Identificación de los genes Kpc2 y Kpc3 mediante el uso de

técnicas de biología molecular

Laura Daniela Quimbaya Sánchez. * Cristian Alejandro Tello Rodriguez*.
ctellor@unbosque.edu.co - lquimbayas@unbosque.edu.co
Universidad El Bosque, Programa de Bioingeniería, Facultad de Ingeniería, No 131 A, Av. 9 #131a2, Bogotá-
Colombia.
BlaKpc es uno de los genes implicados en la resistencia bacteriana del microorganismo Klebsiella pneumoniae,
esta resistencia es uno de los grandes problemas para la eficiencia de distintos fármacos, por esto se hace
impresindible el estudio del gen blaKPC implicado en dicha resistencia, con este fin se ha realizado inicialmente
su aislamiento, posteriormente se ha secuenciado y amplificado mediante el uso de la técnica PCR en conjunto
con electroforesis horizontal, seguido de esto se ha utilizado la enzima de restricción Rsa1 para la identificación
de blakpc 1 y blakpc2 mediante electroforesis horizontal. Se incluye los distintos métodos y técnicas de biología
molecular utilizados, así como los correspondientes resultados de los mismos, se presenta discusión de los
resultados obtenidos observando problemas y posibles causas, para finalizar se exponen algunas conclusiones
inferidas.
Objetivos:
General:
- Determinar la presencia del gen blaKPC en aislamientos Klebsiella pneumoinae resistentes a carbapenémicos.
Específicos:
- Identificar los genes blaKPC-2 o blaKPC-3 mediante restricción enzimática con Rsa1 y electroforesis horizontal.
- Cumplir con los cuidados pertinentes para evitar la contaminación tanto del ADN como de las enzimas utilizadas.
-

Uno de los problemas más serios y de mayor magnitud en el mundo, es la resistencia bacteriana.
Microorganismos como Klebsiella pneumoniaeha han cobrado gran importancia debido a su incremento
desproporcionado como agente causal de infecciones de tipo intrahospitalarias de difícil tratamiento, con
afectación muy variada, como: tracto urinario, pulmones, tejidos blandos, y sepsis.
La familia Enterobacteriaceae comprende en general el 50% de los aislamientos hechos en pacientes con
infecciones adquiridas en los hospitales, K. pneumoniae perteneciente a esta familia es una de las más
estudiadas y de mayor relevancia clínica, debido a su papel como agente etiológico de enfermedades
infecciosas oportunistas.
K. pneumoniae es una bacteria de forma bacilar, gramnegativa, anaerobia facultativa e inmóvil,
ampliamente esparcida en el ambiente, y presente de manera especial en las superficies mucosas de
mamíferos; en los seres humanos coloniza la nasofaringe y el tracto gastrointestinal. Es importante señalar
que la tasa de colonización se incrementa hasta tres veces en el ambiente hospitalario, en forma
directamente proporcional a la duración de la estancia y, especialmente, a la presión selectiva que ejercen
los antibióticos sobre la flora comensal.
Mecanismos de resistencia en bacterias Gram negativas:

Figura 1. Principales mecanismos de resistencia a los antibióticos. 1. Enzimas modificadoras (beta-lacta masas). 2.
Bombas de salida operan tomando el antibiótico del espacio periplásmico y expulsándolo al exterior, con lo cual
evitan que llegue a su sitio de acción. . 3. Cierre de porinas Estas son proteínas que forman canales llenos de agua
embebidos en la membrana externa que regulan la entrada de algunos elementos, entre ellos, los antibióticos. Los
cambios en su conformación pueden llevar a que la membrana externa no permita el paso de estos agentes al
espacio periplásmico. 4. Alteraciones en el sitio activo de los antibióticos. Las bacterias pueden alterar el sitio donde
el antibiótico se une a la bacteria para interrumpir una función vital de ésta.

http://www.scielo.org.co/pdf/inf/v12n3/v12n3a07.pdf

Una característica muy importante de K. pneumoniae es su alta resistencia a los antibióticos beta-
lactámicos, genes como: blaKpc- 2 y blaKpc-3 que difieren por un polimorfismo en su secuencia de DNA
(814C  814T), son de los más estudiados en la resistencia de esta bacteria principalmente por la
producción de beta-lactamasas, enzimas que hidrolizan el el anillo ß-lactámico de dichos medicamentos,
las de mayor interés son las beta-lactamasas de espectro extendido (BLEE) y las carbapenemasas.
 fig. inanctivacion de las Inactivación de los β-lactámicos por β-lactamasas (hidrolisis)
https://es.slideshare.net/jarconetti/tema-43-6797113

Al hidrolizar este anillo el antibiótico beta-lactámico pierde sus propiedades y es incapaz de unirse a las
proteínas captadoras de penicilina. Estas PBP tienen actividad en el ensamblaje final del peptidoglicano,
componente principal de la pared celular bacteriana, que es la estructura que le confiere turgencia a la
bacteria; cuando la pared se debilita la bacteria simplemente estalla.
http://www.scielo.org.co/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0121-07932010000300006

Conclusiones:
Se determinó la presencia del gen blacKpc mediante la utilización de PCR y electroforesis horizontal
Se observó que actualmente las técnicas de biología molecular han evolucionada notoriamente a tal punto
que se caracterizan por por su confiabilidad y rapidez en la obtención del resultado, buena robustez,
especificidad y sensibilidad, además de poder encontrar enzimas que ya vienen preparadas y listas para su
uso.
El uso técnicas moleculares permite el estudio de secuencias específicas de ADN cortas o largas con el
fin de detectar y analizar secuencias de interés como genes específicos, o hasta el diagnóstico de
enfermedades e identificación de genes, bacterias y virus
Para un Bioingeniería, el uso de técnicas de biología molecular, le permiten por ejemplo entender las
capacidades que posee un microorganismo para resistir a variedad de fármacos y con esto evaluar que otra
forma se podría atacar al mismo.
Concentracion del Gel (%) Tamaño de DNA (Kb)
0.50 1-30

0.75 0.8-12

1.00 0.5-12

1.25 0.4-7

1.50 0.2-3

2-5 0.01-0.5
hjbnbj
En esta figura a pesar de que se observa una leve movilización de los fragmentos cortados por la enzima Rsa1,
(aparición de bandas) no se observan las bandas referentes a los fragmentos de menor tamaño esto pudo ser
ocasionado por una concentración inadecuada de la agarosa utilizada para la preparación del gel, otra factor
que pudo haber causado tal resultado es el tiempo de electroforesis, en estos casos según lo dicta Robert
Kuhn, PhD, Universidad de California en Santa Cruz (EE.UU.) se debe aumentar el tiempo de electroforesis
pudiendo requerir menor voltaje,

http://biomodel.uah.es/an/plasmido/0/probl.htm
Otra conclusión que se pudo inferir es que tanto en los controles como en las muestras no toda la enzima de
restricción pudo cortar todas las secuencias de las muestras, por ello colocando como ejemplo el control
(CKPC-2), ha quedado una banda en la sección referente al tamaño de 785 pbs y otra en la sección de 744
pbs. de igual forma para (CKPC-3), se observa una banda en 785 secuancia que no fue cortada y otra banda
en 675 secuencia que si fue cortada.
También se puede notar que (CKPC-2), es semejante a la muestra 1 (m1) pudiendo ser esta también (CKPC-
2), de otro modo (CKPC-3), también es semjante a la muestra 3 (m3) pudiendo ser esta también (CKPC-3),