CARACTERIZACIÓN MORFOLÓGICA Y MOLECULAR DE UN PARÁSITO NO IDENTIFICADO

PRESENTE EN EL BLANQUILLO (Sorubim cuspicaudus) DEL CANAL DEL DIQUE

KAREN SOFÍA ZABALETA MEZA

JESÚS OLIVERO VERBELPh.D.

Trabajo de grado presentada como pre-requisito para optar al título de Magíster en

Microbiología

PRESENTADO AL
PROGRAMA DE MAESTRÍA EN MICROBIOLOGÍA
FACULTAD DE MEDICINA
UNIVERSIDAD DE CARTAGENA
2017
TABLA DE CONTENIDO

RESUMEN .................................................................................................................. 3
I. INTRODUCCIÓN ................................................................................................. 3
II. MARCO TEÓRICO ............................................................................................... 4
III. OBJETIVOS ......................................................................................................... 8
1. Generales ......................................................................................................... 8
2. Específicos ...................................................................................................... 8
IV. METODOLOGÍA ................................................................................................... 8
1. Diseño del estudio, población y técnica de muestreo.............................. 8
2. Muestreo ....................................................................................................... 8
3. Procesamiento de muestras ..................................................................... 15
4. Identificación morfológica ...................... Error! Bookmark not defined.15
5. Caracterización molecular………………………………………………………16

6. Análisis de datos…………………………………………………………………..17

VI. RESULTADOS …………………………………………………………………….......10

1. Procesamiento de muestras e identificación morfológica………….…….17
2. Caracterización molecular…………….…………….…………………………..23
3. Correlación de Spearman……………..….…………..…………………………24
VII. DISCUSIÓN ..................................................................................................... 104
VIII. CONCLUSIONES ............................................................................................. 176
IX. REFERENCIAS .................................................................................................. 18
ANEXOS ..................................................................... Error! Bookmark not defined.34

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RESUMEN

El Blanquillo es un pez de agua dulce, carnívoro y muy consumido por los habitantes de los
municipios y corregimientos aledaños al Canal del Dique, así como por habitantes de la ciudad de
Cartagena y en general la costa colombiana. Este presenta una variedad de parásitos en diferentes
partes de su cuerpo, entre los cuales están los ojos, la parte interna de la cabeza, las branquias, el
mesenterio y los órganos internos como el hígado, las gónadas y los intestinos.
En el mesenterio de este pez se encuentra un parásito de color rojo y de longitudes de hasta 32 cm.
Dicho parásito al parecer aún no ha sido descrito, y entre otras cosas llama la atención el hecho de
encontrarse ya en su estado adulto dentro del pez, los cuales generalmente tienden a ser huéspedes
intermediarios parasitados por las formas larvarias infectivas. Esta situación nos hace pensar en
posibles riesgos en la salud de los peces y descensos en la calidad nutritiva y sanitaria de su carne,
con eventuales repercusiones en la disponibilidad y sobre la salud del consumidor. Por lo anterior, el
objetivo de este estudio será la caracterización morfológica y molecular de dicho parásito, teniendo
en cuenta que la identificación morfológica no orientaría del todo, ya que nos encontramos, al
parecer, frente a una especie no descrita. La identificación morfológica se realizará mediante
estereoscopía, microscopía óptica y microscopía electrónica. También se realizará una
caracterización histológica del parásito. La identificación molecular será realizada mediante PCR
convencional y secuenciación de marcadores de ADN ribosomal y mitocondrial, tales como: ITS,
rrnSy COX II.
Palabras clave: identificación, parásito, Sorubim cuspicaudus.

I. INTRODUCCIÓN

Los parásitos que habitan normalmente en los ecosistemas acuáticos pueden causar o no
afecciones a otros organismos. Estas afecciones en la salud de los peces por parte de una especie
parásita en particular, por ejemplo, pueden ser muy bien conocidas y estudiadas así como también
podría desconocerse la enfermedad provocada o daño en algún órgano o tejido y el agente que la
produce. Estos parásitos pueden ser microscópicos o macroscópicos, lo cual facilitaría más
rápidamente la confirmación de su presencia en los peces, además de una primera identificación
incluso a simple vista para su clasificación dentro de los parásitos helmintos de peces, ya sea como
nemátodo o tremátodo.

Los parásitos están muy difundidos, contaminando cada vez más nuestros ecosistemas hídricos.
Todo esto, por la misma actividad antropogénica, ya que muchos residuos o desechos como las
aguas residuales confluyen en los cuerpos de agua, conllevando a que éstos se encuentren cada
vez más deteriorados en cuanto a su calidad (Mattiucci y Nascetti, 2007) y afectando por
consiguiente, a los organismos que habitan en tales ecosistemas, principalmente los peces, quienes
son infectados por especies parásitas (Barber y Poulin, 2002), los cuales, probablemente aumentan
en cantidad a medida que incrementa la contaminación en éstos ambientes acuáticos (Marcogliese y
Cone, 2001). Por ello, la contaminación de las aguas puede reducir el número de capturas y la
calidad de los peces, impactando en la seguridad alimentaria. Dicha situación podría estarse
presentando en el Blanquillo, un pez que habita aguas dulces y que es muy consumido a nivel de la
costa caribe colombiana, especie en la que se ha detectado probablemente un nuevo parásito, el
cual podría estar afectando su fisiología.

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Algunas parasitosis pueden conllevar a la muerte del pez, disminuyendo así su disponibilidad en el
medio, la nutrición y/o calidad del mismo, y por ende su aprovechamiento biológico. Adicional a esto,
la presencia de un parásito no visto anteriormente puede generar el rechazo o descenso de su
consumo por parte de la comunidad.
La cantidad de parásitos adultos de ésta especie no identificada encontrada en S. cuspicaudus no es
muy significativa, pero éstos pueden alcanzar grandes longitudes en comparación con otras especies
parásitas encontradas en el Blanquillo (hasta 29 cm) y contener un número elevado de huevos y/o
larvas en su interior, representando posiblemente un mayor riesgo sobre la salud del pez y sobre su
valor sanitario. Además, este parásito se encuentra en su estado adulto, cuando normalmente están
en estadio larvario, y no se puede predecir que tanto daño podría causar sobre la población
consumidora, que riesgos corran o que enfermedades pudieran contravenirse al consumir éstos
peces, a corto o largo plazo. Más aún, se desconoce si éste podría parasitar a seres humanos.
Esta especie de parásito no ha sido caracterizada aún, no se tiene conocimiento del porqué el
Blanquillo, un pez carnívoro de agua dulce, se ha convertido probablemente en su huésped
definitivo, cuáles son los organismos que le sirven como huéspedes intermediarios para cumplir con
su ciclo de vida, y qué impacto tiene sobre el mismo pez y sobre el ambiente en el cual habita.

II. MARCO TEÓRICO

1. PARÁSITOS EN PECES
Los parásitos son organismos que dependen de otros para su desarrollo, y aunque su presencia
algunas veces no genera alteraciones fisiológicas que comprometan la salud del hospedador,
algunos estudios han demostrado la generación de efectos nocivos sobre tejidos y órganos que
pueden ejercer alguna función vital (Olivero-Verbel y Baldiris-Ávila, 2008; Naldoni et al., 2009;
Mendlová et al., 2010). En los peces, ha sido documentado que la presencia de éstos organismos
genera afectaciones a nivel de crecimiento, bienestar, comportamiento, viabilidad y fertilidad (con
consecuencias para la reproducción) (Barber, 2007; Abattouy et al., 2011), poca resistencia a otros
factores estresantes y susceptibilidad a la depredación, entre otros (Barber, 2007). Además, los
parásitos han sido asociados con insalubridad y deterioro de la calidad del agua (Chaudhary et al.,
2014). Por esto, las condiciones en las que se encuentran los cuerpos de agua son determinantes de
la cantidad y diversidad de especies de parásitos que están presentes en dichos lugares, y por tanto,
del tipo(s) de huésped(es) (Mancini et al., 2008). Así mismo, de acuerdo a la literatura, los niveles de
prevalencia, así como los grados de parasitismo son muy variables y dependen de algunos aspectos
tales como la especie del pez, el área geográfica, la época del año y las características individuales
del espécimen (Herrero et al., 2011).Por consiguiente, y debido a la gran variedad de especies
parásitas, se da la co-infección como un proceso natural. En dicho proceso, el tipo y la cantidad de
parásitos en un hospedero va a determinar el grado de virulencia por parte de estos organismos
(Rellstab et al., 2011).

Los parásitos nemátodos que comúnmente se encuentran parasitando a una gran variedad de peces
en los diferentes cuerpos de agua pertenecen a la familia Anisakidae (Suzuki et al., 2010; Olivero-
Verbel et al., 2011; Abattouy et al., 2011;Olivero-Verbel y Caballero-Gallardo, 2013), y principalmente
a los géneros Anisakis, Contracaecum y Pseudoterranova, los cuales parecen tener ciclos de vida
similares, aunque sus especies huéspedes varíen (Nieuwenhuizen y Lopata, 2013). Tremátodos
monogéneos o digéneos (localizados principalmente en ojos y branquias) (Karvonen et al., 2009;
Rellstab et al., 2011), cestodos (São Clemente et al., 2004; Dias et al., 2009; Dias et al., 2011) y

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parásitos protozoarios también han sido reportados (Naldoni et al., 2009; Meldau de Campos et al.,
2011; Carnales et al., 2013).

Por lo general, estos diferentes tipos de parásitos ocupan sitios y/o tejidos específicos (Karvonen et
al., 2009) en los cuales pueden causar ciertas patologías (Meldau de Campos et al., 2011). Un
mismo órgano o tejido puede ser infectado por docenas o cientos de parásitos de diferentes especies
estrechamente relacionados (Rellstab et al., 2011). Los sitios más comunes de infección son: dermis,
branquias, ojos, fosas nasales, oído interno, línea lateral y órganos internos (Muñoz et al., 2006),
tejidos en los que estos organismos crecen y se desarrollan hasta cierta etapa de su ciclo de vida o
hasta su adultez, dependiendo de si el pez es un huésped intermediario o definitivo, causando en
algunas ocasiones graves consecuencias para la salud del pez e influyendo en su comportamiento y
bienestar (Barber, 2007). Además, los parásitos tienen la capacidad de diferenciar entre distintas
especies de peces mediante sus estructuras sensoriales. Lo anterior puede obedecer a estímulos de
tipo químico y/o mecánico presentes en la superficie de los peces, ya que cada parásito presenta un
ciclo de vida relacionado a diferentes huéspedes de especies específicas (Hastie et al., 2013). Por su
parte, los peces mediante mecanismos de defensa, tienen la capacidad de minimizar el impacto de la
infección parasitaria al reducir la gravedad de la misma o resistirse completamente a ella. Los
mecanismos de defensa que intervienen en esta resistencia son el innato y el adaptativo (Buchmann,
K., 2012). Las defensas innatas de los peces a helmintos están asociadas con reacciones
inflamatorias (favorecidas por los neutrófilos) (Bahlool et al., 2013; Dezfuli et al., 2015), las cuales
pueden conllevar a su muerte si son el resultado de una gran infección (Buchmann, K., 2012).

De acuerdo a la hipótesis de la adaptación local, los parásitos deben tener la ventaja evolutiva sobre
sus huéspedes, o mayor potencial evolutivo que sus huéspedes, por presentar tiempos más cortos
de generación, tasas de mutación más altas y grandes tamaños de población (Dybdahl y Storfer,
2003). En familias de parásitos como los Anisákidos, la ausencia de perturbación en el medio
acuático podría permitir que dichas especies alcancen grandes tamaños de población con una
reducida probabilidad de la deriva génica (Mattiucci y Nascetti, 2007), mientras que en condiciones
de hábitat extremas, confieren cierta protección a los peces presentes en éstos ecosistemas frente a
la parasitosis, ya que tales organismos parásitos podrían no sobrevivir al no tolerar las condiciones
en las que se encuentran y/o poner en riesgo su supervivencia en vida libre y la de especies
huéspedes que intervienen en sus ciclos de vida indirectos (Tobler et al., 2007).

2. EFECTOS NEGATIVOS EN EL CONSUMIDOR

Además de los efectos negativos de los parásitos en la salud de los peces, el hombre, como
consumidor de tales organismos, se convierte en un blanco para la afección por parte de éstos
parásitos, los cuales generan desde cuadros alérgicos hasta enfermedades (Mattiucci et al., 2013).
Dichas enfermedades surgen a partir de la ingesta de pescado crudo o mal cocido con larvas de
tercer estadio (L3) de nemátodos anisákidos (anisakiasis o anisakidosis humana zoonótica) (Suzuki
et al., 2010; Koinari et al., 2013; Tae-Jong et al., 2014), metacercarias de tremátodos, plerocercoides
de tenias (etapas infectivas). El hecho de que se consuma el pescado de esta forma permite que se
conserve la viabilidad larval, y por consiguiente, el surgimiento de la enfermedad (Dias et al.,
2011).Por lo tanto, se hace necesario el control y tratamiento de la infección parasitaria en los peces,
el cual depende de la identificación adecuada (a nivel molecular) y rápida de parásitos relacionados
(Chaudhary et al., 2014) que podrían causar diversas zoonosis (Zhu et al., 2007).

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 3. TÉCNICAS MOLECULARES
La utilidad de secuencias de ADN para propósitos taxonómicos está bien establecida. La
secuenciación del ADN proporciona un enfoque valioso para la caracterización genética de una
especie de parásitos (Wu et al., 2005; Verma y Chaudhary, 2012), debido a que, por ejemplo, el ADN
ribosómico (ADNr) que es una secuencia de ADN contenida en los cromosomas del nucléolo que
codifica ARN ribosómico (ARNr) regula la transcripción e iniciación de la amplificación y contiene
segmentos espaciadores transcribibles (ITS) y no transcribibles (NTS) (estas regiones de ADNr se
denominan también regiones de organización del nucléolo). Además, el bajo nivel de polimorfismo en
la unidad de transcripción de ADNr permite la caracterización de cada especie usando sólo unos
pocos ejemplares y hace que éste ADN sea útil para la comparación interespecífica (Hillis y Dixon,
1991).

Gracias a lo anterior, una gran cantidad de especies de parásitos, tanto nematelmintos como
platelmintos han sido identificados molecularmente de forma adecuada mediante el desarrollo de
técnicas moleculares para el análisis taxonómico de dichos parásitos. Estas técnicas, en particular el
uso de marcadores moleculares, se han utilizado para identificar y validar los parásitos, como los
monogéneos (Chaudhary et al., 2014).

Datos recientes de las técnicas moleculares, como análisis de alozimas, reacción en cadena de la
polimerasa-polimorfismos en la longitud de los fragmentos de restricción (PCR-RFLP) (Kijewska et
al., 2002; Szostakowska et al., 2002; Shih, 2004;Abe, 2005; Pontes et al., 2005; Murata et al., 2011)y
la secuenciación de la región del espaciador interno transcrito (ITS1-5.8S rRNA-ITS2) del ADN
ribosomal, han revelado la existencia de diferentes especies de parásitos, como las 9 especies
válidas pertenecientes al género Anisakis: Anisakis simplex sensustricto, Anisakis pegreffii, Anisakis
simplex C (3 especies hermanas de la A. simplex complejo para las que se ha utilizado RFLP de la
ITS y la subunidad 5.8 del gen rRNA) (D’Amelio et al., 2000; Abollo et al., 2001; Abollo et al., 2003;
Abe et al., 2005; Martin-Sanchez et al., 2005; Umehara et al., 2006; Abe et al., 2006; Umehara et al.,
2007), A. typica, Anisakis ziphidarum, Anisakis nascettii, A. physeteris, A. brevispiculata y A. paggiae
(Mattiucci et al., 2005; Nadler et al, 2005; Mattiucci et al., 2009).

Entre las técnicas moleculares más utilizadas están la PCR (reacción enzimática que conlleva a la
amplificación de secuencias de ADN específico de un ADN molde determinado) (Chaudhary et al.,
2014) y la secuenciación de ITS (Koinari et al., 2013; Pekmezci et al., 2014) y Cox I y II. Muy poco se
realiza la secuenciación de rrnS y adicionalmente de mtDNA (Koinari et al., 2013). Recientemente,
las técnicas moleculares que se basan en la secuenciación de las regiones ITS del ADN ribosomal y
la subunidad citocromo C oxidasa II, han demostrado ser particularmente útiles para la identificación
precisa de los nemátodos pertenecientes a la familia ascaridoidea, tanto de las larvas y adultos como
de los huevos (D’Amelio et al., 2000; Zhu et al., 2000; Zhu et al., 2007; klimplel et al., 2007; Mattiucci
y Nascetti, 2008; Amor et al., 2011; Setyobudi et al., 2011; D’Amelio et al., 2012; Pekmezci et al.,
2013).

Un gran número de estudios han demostrado que el primer y el segundo espaciador interno
transcrito (ITS-1 e ITS-2: regiones intergénicas de ADNr) del ADN ribosomal proporcionan
marcadores genéticos adecuados para la identificación de especies de anisákidos, cualquiera que
sea su estado de desarrollo (estadio larvario) (Zhu et al., 2000; Zhang et al., 2007; Shamsi et al.,
2011a; Shamsi et al., 2011b; Jabbar et al., 2012 and Jabbaret al., 2013), y que la PCR acoplada al
escaneo de mutaciones de las regiones ITS-1 y/o ITS-2 junto con la secuenciación específica
(Gasser et al., 2006) y el análisis filogenético (Jabbar et al., 2012; Jabbar et al., 2013) ofrecen un
enfoque poderoso para explorar la composición genética de las poblaciones de anisákidos y para la
investigación de su biología. Otros lo han usado para la identificación molecular y para diferenciar
6
entre parásitos nematodos anisákidos del mismo género (Shin, H-H, 2004; Jabbar et al., 2013) sin
dejar de lado la identificación morfológica, a pesar de que la identificación de las especies por
examen microscópico es muy difícil y algunas veces imposible, debido a la pobre variación
morfológica de los nemátodos y su forma larval en particular (Szostakowska et al., 2002). Debido a
todo esto, las regiones ITS son fragmentos de ADN bastante secuenciados en muchos estudios
sobre identificación molecular de parásitos (D´Amelio et al., 2000; Nadler et al., 2005; Pontes et al.,
2005; Abe et al., 2006; Zhu et al., 2007).

Así mismo, se han desarrollado muchos otros métodos como PCR (convencional) y secuenciación
del gen rRNA (Szostakowska et al., 2002; Shih, 2004; Nadler et al., 2005; Abe, 2005) o del ADN
mitocondrial (Valentini et al., 2006). Sin embargo, el establecimiento de una PCR múltiple para el
diagnóstico diferencial de nematodos anisákidos podría representar una alternativa a los métodos
convencionales (Umehara et al., 2008). Estos nemátodos de la familia Anisakidae son los parásitos
mayormente caracterizados molecularmente, por ser especies zoonóticas (causantes de cuadros
alérgicos y anisakiasis) (Koinari et al., 2013; Pekmezci et al., 2014). Se han caracterizado
genéticamente por secuenciación de marcadores nucleares y mitocondriales, como ITS y cox II,
utilizando para su amplificación los primers NC5 (forward: 5′-
GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATT-3′) y NC2 (reverse: 5′-TTAGTTTCTTCCTCCGCT-3′) para
la región ITS (Zhu et al., 2000), y los primers 210 (reverse: 5′-CACCAACTCTTAAAATTATC-3′) y 211
(forward: 5′-TTTTCTAGTTATATAGATTGRTTTYAT-3′) (Nadler y Hudspeth, 2000), para el gen cox II.
Estos primers fueron utilizados convenientemente y por primera vez para la caracterización
molecular de Hysterothylacium fabri (nemátodo de la familia Anisakidae) del mar mediterráneo,
obteniéndose resultados satisfactorios (Pekmezci et al., 2014).

Por otra parte, a nivel morfológico, las larvas del tercer estadio (L3) de Anisakis, que son los agentes
etiológicos de la anisakiasis o anisakidosis humana, se clasificaron morfológicamente en larvas de
Anisakis Tipo I y Tipo II sobre la base de la longitud del ventrículo y la ausencia o presencia de un
mucrón (Berland, 1961; Koyama et al., 1969).
Finalmente, es importante resaltar que el establecimiento de diferentes métodos de PCR para el
diagnóstico diferencial de larvas de nemátodos dentro de las distintas distribuciones geográficas es
muy importante para el diagnóstico y control de las enfermedades a causa de estos parásitos (Fang
et al., 2010), ya que para la epidemiología molecular ha sido y es muy importante proporcionar la
identificación específica y sensiblede parásitos para resolver los problemas taxonómicos,
particularmente a nivel de especie y de niveles taxonómicos inferiores.

4. REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

La técnica molecular PCR amplifica el ADN purificado (un fragmento) y se emplea como base para
un gran número de técnicas en el laboratorio debido a su robustez y rapidez. Se fundamenta en la
propiedad natural de las ADN polimerasas para replicar hebras de ADN. UN fragmento de ADN
nuclear, que contiene una parte del ADN ribosomal permite fácilmente su amplificación
(Szostakowska et al., 2002), por lo cual es muy utilizado a la hora de la aplicación de dicha técnica
molecular.

Además de ser una técnica rápida, segura y fácil, es una herramienta sensible para la identificación
de parásitos, por lo que permite examinar pequeñas cantidades de material para obtener un gran
número de copias (amplificación) y repetir el experimento muchas veces. Además, el material de
muestra puede almacenarse no sólo en un estado congelado, sino también en etanol,
lo cual es importante desde el punto de vista práctico (Szostakowska et al., 2002).

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 III. OBJETIVOS
1. GENERAL

Caracterizar morfológica y molecularmente una especie de parásito no identificada presente en el

Blanquillo (Sorubim cuspicaudus) del Canal del Dique, Norte de Colombia.

2. ESPECÍFICOS
1. Determinar los parámetros morfométricos del S. cuspicaudus del Canal del Dique.
2. Determinar los diferentes índices parasitarios: prevalencia, abundancia e intensidad, para el
parásito presente en S. cuspicaudus del Canal del Dique.
3. Identificar las características morfológicas e histológicas del parásito.
4. Identificar molecularmente al parásito.

IV. METODOLOGÍA
1. DISEÑO DEL ESTUDIO, POBLACIÓN Y TÉCNICA DE MUESTREO
Este proyecto de investigación se basó en un estudio descriptivo de corte transversal.

El período de estudio, más exactamente el período de muestreo o toma de muestras se llevó a cabo
en un periodo de seis (6) meses en el Canal del Dique (desde Mayo hasta Noviembre de 2016), para
lo cual se contó con la ayuda de pescadores del corregimiento de Gambote. Se utilizó la técnica de
muestreo secuencial por conveniencia, accediéndose a un total de 27 muestras (cardumen) tomadas
por muestreos sucesivos. En total, se realizaron seis (6) muestreos.
2. MUESTREO
Los especímenes de S. cuspicaudus fueron colectados en el corregimiento de Gambote
(10°09’35’’N; 75°18’06’’W), Canal del Dique (10°17’8’’N; 75°12’49’’W), en horas de la mañana con
ayuda de pescadores locales. Estos peces, inmediatamente eran recibidos se transportaban en
neveras de icopor con hielo hasta el laboratorio de Ecotoxicología del Grupo de Investigación de
Química Ambiental y Computacional de la Universidad de Cartagena, donde eran procesados en
fresco en un tiempo no superior a 4 horas. En total, se procesaron o examinaron 27 peces.
3. PROCESAMIENTO DE MUESTRAS

En el laboratorio a cada uno de los peces le fue registrado el peso y la talla. Luego de esto, se
procedía a diseccionar el pez longitudinalmente (con mucho cuidado) y a examinar en general la
cavidad abdominal, el mesenterio y cada uno de los órganos internos en búsqueda de ejemplares del
parásito no identificado para realizar el aislamiento de los mismos. De los organismos aislados,
algunos fueron empleados para la identificación morfológica en fresco (con solución salina), así
como con previa conservación en formalina por un período mínimo de 24 horas,y otros para la
caracterización por métodos moleculares. Para este fin último, las muestras eran conservadas
individualmente (sin solución alguna) en eppendorfs a – 20°C. Los ejemplares correspondientes al
parásito registrado para esta especie no identificada fueron el objeto de estudio de esta
investigación.

Posteriormente se determinó el factor de condición (factor que relaciona las variables medibles de
peso (W) y talla (L)), bajo la fórmula CF = (W/L3) x 100 (Pauly, 1983; Granado, 2002) y los índices
parasitarios: prevalencia, abundancia e intensidad parasitaria de acuerdo a Bush et al. (1997).

8
 4. IDENTIFICACIÓN MORFOLÓGICA
Una vez obtenidas las muestras del parásito de interés, se realizó el análisis morfométricoen fresco
(con solución salina) para luego conservar dichas muestras en formalina tamponada al 10% por un
período de 24 horas aproximadamente para futuros aclaramientos mediante la inmersión en una
solución de glicerina y alcohol (70º) en una proporción 50:50, por un período de tiempo corto, 1 hora
(esta mezcla hace que los ejemplares se rehidraten rápidamente y se produzca el aclaramiento
suficiente para el estudio de las estructuras internas del parásito) (Ruiz, S., 1996).
Antes y después del proceso de aclaramiento se hizo la identificación macro y microscópica. Tal
proceso fue efectuado colocando la muestra en un portaobjetos con una gota de solución salina y
con la ayuda de un estereoscopio para el análisis de la estructura macroscópica, así como mediante
un microscopio ópticoOlympus BX41 con cámara Olympus C-7070 wide zoom para observar mejor la
morfología interna del parásito.
Adicionalmente, se realizó la caracterización histológica del parásito, haciendo diferentes cortes
histológicos a lo largo de su cuerpo, enfatizando hacia la cabeza y cola del mismo. Estos cortes
fueron fijados en formalina buferizada al 10% (durante 48 horas) y deshidratados mediante etanol
absoluto y varios lavados con xileno, para luego ser embebidos en parafina. Las placas obtenidas se
examinaron al microscopio luego de la tinción de las mismas con H&E.

Para el análisis morfométrico se tuvieron en cuenta las claves taxonómicas descritas por Abollo et al.
(2001) (Tabla 1) para nemátodos y utilizadas por Martins et al. (2005) enfatizando en los parámetros
comunes a los nemátodos y al espécimen estudiado y que pudieran ser medidos en este último. De
acuerdo a esto se tomó únicamente la medida de la “longitud total (LT)” a todos los parásitos
examinados.

Tabla 1. Índices morfométricos de nemátodos (Abollo et al., 2001).

ÍNDICE Alfa(α) Beta 2 (β2) Beta 3 (β3) Gamma X D1 D2 Z
CÁLCULO LT/DT LT/LE LT/LV LT/LC LT/LAV LT/LCI LV/LCI LAV/LCI
Parámetros (Convenciones y abreviaturas): LT: Longitud Total; DT:Diámetro Total; LE: Longitud Esófago; LV: Longitud Ventrículo;
LC: Longitud ano-punta cola; LAV: Longitud Apéndice Ventricular; AV: Longitud Boca-Anillo nervioso.

5. CARACTERIZACIÓN MOLECULAR
Los parásitos obtenidos se almacenaban a -20°C hasta su caracterización molecular, previo lavado
con solución salina. A cada muestra le era extraído el ADN (Umehara et al., 2006) empleando el kit
DNA Mini (Qiagen, Alemania) siguiendo las recomendaciones del fabricante (La integridad del ADN
se verificó mediante electroforesis en gel de agarosa y en el espectofotómetro – Nanodrop 2000). La
identificación genética fue realizada mediante PCR convencional en termociclador VeritiTM Thermal
Cycler y secuenciación de marcadores de ADN ribosomal y mitocondrial, tales como: ITS
(espaciadores internos transcritos), rrnS(subunidad pequeña del ARN ribosomal mitocondrial) y
COXII (Citocromo C Oxidasa ll). Las condiciones de amplificación para cada marcador fueron
establecidas empleando los protocolos modificados de Nadler y Hudspeth (2000), Zhu et al. (2000) y
D’Amelio et al. (2007). Los resultados de la PCR se analizaron mediante electroforesis en gel de
agarosa al 1,2%, en tampón TBE 1X, revelado con bromuro de etidio para verificar la amplificación
de los diferentes genes. Los cebadores para cada gen se listan en la Tabla 2.

Tabla 2. Secuencia de cebadores a emplear en este estudio.

Nombre del Forward Reverse Tamaño del Referencia

Gen (5’  3’) (5’  3’) amplicón
(bp)

COX II TTTTCTAGTTATATAGATTGRTTYAT CACCAACTCTTAAAATTATC 519-600 Nadler y

9
 Hudspeth, 2000
D’Amelio et al.,
RrnS TTGTTCCAGAATAATCGGCTAGACTT TCTACTTTACTACAACTTACTCC 485
2007
ITS GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATT TTAGTTTCTTTTCCTCCGCT 980-1000 Zhu et al., 2000

6. ANÁLISIS DE DATOS
Los datos son presentados como la media ±error estándar. La correlación de Spearman se utilizó
para determinar las asociaciones entre los índices parasitarios y los parámetros morfométricos del
pez. Para todos los análisis estadísticos, el criterio de significancia fue de P <0.05.

V. RESULTADOS
1. PROCESAMIENTO DE MUESTRAS E IDENTIFICACIÓN MORFOLÓGICA

Un total de 27 especímenes de S. cuspicaudus fueron colectados en el Canal del Dique. El promedio

de todos los datos obtenidos con respecto a los parámetros morfométricos del Blanquillo, la variable
que relaciona estos parámetros (FC o K) y la abundancia parasitaria se muestran en la Tabla 3.

Tabla 3. Parámetros morfométricos, factor de condición (FC) y abundancia parasitaria en S. cuspicaudus del
Canal del Dique.
N Peso (g) Lt(cm) FC Parásito (abundancia parasitaria)

27 995.43 ± 102.84 55.80 ± 1.812 0.5277 ± 0.022 2.96 ± 1.03

Convenciones y Abreviaturas: Lt (Longitud Total).

Luego del procesamiento de los peces, un total de 80 muestras representativas del parásito objeto
de estudio (en estado adulto) fueron aisladas del interior de los mismos (cavidad abdominal), encima
y/o debajo de los diferentes órganos (sin atravesarlos o perforarlos) (Figura 1). Estos parásitos
presentan una coloración roja. Los valores de los índices parasitarios calculados mediante el
programa estadístico Graphpad Instat 3.10 fueron: 44% para la prevalencia, 6,67 ± 1,85 para la
intensidad parasitaria y 2,96 ± 1,03 para la abundancia parasitaria (Tabla 3).

Figura 1. Múltiples parásitos al interior de S. cuspicaudus

10
Los parásitos aislados fueron observados en fresco (al microscopio óptico y al estereoscopio)
(Figuras 2 y 3) y luego del proceso de aclaramiento (Figuras 5 y 6), realizando así un análisis visual
de su estructura externa e interna u órganos internos para su identificación morfológica. Las
imágenes se muestran a continuación.

A B

Figura 2. Imágenes del parásito hallado en el mesenterio de S. cuspicaudus. observados en fresco al

estereoscopio, 0,67 X. A. Parásito de 8,5 cm. B. Parásito de 27,5 cm.

Este parásito es de color rojo, de cuerpo redondo. En el extremo anterior es redondeado y se puede
apreciar su boca con dos labios. El tubo digestivo presenta esófago e intestino, el cual inicia justo
cuando finaliza dicho esófago. En ese mismo punto nace el útero. Este último tiene la misma longitud
del intestino y va a lo largo de prácticamente todo su cuerpo cilíndrico. Dentro del útero, se
encuentran cientos de huevos y/o larvas en continuo movimiento (Figuras 6B, 6C). El extremo
posterior es cónico y presenta el ano justo al final de la cola (en el extremo). Tanto el útero como el
intestino confluyen en el mismo punto.
Es importante mencionar que se ha encontrado igualmente una estructura de diámetro similar al
intestino que rodea en ocasiones al intestino, al útero o a ambos y que también inicia en el mismo
punto que el intestino y el útero pero no se observa una salida (desconocemos su nombre y función).
Esta tiende a enrollarse un poco hacia el extremo posterior justo antes de llegar al ano (Figura 3A,
3B).
Presenta una longitud en promedio de 14.3 ± 0.6 cm, con un rango de 5 – 29 cm.

11
 A B
Útero
Estructura sin
identificar

Intestino Intestino

Útero

Esófago

Ano

Figura 3. Imágenes del parásito hallado en el mesenterio de S. cuspicaudus observados en fresco al

microscopio óptico. A. Extremo anterior. B. Extremo posterior.

A B

100 µm 100 µm

C D

Figura 4. A, B. Parásito adulto con larvas en su interior visto al microscopio, 10X. C, D. Larvas y huevos de
diferentes estadios embrionarios extraídos del interior del parásito adulto. Observados al estereoscopio, 1X.

12
 A B
2

Figura 5. A. Extremo anterior, boca y esófago del parásito; B. Detalle extremo anterior, boca; C. Parte
posterior del esófago e intestino.

13
 A

B C

D
A

Figura 6. A. Intestino y útero del parásito; B. Huevos y larvas al interior del parásito; C, D.Extremo posterior,
ano.

14
 Figura 7. Cortes histológicos del parásito (transversal y longitudinal).

2. CARACTERIZACIÓN MOLECULAR

Los resultados de la verificación de la integridad del ADN extraído, tanto por electroforesis en gel de
agarosa (Figura 8) así como mediante el espectofotómetro (Nanodrop 2000) (Tabla 4) se muestran
a continuación.
Tabla 4.
Marcador
Concentración delB14
ADN
B14extraído.
B14 en
(M) (1) (3) (2) Muestra Concentración 260/280 260/230
(ng/µl)
B14 (1) 240,3 1,86 1,14
239,6 1,86 1,11
B14 (2) 413,9 1,87 1,19*
428,2 1,86 1,14
B14 (3) 323,2 1,88 1,23
345,9 1,86 1,17

Figura 8. Fotodocumentación del gel de

ADN teñido con bromuro de etidio.

La electroforesis en gel de agarosa realizada para analizar los productos de la PCR arrojó resultados
negativos ya que no se evidenció ninguna banda, lo cual indica que la PCR resultó negativa o que no
se dio la amplificación de los diferentes genes (replicación nula del fragmento de ADN).

15
 3. CORRELACIÓN DE SPEARMAN

La correlación entre los parámetros morfométricos y el factor de condición de S. cuspicaudus y la

abundancia parasitaria se muestran en la Tabla 5. Los datos se analizaron teniendo en cuenta un
criterio de significancia de P <0.05.

Tabla 5.Correlación de Spearman entre los parámetros morfométricos y el factor de condición (FC) de S.
cuspicaudus y la abundancia parasitaria.
Peso Longitud FC Parásitos
Total
Peso 1

Longitud Total 0.8790 1

(p<0.0001)
FC 0.4909 0.0546 1
(p<0.0001) (p<0.0001)
Parásitos -0.5452 -0.6621 -0.0808 1
(p=0.0307) (p=0.0040) (p=0.0337)

VI. DISCUSIÓN

A pesar de que el S. cuspicaudus, conocido comúnmente como Blanquillo o Bagre, es muy

consumido por su buen sabor y la ausencia de espinas, son pocos los estudios hechos en Colombia
acerca de ésta especie carnívora. Estos estudios corresponden a los autores Pardos y col. (2009)
(Universidad de Córdoba - Río Sinú), Olivero-Verbel y Caballero-Gallardo (2013) (Universidad de
Cartagena – Canal del Dique). En estos se reporta únicamente la presencia de Contracaecum sp.
con una prevalencia de 100% y 96,9%, respectivamente, más no la del parásito objeto de estudio de
esta investigación. La prevalencia de éste último es mucho menor en comparación con la de
Contracaecum sp. (44% Vs. 96,9 – 100%) en el mismo pez, al igual que la abundancia parasitaria:
2,96 ± 1,03 parásitos/pez Vs. 69,52 ± 22,77 parásitos/pez (Pardo et al., 2009) y 23,1 ± 10,9
parásitos/pez (Olivero-Verbel y Caballero-Gallardo, 2013), pero con la diferencia de que éste se
encuentra en estado adulto y grávido, por lo que presenta cientos de larvas en su interior y/o huevos
en diferentes estadios embrionarios. Sin embargo, no hemos identificado órganos sexuales
masculinos y/o femeninos en los diferentes especímenes y tampoco conocemos su etapa de vida
libre para definir en que momento de su ciclo ingresa o sale del pez. Además, es importante
mencionar que se han encontrado larvas vivas de color blanco, casi traslúcidas y de
aproximadamente 1 cm o menos por fuera del parásito adulto (cavidad abdominal) (Figura 9).

A B

100 µm

16
Figura 9. A. Extremo anterior de larva de 0,5 cm de longitud hallado en la cavidad abdominal del S.
cuspicaudus. B. Parásito adulto y larva vistos al estereoscopio, 1X.

En los estudios antes mencionados, así como el realizado por Guidelli y col. (2001) se ha tenido en
cuenta la medida del factor de condición (FC) como un indicador del estado de salud del pez, ya que
a menudo es asociado con la presencia de parásitos. En este estudio, al realizar la correlación de
dicho factor con la abundancia parasitaria se obtuvo una correlación negativa (ρ = -0.0808; P =
0.0337), por lo que podría pensarse que la cantidad de parásitos que presenta el Blanquillo no es
significativa o no causa muchas afecciones en la salud del mismo. Sin embargo, el factor de
condición tiene valores entre 0 y 1, y en este estudio se obtuvo un valor promedio (0.5277 ± 0.022) a
pesar de que las variables de peso y longitud total si tuvieron una correlación positiva y significativa
entre sí (ρ = -0.8790; P < 0.0001). Esto podría ser debido a que el pez presenta pocos ejemplares
del parásito en comparación con los parásitos del género Contracaecum, por ejemplo, pero no
podemos olvidar que en su interior encontramos grandes cantidades de larvas que podrían ser aún
más significativas, pero la correlación no incluye la abundancia parasitaria de estas sino únicamente
la del parásito adulto.
Diferentes estudios realizados para la caracterización morfológica y/o molecular de nemátodos,
principalmente de anisákidos, han tenido en cuenta los índices morfométricos (y/o todas o algunas
de las parámetros morfométricos o variables que los definen) dados por Abollo et al. (2001) para la
indentificación y comparación de éstos (Murata et al., 2011; Pardo et al., 2009; Mattiucci et al., 2009;
Martins et al., 2005; Martín-Sánchez et al., 2005). Sin embargo, al momento de tenerlas en cuenta,
no todas las mediciones fueron posibles debido a la ausencia de las diferentes estructuras en el
parásito estudiado en comparación con los parámetros morfométricos mencionados por Abollo et al.
(2001). Están ausentes el anillo nervioso, el apéndice ventricular, el ventrículo, y la distancia del ano
a la punta de la cola, ya que se encuentran en el mismo lugar. Además, debido a su fragilidad se
trató de manipularlo muy poco, sobretodo aquellos que debían guardarse en congelación para la
posterior extracción del ADN y para su conservación en formalina previo al proceso de aclaramiento.
Por todo lo anterior se realizó únicamente la medición de su longitud total (LT).
La caracterización morfológica del parásito se dificultó mucho, ya que a pesar de ser un parásito
redondo, por lo cual se piensa que es un nemátodo, no se encontró mucha similitud con aquellos que
pertenecen a la familia Anisakidae, ni tampoco se dio la amplificación del ADN con los diferentes
primers utilizados para la caracterización molecular de dichos parásitos (los nemátodos de la familia
Anisakidae mayormente identificados molecularmente). Esto último, quizás se debió a la diferencia
morfológica interna del parásito estudiado con respecto a dichos nemátodos, ya que si se obtuvo un
ADN bastante puro.
En cuanto a la histología, debido a que el proceso o técnica implica calor y que el especímen es
bastante delgado, ya que tiene alrededor de 50-70 µm de diámetro, no se pudieron obtener los
cortes realizados hacia la cabeza y la cola pero sí los de algunos a lo largo de su cuerpo (cortes
longitudinales y transversales) en los que se logra observar el intestino y las larvas que se
encuentran en su interior, ratificando así lo que se observó al microscopio en fresco y después del
aclaramiento.

VII. CONCLUSIONES
Como resultado de la investigación realizada, podemos concluir inicialmente que a pesar de que la
caracterización histológica y molecular no tuvieron éxito, se logró la caracterización morfológica o
descripción del parásito como un primer avance para su posterior identificación en otros estudios,
bien sea mediante la comparación morfológica entre éste primero y otras especies similares y/o por
17
medio de la técnica molecular de PCR con primers utilizados para la identificación molecular de
estas otras especies parecidas, teniendo en cuenta principalmente su coloración, longitud, y que
tengan como huésped final a un pez, es decir, que se encuentren en estado adulto parasitando o
infectando a un pez.
Los parámetros morfométricos mostraron una relación entre sí y éstos a su vez con el factor de
condición (FC), pero no hay una correlación entre las variables anteriores y la abundancia parasitaria
del parásito estudiado.

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ANEXOS

Tabla 6. Datos tomados durante el procesamiento de las muestras.

Muestra Peso (g) Lt (cm)

FC Parásito rojo

B1 1115,6 60 0,5165 0
B2 985,6 57,0 0,5322 0
B3 922,6 57 0,4982 0
B4 812 61 0,3577 0
B5 572 48 0,5172 12
B6 529 45 0,5805 3
B7 1164 61 0,5128 0
B8 1089 59 0,5302 0
B9 1131 62 0,4746 0
B10 1139 63 0,4555 1
B11 1355 62 0,5685 0
B12 1039 63 0,4155 0
B13 383 42,5 0,4989 10
B14 386 42 0,5210 22
B15 1602 68,1 0,5072 0
B16 1887 69 0,5744 0
B17 709 51,1 0,5314 0
B18 1909 75 0,4525 0
B19 2199 60 1,0181 0
B20 1987,1 68 0,6320 1

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 B21 628 51 0,4734 1
B22 314 41,7 0,4330 13
B23 336,4 40,7 0,4990 3
B24 745,1 52,6 0,5120 0
B25 626,8 51 0,4725 4
B26 805,2 50 0,6442 6
B27 505,2 46 0,5190 4

Tabla 7. Longitud total de los parásitos de acuerdo a la muestra en la que se hallaron.

Longitud Parásitos Rojos (cm)

MUESTRAS B5 B6 B10 B13 B14 B20 B21 B22 B23 B25 B26 B27
13 16 8 11 12 12 6,7 21 20,8 22,7 11,4 9,8
89,7 15 13 10 19,8 5 13 8,6
14 15 13 11 17,3 22,5 20,5 13,1 5,2
12 12 29 14,6 19,6 13,5 8,3
13 10 8,2 16,5 13
13 9,6 23 14,1 18,5
12 11 14 25,6
9,5 12 18 15,3
10 11 18 20,1
9,6 11 11 10,5
11 12 10
12 17 11,1
28 10,8
19
18
18
13
29
18
26
15
14
PROMEDIO 11,4 13,5 8,0 11,5 17,3 12,0 6,7 15,2 21,0 17,0 13,8 8,0

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