0 0 0 0 0 - 0 0 0
Caja 2b 0 + 0 + 0 0 + - 0 -
Caja 2c - 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Caja 3a 0 0 + 0 0 0 0 0 - 0
Caja 3b 0 0 0 0 0 0 0 0 + 0
Caja 3c 0 + 0 0 0 - 0 0 0 0
Caja 1 DMSO
Caja 2 Blanco
Caja 3 Glifosato
94
GRUPO POLIFENOLES
ANEXO 3. Antibiograma
Replica #1 5% 46 40 32 20 0
5% 44 36 32 20 0
5% 44 40 32 20 0
5% 48 28 28 20 0
Promedio 5% 45,5 36 31 20 0
Replica #2 5% 44 28 24 16 0
5% 32 28 24 10 0
5% 32 32 20 16 0
5% 24 28 24 14 0
Promedio 5% 33 29 23 14 0
Replica #3 5% 48 28 28 20 0
5% 44 32 28 20 0
5% 44 36 32 20 0
5% 40 36 28 20 0
Promedio 5% 44 33 29 20 0
95
GRUPO POLIFENOLES
Replica #1 5% 36 32 24 20 0
5% 38 28 24 20 0
5% 32 32 24 24 0
5% 36 28 24 24 0
Promedio 5% 35,5 30 24 22 0
Replica #2 5% 36 32 24 20 0
5% 32 24 24 20 0
5% 36 28 24 20 0
5% 36 32 24 20 0
Promedio 5% 35 29 24 20 0
Replica #3 5% 36 32 24 20 0
5% 36 32 24 20 0
5% 36 32 24 20 0
5% 40 28 28 16 0
Promedio 5% 37 31 25 19 0
96
GRUPO POLIFENOLES
Replica #1 5% 60 80 64 10 0
5% 40 40 20 10 0
5% 36 40 10 10 0
5% 24 24 10 10 0
Promedio 5% 40 46 26 10 0
Replica #2 5% 60 40 24 10 0
5% 24 24 24 10 0
5% 28 36 20 10 0
5% 32 28 20 10 0
Promedio 5% 36 32 22 10 0
Replica #3 5% 40 36 24 10 0
5% 28 28 24 10 0
5% 32 20 24 10 0
5% 28 20 28 10 0
Promedio 5% 32 26 25 10 0
97
GRUPO POLIFENOLES
Replica #1 5% 32 32 24 24 24
5% 28 28 20 20 20
5% 36 28 20 24 24
5% 36 24 24 24 24
Promedio 5% 33 28 22 23 23
Replica #2 5% 36 40 36 24 20
5% 32 28 28 24 20
5% 40 24 28 24 20
5% 36 28 24 20 20
Promedio 5% 36 30 29 23 20
Replica #3 5% 40 40 40 28 20
5% 36 36 32 24 20
5% 36 28 28 40 20
5% 36 36 32 24 20
Promedio 5% 37 35 33 29 20
98