UNIVERSIDAD NACIONAL DE PIURA

´´CULTIVO PURO Y MIXTO. ´´

Métodos y técnicas
https://conalepfelixtovar.wordpress.com/2012/09/26/tecnicas-y-metodos-de-aislamiento-y-
seleccion-de-microorganismos/

TECNICAS Y METODOS DE AISLAMIENTO Y SELECCIÓN DE

MICROORGANISMOS
SEPTIEMBRE 26, 2012 CONALEPFELIXTOVAR DEJA UN COMENTARIO
TÉCNICAS BÁSICAS PARA EL CULTIVO DE MICROORGANISMOS:
SIEMBRA Y ESTUDIO DE BACTERIAS

INTRODUCCIÓN
Para efectuar el estudio de los microorganismos, se han diseñado diversos métodos que
permiten cultivarlos bajo condicione artificiales, en los que es posible cultivarlos bajo
condiciones experimentales y manejar un solo tipo de microorganismo. Una de las
técnicas más usadas en el laboratorio de microbiología consiste en transferir una muestra
microbiológica de un ambiente determinado a un medio de cultivo, lo que permite obtener
cultivos microbianos. A l efectuar este procedimiento, es necesario considerar que, en el
área de trabajo, existen muchos otros microorganismos; debido a esto, es necesario tomar
precauciones para impedir que éstos penetren y contaminen los cultivos en estudio. Por
otra parte, para considerar no sólo el aspecto nutricional, sino también las condiciones
ambientales de su hábitat natural, por lo que en el medio de cultivo se debe ajustar el pH
y concentración de sales y durante la incubación condiciones tales como la temperatura,
aireación, la luminosidad. La aplicación de estos procedimientos ha permitido propagar
a los microorganismos en cultivos mixtos, así como su aislamiento y la obtención de
cultivos puros, facilitando de este modo, el estudio, caracterización, aplicación y control
de los mismos. La forma de sembrarlos y cultivarlos depende del tipo de microorganismo
y propósito específico del estudio.

Cultivar un microorganismo significa promover intencionalmente el desarrollo de éste en

medios de cultivo y condiciones de laboratorio controladas. La población de
microorganismos desarrollada en un medio se denomina cultivo. Cuando éste contiene
una sola especie de microorganismo, se denomina cultivo puro o axénico, cuando
contiene más de una especie de microorganismos se denomina cultivo mixto.

Un cultivo tipo contiene una especie conocida de microorganismos y es conservada en el

laboratorio para realizar diversos ensayos y estudios. Un cultivo axénico consiste en una
sola especie microbiana, proveniente de una sola célula. Los cultivos axénicos son muy
raros en la naturaleza. En los medios naturales -por ejemplo, en el suelo, agua, o en el
cuerpo humano-existen cultivos mixtos. En un cultivo mixto, viven muchas y diferentes
especies de forma conjunta.
Un cultivo axénico se obtiene artificialmente en el laboratorio. A la hora de obtener un
cultivo axénico se han de tomar precauciones especiales, ya que los microorganismos
están por todas partes, en la naturaleza, en el laboratorio y en los instrumentos y
recipientes usados en los experimentos. Estos microorganismos no deseados o
contaminantes deben ser eliminados de un cultivo para que éste pueda ser axénico. El
segundo paso para obtener un cultivo axénico es inocular o introducir, una sola célula de
un microorganismo en un medio sólido o líquido, esterilizado previamente. De esta
manera, aislamos un solo microorganismo del resto y se podrá multiplicar en condiciones
favorables. Un clon está constituido por una población de células descendientes de un
solo microorganismo. Una colonia es un clon lo suficientemente grande como para ser
visible sobre la superficie de un medio sólido. Un cultivo microbiano que ha estado
creciendo por cierto tiempo en el mismo tubo o matraz, debe ser transferido un medio de
cultivo nuevo, de otra manera el crecimiento y sobrevivencia no pueden continuar. En
esta transferencia se deben considerar dos aspectos básicos referentes a: no introducir
microorganismos indeseables(contaminantes) y concentración o carga microbiana de la
muestra (inóculo) a sembrar.

Dispositivos empleados en la transferencia de muestras microbianas:

Los utensilios utilizados para la transferencia de muestras son los siguientes:

Hisopo, pipeta (para uso microbiológico son terminales y la parte superior o boquilla debe
estar protegida con filtro de algodón), pipeta Pasteur, cable de Kolle o portasa con
alambre de platino dispuesto en forma de: aguja, asa, espátula y/o gancho.

En la transferencia de microorganismos se emplean agujas, asas de inoculación, hisopos,

pipetas o pipetas Pasteur que deberán esterilizarse previamente. La utilización de estos
dispositivos, así como de los diferentes medios de cultivo tienen aplicaciones específicas.
Por ejemplo:

Los medios líquidos se preparan en tubos o matraces que se cubren con tapones de
algodón o tapones especiales. Un cultivo líquido puede ser transferido mediante un asa
microbiológica, un hisopo, pipeta o pipeta Pasteur; el inóculo se deposita dentro del caldo
o medio líquido. En este tipo de cultivos los microorganismos presentan un desarrollo
particular que se manifiesta en la superficie o a través de todo el líquido. Una de las
ventajas que presenta este tipo de cultivo se refiere a la posibilidad de agitarlos acelerando
la velocidad de microorganismos anaerobios, por otra parte, en este tipo de cultivos, las
poblaciones se encuentran suspendidas y e fácil homogenizarlas, lo que permite
estandarizar la concentración del inóculo. La desventaja que presentan, es que en ellos y
difícil detectar contaminación a simple vista.
Los medios semisólidos se preparan en tubos, se inoculan con aguja de siembra (asa
recta) o pipeta Pasteur; en este último caso es necesario calentar el medio y cuando se
encuentra en estado líquido y a una temperatura de aproximadamente 42ºC se agrega el
inóculo, se homogeniza y se deja solidificar. Estos medios se emplean para estudiar la
movilidad de los microorganismos y para favorecer la separación de microorganismos
con diferentes requerimientos de oxígeno.
Los medios sólidos se preparan en tubos o matraces dependiendo de la cantidad o de las
necesidades, después de esterilizarlos, estos se inclinan o vierten en cajas de Petri. La
siembra se realiza con el asa, inoculando la superficie del agar con mucha suavidad; en
estos medios, los microorganismos al multiplicarse forman agregados que se hacen
visibles a simple vista; a estos agregados se les denominan colonias, las que presentan
características que varían con el tipo de microorganismo cultivado y el medio de cultivo
empleado. En cualquier medio de cultivo es de primordial importancia ajustar el pH, ya
que aun cuando la mayoría de los microorganismos crecen mejor en pH neutro, algunos
requieren de pH alcalino o ácido, por lo que al proporcionar un pH adecuado se favorecerá
el crecimiento del microorganismo de interés y la obtención del cultivo. Con este mismo
propósito durante la incubación se deben proporcionar las condiciones adecuadas para el
microorganismo en estudio. El crecimiento óptimo de los microorganismos se presenta a
temperaturas que la mayoría de las veces están relacionadas con la de su hábitat natural.
Algunos microorganismos crecen por debajo de 15ºC, otros requieren temperaturas más
elevadas (30 a 45ºC) y algunos hasta 80ºC. Para alcanzar y mantener estas temperaturas
se puede usar una incubadora microbiológica o un baño de agua a temperatura constante,
en tanto que para los microorganismos que presentan su crecimiento óptimo a
temperaturas entre 20 y 25ºC se pueden incubar en la gaveta o cajón del laboratorio, a
temperatura ambiente. En general las incubadoras microbiológicas satisfacen las
necesidades en cuanto a los rangos de temperatura requeridas por los microorganismos.
La desventaja que tienen es que estos aparatos funcionan con aíre seco, lo que determina
la deshidratación de los medios de cultivo. Por lo tanto, el crecimiento de cualquier
cultivo experimental que se realice en incubadora no debe prolongare por más de nueve
días.
Con relación a las necesidades gaseosas, no todos los microorganismos crecen en
presencia de oxígeno atmosférico; los que sólo crecen en presencia de aíre se
llaman aerobios obligados; los que sólo crecen en ausencia de oxígeno se
denominan anaerobios obligados o estrictos, un tercer grupo se adapta a las dos
condiciones y se le conoce como facultativos. Existe una cuarta categoría que comprende
bacterias que requieren oxígeno, pero sólo lo utilizan cuando éste existe en
concentraciones reducidas; a estos se les llama microaerofílicos.
El desarrollo de estos diferentes grupos se favorece mediante la agitación de los cultivos
o mediante la exclusión de oxígeno para lo que se emplean sustancias reductoras o
equipos especiales. Las bacterias son organismos procarióticos, se encuentran
ampliamente distribuidas en la naturaleza, habitan en el agua, el suelo, en la superficie o
en el interior de plantas y animales incluyendo al hombre. Pueden vivir en forma libre o
en simbiosis con otros organismos, ya sea como parásitos, comensales o mutualistas.
Fisiológicamente este grupo presenta características muy variables, hay bacterias móviles
e inmóviles fotosintéticas y quimio tróficas, autótrofas y heterótrofas; se desarrollan en
un rango muy amplio de temperatura, pH y condiciones gaseosas. En el estudio de
cultivos bacterianos algunos de los criterios que se emplean para caracterizarlas incluyen:
tamaño, morfología celular, forma de agrupación, reacción a la tinción de Gram,
formación de esporas, movilidad, presencia de inclusiones de reserva y características
culturales en medios líquidos y sólidos en los que presentan patrones de desarrollo en
cuanto a la forma, tamaño, elevación y color de las colonias.
Técnicas de siembra
Método de siembra por estría en placa
Es el método más fácil y el más usado para obtener cultivos axénicos. Para ello, con un
asa de siembra se toma una muestra de la población mixta y a continuación se hacen
estrías sobre la superficie de un medio sólido preparado en una placa Petri (a las placas
Petri también se les denomina simplemente placas). Conforme se van haciendo estrías en
zigzag con el asa, cada vez se van depositando en la superficie del medio menos
microorganismos. A continuación, se flamea el asa, se toca en la región donde se han
realizado las últimas estrías y se continúa la siembra con la misma técnica, en la superficie
de medio sin sembrar aún. Repitiendo este proceso varias veces se logra separar células
individuales. A continuación, las placas se incuban en un lugar adecuado, permitiendo
que las células aisladas experimenten un número suficiente de divisiones para formar
colonias visibles. Aunque cada colonia posiblemente representa un clon derivado de una
sola célula, no podemos asegurarlo. Quizás, dos células quedaron depositadas tan juntas
que han originado una única colonia mixta. Por tanto, para asegurarnos de que hemos
obtenido un cultivo axénico, conviene repetir el procedimiento a partir de una colonia
bien aislada en la primera placa. Las colonias que se desarrollen la segunda vez, serán,
casi con toda seguridad, cultivos axénicos.

Métodos de vertido en placa y extensión en placa

En estos métodos, las suspensiones de células microbianas se diluyen antes de su siembra
en placa. Se siguen estas técnicas cuando la muestra contiene tantos microorganismos,
que la dilución no se puede realizar en una sola etapa. Por ejemplo, una suspensión con
mil millones de células por mililitro debe ser diluida 10

veces para obtener una suspensión con un centenar de células por mililitro, Por tanto, se
realizan diluciones seriadas (en varias etapas), normalmente de diez en diez, pero a veces
de cien en cien.

Para realizar diluciones de diez en diez, se añade 1 ml de la suspensión bacteriana a 9 ml

(de medio estéril o solución salina, igualmente estéril. Se agita vigorosamente para diluir
las células y el proceso se repite cuantas veces sea necesario. A continuación, se puede
proceder de dos maneras diferentes.

En el método de vertido en placa, las muestras diluidas se mezclan con agar fundido y
se vierten en placa. Algunas colonias quedarán embebidas en el agar y otras crecerán en
la superficie. Las colonias superficiales se extenderán y serán más grandes.
En el segundo método (extensión en placa), las muestras diluidas se siembran
directamente en la superficie de la placa de agar, extendiéndolas con ayuda de un asa de
Diralsky de cristal estéril. La suspensión se absorbe en el agar, dejando las células
microbianas sobre la superficie. En ambas técnicas las placas se incuban hasta la aparición
de las colonias. Como en el método de siembra por estría, no existe la seguridad de que
las colonias que aparecen en las placas sembradas por extensión o en el agar solidificado
sembrado por el método del vertido en placas sean cultivos axénicos hasta que se repita
el proceso. Las dos técnicas de siembra por dilución presentan la ventaja de que permiten
obtener un mayor número de colonias aisladas que el método de siembra por estría, por
tanto, se eligen cuando se ha de seleccionar una cepa a partir de una mezcla con varios
tipos de microorganismos. Para obtener un cultivo axénico mediante este método:
(a) Hacer diluciones seriadas de la suspensión bacteriana hasta obtener una muestra con
sólo unos pocos cientos de bacterias-

(b) verter la muestra en un tubo con agar a sobrefusión, mezclar y verter el contenido en
una placa Petri.

(c) Después de la incubación, se desarrollan colonias en el agar (más pequeñas) y en su

superficie (más grandes).

Método de aislamiento por siembra por estría en placa: Para obtener un cultivo axénico:
(a) esterilizar un asa de siembra por flameado en la llama de un mechero.

(b) introducirla en la suspensión bacteriana para recoger una muestra.

(c) sembrar haciendo estrías sobre la superficie de un medio sólido en una placa Petri, y

(d) volver a esterilizar el asa, tocar en la zona de la placa ya sembrada y hacer un segundo
grupo de estrías en una región nueva de la placa. Repetir el proceso una tercera y una
cuarta vez, hasta conseguir que los grupos de células se diluyan y se separen células
aisladas.
 (e) Después de la incubación, se desarrollan colonias aisladas. Para estar seguro de que
el cultivo es puro, repetir el proceso entero; para ello tomar una colonia aislada y sembrar
por estrías una segunda placa.

3.2.4 El crecimiento de los cultivos axénicos

Una vez que se obtiene un cultivo puro, normalmente se ha de propagar (se le hace crecer
de nuevo). Seguramente, el investigador deseará obtener más células para poder trabajar
con ellas. Para cultivar microorganismos en el laboratorio, se ha de preparar un medio de
cultivo, líquido o sólido, con todos los nutrientes necesarios para su crecimiento. Los
medios sólidos se hacen generalmente, añadiendo agar a los líquidos

LA IMPORTANCIA DE SER CULTIVO PURO

Todos los microbiólogos saben que han de trabajar con cultivos axénicos (puros) para que
sus experimentos sean significativos. Pero incluso los microbiólogos más experimentados
han cometido errores alguna vez. Esto le sucedió a Ralph Wolfe, uno de los microbiólogos
americanos más distinguidos.

En 1960 Wolfe obtuvo un cultivo puro de la bacteria Methanobacillus omelianskii. Este

microorganismo es anaerobio estricto, capaz de producir metano (gas natural). Wolfe
quería conocer de qué manera M. omelianskií producía gas metano a partir de etanol y
anhídrido carbónico. El procedimiento estaba claro; tenía que lisar la bacteria y aislar las
enzimas que catalizan la reacción, en un tubo de ensayo. Esto, aunque suena bastante
simple, había sido intentado previamente por otros investigadores y todos habían
fracasado. Wolfe lo intentó durante todo un año y tampoco tuvo éxito. De repente lo
consiguió: una solución de enzima. sintetizaba metano en un tubo de ensayo! Se trataba
de un descubrimiento espectacular, hasta que un colega se preguntó si el cultivo era
axénico.
Wolfe decidió volver a aislar el cultivo, pero en vez de añadir etanol y anhídrido
carbónico al mismo, añadió hidrógeno y anhídrido carbónico. En el nuevo medio se
desarrollaron colonias, pero cuando se transfirieron al medio con etanol y anhídrido
carbónico no crecieron. ¿ ¿Qué había sucedido? Un colega, M.J. Wolin, se dio
cuenta de lo que estaba sucediendo. Aunque M. omelianskii originaba colonias uniformes
y aisladas en el medio original, se trataba de una mezcla de dos bacterias. Una, designada
cepa S, convertía el etanol en hidrógeno gas. La otra, designada cepa M, convertía el
hidrógeno gas y el anhídrido carbónico en metano. Ninguna de las dos podía crecer sola
con etanol y anhídrido carbónico. Todos los experimentos de Wolfe se habían realizado
con un cultivo mixto y tuvieron que repetirse para averiguar qué enzimas pertenecían a la
cepa S y cuáles a la cepa M.
¿Qué lección puede aprenderse de la historia de Wolfe? Primero, que los problemas
técnicos (tales como obtener un cultivo axénico), aunque son tan básicos que se explican
en los textos introductorios, son reales e importunan a los más prestigiosos investigadores.
Segundo, que incluso un buen microbiólogo puede equivocarse. Algunas especies pueden
crecer juntas (para formar un consorcio) y parecer un cultivo axénico cuando realmente
no lo son.