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GRUPO POLIFENOLES

ACTIVIDAD ALELOPÁTICA Y ANTIBACTERIANA DE FRACCIONES


POLARES F1-C, F1-D Y F1-F OBTENIDAS DE Henriettella trachyphylla Triana
(MELASTOMATACEAE)

TRABAJO DE GRADO
Requisito parcial para optar al título de Tecnólogo Químico

Presentado por:

NATALIA CARDONA CLAVIJO


MELINA SALAZAR OSORIO

UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE PEREIRA


FACULTAD DE TECNOLOGÍA
ESCUELA DE QUÍMICA
GRUPO POLIFENOLES
Pereira, Noviembre de 2012

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GRUPO POLIFENOLES

ACTIVIDAD ALELOPÁTICA Y ANTIBACTERIANA DE FRACCIONES


POLARES F1-C, F1-D Y F1-F OBTENIDAS DE Henriettella trachyphylla Triana
(MELASTOMATACEAE)

TRABAJO DE GRADO
Requisito parcial para optar al título de Tecnólogo Químico

Presentado por:

NATALIA CARDONA CLAVIJO


MELINA SALAZAR OSORIO

Director

FRANCISCO JAVIER JIMÉNEZ GONZÁLEZ

Asesor

Esp. Microbiología Industrial JOSÉ RAFAEL RODRÍGUEZ

UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE PEREIRA


FACULTAD DE TECNOLOGÍA
ESCUELA DE QUÍMICA
GRUPO POLIFENOLES
Pereira, Noviembre de 2012

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NOTA DE ACEPTACIÓN DEL TRABAJO DE GRADO

ACTIVIDAD ALELOPÁTICA Y ANTIBACTERIANA DE FRACCIONES


POLARES F1-C, F1-D Y F1-F OBTENIDAS DE Henriettella trachyphylla Triana
(MELASTOMATACEAE)

Presentado por:

NATALIA CARDONA CLAVIJO


MELINA SALAZAR OSORIO

El suscrito director y jurados del presente trabajo de grado, una vez revisada la
versión escrita y presenciado la sustentación oral, decidimos otorgar la nota de:
______________________

Con la connotación: ______________________

Para constancia firmamos en la ciudad de Pereira hoy

_____________________________

El director: _________________________________
Francisco Javier Jiménez González

Jurado: _______________________________
Dr. Oscar Marino Mosquera

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DEDICATORIA

No me alcanzaría la vida para agradecer a mis padres por su apoyo incondicional


durante todo este tiempo, por su amor, y por su esfuerzo para que culminara esta etapa
en mi vida. Gracias por confiar en mí y por enseñarme hacer mejor persona cada día
¡LOS AMO!

A mi hermana, mi novio y las personas más allegadas a mí por apoyarme en los


momentos en que estuve a punto de desfallecer y alentarme para que saliera adelante
¡MUCHAS GRACIAS POR ESTAR A MI LADO!

A mi abuelita que aunque ya no está conmigo fue uno de mis motivos para seguir
adelante ¡SIEMPRE ESTARAS EN MI CORAZÓN!

NATALIA CARDONA CLAVIJO

A Dios, que es el gran motor de mi vida, lo más grande y sublime, lo inentendible e


inalcanzable, el mejor químico que me ha iluminado incondicionalmente.

A mi madre Liliana Osorio, quien me ha brindado el mejor ejemplo para ser una mujer
virtuosa, por sus consejos de aliento y por tantas noches de insomnio a mi lado. A mi
padre José Fernando Salazar, por siempre brindarme su apoyo e inculcarme el amor de
Dios, a mi abuela Nubia Ramírez, por alimentarme con el amor más puro que pueda
existir y por enseñarme con dulzura lo que significa la palabra disciplina.

A toda mi familia, por la cual siento un gran orgullo y agradecimiento, aquí incluyo a mi
amigo del alma Jhon Fredy Sánchez, por todos los momentos que vivimos juntos.

Y a Natalia Cardona, por ser una excelente compañera y apoyarme cuando más la
necesite.

MELINA SALAZAR OSORIO

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AGRADECIMIENTOS

En primer lugar agradecemos a Dios por darnos la oportunidad de estudiar,


acompañarnos en este camino y poder lograr esta meta.

A nuestro director el profesor Francisco Javier Jiménez por su dedicación, apoyo y


asesoría en la realización de este proyecto.

A todos los profesores de la Escuela de Tecnología Química que contribuyeron a nuestra


formación académica y personal.

Por último al grupo Polifenoles por darnos la oportunidad de desarrollar este trabajo en
sus instalaciones y prestarnos todos sus servicios.

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TABLA DE CONTENIDO
Pág.
RESUMEN ...................................................................................................................... 13
INTRODUCCIÓN ........................................................................................................... 15
1. ANTECEDENTES...................................................................................................... 17
1.1 SURGIMIENTO DEL PROBLEMA ................................................................ 20
1.2 FORMULACIÓN DEL PROBLEMA ................................................................... 21
1.3 OBJETIVOS .......................................................................................................... 21
1.3.1 Objetivo general .............................................................................................. 21
1.3.2 Objetivos específicos ....................................................................................... 21
1.4 JUSTIFICACIÓN .................................................................................................. 22
2. MARCO TEÓRICO .................................................................................................... 23
2.1. Descripción y distribución de la familia melastomataceae ................................... 23
2.1.1 Farmacognosia de la familia melastomataceae ............................................... 23
2.2 Descripción y componentes químicos del género Henriettella y la especie
Henriettella trachyphylla ............................................................................................. 24
2.2.1 Henriettella Naudin ......................................................................................... 24
2.2.2 Henriettella trachyphylla Triana. .................................................................... 25
2.3 Aleloquímicos ........................................................................................................ 25
2.3.2 Germinación .................................................................................................... 27
2.4 Actividad antibacteriana......................................................................................... 29
2.4.1 Descripción de bacterias empleadas ................................................................ 29
2.4.2 Descripción de antibióticos empleados ........................................................... 31
2.5 Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia (HPLC) ............................................... 32
3. SECCIÓN EXPERIMENTAL ..................................................................................... 34
3.1 Materiales y reactivos ............................................................................................ 34
3.2 Disolventes ............................................................................................................. 34
3.3 Equipos ................................................................................................................... 34
3.4 Material vegetal ...................................................................................................... 34
3.5 Prueba preliminar para selección de semillas de lechuga o tomate ....................... 36
3.5.1 Semillas ........................................................................................................... 36
3.5.2 Agua pretratada ............................................................................................... 36
3.5.3 Lavado ............................................................................................................. 36

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3.5.4 Ensayo de germinación de semillas de lechuga y tomate................................ 37


3.6 Ensayo de germinación para semillas de lechuga frente a las fracciones F1-C, F1-
D y F1-F ....................................................................................................................... 39
3.6.1 Esterilización de las semillas ........................................................................... 39
3.6.2 Preparación de las fracciones .......................................................................... 39
3.6.3 Germinación .................................................................................................... 39
3.6.4 Toma de datos y análisis estadístico ................................................................ 39
3.7 Actividad antibacteriana......................................................................................... 40
3.7.1 Microorganismos ............................................................................................. 40
3.7.2 Antibiograma ................................................................................................... 40
3.7.3 Ensayo de actividad antibacteriana de las fracciones polares ......................... 40
3.7.4 Medio de cultivo .............................................................................................. 40
3.7.5 Preparación del inoculo ................................................................................... 40
3.7.6 Controles.......................................................................................................... 41
3.7.7 Preparación de antibióticos estándar ............................................................... 41
3.7.8 Preparación de las fracciones .......................................................................... 41
3.7.9 Evaluación de la actividad inhibitoria ............................................................. 42
3.8 Pruebas de caracterización para flavonoides.......................................................... 45
3.8.1 Prueba de cloruro férrico ................................................................................. 45
3.8.2 Prueba con acetato de plomo ........................................................................... 45
3.8.3 Prueba de Shinoda ........................................................................................... 46
3.8.4 Prueba con gelatina–sal ................................................................................... 46
3.8.5 Prueba de taninos hidrolizables ....................................................................... 47
3.8.6 Prueba de taninos condensados ....................................................................... 48
3.9 Análisis fitoquímico preliminar ............................................................................. 49
3.9.1 Análisis por cromatografía de capa delgada (CCD) ........................................ 49
3.9.2 Análisis por espectroscopía UV ...................................................................... 49
3.9.3 Separación cromatográfica en columna de la fracción F1-F ........................... 49
3.9.4 Cromatografía Preparativa............................................................................... 50
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ................................................................................. 51
4.1 Ensayo de germinación para semillas de lechuga y tomate ................................... 51
4.2 Ensayo de germinación para semillas de lechuga frente a las fracciones F1-C, F1-
D y F1-F. ...................................................................................................................... 53

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4.3 Evaluación de la actividad antibacteriana .............................................................. 56


4.4 Pruebas de caracterización química ...................................................................... 58
4.5 Análisis cromatográfico por HPLC de las fracciones F1-C, F1-D y F1-F............. 59
4.5.1 Perfiles cromatográficos de las fracciones F1-C, F1-D y F1-F a 260 nm ....... 59
4.5.2 Perfiles cromatográficos de las fracciones F1-C, F1-D y F1-F a 330 nm ....... 60
4.5.3. Análisis por cromatografía de capa delgada (TLC) ....................................... 61
4.5.4 Pruebas de desplazamiento para la determinación de núcleos de flavonoides 61
4.6 Separación cromatografía en columna de la fracción F-1 F .................................. 63
4.7 Análisis de espectros de RMN 1H, 13C y HSQC .. ¡Error! Marcador no definido.
5. CONCLUSIONES ....................................................................................................... 72
RECOMENDACIONES .................................................................................................. 78
ANEXOS ......................................................................................................................... 79

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Índice de Tablas
Pág.
Tabla 1. Desviaciones y media de la fracción F1-C……………………….……………54
Tabla 2. Desviaciones y media de la fracción F1-D.……………………….…...………55
Tabla 3. Desviaciones y media de la fracción F1-F……………………………….……55
Tabla 4. Resultados actividad antibacteriana……………………………………...……57
Tabla 5. Pruebas para caracterización química………………………………...……….58

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Índice de Figuras

Pág.
Figura 1. Estructuras químicas de agentes alelopáticos presentes en diferentes plantas. 18
Figura 2. Compuestos aisladas de H. fascicularis ........................................................... 25
Figura 3. Etapas de la germinación en dicotiledóneas (Jean-Yves et al., 2006). ............. 28
Figura 4. Escherichia coli ................................................................................................ 30
Figura 5. Pseudomonas aeruginosa ................................................................................. 30
Figura 6. Amoxicilina ...................................................................................................... 31
Figura 7. Ampicilina ........................................................................................................ 32
Figura 8. Equipo HPLC ................................................................................................... 33
Figura 9. Procedimiento de extracción de las hojas de Henriettella trachyphylla (Isaza et
al., 2005). ......................................................................................................................... 36
Figura 10. Lavado de semillas ......................................................................................... 37
Figura 11. Germinación de semillas en agua ................................................................... 37
Figura 12. Germinación de semillas en DMSO ............................................................... 38
Figura 13. Control con glifosato ...................................................................................... 38
Figura 14. Esterilización de semillas de Lechuga............................................................ 39
Figura 15. Diluciones para la preparación de antibióticos............................................... 41
Figura 16. Diluciones para la preparación de fracciones ................................................. 42
Figura 17. Diagrama de siembra en profundidad ........................................................... 43
Figura 18. Diagrama de distribución y elaboración de los pozos .................................... 44
Figura 19. Diagrama de medición del halo de inhibición. ............................................... 45
Figura 20. Reacción de cloruro férrico ............................................................................ 45
Figura 21. Reacción con solución de acetato de plomo .................................................. 46
Figura 22. Reacción del anillo benzopirona en presencia de ácido clorhídrico y
magnesio .......................................................................................................................... 46
Figura 23. Reacción de la prueba con gelatina-sal .......................................................... 47
Figura 24. Estructuras de los componentes de un tanino hidrolizable............................. 47
Figura 25. Reacción coloreada para taninos condensados ............................................... 48
Figura 26. Separación cromatográfica de la fracción F1-F ............................................. 50
Figura 27. Germinación de semillas de lechuga con agua ............................................... 51
Figura 28. Germinación de semillas de tomate en agua .................................................. 52
Figura 29. Germinación de semillas de tomate con glifosato .......................................... 52
Figura 30. Porcentaje germinación para de la fracción F1-C .......................................... 54
Figura 31. Porcentaje germinación para de la fracción F1-D .......................................... 54
Figura 32. Porcentaje germinación para de la fracción F1-F ........................................... 55
Figura 33. Evaluación de antibióticos frente a microorganismos de prueba ................... 57
Figura 34. Cromatograma fracción F1-C a 260 nm ......................................................... 59
Figura 35. Cromatograma fracción F1-D a 260 nm......................................................... 59
Figura 36. Cromatograma fracción F1-F a 260 nm ......................................................... 59
Figura 37. Cromatograma fracción F1-C a 330 nm ......................................................... 60
Figura 38. Cromatograma fracción F1-D a 330 nm......................................................... 60

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Figura 39. Cromatograma fracción F1-F a 330 nm ......................................................... 60


Figura 40. Cromatoplacas de la fracción F1-F obtenidas con el sistema H2O–i-PrOH
(6:4) .................................................................................................................................. 61
Figura 41. Espectro fracción F1-C en MeOH .................................................................. 62
Figura 42. Espectro fracción F1-D en MeOH.................................................................. 62
Figura 43. Espectro fracción ............................................................................................ 62
Figura 44. Espectro fracción F1-C con CH3ONa ............................................................ 62
Figura 45. Espectro fracción F1-D con CH3ONa ............................................................ 62
Figura 46. Espectro fracción F1-F con CH3ONa ............................................................. 62
Figura 47. Espectro fracción F1-C con CH3COONa ....................................................... 62
Figura 48. Espectro fracción F1-D con CH3COONa ....................................................... 62
Figura 49. Espectro fracción F1-F con CH3COONa ....................................................... 62
Figura 50. Espectro fracción F1-C con AlCl3 .................................................................. 63
Figura 51. Espectro fracción F1-D con AlCl3.................................................................. 63
Figura 52. Espectro fracción F1-F con AlCl3 .................................................................. 63
Figura 53. Cromatoplaca #1 de las fracciones obtenidas del fraccionamiento de la
fracción F1-F.................................................................................................................... 63
Figura 54. Cromatoplaca #2 de las fracciones obtenidas del fraccionamiento de la
fracción F1-F.................................................................................................................... 64
Figura 55. Cromatoplaca #3 de las fracciones obtenidas del fraccionamiento de la
fracción F1-F.................................................................................................................... 64
Figura 56. Cromatoplaca y espectro UV de la fracción F1-F1 ....................................... 65
Figura 57.Cromatoplaca y espectro UV de la fracción F1-F2 ......................................... 65
Figura 58. Cromatoplaca y espectro UV de la fracción F1-F3 ........................................ 65
Figura 59. Cromatoplaca y espectro UV de la fracción F1-F4 ....................................... 66
Figura 60. Cromatoplaca y espectro UV de la fracción F1-F5 ........................................ 66
Figura 61. Cromatoplaca y espectro UV de la fracción F1-F6 ........................................ 66
Figura 62. Cromatoplaca y espectro UV de la fracción F1-F7 ........................................ 67
Figura 63. Porcentaje de rendimiento de las fracciones F1-F1 hasta F1-F7.................... 67
Figura 64. Cromatoplaca preparativa fracción F1-F3 ...................................................... 68
Figura 65. Cromatoplaca preparativa fracción F1-F4 ...................................................... 68
Figura 66 Cromatoplaca preparativa fracción F1-F5 ....................................................... 69
Figura 67. Cromatoplaca de la fracción F1-F3 ............................................................... 69
Figura 68. Cromatoplaca de la fracción F1-F4 ............................................................... 70
Figura 69. Cromatoplacas de la fracción F1-F5 ............................................................. 70
Figura 70. Cromatoplaca revelada con luz UV a de 254 nm de la fracción F1-F5 ...... 70

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Índice de Anexos
Pág.
ANEXO 1. Tablas primer ensayo germinación de semillas de lechuga. ......................... 79
ANEXO 2. Tablas primer ensayo de germinación semillas de tomate ........................... 87
ANEXO 3. Antibiograma ................................................................................................ 95

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RESUMEN

En este estudio, fueron evaluadas la actividad alelopática y antibacteriana de las


fracciones polares F1-C, F1-D y F1-F obtenidas de Henriettella trachyphylla Triana.,
pertenecientes a la familia melastomataceae frente a semillas de lechuga (Lactuca sativa
L.) y cepas de las bacterias Gram negativas Escherichia coli (ATCC 25922) y
Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853).
La fracción F1-F se separó en columna cromatográfica empacada sobre Toyopearl HW-
40C, utilizando como fase móvil isopropanol - agua- metanol en diferentes
proporciones. Obteniéndose siete fracciones, las cuales fueron monitoreadas por TLC en
fase reversa, y nombradas como F1-F1 hasta F1-F7.
La fracción F1-F5 mostró bandas características de color azul, las cuales fueron
recogidas por placa preparativa sobre sílicagel en fase reversa, siendo nombradas como
F1-F5-A hasta F1-F5-G. Las fracciones F1-F5-D, F1-F5-F y F1-F5-G fueron purificadas
y llevadas a análisis por CG/EM y RMN de protón para su posterior determinación
estructural.
La actividad alelopática frente a la germinación de semillas de lechuga (Lactuca sativa
L.) de la fracción F1-C presentó a una concentración de 0,05 mg/mL un porcentaje de
germinación (75,56%), la fracción F1-D a una concentración de 0,8 mg/mL obtuvo un
porcentaje de germinación (31,11%), y la fracción F1-F a una concentración de 0,8
mg/mL obtuvo el mayor valor (44,44%) de germinación, lo que sugiere que esta fracción
puede actuar mejor como agente promotor de germinación mientras que F1-D inhibe la
germinación de las semillas. Esta evaluación se presentó a las 36 horas de iniciado el
ensayo.
En la evaluación de la actividad antibacteriana realizada a las fracciones F1-C, F1-D,
F1-F, no presentó inhibición frente al crecimiento de E. coli y P. aeruginosa a las
concentraciones de 1000, 500, 250, 125 y 62,5 mg/mL.

Palabras clave: Escherichia coli, Henriettella trachyphylla, Lactuca sativa,


Pseudomonas aeruginosa.

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ABSTRACT

In this study, were evaluated allelopathic and antibacterial activity of polar fractions F1-
C, F1-D and F1-F obtained from Henriettella trachyphylla Triana, belonging to
melastomataceous family against lecttuce (Lactuca sativa L.) seeds and Gram negative
strain bacterias Escherichia coli (ATCC 25922) and Pseudomonas aeruginosa (ATCC
27853), respectively.
F1-F fraction was separated on chromatography column packed with Toyopearl HW-
40C, obtained seven fractions, which were monitored by reverse phase plate TLC,
namely as F1-F1 to F1-F7.
F1-F5 fraction showed blue color spots, which were collected after separated by
preparative plate on silice gel reverse phase, namely as F1-F5-A to F1-F5-G. F1-F5-E,
F1-F5-F and F1-F5-G fractions were purified and carried to GC/MS and proton-carbon
NMR structural determination.
Allelopathic activity against to lecttuce (Lactuca sativa L.) seeds germination from F1-C
fractions presented percentage germination (75,56%) to 0,05 mg/mL concentration, F1-
D fraction presented germination percentage (31,11%) to 0,8 mg/mL concentration, and
the F1-F fraction at a concentration of 0.8 mg/mL had the lowest value (44.44%) of
germination, which suggests that this fraction can act better as promotor agent. This
assay was presented at 36 hours into the test.
The evaluation of the antibacterial activity F1-C, F1-D and F1-F fractions weren´t
showed inhibition against the growth of E. coli and P. aeruginosa to 1000, 500, 250, 125
and 62.5 mg/mL concentrations.

Keywords: Escherichia coli, Henriettella trachyphylla, Lactuca sativa, Pseudomonas


aeruginosa.

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INTRODUCCIÓN

Este estudio se centra en la evaluación de la actividad alelopática y antibacteriana


de fracciones polares obtenidas a partir del extracto en i-PrOH-agua (65:35) de
Henriettella trachyphylla Triana., especie perteneciente a la familia melastomataceae.
La alelopatía en su definición más tradicional, postulada por Rice, descrita como
“cualquier efecto directo o indirecto causado por una planta (incluyendo
microrganismos) sobre otras a través de la producción de compuestos químicos que se
escapan al medio ambiente” (Macías et al., 2009). Con el ánimo de englobar otras
interacciones, se ha orientado una definición más amplia, como ha sido la desarrollada
por la IAS (Sociedad Internacional de Alelopatía) en 1996, como “cualquier proceso que
involucre metabolitos secundarios producidos por plantas, algas, bacterias y hongos, que
influyan en el crecimiento y desarrollo de sistemas agrícolas y biológicos, tanto con
efectos positivos como negativos”.
En la parte experimental de este trabajo se llevó a cabo la actividad germinativa,
utilizando semillas de lechuga (lactuca sativa L) como una especie receptora. Esta
actividad germinativa se determina por la emergencia y el desarrollo de las estructuras
esenciales del embrión, manifestándose su capacidad de dar origen a una plántula
normal, bajo condiciones ambientales favorables.
Durante las últimas décadas, muchas investigaciones que se han realizado han
conllevado a explorar el potencial alelopático en cultivos y otras plantas, para controlar
las malas hierbas. Por ejemplo, Dzyubenko y Petrenko en 1971, encontraron que las
secreciones de raíces de maíz (Zea mays L.) inhiben el crecimiento de Chenopodium
album L., mientras Cheema et al. En 1988, demostró que los extractos acuosos de paja
de trigo inhiben significativamente la germinación y el crecimiento de correhuela ó
cahiruela (Convolvulus arvensis L.) (Javaid et al., 2006). Además, con esta actividad se
ha demostrado que gran variedad de plantas poseen efectos inhibitorios sobre el
crecimiento y la población de otras plantas vecinas o de sucesión por la liberación de
sustancias alelopáticas en el suelo, ya sea como exudados de tejidos de plantas vivas o
por descomposición de los residuos vegetales (Kato-Noguchi y Macías, 2005).
En la parte experimental se utilizaron semillas de lechuga (Lactuca Sativa L.), usadas
como material de bioensayo, para evaluar la actividad germinativa de las fracciones
polares.
La actividad antibacteriana se define como la actividad in vitro de un antibiótico frente
a un microorganismo determinado y refleja su capacidad para inhibir el crecimiento de
una bacteria o población bacteriana (Niño et al., 2006).
La permanencia de enfermedades infecciosas causadas por cepas patógenas resistentes
es un problema de salud a nivel mundial. Las cepas patógenas resistentes han surgido
principalmente en los hospitales a consecuencia de varios factores, como son el amplio
uso de antibióticos, las dosis utilizadas, el tiempo de tratamiento, la eliminación de la
mitad de la droga que no se alcanza a metabolizar en su totalidad, otros elementos que
influyen son las altas posibilidades de transmisión o contagio y el estado

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inmunocomprometido de los pacientes que los hace susceptibles a infecciones con


patógenos oportunistas (Luján, 2006).
Las opciones de agentes antimicrobianos utilizadas en las terapias para el tratamiento de
las enfermedades infecciosas causadas por las bacterias con resistencia múltiple están
por lo tanto seriamente limitadas. Las compañías farmacéuticas están buscando drogas
alternativas de otras fuentes incluyendo las plantas y los animales. Las plantas
medicinales son consideradas como una fuente potencial de nuevas drogas
quimioterapéuticas debido a su contenido de fitoquímicos y a su poco o nulo efecto
tóxico. Ciertamente, las plantas poseen un enorme y desconocido reservorio de
sustancias derivado de sus sistemas de defensa en contra de microorganismos, insectos
y herbívoros. Aunque se han identificado algunas sustancias simples como fenoles,
derivados de los fenoles (quinonas, flavonas, flavonoides, flavonoles, taninos y
cumarinas, terpenoides, aceites esenciales, alcaloides lectinas y polipéptidos. Uno de los
mecanismos para la inducción de la resistencia es la presión selectiva a la que se
someten las bacterias, pero como el uso de extractos vegetales a nivel hospitalario es
limitado, las bacterias no han desarrollado mecanismos de resistencia en su contra.
Siendo esto posible que los extractos pueden inhibir el crecimiento de cepas con
resistencia múltiple (Luján, 2006).
Por lo anterior se busca valorar la actividad antimicrobiana in vitro de las fracciones
polares F1-C, F1-D, F1-F contra cepas Gram negativas Escherichia coli (ATCC 25922)
y Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853).

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1. ANTECEDENTES

En los últimos años la actividad alelopática se ha presentado como una alternativa viable
para incrementar los niveles de producción por cosecha y prevenir el uso indiscriminado
de herbicidas sintéticos, los cuales generan costos elevados en la producción y conllevan
a problemas de contaminación por residuos de los mismos en el producto recolectado, o
como en otras ocasiones contaminación cruzada a otros cultivos y ríos cercanos en áreas
de actividad agrícola (Macías et al., 2000).
La manipulación adecuada de los cultivos, utilizando la alelopatía para la mejora de la
productividad de los mismos, ayuda a la protección del medio ambiente a través del eco-
amigable control de malezas y plagas, la conservación de nitrógeno en la tierra de
cultivo y la síntesis de nuevos productos agroquímicos a base de productos naturales,
han ganado la atención prominente del científico dedicado a esta investigación (Sang-Uk
et al., 2005).
Se ha confirmado que los metabolitos secundarios constituyen una fuente de productos
naturales con actividad biológica diversa, comprobándose su actividad antibacteriana,
antifúngica, antiviral, antineoplásica, anticancerígena, anticoagulante, citotóxica entre
otras. Esta gama de propiedades, permite a estos compuestos tener un gran potencial de
aplicación, ya sea aislados o usando directamente el extracto o infusión del compuesto al
que se le ha detectado una actividad biológica específica, empleándose como precursor
en la síntesis de compuestos orgánicos o para caracterizar la estructura de sus centros
activos con el fin de modelar nuevas sustancias con propiedades prestablecidas.
El creciente interés por el estudio de los metabolitos secundarios ha dado origen a la
descripción de un gran número de compuestos. Esto ha sido motivado por inquietudes
farmacológicas en un principio y, posteriormente, por conocer el rol que estos
metabolitos desempeñan durante el ciclo vital de los organismos que los sintetizan, así
como, llegar a comprender cómo estos compuestos contribuyen al funcionamiento de los
sistemas ecológicos (Organization for Tropical Studies).
La naturaleza química de los agentes alelopáticos es muy variada. (Rivenshield, 2008)
Según estudios, los compuestos fenólicos tales como los ácidos ferúlico (Fig. a) y
caféico (Fig. b) identificados en los tejidos de las plantas y en los exudados de raíces de
tomate, pepino, alfalfa, arroz y avenilla pueden inducir efectos fitotóxicos en tomate,
lechuga y pepino (Loffredo et al.,2005).
Un compuesto que causa inhibición del crecimiento ha sido recientemente aislado de los
exudados de arroz, y su estructura química fue determinada por los datos espectrales
como momilactona B (Fig. c), la cual impidió el crecimiento de plántulas de berro y de
lechuga a concentraciones superiores de 3 y 30 mmol/L respectivamente (Kato-Noguchi
et al.,2005).
Un estudio más reciente, sugiere que la radiación UV no sólo aumenta la concentración
de la momilactona B en las semillas de arroz, sino también su secreción a la rizósfera,
proporcionándole una ventaja competitiva a través de la inmovilización local de los

17
GRUPO POLIFENOLES

microorganismos del suelo, y la inhibición del crecimiento de las especies de plantas


competidoras (Kato-Noguchi et al., 2005).

O OH O OH

CH3 HO
O OH
O
CH3 CH3 O
(a) (b) (c)

Figura 1. Estructuras químicas de agentes alelopáticos presentes en diferentes plantas.

Krautmann et al., en 2001 demostraron como fracciones cromatográficas diferentes de la


especie Tridax procumbens L. (asteraceae), inhibían el crecimiento de semillas
pregerminadas de L. sativa. De esta manera se definió el efecto alelopático negativo.
Otra investigación sugerida por Waller et al., 1992, donde se evaluaron los extractos de
las hojas de la especie Vigna radiata L. (fabaceae) y encontraron actividad alelopática
positiva sobre el crecimiento de la radícula de L. sativa y de V. radiata, al observar que
las semillas crecieron más que en el testigo absoluto; con lo que se tuvo el concepto de
efecto alelopático positivo, que fue atribuido a una saponina triterpénica.
Del género Henriettella se tiene el reporte de H. fascicularis (Sw.), de la cual se aislaron
ácido palmítico, ácido betulínico, β-sitosterol, (-)-pinoresinol, 4´,5,7-trihidroxi-6-8-
dimetilisoflavona y taxifilina. La presencia de taxifilina, un glicósido cianogénico indica
la toxicidad potencial de esta planta en herbívoros (Calderon et al., 2003).
Estudios realizados por el grupo Polifenoles, para el extracto en i-PrOH-agua (65-35) de
H. trachyphylla, y sus respectivas fracciones frente a plántulas de lechuga (L. sativa L.),
mostraron actividad alelopática tanto inhibitoria como promotora del crecimiento;
algunas de sus fracciones activas presentaron compuestos de tipo flavonoide según
pruebas de caracterización (Isaza y Jiménez, 2005).
Un estudio más reciente realizado por este grupo evaluó la actividad alelopática del
extracto en cloroformo de Henriettella trachyphylla Triana, el extracto en acetato de
etilo de Miconia coronata (BONPL.) D.C., pertenecientes a la familia melastomataceae
y sus respectivas fracciones, frente a plántulas de lechuga.
El extracto en cloroformo de H. trachyphylla fue separado en columna cromatográfica
empacada sobre sílicagel, obteniendo diez fracciones, las cuales nombraron como
HtCHF1 hasta HtCHF10.

18
GRUPO POLIFENOLES

Las fracciones HtCHF1, HtCHF2 y HtCHF3 provenientes del extracto en cloroformo de


H. trachyphylla, fueron separadas por cromatografía preparativa en capa fina sobre
sílicagel. De las cuales obtuvieron 5 subfracciones de HtCHF1 nombradas como (F1A,
F1B, F1C, F1D, F1E), 4 de HtCHF2 (F2A - F2D) y 6 subfracciones de HtCHF3 (F3B -
F3F).
Teniendo como resultado que el extracto en cloroformo de H. trachyphylla, presento un
máximo de actividad alelopática inhibitoria en hipocótilo (-38,8%), y del 6,8% como
promotor de crecimiento en epicótilo para el segundo día del ensayo, mientras que las
fracciones F10A1 y F10A2 exhibieron efecto inhibidor, tanto para el hipocótilo como
para epicótilo. Las fracciones Fr1, Fr3, Fr4 y Fr5 de M. coronata mostraron actividad
alelopática.
Inhibitoria de crecimiento en hipocótilo con máximo de -19,4% (quinto día), -7,1%
(quinto día), -64,5% (segundo día), -44,7% (segundo día), respectivamente; mientras que
para epicótilo se observó inhibición de crecimiento al tercer día del -20,3%, -33,3%,
47,8%y -43,5% (Erira y Jiménez, 2012).
En actividad alelopática se han empleado diversidad de semillas por otros
investigadores, entre las cuales se encuentran la especie L. sativa, R. sativus, Allium
cepa (alliaceae), O. basilicum L (lamiaceae) y O. sativa. A las semillas mencionadas se
les evaluó el crecimiento y desarrollo frente a un extracto determinado; los resultados
obtenidos permitieron concluir que dentro del grupo seleccionado L. sativa fue la que
mostró mayor sensibilidad a los aleloquímicos, elevado ritmo de crecimiento y de
absorción de nutrientes en el desarrollo del ensayo (Aportela et al., 2001; Chi-Ming et
al., 2002; Olaya, 2005).
A través del tiempo, las plantas son conocidas por producir moléculas bioactivas que
reaccionan con otros organismos en el medio ambiente (Basile et al., 2000). Estas
sustancias pueden inhibir el crecimiento de hongos y bacterias, atribuyendo propiedades
interesantes para su posible síntesis y/o semi-síntesis, además de convertirse en una
alternativa para el fortalecimiento de la investigación científica en el campo de los
antimicrobianos.
Actualmente, estos fitoquímicos están siendo empleados a escala comercial para
prolongar la vida humana y mejorar la seguridad en diversos aspectos. Es por esta razón
que se ha desarrollado un creciente interés en la búsqueda de extractos y compuestos
naturales de plantas, para sustituir los actuales agentes antimicrobianos sintéticos.
El uso de plantas medicinales se ha dado desde tiempos prehistóricos hasta los tiempos
actuales; el hombre por ensayo y error utilizó los elementos que la naturaleza le brindaba
para curar sus enfermedades y las de sus animales, este conocimiento se transmitió de
generación en generación y fue perfeccionándose con la experiencia (Hoogesteger,
1994).

19
GRUPO POLIFENOLES

1.1 SURGIMIENTO DEL PROBLEMA


Cada día los herbicidas sintéticos no representan un instrumento adecuado para el
control de algunas malezas en desarrollo de resistencia. El control de las malezas a
través de la alelopatía es una estrategia para solucionar los numerosos problemas
derivados de la insuficiencia de las prácticas de la cultura, y el abuso de herbicidas
sintéticos (Singh et al., 2003; Macías et al., 2003; Hao et al., 2007).
La comprensión de los mecanismos de acción de los aleloquímicos permite la utilización
de estos compuestos para mejorar la producción de cultivos y el desarrollo de una
agricultura más sostenible, incluyendo el control de plagas y de malezas a través de la
rotación de los cultivos, manejo de residuos y una variedad de enfoques en bio-control
(Popaa et al., 2008).
La prevalencia de enfermedades infecciosas causadas por cepas patógenas de bacterias,
ha surgido como respuesta al uso indiscriminado de los antibióticos. Esta resistencia es
debida en muchos casos a la utilización inadecuada de las dosis y al tiempo de
tratamiento que no es el recomendado por el médico. Esto ha llevado a promover la
resistencia de los microorganismos frente a antibióticos. La utilización de plantas
medicinales en nuestro medio, y el hecho que en gran cantidad de vegetales se
encuentran principios activos empleados en el tratamiento de diversas enfermedades, ha
incrementado el interés por su estudio.
La actividad antimicrobiana de los extractos vegetales y productos naturales ha revelado
el potencial de las plantas superiores como fuente de agentes anti-infectivos,
permitiendo de esta manera un avance al uso empírico de las especies vegetales
medicinales con una base científica (López et al., 1997). Los efectos negativos sobre
otras especies pueden deberse a una variedad de procesos, incluyendo la reducción de
división celular en las raíces, la reducción de la absorción de iones, la inhibición de la
fotosíntesis y la respiración, la inhibición de la síntesis de proteínas, la inhibición de
proteínas de la actividad enzimática y una menor permeabilidad de la membrana celular.
Algunos de los aleloquímicos con más frecuencia encontrados son los flavonoides, los
cuales, han sido frecuentemente implicados en la inhibición de la germinación de
semillas y crecimiento de raíces (Taylor et al., 2005).
Actualmente, a nivel mundial existe una problemática relacionada a la resistencia que
presentan algunos microorganismos frente a antibióticos que se consideran de amplio
espectro. Es por esta razón que se pretende buscar nuevas alternativas de
antimicrobianos naturales, logrando ser un aporte innovador en este campo.

20
GRUPO POLIFENOLES

1.2 FORMULACIÓN DEL PROBLEMA


La información anterior condujo a determinar el problema objeto de estudio de esta
investigación en las siguientes preguntas:
¿Poseen las fracciones polares F1-C, F1-D y F1-F actividad antibacteriana frente a las
bacterias Escherichia coli (ATCC 25922) y Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853)?
¿Presentan las fracciones polares F1-C, F1-D y F1-F actividad inhibitoria frente a la
germinación de semillas de lechuga (Lactuca sativa L.)?

1.3 OBJETIVOS

1.3.1 Objetivo general


Determinar la actividad alelopática y antibacteriana de las fracciones polares F1-C, F1-D
y F1-F obtenidas de Henriettella trachyphylla Triana (Melastomataceae).

1.3.2 Objetivos específicos


1.3.2.1 Realizar ensayos de actividad alelopática a las fracciones F1-C, F1-D y F1-F
sobre la germinación de semillas de lechuga (Lactuca sativa L).
1.3.2.2 Desarrollar ensayos de actividad antibacteriana de las fracciones F1-C, F1-D y
F1-F frente a cepas de Escherichia coli y Pseudomonas aeruginosa.
1.3.2.2 Separar por columna cromatográfica empacada con Toyopearl HW40 la fracción
más promisoria frente a su actividad alelopática o antibacteriana.

21
GRUPO POLIFENOLES

1.4 JUSTIFICACIÓN

La tendencia de volver a lo natural y el uso creciente de los fitoquímicos como agentes


terapéuticos para el tratamiento de diversas enfermedades, ha llevado desde hace
algunos años al grupo Polifenoles de la Universidad Tecnológica de Pereira a investigar
sustancias con potencial biológico obtenidas de algunas plantas de la Eco-región Eje
Cafetero, y en especial las pertenecientes a la familia melastomataceae.
En nuestra región, el uso tradicional de estos fitoquímicos ha llevado al descubrimiento
y obtención de estructuras que son reconocidas por tener alguna actividad biológica
frente a organismos, ya sea contra bacterias como antibacterianos, contra hongos como
antifúngicos, o los que intervienen en el proceso de inhibición del crecimiento y muerte
de otras especies vegetales, como pueden ser los agentes alelopáticos. En la actualidad,
este uso ha permitido en otras latitudes desarrollar muchos agentes farmacéuticos o
agroquímicos que tengan como base los compuestos naturales, además de las posibles
modificaciones de los mismos por medio de biosíntesis, síntesis química y/o semi-
síntesis.
Según la OMS (Gómez et al., 2011), se estima que el 80% de los habitantes de los países
en vía de desarrollo dependen de las plantas medicinales para satisfacer sus necesidades
de atención primaria en salud. Lo anterior, se basa en la confianza que producen los
tratamientos con fitoterapéuticos, al evitar los efectos secundarios producidos por
fármacos sintéticos, además de su alta disponibilidad y bajo costo (Mongeli et al., 2000).
Del mismo modo, estas sustancias podrían ser utilizadas como potenciadores de
germinación, controladores biológicos en el diseño de sistemas de cultivos intercalados
y en el manejo de la rotación de los mismos (Gliessman, 2002).
Por medio de esta investigación se busca proveer una alternativa para conseguir
antibacterianos, herbicidas o potenciadores de germinación que sean competitivos e
innovadores, que favorezcan el desarrollo de nuestro país y la Eco-región Eje Cafetero,
además de ser un aporte significativo para ampliar el conocimiento de nuestro recurso
natural.
De esta forma, y teniendo antecedentes de otras investigaciones llevadas a cabo a partir
de las plantas melastomatáceas, se pretende seguir contribuyendo al desarrollo en la
búsqueda de nuevos agentes antimicrobianos y alelopáticos. Para este trabajo de
investigación se pretenden estudiar las fracciones polares F1C, F1D y F1F obtenidas de
Henriettella trachyphylla Triana, ya que esta ha sido poco estudiada frente a su
fitoquímica y farmacognosia.
.

22
GRUPO POLIFENOLES

2. MARCO TEÓRICO

2.1. Descripción y distribución de la familia melastomataceae


Melastomataceae Juss, comprende arbustos, trepadoras, leñosas, hierbas y árboles. Es la
séptima familia más diversa del planeta con 4570 especies en 150 a 166 géneros (Popaa
et al., 2008). Se reconoce fácilmente por el patrón de nerviación de las hojas. Muchas
especies se caracterizan por tener flores, siendo estas aprovechas por su importancia
como ornamentales (Quiñones. 2001).
La familia melastomatácea, se producen en todos los biomas tropicales, particularmente
de las regiones del Nuevo Mundo. En Suramérica se encuentran 166 géneros, ninguno
de ellos existe en el viejo mundo. Para Colombia se registran aproximadamente 900
especies y 61 géneros, distribuidas en los Andes, Chocó y Amazonía. En la Orinoquía se
encuentran 38 géneros y alrededor de 180 especies (Quiñones. 2001).

2.1.1 Farmacognosia de la familia melastomataceae


Las plantas melastomataceaes han sido usadas para medicina tradicional, especialmente
en Asia y Latinoamérica, como astringentes, hemostáticos, como remedios para diarrea,
disentería, leucorrea y enfermedades de la piel; contra afecciones respiratorias, malaria,
cálculos en la vejiga y otras enfermedades del tracto genitourinario, irritaciones en las
encías y como diurético. En Colombia, algunas especies de la familia son usadas como
medicina tradicional para el tratamiento de la malaria, infecciones, heridas en la piel,
enfermedades respiratorias, cálculos en la vejiga y otras dolencias genitourinarias, como
diurético, y como un remedio tópico para irritaciones en la encía (García. 1974 ).
Según información de pobladores en Riosucio Caldas, indican que Tibouchina ciliaris y
Monochaetum multiflorum han sido usadas tradicionalmente para el tratamiento de
infecciones en heridas de la piel.

2.1.2 Fitoquímica de la familia melastomataceae


Muchos de los constituyentes químicos de las plantas melastomatáceas son de tipo
polifenólico; sin embargo, también han sido reportados algunos triterpenoides y
aquilbencenos.
Se han detectado alcaloides en clidemia hirta D. Don. y Sonerila heterostemon Naudin,
pero aún no se han aislado. En la planta Clidemia floribunda Planch. Se ha detectado el
ácido caféico. Molisch, describió en 1928 la presencia de antocianinas en las raíces de
algunas especies de melastomataceaes, como Centradenia grandiflora Endl. Ex. Walp,
Monochaetum umbellatum Naudin, Tibouchina semidecandra Cogn, Medinillina
magnifica Linl, Bertolonia aenea Naudin, B. Marmorata Naudin, y B. Vittata.

23
GRUPO POLIFENOLES

La mayor parte de los constituyentes de las plantas melastomatáceas son taninos


hidrolizables. Hasta ahora los taninos hidrolizables aislados de especies de
melastomatáceas son representativos de grupos galotaninos y elagitinanos.
La composición de los taninos hidrolizables oligoméricos de Tibouchina multiflora
colectada en colombia, fueron similares a los de T. Semidecandra, incluyendo 1, 2, 3, 6
tetragaloiglucopiranosa, casuarictin, pterocarianin C, pedunculagin, y los nobotaninos
A-A-E aislados de las hojas de Monochaetum multiflora, junto con nueve nuevos
nobotaninos O-W, dimeros, trimeros y tetrámeros (Isaza y Jiménez, 2005).

2.2 Descripción y componentes químicos del género Henriettella y la especie


Henriettella trachyphylla

2.2.1 Henriettella Naudin


El género Henriettella Naudin, se caracteriza por árboles o arbustos con flores
tetrámeras o pentámeras, hojas cartáceas a subcoriáceas, pétalos ovados a lanceolados,
obtusamente agudos a obtusos apicalmente, blancos o amarillentos (Tropicos.org. 2012).
Este género cuenta con alrededor 40 especies, que se distribuyen desde Guatemala hasta
Bolivia y el sur oriente de Brasil. En Colombia se registran 16 especies en las regiones
del Chocó, Magdalena Medio, Andes, Sierra Nevada, Orinoquía, las Guayanas y
Amazonía, entre los 0 y los 2800 metros de altitud (Mendoza et al., 2006).
De la fracción en acetato de etilo de Henriettella fascicularis condujo al aislamiento de
taxyphyllin (a) el cual ha mostrado potencial toxicidad en los herbívoros (Calderon et
al., 2003). A partir de la fracción en diclorometano de H. fascicularis se registraron el β-
sitosterol (b), 4´,5,7-trihidroxi-6,8-dimetilisoflavona (c) y ácido (3E,6S)-6-
[(1R,5Z,3aS,9R,10Z,12aR)-1,2,3,3a,4,7,8,9,12,12a-decahidro-9-hidroxi-3a-6,10-
trimetilciclopentamocicloundecano-1-il]-2-metil-hept-2-enoico (d).
OH

O CN
O
HO
HO
OH

OH HO

Taxyphyllin -sitosterol
a. b.

24
GRUPO POLIFENOLES

CH3
COOH

HO O HO

H3C

OH O
OH
4´,5,7-trihidroxi-6,8-dimetilisoflavona ácido sesterterpenoico
c. d.
Figura 2. Compuestos aisladas de H. fascicularis

2.2.2 Henriettella trachyphylla Triana.


La especie de H. trachyphylla se caracteriza por árboles 4-5 m de altura; ramas y
pecíolos densa a moderadamente verrucoso-hirsutos, hojas elípticas a elíptico-obovadas,
flores densamente estrigosos, pétalos ovados, glabros en ambas superficies, blancos
(Tropicos.org. 2012).
El fraccionamiento guiado por bioensayos del extracto en i-PrOH–agua (65:35) de H.
trachyphylla sugieren la presencia de isoflavonas y flavonas (Isaza y Jiménez, 2005).

2.2.2.1 Indicios de actividad alelopática de Henriettella trachyphylla Triana


Estudios realizados de actividad alelopática del extractos en i-PrOH-agua (65:35) y
fracciones de las hojas de H. trachyphylla, mostraron un efecto inhibidor de crecimiento
de acción en hipocótilo, se debe a la presencia de compuestos con acción pesticida y se
evidencia un efecto promotor en epicótilo, esto sugiere que los compuestos presentes en
H. trachyphylla son potenciales de crecimiento, y sus productos de degradación actúan
como fitohormonas (Isaza et al., 2005).

2.2.2.2 Indicios de actividad antibacteriana de Henriettella trachyphylla Triana


No se han encontrado estudios pertinentes en cuanto a la evaluación de la actividad
antibacteriana sobre H. trachyphylla.

2.3 Aleloquímicos
Los aleloquímicos son en gran parte clasificados como metabolitos secundarios de
lasplantas, que juegan un papel importante en interacciones o defensas en las plantas y
en mecanismos ecológicos. Los aleloquímicos están presentes prácticamente en todos
los tejidos vegetales, incluyendo hojas, flores, frutos, tallos, raíces, rizomas, las semilla y
el polen. Pueden ser liberados de las plantas al medio ambiente a través de

25
GRUPO POLIFENOLES

volatilización, lixiviación, exudación de las raíces, y la descomposición de residuos


vegetales (An, 2003).
La producción de aleloquímicos en plantas vivas se ve afectada por: factores abióticos,
como alta temperatura, modificación en la calidad de luz, características del suelo (pH,
estructura, estado de los nutrientes, textura, presencia de contaminantes), la altitud y
latitud, factores bióticos, como agentes patógenos, plagas, parásitos o herbívoros. Sin
embargo, los efectos de las interacciones planta-planta son menos conocidos (Rivoal et
al., 2011).
Con los años se ha demostrado que las plantas producen sustancias con propiedades
químicas alelopáticas que afectan a algunas especies de plantas. Estas sustancias se
distribuyen en diferentes partes de la planta, durante su ciclo de vida.
Cuando estas sustancias se liberan en cantidades suficientes, tienen efectos alelopáticos
que se puede observar en la germinación, crecimiento y/o el desarrollo de la plantas. Los
principales agentes alelopáticos son metabolitos secundarios de naturaleza química muy
variada. A medida que avanza las investigaciones en el tema se incorporan nuevos
grupos de sustancias a las cuales no se les atribuía esta actividad biológica. Se conocen
alrededor de 10.000 metabolitos secundarios con acción alelopática como esteroides,
ácidos grasos de cadenas largas, lactonas, flavonoides, cumarinas, naftoquinonas,
antraquinonas, fenoles simples, taninos, terpenoides, aminoácidos (Santos, 2007;
Vyvyan, 2008).
El efecto alelopático que puede tener una planta sobre otra, puede clasificarse como
positivo, cuando estimula el crecimiento normal; negativo, cuando se inhibe el
crecimiento o nulo, cuando los aleloquímicos no tienen ningún efecto sobre el desarrollo
de la planta; dichos efectos dependen del comportamiento de cada aceptor frente al
aleloquímico y de las propiedades tanto del aceptor como del aleloquímico (Krautmann
et al, 2001; Waller et al, 1992).

2.3.1 Aleloquímicos como herbicidas naturales


Se denominan aleloquímicos a los herbicidas naturales obtenidos de diversas fuentes
vegetales. La obtención de estos agroquímicos basados en fuentes naturales son
atractivos por varias razones. Primero, la mayoría de ellos son solubles en agua, y como
resultado, es posible que sean activos a muy bajas concentraciones, reduciendo su
presencia en el ambiente. Los productos naturales tienen relativamente vida media corta.
Algunos productos naturales son explotados comercialmente como son los herbicidas
derivados de las tricetonas (Sampietro, 2008; Lopes et al., 2009).
Es importante señalar que los herbicidas sintéticos de amplio espectro, que son los más
comerciales, además de controlar las arvenses influyen negativamente en la salud de los
seres vivos, deterioran las fuentes hídricas y el suelo, puesto que muchos de ellos, por
sus características físico-químicas son difíciles de degradar. El uso indiscriminado de
estas sustancias ha generado efectos tóxicos en las comunidades aledañas a los cultivos,

26
GRUPO POLIFENOLES

por lo cual se deben plantear nuevas alternativas de control (Nivia, 2000; Cuenca et al.,
2004).
Los extractos vegetales con propiedades alelopáticas son de fácil degradación en el
control de las arvenses y se pueden obtener de tal manera que sean selectivos dentro de
los cultivos, lo cual regula las cantidades demandadas por el mismo. La importancia de
avanzar en el estudio de la actividad alelopática de extractos vegetales, se manifiesta en
la disminución de los costos de mantenimiento de los cultivos y en la reducción del
impacto ambiental que causa el uso de herbicidas (Macías et al.,2000).
Las estrategias alelopáticas apuntan a la reducción de la polución ambiental y a
mantener un balance ecológico en la flora y la fauna, con la disminución en el uso de
pesticidas (insecticidas, fungicidas, nematicidas y herbicidas) sustituyendo estos por
compuestos naturales (plantas y microorganismos); los aleloquímicos y fitoquímicos
están libres de todos estos problemas asociados con la presencia de pesticidas. Por esto
la alelopatía es un área prioritaria de investigación en la mayoría de los países del mundo
(Min et al., 1997).

2.3.2 Germinación
Durante las dos últimas décadas, la ciencia de la alelopatía ha atraído un gran número de
investigadores. Esto ha sido en gran medida, por las perspectivas de que la alelopatía es
válida en la agricultura y la calidad en la producción de alimentos para humanos. En
reducir los daños ambientales por la dependencia a los herbicidas sintéticos y los riesgos
generados, en ocasiones por contaminación cruzada a otros cultivos y ríos cercanos en
áreas de actividad agrícola (An et al., 2003).
Compuestos que inhiben la germinación son llamados fitotóxicos, producidos por
plantas que tienen relación específica e inter-específica para la competición por
nutrientes del medio. La búsqueda de aleloquímicos es un campo de investigación
creciente, en relación a que dichos compuestos pueden ser desarrollados como
herbicidas en la agricultura. Uno de los bioensayos más comunes para aleloquímicos es
usar semillas de lechuga (Lactuca sativa L.) en la prueba de germinación en cajas de
Petri, como esta es generalmente una especie sensible a los aleloquímicos, es de fácil
adquisición y su germinación es rápida y uniforme. El aislamiento de los compuestos
bioactivos es usualmente a partir del fraccionamiento de un extracto.
Para que el proceso de germinación ocurra es necesario que la semilla pase por tres fases
(Jean-Yves et al., 2006) la fase de hidratación, la fase de germinación y la fase de
crecimiento. La fase de hidratación, es donde todos los tejidos internos absorben agua y
la semilla aumenta su proceso respiratorio. En la fase de germinación, se producen
transformaciones bioquímicas y fisiológicas internas y se reduce el consumo de agua;
dentro de esta fase se encuentran cuatro etapas como se ilustra en la (Fig. 3), desde el
brote de la radícula hasta la formación de la primera hoja.

27
GRUPO POLIFENOLES

Figura 3. Etapas de la germinación en dicotiledóneas (Jean-Yves et al., 2006).

La última es la fase de crecimiento en la cual se reactiva la absorción del agua, el


proceso respiratorio y la fotosíntesis, (Jean-Yves et al., 2006). Las fases mencionadas
anteriormente, son necesarias para la germinación de la semilla, y cuando se alteran, las
semillas pueden impermeabilizarse, evitando la entrada de sustancias, (Bradford, 1995)
o por el contrario, pueden absorber gran cantidad de agua, evitando su germinación
(Zalacain et al., 2005).
La germinación puede ser afectada por sustancias aleloquímicas, que la inhiben o la
favorecen. Entre las sustancias que inhiben la germinación, podemos encontrar los
alcaloides y coumarinas, porque interfieren en los procesos respiratorios, retardando el
desarrollo de la planta (Luzzet et al., 2004). Mientras que en el grupo de sustancias que
favorecen la germinación, los lupanos triterpénicos estimulan la actividad germinativa
(Macía et al., 1999). Por otra parte, la germinación de las semillas y su desarrollo rápido
está determinada por factores intrínsecos y extrínsecos; los intrínsecos son aquellos
referentes a la madurez y la viabilidad de las semillas (García et al., 2001). Esta
viabilidad depende de variaciones genéticas y determinan para una especie que algunas
variedades pueden adaptarse mejor a unas condiciones que a otras (Moreno et al., 2001).
Mientras que, los factores extrínsecos están determinados por las condiciones
ambientales, como la temperatura, la humedad relativa, la iluminación, entre otros;

28
GRUPO POLIFENOLES

propiedades que pueden acelerar o retardar los procesos de crecimiento de las semillas
(Bertín et al., 2011).

2.4 Actividad antibacteriana


La historia de los productos naturales bioactivos inició hace más de 100 años. En el
sentido más amplio, éstos se definen usualmente como los compuestos químicos
derivados y aislados de los organismos vivos de la naturaleza como las plantas,
animales, microorganismos y especies marinas, sintetizados durante el metabolismo
primario o secundario de los mismos ( Organization For Tropical Studies, 2012).
Por otra parte, estos componentes naturales exhiben tanto actividad antibacteriana como
otra actividad en la mayoría de los casos. Esta capacidad antimicrobiana en extractos, se
encuentra disponible en una serie de componentes de variadas estructuras, incluidos los
de funcionalidad aldehído y fenoles. Las combinaciones naturales de estos compuestos
son a menudo sinérgicos, dando lugar a una mayor actividad antimicrobiana en los
extractos crudos que en los compuestos puros individuales.
La aceptación de la medicina natural en plantas, como una alternativa para el cuidado de
la salud y la conservación de la calidad de vida para evitar la resistencia microbiana a los
antibióticos ha llevado a muchos autores a investigar la actividad antibacteriana en
plantas (Lou et al., 2001).

2.4.1 Descripción de bacterias empleadas

2.4.1.1 Estructura
Constan de un citoplasma y un material nuclear. Están separadas del exterior por una
membrana citoplasmática, que está rodeada por una pared celular. No posee membrana
nuclear, ni organelas celulares y el citoplasma está lleno de ribosomas. La membrana
citoplasmática es el lugar de obtención de energía por respiración o fotosíntesis; toda la
información genética del procariota se encuentra en un solo filamento de DNA. Esta
molécula de DNA se presenta como una hebra circular y cerrada; su contorno mide de
0,25 mm a 3 mm. En muchas bacterias se ha encontrado DNA extra cromosómico; los
cuales son moléculas pequeñas, igualmente circulares y cerradas, que se denominan
plásmidos (Schiegel et al., 1997).

2.4.1.2 Escherichia coli


Escherichia coli (Fig. 4) es una de las especies bacterianas más minuciosamente
estudiadas, y no solamente por sus capacidades patogénicas, sino también como sustrato
y modelo de investigaciones metabólicas, genéticas, poblacionales y de diversa índole;
Forma parte de la familia Enterobacteriaceae y está integrada por bacilos Gram
negativos no esporulados, móviles con flagelos peritricos o inmóviles, aerobios-

29
GRUPO POLIFENOLES

anaerobios facultativos, capaces de crecer en agar MacConkey y en medios simples con


o sin agregado de NaCl.
Son bacterias de rápido crecimiento y amplia distribución en el suelo, agua, vegetales y
en gran variedad de animales.

Figura 4. Escherichia coli


Fuente: http://www.rightdiagnosis.com/phil/html/e-coli-food-poisoning/2112.html

2.4.1.3 Pseudomonas aeruginosa


Pseudomonas aeruginosa pertenece a la familia Pseudomonadaceae y es un bacilo Gram
negativo aerobio con un flagelo polar. Cuando se cultiva en medios adecuados produce
piocianina, un pigmento azulado no fluorescente. Muchas cepas producen también el
pigmento verde fluorescente pioverdina.
Al igual que otras Pseudomonas fluorescentes, produce catalasa y oxidasa, así como
amoniaco a partir de la arginina, y puede utilizar citrato como única fuente de carbono.
Pseudomonas aeruginosa (Fig. 5) es un microorganismo común en el medio ambiente y
puede encontrarse en las heces, el suelo, el agua y las aguas residuales. Puede proliferar
en ambientes acuáticos, así como en la superficie de materias orgánicas propicias en
contacto con el agua.

Figura 5. Pseudomonas aeruginosa


Fuente: http://www.rightdiagnosis.com/phil/html/e-coli-food-poisoning/2112.html

30
GRUPO POLIFENOLES

2.4.2 Descripción de antibióticos empleados

2.4.2.1 Amoxicilina
La amoxicilina (Fig. 6) es un antibiótico semisintético derivado de la penicilina. Se trata
de una amino penicilina. Actúa contra un amplio espectro de microorganismos, tanto
Gram positivos como Gram negativos. Por esto se emplea a menudo como primer
remedio en infecciones de diferente gravedad, tanto en medicina humana como también
en veterinaria. Se utiliza por vía oral o parenteral, aunque la forma parenteral
(intramuscular ointravenosa) no está aprobada en todos los países debido a su
comprobado daño al sistema auditivo y renal, causando en algunos casos sordera.
Como las demás penicilinas la amoxicilina impide en las bacterias la correcta formación
de las paredes celulares. Concretamente inhibe la conexión entre las cadenas
peptidoglicáneas lineares que forman la mayor parte de las paredes de los
microorganismos Gram positivos. Al impedir que la pared celular se construya
correctamente, la amoxicilina ocasiona, en último término, la lisis de la bacteria y su
muerte.
HO
O
H H

S CH3
N

NH2 H N
CH3
O
COOH
Figura 6. Amoxicilina

2.4.2.2 Ampicilina
La ampicilina (Fig. 7) es un antibiótico penicilínico semisintético, de amplio espectro y
activo por vía oral. Aunque es más activo que las penicilinas naturales no estable frente
a las beta-lactamasa producidas por bacterias Gram positivas o Gram negativas. La
ampicilina se utiliza para el tratamiento de infecciones debidas a organismos
susceptibles como la otitis media, la sinusitis y las cistitis. Debido al aumento de
resistencias ya no se recomienda la ampicilina para el tratamiento de la gonorrea.
Los antibióticos beta-lactámicos como la ampicilina son bactericidas. Actúan inhibiendo
la última étapa de la síntesis de la pared celular bacteriana uniéndose a unas proteínas
específicas llamadas PBPs (Penicillin-Binding Proteins) localizadas en la pared celular.
Al impedir que la pared celular se construya correctamente, la ampicilina ocasiona, en
último término, la lisis de la bacteria y su muerte.

31
GRUPO POLIFENOLES

NH2 H

S CH3
NH

N
CH3
O
O
OH

O
Figura 7. Ampicilina

2.5 Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia (HPLC)


La cromatografía es un método físico de separación basado en la distribución de los
componentes de una mezcla entre dos fases inmiscibles, una fija o estacionaria y otra
móvil. En la cromatografía líquida, la fase móvil es un líquido que fluye a través de una
columna que contiene a la fase fija.
La cromatografía líquida “clásica” se lleva a cabo en una columna generalmente de
vidrio, la cual está rellena con la fase fija. Luego de sembrar la muestra en la parte
superior, se hace fluir la fase móvil a través de la columna por efecto de la gravedad.
Con el objeto de aumentar la eficiencia en las separaciones, el tamaño de las partículas
de fase fija se fue disminuyendo hasta el tamaño de los micrones, lo cual generó la
necesidad de utilizar altas presiones para lograr que fluya la fase móvil. De esta manera,
nació la técnica de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), que requiere de
instrumental especial que permita trabajar con las altas presiones requeridas.
Para el presente estudio se utilizo esta técnica, pues en la actualidad ha llegado a ser una
de las más importantes como herramienta analítica para separar y detectar compuestos
químicos.

32
GRUPO POLIFENOLES

Detector Interfase Software

Horno

Sistema de elución

Bomba

Columna
Automuestreador inteligente

Figura 8. Equipo HPLC


Fuente: Autor

33
GRUPO POLIFENOLES

3. SECCIÓN EXPERIMENTAL

3.1 Materiales y reactivos


El material de vidrio como cajas petri, cromatoplacas de sílica gel 60 F254 y en RP-18
F254s (Merck), así como reactivos DMSO grado analítico (Dimetil sulfóxido, Phyto
Technology Laboratories), Tween 20 y Glifosato comercial (648 g/L, Raundup Spectra,
transorb Technology). Los medios de cultivo, como agar Mueller Hinton, agar nutritivo
y caldo infusión cerebro corazón (BHI), se encuentran en el laboratorio del grupo
Polifenoles. Los medio de cultivo se prepararon según indicación del fabricante. Las
cepas de microorganismos empleadas Escherichia coli (ATCC 25922) y Pseudomona
aeruginosa (ATCC 27853), estaban disponibles en el laboratorio de microbiología
(Escuela de Química, UTP).

3.2 Disolventes
Tanto en las separaciones cromatográficas, como en las cromatografías se utilizaron
disolventes grado analítico (Merck). Para HPLC, estos se filtraron y sometieron a
ultrasonido.

3.3 Equipos
Se utilizó un equipo de ultrasonido Fisher Scientific FS60H, balanza analítica OHAUS
Advance, rotaevaporador Heidolph Laborota 4003-control, cámara de revelado UV
Camag, incubadora Velp scientific FOC 225i y un espectrofotómetro UV/Vis Shimadzu
UV-1700 PharmaSpec (laboratorio de Fitoquímica).
Para el análisis por HPLC, se empleo un equipo Jasco HPLC 2000 Plus. Sistema
equipado con bomba de gradiente cuaternario PU-2089 Plus, automuestreador
inteligente AS-2059 Plus, horno para columna CO-2065 Plus, columna Cromolith
Performance RP-18 endcapped (100-4,6 mm), detector inteligente de arreglo de diodos
MD-2015 Plus y LC Net II/ADC, controlado por el Software EZChrom Elite.
Sistema de elución isocrático con ácido fosfórico 0.05%-isopropanol (95:5), flujo 0.5
µL/min, volumen de inyección 15 µL, presión (0-250) bar, temperatura del horno 35 °C,
tiempo de corrido 10 minutos.

3.4 Material vegetal


Henriettella trachyplylla Triana, se encontró disponible en el Laboratorio del grupo
Polifenoles, la cual fue recolectada en la vereda Laguneta, vía Pereira-Armenia, e
identificada por el Dr. Frank Almeda de la Academia de Ciencias de California.

34
GRUPO POLIFENOLES

3.4.1. Fracciones polares empleadas


Para este trabajo las fracciones polares se obtuvieron en investigaciones anteriores,
realizando un fraccionamiento por cromatografía en columna de la fase acuosa F-1, la
fase acuosa F-1 (2,2 L, 15,422 g) fue pasada por columna cromatográfica (d.i. 5 cm, 17
cm de largo) empacada con DIAION HP-20 (Mitsubishi Japón; resina de intercambio
iónico), utilizándose como gradiente isopropanol-agua (0:100 ;10:90; 15:85; 20:80
;30:70; 40:60; 50:50; 70:30; 100:0), finalizando con isopropanol-n-hexano (70:30),
recogiendo 4 fracciones de 500 mL por cada etapa, para un total de 46 fracciones.
Cada fracción fue monitoreada por espectrofotometría UV a 280 nm (espectrofotómetro
Génesis 10, laboratorio de análisis instrumental, UTP) midiendo en una celda de cuarzo
y agua como blanco. Con base a las lecturas de absorbancia se realizó un cromatograma
que permitió reunir las fracciones acorde con los picos cromatográficos y estas fueron
nombradas desde F-1A hasta F-J. Las fracciones así reunidas (Fig. 9) se secaron en
evaporador rotatorio (Buchi R-205, laboratorio de Fitoquímica) y monitoreadas por
cromatografía en capa fina en fase normal, usando como fase estacionaria silica gel 60
(F254, Merck) y como sistema eluente n- hexano- acetato de etilo (7:3); n-hexano-acetona
(7:3) y en fase reversa (RP-18 F254s, Merck) con el sistema isopropanol-agua (60:40)
(Isaza et al., 2005).

35
GRUPO POLIFENOLES

Figura 9. Procedimiento de extracción de las hojas de Henriettella trachyphylla (Isaza et al., 2005).

3.5 Prueba preliminar para selección de semillas de lechuga o tomate

3.5.1 Semillas
Las semillas de lechuga (Lactuca sativa L.) y tomate (Lycopersicum esculentum Mill.)
fueron compradas a Fercon Ltda, estas se mantuvieron y trataron a condiciones de
laboratorio (laboratorio de Fitoquímica).

3.5.2 Agua pretratada


Se calentaron 300 mL de agua potable hasta ebullición por 5 minutos y se dejó enfriar
hasta temperatura ambiente.

3.5.3 Lavado
Las semillas de lechuga y tomate se lavaron con agua pretratada (Fig. 10).

36
GRUPO POLIFENOLES

Figura 10. Lavado de semillas


3.5.4 Ensayo de germinación de semillas de lechuga y tomate

3.5.4.1 Germinación de semillas de lechuga y tomate en agua


Se depositaron 10 semillas de lechuga en forma radial sobre papel filtro, el cual se
encuentra en una caja de petri impregnado con 5 mL de agua pretratada (Fig. 11a). El
mismo procedimiento se realizó para las semillas de tomate (Fig. 11b). Los
experimentos preliminares de germinación se realizaron por triplicado.

SEMILLAS DE LECHUGA SEMILLAS DE TOMATE


EN AGUA PRETRATADA EN AGUA PRETRATADA
a. b.
Figura 11. Germinación de semillas en agua

3.5.2.2 Germinación de semillas de lechuga y tomate en solución de DMSO


Se adicionaron 14,95 mL de H2O y 0,05 mL de DMSO sobre una hoja de papel filtro
colocada dentro de una caja de petri, para llegar así a una concentración final en DMSO
del 0,33% esto con el fin de evaluar a esta concentración la actividad germinativa del
DMSO para ser empleado como solubilizador de las fracciones a evaluar. Después de
esto, se colocaron 10 semillas de lechuga sobre del papel (Fig. 12a). Se lleva a cabo el
mismo procedimiento con las semillas de tomate (Fig. 12b). Este procedimiento se
realizo por triplicado.

37
GRUPO POLIFENOLES

SEMILLAS DE LECHUGA SEMILLAS DE TOMATE


EN AGUA PRETRATADA EN AGUA PRETRATADA
a. b.

Figura 12. Germinación de semillas en DMSO

3.5.2.3 Control con glifosato


Se utilizó como control glifosato comercial a una concentración de 3,7x10-2 M. Esta se
preparó disolviendo 0,7 mL de glifosato comercial en 49,3 mL de agua pretratada.
Después, se adicionaron 10 semillas de lechuga sobre el papel de filtro (Fig. 13a). Se
lleva a cabo el mismo procedimiento con las semillas de tomate (Fig. 13b), Este
procedimiento se realizó por triplicado.

SEMILLAS DE LECHUGA SEMILLAS DE TOMATE


EN AGUA PRETRATADA EN AGUA PRETRATADA
a. b.

Figura 13. Control con glifosato

Después de tener las semillas en caja Petri para su germinación en agua, DMSO y
glifosato se dejaron germinar durante 5 días (120 horas) a condiciones ambiente del
laboratorio y privadas de la luz solar.

38
GRUPO POLIFENOLES

3.6 Ensayo de germinación para semillas de lechuga frente a las fracciones F1-C,
F1-D y F1-F

3.6.1 Esterilización de las semillas


Las semillas de lechuga se esterilizaron en una solución al 5% (v/v) de hipoclorito de
sodio durante 15 minutos, y se enjuagaron por cuatro veces con agua destilada estéril
(Fig.14).

Agua pretratada

lavar con H2O

Semillas con hipoclorito al 5 %

Figura 14. Esterilización de semillas de Lechuga

3.6.2 Preparación de las fracciones


Se prepararon las soluciones de cada fracción a concentraciones de 0,05 mg/mL, 0,1
mg/mL, 0,5 mg/mL, y 0,8 mg/mL en metanol (Kato-Noguchi et al., 2005).

3.6.3 Germinación
Las soluciones preparadas a concentraciones de 0,05 mg/mL, 0,1 mg/mL, 0,5 mg/mL,
0,8 mg/mL. Se adicionaron sobre dos hojas de papel filtro colocadas dentro de una caja
de Petri. Posterior a esto se mantuvieron en cámara de flujo laminar 25 °C hasta
sequedad. Luego se adiciono a cada caja de Petri 4 mL de Tween 20 al 0.05%. El Tween
20 es utilizado a concentraciones menores de 0,05% en volumen en ensayos de actividad
alelopática, sin que se presente alguna acción inhibitoria o promotora de germinación
sobre las semillas de prueba. Por último se procedió a colocar 15 semillas bien
distribuidas por caja, estas se dejaron en oscuridad por 36 horas a temperatura ambiente.
Este ensayo se realizo por triplicado. Después de esto se contaron las semillas
germinadas y se tomó el registro para su análisis posterior (Kato-Noguchi et al., 2005).

3.6.4 Toma de datos y análisis estadístico


Los resultados obtenidos a partir de las semillas germinadas por horas se reportan en las
tablas de los anexos 1 y 2. Los datos obtenidos de las semillas germinadas se representan
mediante signo positivo (+), las semillas que no germinan por signo negativo (-) y el

39
GRUPO POLIFENOLES

acumulado de semillas por horas con cero (0). Los datos obtenidos se trataron con
estadística clásica para determinar porcentaje de germinación y desviación estándar, así
como las gráficas en las que se muestra la información será llevado a cabo por medio del
programa GraphPad Prism versión 6.00 (Trial), versión libre para descarga en la página
web: http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/

3.7 Actividad antibacteriana

3.7.1 Microorganismos
Para la actividad antibacteriana se usaron cepas liofilizadas, replicadas en BHI, de los
microorganismos Escherichia coli (ATCC 25922) y Pseudomonas aeruginosa (ATCC
27853).

3.7.2 Antibiograma
Se evaluó por el método de difusión en agar (Ramírez y Díaz, 2007) frente a los
antibióticos: ampicilina sódica y amoxicilina a concentraciones recomendadas de 1000,
500, 250, 125 y 62,5 ppm, y un blanco de una solución de DMSO al 5%.
Con este ensayo se determina la sensibilidad o resistencia de los microorganismos frente
a los antibióticos de prueba, tomando como base el promedio de las réplicas de medición
del halo de inhibición a la menor concentración. Según este criterio de selección, las
fracciones que presenten halos de inhibición mayores en relación al antibiótico de
prueba se tomarán como fracción activa frente a los microorganismos.

3.7.3 Ensayo de actividad antibacteriana de las fracciones polares


Se determinó la actividad antibacteriana de las fracciones polares F1-C, F1-D, F1-F, a
1000, 500, 250, 125 y 62,5 ppm, utilizando las cepas de E. coli y P. aeruginosa,
empleando el método de difusión en agar.

3.7.4 Medio de cultivo


Se utilizó agar Mueller-Hinton, teniendo en cuenta que en este medio gran parte las
bacterias con características patógenas desarrollan un crecimiento óptimo.

3.7.5 Preparación del inoculo


La preparación del inoculo se realizó tomando de 3 a 5 colonias aisladas del
microorganismo, se trasfirieron a un tubo con 4 a 5 mL de un medio de cultivo
adecuado, tal como infusión cerebro corazón (BHI) y se incubó durante 24 h a 37 °C;
transcurrido este tiempo, 1 mL del inoculo se transfirió a 4 mL de caldo y se midió la

40
GRUPO POLIFENOLES

absorbancia a 540 nm, dependiendo de este resultado y del tiempo de generación


característico de la bacteria, se calculó el tiempo de incubación para obtener una
turbidez de 0,100 de absorbancia óptimamente comparable a un estándar de 0,5
McFarland, de forma que las bacterias estuvieran en fase exponencial al momento de
realizar el ensayo (Ramírez et al., 2011).

3.7.6 Controles
Para la actividad antibacteriana se utilizo como control amoxicilina y ampicilina anhídra
sódica, y como blanco DMSO al 5% (Wadhwani et al., 2009)

3.7.7 Preparación de antibióticos estándar


El blanco utilizado fue una solución de DMSO al 5%. Los controles fueron los
antibióticos evaluados en el antibiograma. La ampicilina se preparó disolviendo 0,051 g
en una solución de DMSO al 5%, en un volumen final de 50 mL.
Para la amoxicilina se disolvió 0,052 g en una solución de DMSO al 5%, en un volumen
final de 50 mL. Para ambos antibióticos la concentración final fue de 1000 ppm. A partir
de esta solución madre se realizaron las respectivas diluciones (Fig. 15). Para llegar a
concentraciones de 500, 250, 125 y 62,5 ppm.

1000 ppm 500 ppm 250 ppm 125 ppm 62,5 ppm

Figura 15. Diluciones para la preparación de antibióticos

3.7.8 Preparación de las fracciones


Las fracciones F1-C, F1-D y F1-F, provenientes de la separación cromatográfica en
columna sobre DIAION HP-20, se disolvieron en una solución de DMSO al 5% con
ayuda del ultrasonido, preparando para cada una de las fracciones, soluciones iniciales

41
GRUPO POLIFENOLES

de 1000 ppm, y a partir de estas se realizaron las diluciones respectivas (Fig.16) hasta
llegar a concentraciones de 500, 250, 125 y 62,5 ppm.

1000 ppm 500 ppm 250 ppm 125 ppm 62,5 ppm

Figura 16. Diluciones para la preparación de fracciones

3.7.9 Evaluación de la actividad inhibitoria


En una caja petri se agregaron 100 µL de la bacteria a evaluar, la cual estaba en (caldo
BHI) a una absorbancia de 0,1 a 540 nm. Luego se agregaron 25 mL de agar Mueller
Hinton a 25 °C y se mezcló suavemente en forma de ocho hasta solidificación (Fig.17).

42
GRUPO POLIFENOLES

100 uL de cultivo
0,1 de abs a 540 nm

25 mL de agar
a 45 °C

Homogenizar en forma de 8 y
dejar solidificar

Figura 17. Diagrama de siembra en profundidad

Con ayuda de un sacabocados se hicieron 5 pozos (5 mm de diámetro), sobre la placa de


agar sólido (Fig.18). Los pozos se realizaron hasta el fondo, y para sellarlos se
adicionaron 15 µL de agar a 45 °C, dejando reposar hasta solidificación.

43
GRUPO POLIFENOLES

1 2
1: Control
2: Blanco DMSO
5
3: Fracción C: 1000 ppm
4: Fracción D: 1000 ppm
3 4 5: Fracción F: 1000 ppm

15 uL de agar a 45 °C
en cada pozo dejar enfriar

Figura 18. Diagrama de distribución y elaboración de los pozos

Por último se aplicaron 10 µL del blanco, control y muestra problema, a tres


concentraciones diferentes en cada uno de los pozos (Fig.18), dejando en incubación a
37 °C por 24 horas. Este procedimiento se realizó por triplicado y se realizó para cada
uno de los microorganismos y antibióticos. De esta misma manera se realizó para las
diferentes concentraciones de 500, 250, 125 y 62,5 ppm.
La lectura se realizó midiendo el diámetro del halo de inhibición con regla milimetrada
(Fig.19), tomando tres medidas en forma radial en cada pozo. Cada uno de los ensayos
será realizado por triplicado. Suministrando los datos en una tabla de recopilación de
medidas en milímetros (mm) (tabla 1); estos datos se promedian determinando el
porcentaje de desarrollo del halo de la muestra a evaluar y del halo de control, según se
muestra en la siguiente fórmula (Ramírez y Díaz, 2007):

% Inhibición = (Diámetro del halo muestra/Diámetro del halo control)*100

44
GRUPO POLIFENOLES

Figura 19. Diagrama de medición del halo de inhibición.

3.8 Pruebas de caracterización para flavonoides


A las fracciones polares F1-C, F1-D y F1-F se les realizaron las siguientes pruebas de
clasificación química.

3.8.1 Prueba de cloruro férrico


Se realizó esta prueba para determinar la presencia de fenoles. Los taninos reaccionan
con solución acuosa de tricloruro férrico al 1% (Fig.20) dando coloración azul (taninos
derivados del ácido gálico) o verde (taninos derivados del ácido protocatéquico) (Calle y
Jiménez, 2002).

OH
O-

+ FeCl3 Fe + 3HCl

Complejo coloreado
Figura 20. Reacción de cloruro férrico

A 0.2 mL de la fracción disuelta en etanol, se agregó una gota de solución de tricloruro


férrico. Se empleó ácido tánico al 5% como solución patrón y se compararon los
resultados.

3.8.2 Prueba con acetato de plomo


Esta prueba se realizó con el fin de identificar fenoles, en caso de haberlos. Los taninos
reaccionan con solución de acetato de plomo (Fig. 21), produciendo turbidez o
precipitado blanco (Calle y Jiménez, 2002).

45
GRUPO POLIFENOLES

OH O-

+ (CH3COO-)2Pb Pb

Figura 21. Reacción con solución de acetato de plomo

A 1 mL de solución etanólica de las fracciones se le adicionó 1 mL de solución de


acetato de plomo al 10%, y se registraron los resultados.

3.8.3 Prueba de Shinoda


Esta prueba se hace para reconocer la existencia de flavonoides, los cuales son anillos de
gama benzopirona que reaccionan en presencia de ácido clorhídrico concentrado y
magnesio (Calle y Jiménez, 2002).

OH
OH

OH
OH

OH O
OH O+

Mg/HCl

OH O
OH

Figura 22. Reacción del anillo benzopirona en presencia de ácido clorhídrico y magnesio
A 1 mL del extracto etanólico en un tubo de ensayo se agregó magnesio en polvo y gotas
de ácido clorhídrico. Se utilizó como patrón de reacción el extracto etanólico de las
hojas de Rosácea.

3.8.4 Prueba con gelatina–sal


Los taninos precipitan las proteínas de sus soluciones. Se agregó 1 mL del extracto
etanólico en un tubo de ensayo, 1 mL de solución acuosa de gelatina-sal, y 100 g de
cloruro de sodio por litro. Se empleó solución de ácido tánico al 10% como patrón para
comparar los resultados (Calle y Jiménez, 2002).

46
GRUPO POLIFENOLES

OH

-O

OH

HO CO2
R-CO-NH-R'-CO-NH-R´´+RCO-NH-R´-CO-NH-R''

HO CO2-
HO

-O

OH

HO O2C

HO
CO2-

Figura 23. Reacción de la prueba con gelatina-sal

3.8.5 Prueba de taninos hidrolizables


Esta prueba sirve para detectar taninos del tipo esteres fácilmente hidrolizables,
formados por una molécula de azúcar en general glucosa ligado a un número variable de
ácidos fenólicos como gálico ó elágico (Fig. 24) (Calle y Jiménez 2002).

OH OH

HO OH HO

HO COOH
Taninos hidrolizables
COOH HOOC OH

Ácido gálico

OH

OH

Ácido elágico

Figura 24. Estructuras de los componentes de un tanino hidrolizable

A una gota de la muestra se le adiciono 3 gotas de etanol, luego una poca cantidad de
nitrito de sodio, y por último unas gotas de ácido acético.

47
GRUPO POLIFENOLES

3.8.6 Prueba de taninos condensados


Esta prueba sirve para detectar taninos del tipo proantocianidina. Se adiciono una gota
de la muestra, una gota de n-butanol y por último una gota de ácido
clorhídrico concentrado con calentamiento (Calle y Jiménez, 2002).

OH

OH

HO O
Subunidades de extensión

OH
OH
OH
OH

HO O

n
R1
OH
OH
OH

HO O
R2

Subunidad terminal
OH

OH
R1
HCl-n-butanol Calor
OH

HO O
R2

OH

OH

Figura 25. Reacción coloreada para taninos condensados

48
GRUPO POLIFENOLES

3.9 Análisis fitoquímico preliminar

3.9.1 Análisis por cromatografía de capa delgada (CCD)


A las fracciones F1-C, F1-D y F1-F, se les realizó una serie de placas en fase normal y
en fase reversa con el fin de encontrar el mejor eluente, que permitiera una buena
separación en los compuestos (Isaza et al., 2006).

3.9.1.1 Revelado UV
Al emplear una lámpara ultravioleta, cualquier sustancia orgánica que contenga un
grupo cromóforo (una parte de la molécula que absorbe la radiación UV) aparecerá
sobre la placa como una mancha oscura sobre un fondo luminoso. La mayoría de los
adsorbentes en CCD contiene un compuesto fluorescente, que cuando se expone a la
radiación UV aparece como un fondo luminoso. Teniendo en cuenta que el material
orgánico se deposita sobre la superficie del adsorbente (Durst y Gokel, 1985).

3.9.2 Análisis por espectroscopía UV


Se tomo 0,1mg de cada una de las muestras se disolvieron en metanol y esta solución fue
transferida a una celda de cuarzo que fue llevada al equipo de UV–vis para realizar un
barrido espectral; como blanco se utilizó metanol. Para realizar las reacciones de
desplazamiento se emplearon los siguientes reactivos: metóxido de sodio (NaOMe), que
hidroliza todos los grupos hidroxilo de la molécula; cloruro de aluminio y la mezcla de
este con HCl, estos proporcionan información sobre los hidroxilos en las posiciones 3 y
5 del flavonoide a la vez que permiten determinar la posición de otros posibles
sustituyentes en los anillos A y B; acetato de sodio, ioniza los hidroxilos más ácidos de
la molécula (3,7 y 4´) y la mezcla de este con borato de sódico que ayuda a formar
quelatos con todos los grupos o-(OH)2 exceptuando lo que se encuentra en las posiciones
5 y 6 (Harbone. 1980).

3.9.2.1 Pruebas de desplazamiento para la determinación de núcleos de flavonoides


Los espectros UV de los flavonoides en metanol presentan bandas características
debidas a los sistemas conjugados de los anillos aromáticos, por esta razón se procedió a
utilizar esta técnica para facilitar la determinación de estos componentes en las
fracciones en caso de haberlos.

3.9.3 Separación cromatográfica en columna de la fracción F1-F


La fracción F1-F (80 mg) fue pasada por una columna cromatográfica (d.i. 2.0 cm, 17
cm largo) sobre Toyopearl HW-40C (TSK gel, Tosoh Corporation), como fase
estacionaria, con gradiente por etapas metanol-agua (10:90 hasta 80:20), y agua-
isopropanol (5:95 hasta 40:60). Se colectaron las fracciones en tubos de ensayo con un

49
GRUPO POLIFENOLES

volumen de 10 mL por etapa, recogiendo 94 fracciones en total. Las fracciones


recogidas fueron monitoreadas por TLC en fase reversa se reveló con luz UV a
longitudes de onda de 254 y 366 nm, según los resultados obtenidos en las placas se
decidió recoger 7 fracciones nombradas F1-F1 hasta F1-F7 (Fig. 26). Las fracciones
fueron secadas y tomado su rendimiento en peso. Del mismo modo las fracciones
recogidas fueron monitoreadas por cromatografía en fase reversa en isopropanol–agua
(6:4) (Isaza et al., 2005).

Fracción F1-F (80 mg)

CC-Toyopearl HW40C
MeOH- Agua (10-90 hasta 80-20)
Agua- i-PrOH (5-95 hasta 40-60)

F1-F1 F1-F2 F1-F3 F1-F4 F1-F5 F1-F6 F1-F7


15,0 mg 4,0 mg 3,1 mg 7,0 mg 22,0 mg 20,0 mg 8,0 mg

Figura 26. Separación cromatográfica de la fracción F1-F

3.9.4 Cromatografía Preparativa


Esta técnica se utiliza para purificar cantidades pequeñas de sustancias y así
posteriormente determinar su estructura molecular (Wasmundzk et. al., 2008). Para la
fracción F1-F5 (34,23 mg), se realizó cromatografía preparativa en fase reversa, en placa
de 10x10 cm utilizando como sistema eluente isopropanol-agua (6:4).

50
GRUPO POLIFENOLES

4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

4.1 Ensayo de germinación para semillas de lechuga y tomate


Los resultados obtenidos (ver tablas de anexos 1 y 2, cajas 2a, 2b y 2c), muestran una
tendencia de germinación mayor en horas para las semillas de lechuga (Fig. 27) que para
las semillas de tomate (Fig. 28), utilizando como medio de germinación agua pretratada.
En estas figuras se hace una lectura de las semillas germinadas a 38, 47, 63, 72, 111 y
120 horas, a su vez del acumulado de semillas germinadas a la misma hora de lectura. Se
cuentan como semillas germinadas aquellas cuya raíz se haya desarrollado, es decir,
desde el brote de la radícula. La selección de semillas de lechuga y tomate como
material vegetal de prueba se ha basado en investigaciones previas (Macías et al., 1999),
las cuales sugieren que estas son sensibles frente a diversos metabolitos procedentes de
extractos y fracciones vegetales, así como un gran número de herbicidas comerciales
utilizados como controles.

30 93% Acumulado semillas germinadas


Semillas germinadas

83% en horas (por todas las cajas)


Semillas germinadas en horas
20 por cada caja
57%
43%
37%
10

13%

0
38

47

63

72

0
11

12

Tiempo (Horas)

Figura 27. Germinación de semillas de lechuga con agua

En la figura 27 (barra azul), se muestra como las semillas de lechuga inician su


germinación a las 38 horas, con un porcentaje de germinación del 13,3% y a las 47 horas
con un porcentaje del 36,7%. En comparación con las semillas de tomate (Fig. 28) que
germinaron a las 63 horas con un porcentaje de germinación del 26,7%. Según estos
resultados, se seleccionaron las semillas de lechuga como especie receptora para evaluar
la actividad germinativa de las fracciones, debido a su corto tiempo de germinación en
agua. Para los ensayos de germinación con las fracciones se tomaron 15 semillas, esto
con el objetivo de ampliar el rango de germinación y así su porcentaje de germinación.

51
GRUPO POLIFENOLES

30
Acumulado semillas germinadas

Semillas germinadas
83% en horas (por todas las cajas)
73%
Semillas germinadas en horas
20 por cada caja
47%

10 27%

0
38

47

63

72
Tiempo (Horas)

Figura 28. Germinación de semillas de tomate en agua

Por el contrario, al someter las semillas a germinación frente a una solución de DMSO
al 0,33% v/v (ver anexos 1 y 2, cajas 1a, 1b y 1c), el cual se utiliza para disolver los
metabolitos que difícilmente se solubilizan en agua, marca una tendencia de inhibición
de la germinación en ambas especies receptoras durante las 120 horas del ensayo. Por
este motivo, se decide utilizar Tween 20 al 0,05% como medio para solubilizar las
fracciones a evaluar (Kato-Noguchi & Macías, 2005).
Al utilizar glifosato como control de inhibición de la germinación en ambas especies a la
concentración de 3,7x10-2 M (ver anexos 1 y 2, cajas 3a, 3b y 3c), evidenció una
tendencia de inhibición de germinación para las semillas de lechuga, pero en las semillas
de tomate potenció la germinación (Fig. 29), siendo un resultado promisorio para este
estudio.
El resultado obtenido con el glifosato muestra como hay una germinación atribuible
posiblemente a que el glifosato en bajas concentraciones actúa como potenciador de
germinación y crecimiento en plántulas de distintas especies.

30 Acumulado semillas germinadas


93% en horas (por todas las cajas)
Semillas germinadas

83% Semillas germinadas en horas


por cada caja
20

50%

10 27%

0
63

72

0
11

12

Tiempo (Horas)

Figura 29. Germinación de semillas de tomate con glifosato

52
GRUPO POLIFENOLES

Con este ensayo se demuestra como algunas especies receptoras son sensibles frente a
algunos herbicidas, los cuales a muy bajas concentraciones funcionan como
potenciadores de la germinación o crecimiento en especies receptoras. Los bioensayos
de germinación son probablemente los más comunes al momento de evaluar
aleloquímicos. La germinación (usualmente definida como la emergencia de la radícula),
como en este caso es determinada a intervalos de tiempo expresados como el porcentaje
de germinación de las semillas a un periodo o valor de germinación.
Aunque según Williams y Hoagland, debido a la solubilidad limitada en agua de algunos
aleloquímicos, sugieren la disolución de cantidades adecuadas de estas sustancias
inicialmente en DMSO, y luego diluir en agua hasta la concentración deseada (Macías et
al., 2003). Contenidos de 0,05% v/v de DMSO no tendrían efectos sobre la germinación.
Según esto, se deben realizar ensayos preliminares de germinación en una solución de
DMSO para determinar la concentración adecuada para la disolución de los
aleloquímicos.
De igual manera, el glifosato a concentraciones de entre 10-2 y 10-3 M no ocasionaría
falsos resultados en la germinación o crecimiento de plántulas. Aunque es posible, que
efectos aditivos o sinérgicos entre testigos de los ensayos pueden evaluarse usando
combinaciones de varios aleloquímicos.

4.2 Ensayo de germinación para semillas de lechuga frente a las fracciones F1-C,
F1-D y F1-F.
Después de elegidas las semillas de lechuga como especie receptora, se procedió a
realizar la evaluación de la germinación a las 36 horas después de iniciado el ensayo.
Las fracciones se disolvieron en metanol hasta alcanzar concentraciones finales de 0,05,
0,1, 0,5 y 0,8 mg/mL, esta solución se añadió sobre dos hojas de papel de filtro en caja
de Petri. El metanol se evaporo en cámara de flujo laminar, posteriormente el papel filtro
se humedeció con 4 mL de Tween 20 al 0,05% (v/v). El Tween 20 se utiliza como
tensoactivo y no causa ningún efecto tóxico ( Pokclai & Noguchi, 2011). Como control
de germinación se utilizó glifosato a una concentración de 3,7x10-2 M. Este ensayo se
realizó por triplicado.
Las cajas de Petri que contienen las diluciones de prueba y las semillas (15 semillas por
caja) se incubaron bajo la oscuridad a 25 °C, con lectura de la germinación a las 36
horas de iniciado el ensayo.
Con la información obtenida se construyeron las curvas de porcentaje de germinación de
semillas en función de las concentraciones evaluadas.
Los resultados obtenidos señalan que las fracciones F1-C, F1-D y F1-F (Fig. 29, 30 y
31) presentan a una concentración de 0,05 mg/mL una tendencia de germinación mayor
que a las demás concentraciones evaluadas. De esta manera a bajas concentraciones las
fracciones actúan como agentes promotores de la germinación, y por el contrario, altas
concentraciones actúan como inhibidores leves de la germinación.

53
GRUPO POLIFENOLES

En términos de porcentaje de germinación, la fracción F1-C (Fig. 30) evaluada a una


concentración de 0,05 mg/mL presenta un porcentaje de 75,56%, mayor que el evaluado
a una concentración de 0,8 mg/mL (42,22%). Indicando que esta fracción se encuentra
como un potenciador efectivo de la germinación a bajas concentraciones.

100

% d e g e r m in a c ió n
80

60

40

20

0
0 .0 0 .2 0 .4 0 .6 0 .8 1 .0
c o n c e n t r a c ió n ( m g /m L )

Figura 30. Porcentaje germinación para de la fracción F1-C

Tabla 1. Desviaciones y media de la fracción F1-C


Fracción F1-C

CONCENTRACIÓN DS X

0 mg/mL 3,849 62,22


0,05 mg/mL 3,849 75,56
0,1 mg/mL 10,184 62,22
0,5 mg/mL 7,698 51,11
0,8 mg/mL 7,698 42,22

Para la fracción F1-D (Fig. 31) el resultado del porcentaje de germinación a una
concentración de 0,05 mg/mL es 64,44% y el obtenido a una concentración de 0,8
mg/mL corresponde a 31,11%.

80
% d e g e r m in a c ió n

60

40

20

0
0 .0 0 .2 0 .4 0 .6 0 .8 1 .0
c o n c e n t r a c ió n ( m g /m L )

Figura 31. Porcentaje germinación para de la fracción F1-D

54
GRUPO POLIFENOLES

Tabla 2. Desviaciones y media de la fracción F1-D


Fracción F1-D

CONCENTRACIÓN DS X

0 mg/mL 3,85 62,22


0,05 mg/mL 7,70 64,44
0,1 mg/mL 7,70 57,78
0,5 mg/mL 3,85 37,78
0,8 mg/mL 3,85 31,11

Para la fracción F1-F (Fig. 32), evaluada a una concentración de 0,05 mg/mL el
porcentaje de germinación corresponde al 75,56% y un porcentaje de germinación del
44,44% a una concentración de 0,8 mg/mL.

100
% d e g e r m in a c ió n

80

60

40

20

0
0 .0 0 .2 0 .4 0 .6 0 .8 1 .0
c o n c e n t r a c ió n ( m g /m L )

Figura 32. Porcentaje germinación para de la fracción F1-F

Tabla 3. Desviaciones y media de la fracción F1-F


Fracción F1-F

CONCENTRACIÓN DS X

0 mg/mL 13,88 62,22


0,05 mg/mL 10,18 75,56
0,1 mg/mL 7,70 71,11
0,5 mg/mL 20,00 53,33
0,8 mg/mL 3,85 44,44

De esta forma, se puede deducir que para las tres fracciones en estudio, la mejor
concentración evaluada para obtener altos porcentajes de germinación fue de 0,05
mg/mL. Por el contrario si se desea obtener bajos porcentajes de germinación, es decir
buenos agentes inhibitorios, se deben usar altas concentraciones, para este estudio la
mayor fue de 0,8 mg/mL.

55
GRUPO POLIFENOLES

De aquí se toman las fracciones F1-C y F1-F como promisorias para su fraccionamiento
en columna, aunque debido a su mayor rendimiento en masa se elige la fracción F1-F
como promisoria para separación cromatográfica en columna empacada sobre Toyopearl
HW40C.
De igual forma, al examinar el efecto de las fracciones evaluadas sobre las semillas de
lechuga se detecta una sensibilidad significativa (a concentraciones conocidas), pues las
variaciones en los porcentajes de germinación son pequeños. Un inconveniente común
en este bioensayo de germinación sugiere que algunas variedades de especies receptoras
no son tan sensibles a los metabolitos presentes en los extractos de las plantas o
fracciones de interés. Estos ensayos pueden llevarse a cabo bajo la oscuridad, en
condiciones que permiten un alargamiento del tallo más rápido, aumentando su
sensibilidad. Si la germinación de las semillas es retardada por los aleloquímicos, esto
refleja un retraso en el desarrollo de la plántula, generando un efecto directo negativo
sobre la especie receptora atribuido al compuesto activo.

4.3 Evaluación de la actividad antibacteriana


En la siguiente (Fig. 33), (tabla anexo 5), se muestra el comportamiento de inhibición de
los microorganismos evaluados frente a los antibióticos de prueba al medir su halo de
inhibición. Por medio de un antibiograma se muestra una tendencia de inhibición mayor
a una concentración de 1000 ppm, y a una concentración de 62,5 ppm esta tendencia se
ve disminuida al tratarse P. aeruginosa frente a ampicilina, sugiriendo que este
microorganismo adquirió cierta resistencia al antibiótico de prueba.
Un antibiograma nos da una idea sobre la presencia o ausencia de sustancias con
actividad antimicrobiana. Esta técnica cualitativa, puede ser evaluada por diversos
métodos para determinar antimicrobianos con buena sensibilidad, reproducibilidad,
utilizando cantidades pequeñas de la sustancia a evaluar, además de la facilidad para
trabajar con diferentes cepas de microorganismos (valgas et al., 2007).

56
GRUPO POLIFENOLES

Promedio halos de inhibición (mm)


50
E. Coli - Amoxicilina

E. Coli - Ampicilina
40
P. Aeroginosa - Ampicilina

30 P. Aeroginosa - Amoxicilina

20

10

00
5

0
.5

12

25

50
62

10
Concentración de antibióticos (mg/mL)

Figura 33. Evaluación de antibióticos frente a microorganismos de prueba

Los resultados obtenidos para la evaluación de la actividad antibacteriana (tabla 4) frente


a las fracciones F1-C, F1-D y F1-F evidencian que estas no presentaron actividad alguna
frente a la inhibición de los microorganismos estudiados.

Tabla 4. Resultados actividad antibacteriana

Concentración 1000 ppm 500 ppm 250 ppm 125 ppm 62,5 ppm

Amoxicilina + + + + -
Escherichia coli

Ampicilina + + + + -

F1-C - - - - -

F1-D - - - - -

F1-F - - - - -
Pseudomonas aeruginosa

Amoxicilina + + + + -

Ampicilina + + + + +

F1-C - - - - -

F1-D - - - - -

F1-F - - - - -

57
GRUPO POLIFENOLES

(+): Presenta halo de inhibición; (-): no presenta halo de inhibición.

El comportamiento de las fracciones polares obtenidas de H. trachyphylla sugiere que


estas no son promisorias frente a la actividad antibacteriana. Esto debido a que
posiblemente no cuentan con antimicrobianos potenciales o, los que allí se podrían
encontrar están en muy bajas concentraciones. Esto concuerda con trabajos previos, en
los cuales se ha determinado la actividad antibacteriana de el extracto isopropanol-Agua
(65:35), y algunas fracciones apolares obtenidas de H. trachyphylla frente a cepas de
Salmollena gallinarum y Salmonella thyphymurium, evaluadas por el método de
perforación en placa de agar. (Isaza y Jimenez, 2005).
Otro estudio sobre esta planta realizado por el grupo Polifenoles, sugiere la presencia de
compuestos tales como alcanos, esteres y ácidos como 6-octadecanoico y octadecanoico
a los cuales no se les atribuye acción antimicrobiana alguna (Erira y Jiménez, 2012).
Con lo anterior se corrobora que no existen hasta el momento antecedentes que sugieran
actividad antimicrobiana alguna a extractos o fracciones obtenidas de la planta H.
trachyphylla.
Aunque en este estudio se buscaron compuestos del tipo flavonoide, taninos, fenoles y
ácidos fenólicos, sustancias a las cuales se les atribuye alguna actividad antibacteriana,
estas si se han encontrado en algunas especies de la familia melastomataceae.

4.4 Pruebas de caracterización química


Se realizaron pruebas químicas coloreadas a las fracciones F1-C, F1-D y F1-F, dando
positiva la prueba del cloruro férrico a las fracciones F1-D y F1-F con una coloración
verde claro que es confirmatoria para compuestos del tipo taninos derivados del ácido
protocatéquico. De igual forma, también se utiliza para determinar la presencia o
ausencia de compuestos de tipo fenoles.

Tabla 5. Pruebas para caracterización química

Fracción Cloruro Acetato Shinoda Gelatina - Taninos Taninos


férrico de plomo sal hidrolizables condensados

F1-C - - - - - -

F1-D + (verde) - - - - -

F1-F + (verde) - - - - -

58
GRUPO POLIFENOLES

4.5 Análisis cromatográfico por HPLC de las fracciones F1-C, F1-D y F1-F

4.5.1 Perfiles cromatográficos de las fracciones F1-C, F1-D y F1-F a 260 nm


Según los perfiles cromatográficos de las fracciones F1-C, F1-D y F1-F tomados a 260
nm,( Fig. 34, 35, 36) muestran picos de absorción a 3,187, 3,460 y 3,513 minutos. Sus
espectros de absorción entre los 200 y 400 nm no mostraron absorciones significativas,
en las que se puedan correlacionar estas bandas a compuestos del tipo fenólico como
taninos, flavonoides o ácidos fenólicos.

Figura 34. Cromatograma fracción F1-C a 260 nm

Figura 35. Cromatograma fracción F1-D a 260 nm

Figura 36. Cromatograma fracción F1-F a 260 nm

59
GRUPO POLIFENOLES

4.5.2 Perfiles cromatográficos de las fracciones F1-C, F1-D y F1-F a 330 nm


De igual forma, los perfiles cromatográficos de las fracciones F1-C, F1-D y F1-F
tomados a 330 nm, (Fig. 37, 38, 39) muestran picos de absorción a 3,187, 3,433, 3,467 y
3,513 minutos. Los espectros de absorción entre los 200 y 400 nm no mostraron
absorciones significativas, en las que se puedan correlacionar estas bandas a compuestos
del tipo fenólico como taninos, flavonoides o ácidos fenólicos.

Figura 37. Cromatograma fracción F1-C a 330 nm

Figura 38. Cromatograma fracción F1-D a 330 nm

Figura 39. Cromatograma fracción F1-F a 330 nm

60
GRUPO POLIFENOLES

4.5.3. Análisis por cromatografía de capa delgada (TLC)


Los sistemas utilizados fueron los siguientes: n-hexano-acetato de etilo (7:3),
cloroformo-metanol (9:1), n-hexano-THF-ácido fórmico (60:11:20), acetato de etilo-
diclorometano-metanol (4:1:1), n-hexano-THF-metanol-ácido fórmico (47:11:41:1),
acetato de etilo-diclorometano-metanol (3:1:2), acetato de etilo-diclorometano-metanol
(2:1:3) acetato de etilo-diclorometano-metanol (1:1:4). En estas primeras placas no se
observó una buena separación por parte de los compuestos, por ende se procedió a
ensayar con otros sistemas los cuales fueron: agua-isopropanol (2:8) (fig.a), (4:6) (fig.b),
(6:4) (fig.c), (7:3) (fig.d), (8:2) (fig.e) de las Cromatoplacas de la fracción F1-F
obtenidas con el sistema H2O–i-PrOH (6:4) (Fig. 40).

C D F C D F C D F

(a) (b) (c)

C D F C D F

(d) (e)
Figura 40. Cromatoplacas de la fracción F1-F obtenidas con el sistema H2O–i-PrOH (6:4)

4.5.4 Pruebas de desplazamiento para la determinación de núcleos de flavonoides


Se realizaron pruebas de desplazamiento químico a las fracciones F1-C, F1-D y F1-F
con metóxido de sodio (MeONa; fig. 42, 46, 50), acetato de sodio (AcONa; fig. 42, 46,
50), cloruro de aluminio (AlCl3; fig. 44, 48, 52) con y sin HCl, y ácido bórico (H3BO3)
en comparación con el espectro tomado en metanol de la muestra problema
(Harbone,1980). Estas reacciones representan modelos característicos para análisis de
flavonoides glicosilados y no glicosilados presentes en hojas o flores de algunas plantas.

61
GRUPO POLIFENOLES

Según la literatura estudiada la presencia de hidroxilos fenólicos en posiciones 3 y 4´ es


debida a la interacción con NaOMe que es una base muy fuerte la cual ioniza estos
grupos hidroxilos. Por el contario NaOAc es una base muy débil, que ioniza solo los
grupos fenólicos más ácidos en posiciones 3, 4´ y 7. Con AlCl3 se forman quelatos con
flavonoides o-dihidroxilados, 3-hidroxilados y 5-hidroxilados. En el caso de los o-
dihidroxilados el quelato es inestable a pH ácido, mientras que los quelatos formados
con 3- y/o 5-hidroxilados son estables.

Los resultados obtenidos de los espectros realizados muestran poca información frente a
cada uno de los reactivos de desplazamiento. Aunque se muestra un leve desplazamiento
en las fracciones F1-D y F1-F figuras 48 y 52, respectivamente, al realizar el ensayo con
cloruro de aluminio. Esto puede ser debido a la presencia de compuestos de tipo fenolico
al ser evaluadas las mismas fracciones frente al reactivo de cloruro férrico.

Espectros fracción F1-C Espectros fracción F1-D Espectros fracción F1-F

Figura 41. Espectro fracción Figura 42. Espectro fracción F1-D Figura 43. Espectro fracción
F1-C en MeOH en MeOH F1-F en MeOH

Figura 44. Espectro fracción Figura 45. Espectro fracción F1-D Figura 46. Espectro fracción F1-F
F1-C con CH3ONa con CH3ONa con CH3ONa

Figura 47. Espectro fracción Figura 48. Espectro fracción F1- Figura 49. Espectro fracción F1-F
F1-C con CH3COONa D con CH3COONa con CH3COONa

62
GRUPO POLIFENOLES

Figura 50. Espectro fracción Figura 51. Espectro fracción F1-D Figura 52. Espectro fracción F1-F
F1-C con AlCl3 con AlCl3 con AlCl3

4.6 Separación cromatografía en columna de la fracción F-1 F


La separación cromatografía realizada a la fracción F1-F (Fig. 26) se desarrolló
mediante el sistema de elusión MeOH-agua-i-PrOH por etapas.
Las cromatoplacas de las fracciones obtenidas de la columna se muestran a
continuación:

F-1F 2 4 6 8 10 12 14 16 18

Figura 53. Cromatoplaca #1 de las fracciones obtenidas del fraccionamiento de la fracción F1-F

De acuerdo al resultado obtenido en la anterior cromatoplaca (Fig. 53) se procedió a


juntar las fracciones 1 y 2, convirtiéndose está en la fracción F1-F1 (15,0 mg), lo mismo
para la fracción 3 y 4 llamándose F1-F2 (4,0 mg), y de igual forma para la 5,6 y 7 para
formar la fracción F1-F3 (3,1 mg).

63
GRUPO POLIFENOLES

20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50 52 54 56

Figura 54. Cromatoplaca #2 de las fracciones obtenidas del fraccionamiento de la fracción F1-F

Teniendo en cuanta la cromatoplaca anterior (Fig. 54) se decidió juntar las fracciones de
la 8 y 28 puesto a que no se evidencia ningún compuesto, convirtiéndose esta en la
fracción F1-F4 (7,0 mg), por lo contrario de la 29 y 38 al revelar en luz UV a 254 y 366
nm se observaron compuestos de interés (manchas de color azul), y se juntaron
convirtiéndose en la fracción F1-F5 (22,0 mg), y de la 39 y 52 F1-F6 (20,0 mg) , de la
54 y 94 (Fig. 54) es la fracción F1-F7 (8,0 mg).

58 60 62 64 66 68 70 72 74 76 78 80 82 84 86 88 90 92 94

Figura 55. Cromatoplaca #3 de las fracciones obtenidas del fraccionamiento de la fracción F1-F

Posterior a esto se procedió a tomar los siguientes espectros UV para cada fracción final,
adicionalmente se muestran las cromatoplacas respectivas:

64
GRUPO POLIFENOLES

Rf = 3,7cm

Figura 56. Cromatoplaca y espectro UV de la fracción F1-F1

Rf = 3,4cm

Figura 57.Cromatoplaca y espectro UV de la fracción F1-F2

Rf = 2,9cm

Figura 58. Cromatoplaca y espectro UV de la fracción F1-F3

65
GRUPO POLIFENOLES

Rf = 2,8cm

Figura 59. Cromatoplaca y espectro UV de la fracción F1-F4

Rf = 1,6cm
Rf = 1,9cm

Figura 60. Cromatoplaca y espectro UV de la fracción F1-F5

Rf = 2,5cm

Figura 61. Cromatoplaca y espectro UV de la fracción F1-F6

66
GRUPO POLIFENOLES

Rf = 1,9cm

Figura 62. Cromatoplaca y espectro UV de la fracción F1-F7

De esta manera se obtuvieron de esta separación 7 fracciones, nombradas desde la F1-F1


hasta la F1-F7, con un rendimiento mayor en masa para la fracción F1-F5 (Fig. 63). Al
realizar placa sobre TLC en fase reversa a las fracciones obtenidas, se reveló una
mancha de interés la cual presentaba una coloración azul en las fracciones F1-F3, F1-F4
y F1-F5.

50
% d e r e n d im ie n t o

40

30

20

10

0
1

7
F

F
-1

-1

-1

-1

-1

-1

-1
F

F r a c c io n e s

Figura 63. Porcentaje de rendimiento de las fracciones F1-F1 hasta F1-F7

Como se tenia tampoca cantidad de las fracciones obtenidas se procedió a realizar


cromatografía preparativa a las fracciones F1-F3, F1-F4 y F1-F5; (Fig. 64, 65, 66) las
cuales presentaban manchas de interés en la cromatografía de capa fina.
Las fracciones se diluyeron en metanol y cada una se sembró en placas de 10x10 cm. El
sistema utilizado fue agua-i-PrOH (6:4). Se reveló con luz UV a longitudes de onda de
254 nm y 366 nm, y se procede a raspar por encima de la placa, donde se podían
observar manchas.
Los resultados obtenidos se ilustran a continuación:

67
GRUPO POLIFENOLES

F1-F3 e Rf =8,2cm

F1-F3 d Rf =7,4cm

F1-F3c Rf =5,4cm

F1-F3 b Rf =4,1cm

F1-F3 a Rf =2,7cm

Figura 64. Cromatoplaca preparativa fracción F1-F3

F1-F4 e Rf =8,1cm

F1-F4 d Rf =7,9cm

F1-F4 c Rf =5,2cm

F1-F4 b Rf =3,9cm

F1-F4 a Rf = 2,2cm

Figura 65. Cromatoplaca preparativa fracción F1-F4

68
GRUPO POLIFENOLES

F1-F5 g Rf =8,4cm

F1-F5 F Rf =7,5cm

F1-F5 e Rf =7,7cm

F1-F5 d Rf =5,0cm

F1-F5 c Rf =3,4cm

F1-F5 b Rf =2,4cm
F1-F5 a Rf = 1,6cm

Figura 66 Cromatoplaca preparativa fracción F1-F5

Cuando se rasparon las manchas, se coloco cada una en un viales, se les adicionó
metanol y el sobrenadante se paso a otro vial, antes de evaporar el metanol se tomaron
placas en fase reversa (Fig. 67, 68, 69) y en un sistema agua-i-PrOH (6:4) de las tres
fracciones, las cuales se revelaron con luz UV a longitudes de onda de 254 nm y 366
nm.
Las placas se muestran a continuación:

F-1F3

1 2 3 4 5

Figura 67. Cromatoplaca de la fracción F1-F3

69
GRUPO POLIFENOLES

F-1F4

Rf =2,9cm

Rf =2,5cm

1 2 3 4 5

Figura 68. Cromatoplaca de la fracción F1-F4

F-1F5

Rf =1,8cm

1 2 3 4 5 6 7

Figura 69. Cromatoplacas de la fracción F1-F5

Como se puede observar en las placas anteriores (Fig. 68, 69) solo se evidencia
desplazamiento por parte de los compuestos en las placas F1-F4 y F1-F5, los cuales
muestran manchas de color azul, estas manchas se pueden observar mejor en la fracción
F1-F5, como se muestran a continuación:

F-1F5

Rf =1,8cm

1 2 3 4 5 6 7

Figura 70. Cromatoplaca revelada con luz UV a de 254 nm de la fracción F1-F5

De la fracción F1-F3 se recogieron 5 fracciones nombradas como F1-F3A hasta F1-F3E,


de F1-F4 se recogieron 5 fracciones nombradas como F1-F4A hasta F1-F4E y de F1-F5
se recogieron 7 fracciones nombradas como F1-F5A hasta F1-F5G. Según se observó, se
eligieron las fracciones F1-F5D (7,0 mg), F1-F5F (6,0 mg) y F1-F5G (8,0 mg) para su

70
GRUPO POLIFENOLES

1 13
posterior análisis por RMN unidimensional de protón H y carbono C, y
bidimensional HSQC.

71
GRUPO POLIFENOLES

5. CONCLUSIONES

 Para el ensayo de germinación frente a semillas de lechuga (Lactuca sativa L.) y


tomate (Lycopersicum esculentum Mill.) en presencia de agua, se evidencia una
tendencia de germinación mayor, mientras que la germinación frente a DMSO al
0,33% presentó inhibición de la germinación durante el tiempo del ensayo.

 Al emplear glifosato a una concentración de 3,7x10-2 M como control de


inhibición de la germinación en ambas especies receptoras, se presentó una
tendencia de inhibición de la germinación para las semillas de lechuga, mientras
que para las semillas de tomate potenció la germinación.

 Las fracciones F1-C, F1-D y F1-F provenientes de la fase polar de Henriettella


trachyphylla Triana., a bajas concentraciones (0,05 mg/mL) actúan como agentes
promotores de la germinación. Por el contrario, a medida que las concentraciones
de las fracciones aumentan (hasta 0,8 mg/mL), se presenta disminución en la
germinación de las semillas, actuando como inhibidores leves de la germinación.

 Los resultados obtenidos a frente a la actividad antibacteriana de las fracciones


polares F1-C, F1-D y F1-F obtenidas de Henriettella trachyphylla Triana.,
evidencian que estas no son promisorias como antibacterianos. Esto debido
posiblemente a que no cuentan con metabolitos que tienen acción antimicrobiana
o, que se encuentran presentes a muy bajas concentraciones.

72
GRUPO POLIFENOLES

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77
GRUPO POLIFENOLES

RECOMENDACIONES

 Evaluar la actividad antibacteriana de las fracciones polares frente a Escherichia


coli y Pseudomonas aeruginosa, empleando concentraciones más altas.

 Determinar la actividad alelopática de las fracciones con plántulas de lechuga,


observando comportamiento de inhibición o estimulación en hipocótilo y
epicotilo.

78
GRUPO POLIFENOLES

ANEXOS

Los resultados de la germinación ubicados en las tablas de los anexos 1 y 2, que tienen
el signo (-) representan las semillas que no germinaron, el signo (+) las semillas que
germinaron, y el (0) se coloca como valor acumulado de las semillas ya germinadas en
la hora anterior.

ANEXO 1. Tablas primer ensayo germinación de semillas de lechuga.

H ora 3 Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Caja 1a - - - - - - - - - -

Caja 1b - - - - - - - - - -

Caja 1c - - - - - - - - -

Caja 2a - - - - - - - - - -

Caja 2b - - - - - - - - - -

Caja 2c - - - - - - - - - -

Caja 3a - - - - - - - - - -

Caja 3b - - - - - - - - - -

Caja 3c - - - - - - - - - -

79
GRUPO POLIFENOLES

Hora 6 Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Caja 1a - - - - - - - - - -

Caja 1b - - - - - - - - - -

Caja 1c - - - - - - - - - -

Caja 2a - - - - - - - - - -

Caja 2b - - - - - - - - - -

Caja 2c - - - - - - - - - -

Caja 3a - - - - - - - - - -

Caja 3b - - - - - - - - - -

Caja 3c - - - - - - - - - -

Hora 9 Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Caja 1a - - - - - - - - - -

Caja 1b - - - - - - - - - -

Caja 1c - - - - - - - - - -

Caja 2a - - - - - - - - - -

Caja 2b - - - - - - - - - -

Caja 2c - - - - - - - - - -

Caja 3a - - - - - - - - - -

Caja 3b - - - - - - - - - -

Caja 3c - - - - - - - - - -

80
GRUPO POLIFENOLES

Hora 13 Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Caja 1a - - - - - - - - - -

Caja 1b - - - - - - - - - -

Caja 1c - - - - - - - - - -

Caja 2a - - - - - - - - - -

Caja 2b - - - - - - - - - -

Caja 2c - - - - - - - - - -

Caja 3a - - - - - - - - - -

Caja 3b - - - - - - - - - -

Caja 3c - - - - - - - - - -

Hora 16 Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Caja 1a - - - - - - - - - -

Caja 1b - - - - - - - - - -

Caja 1c - - - - - - - - - -

Caja 2a - - - - - - - - - -

Caja 2b - - - - - - - - - -

Caja 2c - - - - - - - - - -

Caja 3a - - - - - - - - - -

Caja 3b - - - - - - - - - -

Caja 3c - - - - - - - - - -

81
GRUPO POLIFENOLES

Hora 20 Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Caja 1a - - - - - - - - - -

Caja 1b - - - - - - - - - -

Caja 1c - - - - - - - - - -

Caja 2a - - - - - - - - - -

Caja 2b - - - - - - - - - -

Caja 2c - - - - - - - - - -

Caja 3a - - - - - - - - - -

Caja 3b - - - - - - - - - -

Caja 3c - - - - - - - - - -

Hora 22 Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Caja 1a - - - - - - - - - -

Caja 1b - - - - - - - - - -

Caja 1c - - - - - - - - - -

Caja 2a - - - - - - - - - -

Caja 2b - - - - - - - - - -

Caja 2c - - - - - - - - - -

Caja 3a - - - - - - - - - -

Caja 3b - - - - - - - - - -

Caja 3c - - - - - - - - - -

82
GRUPO POLIFENOLES

Hora 24 Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Caja 1a - - - - - - - - - -

Caja 1b - - - - - - - - - -

Caja 1c - - - - - - - - - -

Caja 2a - - - - - - - - - -

Caja 2b - - - - - - - - - -

Caja 2c - - - - - - - - - -

Caja 3a - - - - - - - - - -

Caja 3b - - - - - - - - - -

Caja 3c - - - - - - - - - -

Hora 30 Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Caja 1a - - - - - - - - - -

Caja 1b - - - - - - - - - -

Caja 1c - - - - - - - - - -

Caja 2a - - - - - - - - - -

Caja 2b - - - - - - - - - -

Caja 2c - - - - - - - - - -

Caja 3a - - - - - - - - - -

Caja 3b - - - - - - - - - -

Caja 3c - - - - - - - - - -

83
GRUPO POLIFENOLES

Hora 38 Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Caja 1a - - - - - - - - - -

Caja 1b - - - - - - - - - -

Caja 1c - - - - - - - - - -

Caja 2a - - - - - - - - - -

Caja 2b - - - - - - + - + -

Caja 2c - - + + - - - - - -

Caja 3a - - - - - - - - - -

Caja 3b - - - - - - - - - -

Caja 3c - - - - - - - - - -

Hora 47 Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Caja 1a - - - - - - - - - -

Caja 1b - - - - - - - - - -

Caja 1c - - - - - - - - - -

Caja 2a - - - - + + + - + -

Caja 2b - - - - - + 0 + 0 +

Caja 2c - - 0 0 - - - - - -

Caja 3a - - - - - - - - - -

Caja 3b - - - - - - - - - -

Caja 3c - - - - - - - - - -

Caja 3c - - - - - - - - - -

84
GRUPO POLIFENOLES

Hora 63 Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Caja 1a - - - - - - - - - -

Caja 1b - - - - - - - - - -

Caja 1c - - - - - - - - - -

Caja 2a - - - - 0 0 0 - 0 -

Caja 2b - - - - - 0 0 0 0 0

Caja 2c - + 0 0 - + - - - -

Caja 3a - - - - - - - - - -

Caja 3b - - - - - - - - - -

Caja 3c - - - - - - - - - -

Hora 72 Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Caja 1a - - - - - - - - - -

Caja 1b - - - - - - - - - -

Caja 1c - - - - - - - - - -

Caja 2a - - + - 0 0 0 - 0 -

Caja 2b + - + - - 0 0 0 0 0

Caja 2c 0 0 0 - 0 - + - -

Caja 3a - - - - - - - - - -

Caja 3b - - - - - - - - - -

Caja 3c - - - - - - - - - -

85
GRUPO POLIFENOLES

Hora Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla
111 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Caja 1a - - - - - - - - - -

Caja 1b - - - - - - - - - -

Caja 1c - - - - - - - - - -

Caja 2a - + 0 + 0 0 0 - 0 -

Caja 2b 0 + 0 + + 0 0 0 0 0

Caja 2c + 0 0 0 - 0 + 0 + -

Caja 3a - - - - - - - - - -

Caja 3b - - - - - - - - - -

Caja 3c - - - - - - - - - -

Hora Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla
120 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Caja 1a - - - - - - - - - -

Caja 1b - - - - - - - - - -

Caja 1c - - - - - - - - - -

Caja 2a - 0 0 0 0 0 0 - 0 +

Caja 2b 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Caja 2c 0 0 0 0 + 0 0 0 0 +

Caja 3a - - - - - - - - - -

Caja 3b - - - - - - - - - -

Caja 3c - - - - - - - - - -

Caja 1 DMSO
Caja 2 Blanco
Caja 3 Glifosato

86
GRUPO POLIFENOLES

ANEXO 2. Tablas primer ensayo de germinación semillas de tomate

Hora 3 Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Caja 1a - - - - - - - - - -

Caja 1b - - - - - - - - - -

Caja 1c - - - - - - - - - -

Caja 2a - - - - - - - - - -

Caja 2b - - - - - - - - - -

Caja 2c - - - - - - - - - -

Caja 3a - - - - - - - - - -

Caja 3b - - - - - - - - - -

Caja 3c - - - - - - - - - -

Hora 6 Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Caja 1a - - - - - - - - - -

Caja 1b - - - - - - - - - -

Caja 1c - - - - - - - - - -

Caja 2a - - - - - - - - - -

Caja 2b - - - - - - - - - -

Caja 2c - - - - - - - - - -

Caja 3a - - - - - - - - - -

Caja 3b - - - - - - - - - -

Caja 3c - - - - - - - - - -

87
GRUPO POLIFENOLES

Hora 9 Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Caja 1a - - - - - - - - - -

Caja 1b - - - - - - - - - -

Caja 1c - - - - - - - - - -

Caja 2a - - - - - - - - - -

Caja 2b - - - - - - - - - -

Caja 2c - - - - - - - - - -

Caja 3a - - - - - - - - - -

Caja 3b - - - - - - - - - -

Caja 3c - - - - - - - - - -

Hora 13 Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Caja 1a - - - - - - - - - -

Caja 1b - - - - - - - - - -

Caja 1c - - - - - - - - - -

Caja 2a - - - - - - - - - -

Caja 2b - - - - - - - - - -

Caja 2c - - - - - - - - - -

Caja 3a - - - - - - - - - -

Caja 3b - - - - - - - - - -

Caja 3c - - - - - - - - - -

88
GRUPO POLIFENOLES

Hora 16 Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Caja 1a - - - - - - - - - -

Caja 1b - - - - - - - - - -

Caja 1c - - - - - - - - - -

Caja 2a - - - - - - - - - -

Caja 2b - - - - - - - - - -

Caja 2c - - - - - - - - - -

Caja 3a - - - - - - - - - -

Caja 3b - - - - - - - - - -

Caja 3c - - - - - - - - - -

Hora 20 Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Caja 1a - - - - - - - - - -

Caja 1b - - - - - - - - - -

Caja 1c - - - - - - - - - -

Caja 2a - - - - - - - - - -

Caja 2b - - - - - - - - - -

Caja 2c - - - - - - - - - -

Caja 3a - - - - - - - - - -

Caja 3b - - - - - - - - - -

Caja 3c - - - - - - - - - -

89
GRUPO POLIFENOLES

Hora 22 Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Caja 1a - - - - - - - - - -

Caja 1b - - - - - - - - - -

Caja 1c - - - - - - - - - -

Caja 2a - - - - - - - - - -

Caja 2b - - - - - - - - - -

Caja 2c - - - - - - - - - -

Caja 3a - - - - - - - - - -

Caja 3b - - - - - - - - - -

Caja 3c - - - - - - - - - -

Hora 24 Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Caja 1a - - - - - - - - - -

Caja 1b - - - - - - - - - -

Caja 1c - - - - - - - - - -

Caja 2a - - - - - - - - - -

Caja 2b - - - - - - - - - -

Caja 2c - - - - - - - - - -

Caja 3a - - - - - - - - - -

Caja 3b - - - - - - - - - -

Caja 3c - - - - - - - - - -

90
GRUPO POLIFENOLES

Hora 30 Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Caja 1a - - - - - - - - - -

Caja 1b - - - - - - - - - -

Caja 1c - - - - - - - - - -

Caja 2a - - - - - - - - - -

Caja 2b - - - - - - - - - -

Caja 2c - - - - - - - - - -

Caja 3a - - - - - - - - - -

Caja 3b - - - - - - - - - -

Caja 3c - - - - - - - - - -

Hora 38 Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Caja 1a - - - - - - - - - -

Caja 1b - - - - - - - - - -

Caja 1c - - - - - - - - - -

Caja 2a - - - - - - - - - -

Caja 2b - - - - - - - - - -

Caja 2c - - - - - - - - - -

Caja 3a - - - - - - - - - -

Caja 3b - - - - - - - - - -

Caja 3c - - - - - - - - - -

91
GRUPO POLIFENOLES

Hora 47 Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Caja 1a - - - - - - - - - -

Caja 1b - - - - - - - - - -

Caja 1c - - - - - - - - - -

Caja 2a - - - - - - - - - -

Caja 2b - - - - - - - - - -

Caja 2c - - - - - - - - - -

Caja 3a - - - - - - - - - -

Caja 3b - - - - - - - - - -

Caja 3c - - - - - - - - - -

Hora 63 Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Caja 1a - - - - - - - - - -

Caja 1b - - - - - - - - - -

Caja 1c - - - - - - - - - -

Caja 2a - + + - - - - - + -

Caja 2b + - - - - - - - + -

Caja 2c - + - - + + - - - -

Caja 3a - + - - - - - - - -

Caja 3b + + + + + - - - - -

Caja 3c - - + - + - - - - -

92
GRUPO POLIFENOLES

Hora 72 Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Caja 1a - - - - - - - - - -

Caja 1b - - - - - - - - - -

Caja 1c - - - - - - - - - -

Caja 2a + 0 0 - - + - - 0 -

Caja 2b 0 - + + - - - - 0 -

Caja 2c - 0 + - 0 0 0 + - -

Caja 3a + 0 - + - + 0 - - +

Caja 3b 0 0 0 0 0 - - - - -

Caja 3c + - 0 - 0 - + - + -

Hora Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla
111 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Caja 1a - - - - - - - - - -

Caja 1b - - - - - - - - - -

Caja 1c - - - - - - - - - -

Caja 2a 0 0 0 + + 0 - + 0 +

Caja 2b 0 - 0 0 0 + - - 0 -

Caja 2c - 0 0 + 0 0 0 0 + +

Caja 3a 0 0 - 0 + 0 0 + - 0

Caja 3b 0 0 0 0 0 + + + - +

Caja 3c 0 - 0 + 0 - 0 + + +

93
GRUPO POLIFENOLES

Hora Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla Semilla
120 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Caja 1a - - - - - - - - - -

Caja 1b - - - - - - - - - -

Caja 1c - - - - - - - - - -

Caja 2a 0 0 0 0 0 0 - 0 0 0

Caja 2b 0 + 0 + 0 0 + - 0 -

Caja 2c - 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Caja 3a 0 0 + 0 0 0 0 0 - 0

Caja 3b 0 0 0 0 0 0 0 0 + 0

Caja 3c 0 + 0 0 0 - 0 0 0 0

Caja 1 DMSO
Caja 2 Blanco
Caja 3 Glifosato

94
GRUPO POLIFENOLES

ANEXO 3. Antibiograma

 Escherichia coli con amoxicilina

Diámetro de halo de inhibición en mm

Blanco Amoxicilina Amoxicilina Amoxicilina Amoxicilina Amoxicilina


DMSO 1000 ppm 500 ppm 250 ppm 125 ppm 62,5 ppm

Replica #1 5% 46 40 32 20 0

5% 44 36 32 20 0

5% 44 40 32 20 0

5% 48 28 28 20 0

Promedio 5% 45,5 36 31 20 0

Replica #2 5% 44 28 24 16 0

5% 32 28 24 10 0

5% 32 32 20 16 0

5% 24 28 24 14 0

Promedio 5% 33 29 23 14 0

Replica #3 5% 48 28 28 20 0

5% 44 32 28 20 0

5% 44 36 32 20 0

5% 40 36 28 20 0

Promedio 5% 44 33 29 20 0

95
GRUPO POLIFENOLES

 Escherichia coli con ampicilina

Diámetro de halo de inhibición en mm

Blanco Ampicilina Ampicilina Ampicilina Ampicilina Ampicilina


DMSO 1000 ppm 500 ppm 250 ppm 125 ppm 62,5 ppm

Replica #1 5% 36 32 24 20 0

5% 38 28 24 20 0

5% 32 32 24 24 0

5% 36 28 24 24 0

Promedio 5% 35,5 30 24 22 0

Replica #2 5% 36 32 24 20 0

5% 32 24 24 20 0

5% 36 28 24 20 0

5% 36 32 24 20 0

Promedio 5% 35 29 24 20 0

Replica #3 5% 36 32 24 20 0

5% 36 32 24 20 0

5% 36 32 24 20 0

5% 40 28 28 16 0

Promedio 5% 37 31 25 19 0

96
GRUPO POLIFENOLES

 Pseudomonas aeruginosa con ampicilina

Diámetro de halo de inhibición en mm

Blanco Ampicilina Ampicilina Ampicilina Ampicilina Ampicilina


DMSO 1000 ppm 500 ppm 250 ppm 125 ppm 62,5 ppm

Replica #1 5% 60 80 64 10 0

5% 40 40 20 10 0

5% 36 40 10 10 0

5% 24 24 10 10 0

Promedio 5% 40 46 26 10 0

Replica #2 5% 60 40 24 10 0

5% 24 24 24 10 0

5% 28 36 20 10 0

5% 32 28 20 10 0

Promedio 5% 36 32 22 10 0

Replica #3 5% 40 36 24 10 0

5% 28 28 24 10 0

5% 32 20 24 10 0

5% 28 20 28 10 0

Promedio 5% 32 26 25 10 0

97
GRUPO POLIFENOLES

 Pseudomonas aeruginosa con amoxicilina

Diámetro de halo de inhibición en mm

Blanco amoxicilina Amoxicilina amocixilina Amoxicilina Amoxicilina


DMSO 1000 ppm 500 ppm 250 ppm 125 ppm 62,5 ppm

Replica #1 5% 32 32 24 24 24

5% 28 28 20 20 20

5% 36 28 20 24 24

5% 36 24 24 24 24

Promedio 5% 33 28 22 23 23

Replica #2 5% 36 40 36 24 20

5% 32 28 28 24 20

5% 40 24 28 24 20

5% 36 28 24 20 20

Promedio 5% 36 30 29 23 20

Replica #3 5% 40 40 40 28 20

5% 36 36 32 24 20

5% 36 28 28 40 20

5% 36 36 32 24 20

Promedio 5% 37 35 33 29 20

98

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