Decoloración de los colorantes azoicos solubles en agua y en aceite por acidophilus y Lactobacillus

fermentum

Huizhong Chen · Haiyan Xu · Thomas M. Heinze ·

Carl E. Cerniglia

Recibido: 4 de junio de 2009 / Aceptado: 11 de agosto de 2009 / Publicado en línea: 29 de agosto

de 2009

© Sociedad de Microbiología Industrial 2009

Palabras clave Azo colorantes · Tintes de Sudán · Lactobacillus especies ·

Aminas aromáticas · Biodegradación

Azo colorantes: Un azo colorante es uno de un extenso rango de colorantes sintéticos orgánicos
hechos de anilina, convirtiéndolo primero con nitrito de sodio a una sal de cloruro de diazonio y
después reaccionando con otras aminas aromáticas, fenoles y ácidos sulfónicos

Más información en: Azo colorantes (Química) © https://glosarios.servidor-alicante.com

Tintes de sudan: El Sudán III es un colorante que se utiliza para detectar específicamente las
grasas, porque es insoluble en agua y en cambio es soluble en las grasas. Al ser de color rojo,
cuando se disuelve tiñe las grasas de color rojo anaranjado.

Lactobacillus especies: Lactobacillus es un género de bacteria constituido por una serie de

especies benéficas de interés particular en la industria. La palabra Lactobacillus proviene de
«lactis», que significa leche, y «bacillus», que significa pequeños bacilos.

Una amina aromática es un compuesto orgánico que consiste en un anillo aromático unido a una
amina

Descomposición natural y no contaminante de una sustancia o producto por la acción de agentes

biológicos.

Resumen

Se investigó la capacidad de Lactobacillus acidophilus y Lactobacillus fermentum para degradar los

colorantes azoicos. Las bacterias se incubaron en condiciones anaeróbicas en presencia de 6 g / ml
de Methyl Red, Ponceau BS, Orange G, Amaranth, Orange II y Direct Blue 15; 5 g / ml Sudán I y II; o
1,5 g / ml de Sudán III y IV en caldo deMann-Rogosa-Sharpe a 37 ° C durante 36 h, y se controló la
reducción de los colorantes. Ambas bacterias fueron capaces de degradar todos los colorantes
azoicos solubles en agua en cierta medida. También fueron capaces de reducir completamente los
colorantes diazoicos solubles en aceite Sudán III y IV, pero fueron incapaces de reducir los
colorantes monoazoicos solubles en aceite Sudán I y II a cualquier grado significativo en las
concentraciones estudiadas. El crecimiento de las bacterias no se vio afectado significativamente
por la presencia de los colorantes azoicos de Sudán. Los metabolitos de la degradación bacteriana
de Sudán III y IV se aislaron y se identificaron mediante análisis de espectrometría de masas en
tándem de ionización por electropulverización por cromatografía líquida y se compararon con
estándares auténticos. La anilina y la o-toluidina (2-metilanilina), ambas aminas aromáticas
potencialmente carcinógenas, fueron metabolitos de Sudán III y IV, respectivamente

Introducción

Los colorantes azoicos, que se caracterizan por uno o más enlaces azoicos, son un grupo
importante de colorantes utilizados en textiles, plásticos, productos farmacéuticos, cosméticos y
productos alimenticios [11]. Muchos colorantes azo sintéticos se pueden convertir en aminas
aromáticas incoloras, algunas de las cuales son cancerígenas, por
Azoreductasas que catalizan una nicotinamida adenina dinucleótido fosfato NAD (P) Reducción
dependiente de H [8]. Muchos colorantes de alimentos, medicamentos y textiles son colorantes
azoicos sulfonados, que son los tipos más frecuentes de colorantes químicos en uso [7]. Sudan I, II,
III y IV son una familia de colorantes azoicos solubles en aceite ampliamente utilizados en procesos
industriales para la fabricación de plásticos, tintas de impresión, ceras, cuero, telas y
abrillantadores Xoor [2, 4]. Estos tintes de Sudán están clasificados como carcinógenos de
categoría tres por la Agencia Internacional para la Investigación del Cáncer (IARC) [1]. Aunque los
tintes de Sudán no son legales para su uso en alimentos, Han sido encontrados como
contaminantes en el suministro de alimentos.
[4, 24, 26]. Se monitoriza el nivel de colorantes sudaneses en los alimentos.
por agencias internacionales de seguridad alimentaria. La reciente detección
de tintes de Sudán en diversos productos alimenticios, incluidos los calientes
Productos de chile, enfatiza la necesidad de evaluación toxicológica.
por las agencias reguladoras para determinar el impacto de
estos tintes en la salud humana [4, 24, 31]. La exposición humana a los colorantes azoicos ocurre
principalmente a través de la ingestión de alimentos contaminados con los colorantes. El tracto
gastrointestinal humano alberga un complejo y diverso microbiano.
Comunidad compuesta por varios miles de especies [16]. La microbiota intestinal humana
proporciona nutrición, regula
el desarrollo epitelial, instruye la inmunidad innata, actúa como una barrera para la colonización del
tracto intestinal por bacterias patógenas, y metaboliza los compuestos tanto de la dieta como los
producidos in situ [6, 7]. Estos microorganismos también desempeñan un papel clave en la
degradación de los colorantes azoicos, con reducción azoica.
siendo la reacción más crucial relacionada con la toxicidad y la mutagenicidad [8, 11, 12, 19, 30].
Las bacterias del ácido láctico son habitantes normales del aparato digestivo.
tractos de humanos y animales y juegan un papel importante en
Xenobióticos degradantes [20]. Los lactobacilos son bacterias facultativas anaerobias o
microaerofílicas del ácido láctico, estrictamente fermentativas y están presentes en todo el tracto
gastrointestinal [13]. El grupo de Lactobacillus representa 1 a 6% de la microbiota intestinal y es
esencial para el mantenimiento y la restauración de la salud humana, ya que proporciona funciones
metabólicas, nutricionales y de protección [15]. Lactobacillus acidophilus y L. fermentum son
lactobacilos predominantes en el intestino humano y se presentan
Propiedades probióticas [32]. Son los más industrialmente.
Especies importantes utilizadas en la fabricación de yogur y suplementos dietéticos [27]. L.
acidophilus se encuentra entre los más versátiles y
especies de lactobacilos de aplicación práctica, comúnmente utilizadas como
Cultura inicial. Se cree que la bacteria tiene un beneficio.
eVect en la salud humana y se encuentra en muchos productos probióticos
[23]. L. fermentum está comúnmente presente en los productos lácteos fermentados y ha sido
reconocido como uno de los microorganismos dominantes en las fermentaciones de masa
fermentada y en la preparación de muchos alimentos fermentados tradicionales [17, 22]. Los
colorantes azoicos se encuentran en muchos productos alimenticios fermentados con Lactobacillus,
algunos de los cuales tienen un riesgo potencial de estar contaminados con colorantes sudaneses
solubles en aceite. Aunque algunos informes describen la capacidad de algunas bacterias del ácido
láctico para degradar los colorantes azoicos solubles en agua [28], se sabe poco acerca de la
degradación de los colorantes azoicos solubles en aceite por las bacterias del ácido láctico. Además,
no se ha publicado ningún informe sobre la degradación de los colorantes azoicos por L. acidophilus
o L. fermentum.
El foco de nuestra investigación es investigar la biodegradación.

y la bioconversión de colorantes azoicos en productos alimenticios, medicamentos y cosméticos por

la microbiota comensal. Recientemente, demostramos que la microbiota intestinal humana puede
reducir los colorantes azoicos [33, 35]. Además, encontramos que los tintes de Sudán se degradan
para formar aminas aromáticas potencialmente cancerígenas [35] por las suspensiones fecales
humanas. En este estudio examinamos la capacidad de
L. acidophilus y L. fermentum para degradar los colorantes azoicos y
Analizó los metabolitos de la degradación bacteriana de Sudán III y IV mediante electropulverización
de cromatografía líquida.
ionización tándem espectrometría de masas

materiales y métodos
Productos quimicos
Rojo de metilo, Ponceau BS, Naranja G, Amaranto, Naranja II,
Direct Blue 15, Sudan I (1 - [(2,4-dimetilfenil) azo] -2 naftol), Sudan II (1 (fenilazo) -2naftol), Sudán III
(1- [4- (fenilazo) fenilazo) -2 -naftol), Sudán IV (o-tolyazo-
o-tolyazo-naftol), anilina y o-toluidina (2-metilanilina) se compraron en Sigma Chemical Co. Se
adquirió acetonitrilo en J.T. Panadero. El dimetilsulfóxido (DMSO) y el acetato de etilo se adquirieron
de Fisher ScientiWc Co. Soluciones madre de Red de metilo, Sudán
I, II, III y IV se hicieron disolviendo cada colorante en DMSO (1 mg / ml). Las estructuras químicas de
los colorantes se muestran en la Tabla 1.

Bacterias y condiciones de cultivo.

L. acidophilus ATCC 4356 y L. fermentum ATCC 23271
Se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC). Las cepas se conservaron para el
almacenamiento a largo plazo a 80 ° C en 10-15% de reservas de glicerol y se reavivaron como
necesario. Fueron cultivados rutinariamente en deMann – Rogosa–
Caldo Sharpe (MRS) o en medio de agar MRS (Becto Dickinson & Company) a 37 ° C bajo una
atmósfera anaeróbica de 91% de nitrógeno, 4% de hidrógeno y 5% de dióxido de carbono en una
cámara anaeróbica (Coy Laboratory Products, Inc.) [18]. L. acidophilus y L. fermentum se cultivaron
anaeróbicamente a 37ºC en caldo MRS suplementado con varios colorantes azoicos. Se cultivó un
bucle de cada cepa a 37 ° C durante 24 h en un Erlenmeyer Xask que contenía 100 ml de medio para
usar como cultivo iniciador. Los matraces que contenían 100 ml de caldo MRS se inocularon con 1,5
ml del cultivo de inóculo bacteriano. Las soluciones madre de colorantes azoicos se agregaron al
medio en concentraciones de Wnal de 6 g / ml (rojo de metilo y colorantes azoicos solubles en agua),
5 g / ml (Sudán I y II) y 1,5 g / ml (Sudán III). y IV) debido a la insolubilidad de la
Los tintes, especialmente los tintes de Sudán, y los cultivos se incubaron a 37 ° C en una cámara
anaeróbica durante 36 h sin agitación. Tres incubaciones de control que consistían en medio líquido
estéril, medio líquido estéril con bacterias y
Se usó medio líquido estéril con tintes para LC / ESI-MS /
MS análisis. Para el efecto del tinte de Sudán sobre el crecimiento de la bacteria, solo se incluyó un
control (sin tinte) en el experimento.

Ensayo de la decoloración de los colorantes azoicos por L. acidophilus.

y L. fermentum. Para las mediciones de decoloración de los tintes solubles en agua y rojo de metilo
(Ponceau BS, Orange G, Amaranth, Orange II y Direct Blue 15), las células en los cultivos fueron
eliminado por centrifugación a 6,000 £ g a 4 ° C durante 10 min.
La decoloración de los tintes se determinó midiendo
la absorción en la longitud de onda correspondiente para cada tinte (Tabla 2). Para medidas de
decoloración por aceite soluble.
Tintes de Sudán, se recogieron 3 muestras de 20 ml de los cultivos.
al final del tiempo de incubación y se extrajo dos veces con volúmenes iguales de acetato de etilo.
Los extractos se evaporaron en un evaporador rotatorio a 40 ° C, y la traza del disolvente restante
se eliminó mediante evaporación a temperatura ambiente durante la noche. Cada residuo se
disolvió en 4 ml de acetonitrilo y se filtró a través de una jeringa de 0,2 ml de agua. Se analizaron
muestras de 40 l con un cromatógrafo de líquidos de alto rendimiento (HPLC) Hewlett-Packard 1050
equipado con un Módulo detector de longitud de onda variable (longitudes de onda de detección).
fueron 250 y 500 nm), un inyector automático y una columna Luna C18 [2] de fase inversa (150 £
3.0 mm, tamaño de partícula 5 m,
Phenomenex) con una columna de protección (40 £ 3.0 mm, Phenomenex). La fase móvil estaba
compuesta por un gradiente lineal de acetonitrilo del 30% al 95% en H2O con ácido fórmico al 0,1%
durante 40 minutos. El área del pico se usó para calcular la concentración de los tintes de Sudán.
Reducción de los tintes de Sudán en el
Las culturas se determinaron directamente mediante el seguimiento de la desaparición.
del pico de absorción para cada tinte a 500 nm después de la extracción.

El curso temporal de la degradación del colorante en Sudán por L. acidophilus

y L. fermentum fue monitoreado usando HPLC y
LC / ESI-MS / MS, como se describe a continuación. Muestras (5-10 ml)
se recogieron asépticamente cada 4 h y se analizaron para determinar el crecimiento y la reducción
de los colorantes. Luego, se realizaron extracciones con acetato de etilo como se describe
anteriormente. Para determinar si los tintes de Sudán inhibían el crecimiento bacteriano, se
determinó la densidad bacteriana en los cultivos midiendo la densidad óptica (OD) de los cultivos a
OD600.

Ensayo de metabolitos formados a partir de la biodegradación de los tintes de Sudán por L.

acidophilus y L. fermentum.
Se realizó la identificación de los metabolitos de los tintes de Sudán.
utilizando un procedimiento similar al descrito anteriormente [35]. Los análisis de LC / ESI-MS / MS
se realizaron en el espectrómetro de masas ThermoFinnigan Quantum Ultra equipado con un HPLC
Agilent serie 1100 y un detector de matriz de diodos (DAD). La HPLC se realizó con una columna de
HPLC Prodigy ODS [3] 2.0 £ 250 mm 5 m 100 A (Phenomenex). El DAD fue escaneado desde 200 a
550 nm a 2.5 Hz. El espectrómetro de masas se hizo funcionar en el modo de ionización por
electropulverización de iones positivos (ESI) con un disociado de disociación inducida por colisión
(CID) de 0 V.
Otras condiciones de ESI fueron voltaje de pulverización 3.0 kV, capilar temperatura 350 ° C, gas de
envoltura 50 psi, gas de barrido iónico 1, y gas auxiliar 5. Para MS / MS, el gas de colisión de argón
se fijó en 1.5 mT; Q1 iones parentales se alternaron entre m / z 94, 108 y 160, con energías de
colisión a 30, 20 y 20 eV, respectivamente; y Q3 fue escaneado m / z 30¡170 / 0.5 s. Los patrones de
aminas aromáticas se recuperaron por extracción. Procedimiento con acetato de etilo, se seca, y
luego se disuelve en un buVer con acetonitrilo y ácido fórmico al 0,1% (5:95, v / v), respectivamente.
Otras muestras fueron tratadas de forma similar. Moda. Gran parte de la muestra seca era insoluble,
por lo que las muestras se tomaron por encima del precipitado. Para analisis de Metabolitos de
colorantes azoicos de Sudán, el buVer inicial se mantuvo durante 20 minutos, aumentó a acetonitrilo
y 0,1% de ácido fórmico (95: 5, v / v), respectivamente, a los 40 minutos, y se mantuvo a 70 minutos.
Los extractos de acetato de etilo de los caldos de incubación en los que L. acidophilus y L. fermentum
se incubaron con Sudán III y IV y se secaron. Los residuos se extrajeron con el buVer inicial y los
metabolitos solubles se analizaron por LC / ESI-MS / MS. Espectros de iones del producto, tiempos
de retención, y Los datos ultravioleta (UV) de los metabolitos se compararon con Los de compuestos
auténticos para la identificación.
Resultados
Reducción de los colorantes azoicos por L. acidophilus y L. fermentum
Se incluyeron varios colorantes mono y diazo solubles en agua y en aceite (Tabla 1) en los
experimentos de degradación. Después de 36 h de cultivo, todos los tintes azo solubles en agua se
redujeron en cierta medida en medio MRS por L. acidophilus y L. fermentum, lo que indicó que las
bacterias eran capaces de degradar los colorantes solubles en agua monoazo y diazo (Tabla 2). L.
acidophilus redujo el rojo de metilo y la naranja G mucho más rápido que L. fermentum. Sin
embargo, ambas especies redujeron Ponceau BS, Amaranth, Orange II y Direct Blue 15 a tasas
similares. La Tabla 2 muestra que L. acidophilus y L. fermentum fueron capaces de degradando los
colorantes diazoicos solubles en aceite Sudán III y IV a una concentración de 1,5 g / ml. Sin embargo,
ninguna cepa fue capaz de degradar los colorantes monoazoicos solubles en aceite Sudán I y II a una
concentración de 5 g / ml. Además, cuando la concentración de Sudán I y II en el medio se redujo a
1,5 g / ml, no se observó una reducción de los colorantes por parte de las bacterias.

Estudio en el transcurso del tiempo de la degradación de Sudán III y IV por L. acidophilus y L.

fermentum y efectos de los colorantes en el crecimiento de las bacterias.

La degradación de los contaminantes alimentarios de Sudán III y IV. por L. acidophilus y L.

fermentum se investigó con un experimento de curso temporal. L. acidophilus y L. fermentum se
inocularon en medio MRS en condiciones anaeróbicas para observar el efecto de estas dos especies
bacterianas en Decoloración de tintes de Sudán individuales (Fig. 1). Después de un retraso de 4 h,
Sudán III y IV comenzaron a reducirse por L. acidophilus. Sudán IV se redujo más rápidamente que
Sudán III. Aproximadamente el 65% de Sudán IV se degradó en 16 h, y el tinte desapareció
completamente después de 24 h (Fig. 1b). Sin embargo, solo el 49% de Sudán III se degradó en 16
h, y la bacteria tardó de 28 a 32 h en desaparecer por completo Los tintes diazo sudaneses a mayor
concentración (5 g / ml) no Inhibe significativamente el crecimiento de cepas. En un experimento
similar, la velocidad de crecimiento de las células bacterianas de L. acidophilus y L. fermentum no
se vio afectada por la presencia de Sudán I o II en el medio (no se muestra). Identificación de los
metabolitos de Sudán III y IV por L. acidophilus y L. fermentum utilizando LC / ESI-MS / MS El
metabolito de Sudán III se identificó como anilina, basado en un tiempo de retención de 4.1 min y
un espectro de masas de iones producto idéntico a El de la norma (Fig. 3a – c). La molécula
protonada a m / z 94 se fragmentó para dar iones a m / z 77 [MH + -17] y 51. El metabolito de Sudán
IV se identificó como o-toluidina en base a un tiempo de retención de 7,5 minutos y un producto de
masa iónica. espectro idéntico al estándar (Fig. 3d – f). La molécula protonada a m / z 108 se
fragmentó para dar iones a m / z 93 [MH + -15], 91 [MH + - 17], y 65. El 1-amino-2-naftol de todos
los tintes de Sudán analizados, 1,4-fenilendiamina de Sudán III y 2,5-diaminotueno de Sudán IV
(Tabla 1) no pudo detectarse en las muestras extraídas como demostrado en muestras inoculadas
con suspensión fecal humana [35]. Las áreas de las moléculas protonadas de los datos de LC / ESI-
MS / MS se utilizaron para determinar las cantidades de anilina y o-toluidina en cultivos a lo largo
del tiempo. Esto confirmó que las cantidades de anilina y o-toluidina aumentaron a medida que
Sudán III y IV, respectivamente, Desaparecidos (fig. 1).

Discusión
L. acidophilus y L. fermentum pudieron degradar los colorantes solubles en agua tanto monoazoicos
como diazoicos de una manera similar a la de Lactobacillus casei TISTR 1500 [28]. Anteriormente, se
demostró que los colorantes azoicos solubles en agua pueden moverse libremente en el medio,
pasar a través de las paredes celulares más fácilmente que los colorantes azoicos insolubles en agua,
y son degradados por las azoreductasas en varias otras bacterias [8]. L. acidophilus y L. fermentum
solo pudieron degradar los tintes diazo sudán III y IV, pero no los tintes monoazoudán I y II. Esto
implica que estas cepas pueden tener una preferencia por reducir el diazo soluble en aceite Sudán
colorantes sobre monoazo solubles en aceite colorantes de Sudán, que se diferencian de los
resultados observados con inóculos de suspensión fecal. Como un consorcio bacteriano, la
microbiota intestinal no solo fue capaz de reducir lentamente los colorantes diazo sudán III y IV, sino
también los colorantes monoazoudán I y II [35]. Los tintes de Sudán no fueron tóxicos para el
crecimiento de L. acidophilus y L. fermentum en las concentraciones probado, que es similar a los
resultados obtenidos con dos bacterias comensales humanas, Staphylococcus aureus [9] y
Enterococcus faecalis [10] en colorantes azoicos solubles en agua y reducir este tinte (Fig. 1a). La
diferencia en las tasas de degradación de Sudán III y IV por L. fermentum fue menos pronunciada,
ya que ambos colorantes se metabolizaron completamente en 24–28 h (fig. 1c, d). Para comprender
los efectos de Sudán III y IV sobre el crecimiento de L. acidophilus y L. fermentum, la densidad
bacteriana en el medio se determinó a 600 nm en varios intervalos de tiempo de 0 a 36 h (Fig. 2).
En el medio sin colorante de Sudán, se obtuvo la densidad celular máxima de L. acidophilus después
de 28 h. En el medio con Sudán III o IV. (1,5 g / ml), no se observó retraso en el crecimiento y se
alcanzó una densidad celular de Wnal similar a la de los tintes (Fig. 2a). En cultivos de L. fermentum
sin colorante, la densidad celular máxima se obtuvo después de 24 h. Se observó un pequeño retraso
en el crecimiento de 1 a 2 h en cultivos con Sudán III o IV, y las densidades de células de Wnal
alcanzaron el 95% de eso sin tinte (Fig. 2b). Las inhibiciones insignificantes en el crecimiento de L.
acidophilus y L. fermentum por los tintes de Sudán indicó que los colorantes no eran tóxicos para
las bacterias (Fig. 2) a baja concentración (1,5 g / ml). Además, a los resultados obtenidos con un
consorcio fecal humano en Sudán tintes [35]. Sudán III fue reducido por L. acidophilus y L.
fermentum, que resulta en la liberación de anilina (Figs. 1a, c, 3a, b). La anilina es considerada
peligrosa por su toxicidad. y carcinogenicidad [3, 5]. Animales experimentales que fueron Dosificado
con anilina en el alimento desarrollado cáncer del bazo. [34]. La exposición a anilina induce la
peroxidación lipídica y oxidación de proteínas en el bazo, y una asociación entre la liberación de
hierro libre y el daño del ADN oxidativo, lo que podría conducir a respuestas mutagénicas y / o
carcinogénicas en El bazo [34]. o-Toluidina (2-metilanilina), un metabolito El sudán IV producido por
L. acidophilus y L. fermentum (Figs. 1b, d, 3d, e) se metaboliza in vivo en varios compuestos, algunos
de los cuales son genotoxinas activas [1]. Induce aneuploidía tanto en hongos como en mamíferos.
Las células y también produce daño en el ADN y causa la transformación celular [21, 25]. Se ha
demostrado que la o-toluidina es un carcinógeno en ratones y ratas y se sospecha que es un
carcinógeno humano [29]. Tiene una amplia gama de efectos genéticos y es un clastógeno en la
exposición prolongada [14]. o-Toluidina tiene ha sido clasificado por la Agencia de Protección
Ambiental de los Estados Unidos (EPA) como un probable carcinógeno humano. En conclusión,
nuestros resultados demostraron que L. acidophilus y L. fermentum son capaces de degradar el
Sudzo III y IV soluble en aceite de diazo, produciendo aminas aromáticas potencialmente tóxicas.
Además, estas bacterias pueden degradar los tintes solubles en agua tanto monoazoicos como
diazoicos. Se necesitan más investigaciones sobre el mecanismo metabólico de los colorantes
azoicos en lactobacilos y los problemas de contaminación de los alimentos de los colorantes
sudaneses, junto con el potencial de producir metabolitos tóxicos.