16/09/2019 Transformação de Bactérias

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TRANSFORMAÇÃO DE BACTÉRIAS

Bactérias Competentes:

1. Crescer 1 mL de bactérias (E.coli p.exemplo) em meio LB, sob agitação por 16-18 hrs a 37°C.
2. Inocular este 1 mL em 100 mL de meio LB colocar para crescer sobagitação a 37°C até atingir a densidade óptica de 0,3 A
600nM (+- 2-3 horas).
3. Centrifugar a cultura a 3200 g por 10 min a 4°C. Descartar o sobrenadante.
4. Ressuspender as células em 25 mL de CaCl2 100mM a 4°C. Incubar no gelo por 20 min.
5. Centrifugar por 3200 g por 10 min a 4°C. Descartar o sobrenadante.
6. Ressuspender em 5 mL de CaCl2 novamente e incubar por 1 hora no gelo.
7. Centrifugar nas mesmas condições e descartar o sobrenadante.
8. Ressuspender as células em 5 mL de CaCl2 100mM, glicerol 15%.
9. Fracionar em alíquotas de 100 uL em tubos eppendorf estéreis e congelar a -80°C.

Eletroporação:

Choque Térmico

1. Descongelar em gelo 1 eppendorf (uns 100 uL) de bactérias competentes que estão no freezer -80°C.
2. Misturar 400 ng do plasmídeo a ser inserido na bactéria. Incubar por 10 min no gelo.
3. Choque térmico: colocar no banho a 42°C por exatos 40 segundos.
4. Incubar no gelo por 10 minutos.
5. Adicionar 1 mL de meio SOC ou LB sem antibiótico.
6. Colocar as bactérias para crescer a 37°C, 200 rpm, por 1 hora.
7. Centrifugar por 1 min a 12000 rpm para pelletear as bactérias. Retirar 800 uL e ressuspender o pellet no restante do meio.
8. Plaquear todo o conteúdo em placa de agar com antibiótico (ampicilina 100 ug/mL) e colocar para crescer na estufa a 37°C
overnight.

Preparo das Soluções:

Meio SOC:
Triptona 20 g/L
Extrato de levedura 5 g/L
NaCl 0,5 g/L
KCl 2,5 mM
MgCl2 7 mM
Glicose 20 mM

Ajustar pH para 7,0.

Autoclavar por 15 min a 121°C.
Meio LB:
1g Triptona
0.5g Extrato de levedura
1g NaCl
100 ml H20 destilada qsq

Autoclavar por 15 min a 121°C.

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