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DIN EN 13727:2014-03

Nationales Vorwort
Dieses Dokument (EN 13727:2012+A1:2013) wurde von der Arbeitsgruppe 1 „Humanmedizin“ (Sekretariat:
DIN) des Technischen Komitees CEN/TC 216 „Chemische Desinfektionsmittel und Antiseptika“ (Sekretariat:
AFNOR, Frankreich) unter Beteiligung deutscher Experten ausgearbeitet.

Die Mitarbeit des DIN in der Arbeitsgruppe 1 des CEN/TC 216 wird über den Arbeitsausschuss
NA 063-04-07 AA „Chemische Desinfektionsmittel und Antiseptika in der Humanmedizin“ des Normen-
ausschusses Medizin (NAMed) wahrgenommen.

Änderungen

Gegenüber DIN EN 13727:2012-07 wurden folgende Änderungen vorgenommen:

a) die Liste der Änderungen im Vorwort wurde um die reduzierte Neutralisationszeit von 10 s bei Produkten
mit Einwirkzeit von 10 min oder weniger ergänzt;

b) in der Länderliste im Vorwort wurde um die ehemalige jugoslawische Republik Mazedonien und die
Türkei ergänzt;

c) in 5.4.2, 5.5.4.1 und 5.6.2.3 wurden die Verfahren zur Prüfung von gebrauchsfertigen Produkten
überarbeitet bzw. ergänzt;

d) in 5.6.2.2 wurden die Volumen für Membranfiltration und/oder Handwaschprodukte ergänzt;

e) in 5.6.2.4 wurden in den Beispielen a1 und a2 die Fehler in der Gleichung korrigiert;

f) in 5.8.2 wurde das Wort „hygienischen“ zweimal ergänzt;

g) in 5.9.2 wurde die lg-Reduktion von 3 auf 5 für die chirurgische Händewaschung korrigiert.

Frühere Ausgaben

DIN EN 13727: 2004-03, 2012-07

2
EUROPÄISCHE NORM EN 13727:2012+A1
EUROPEAN STANDARD
NORME EUROPÉENNE November 2013

ICS 11.080.20 Ersatz für EN 13727:2012

Deutsche Fassung

Chemische Desinfektionsmittel und Antiseptika —


Quantitativer Suspensionsversuch zur Bestimmung der
bakteriziden Wirkung im humanmedizinischen Bereich —
Prüfverfahren und Anforderungen (Phase 2, Stufe 1)

Chemical disinfectants and antiseptics — Antiseptiques et désinfectants chimiques —


Quantitative suspension test for the evaluation of Essai quantitatif de suspension pour l’évaluation
bactericidal activity in the medical area — de l’activité bactéricide en médecine —
Test method and requirements (phase 2, step 1) Méthode d’essai et prescriptions (Phase 2, Étape 1)

Diese Europäische Norm wurde vom CEN am 9. März 2012 angenommen und schließt Änderung 1, die am 14. Oktober 2013 vom CEN
angenommen wurde.

Die CEN-Mitglieder sind gehalten, die CEN/CENELEC-Geschäftsordnung zu erfüllen, in der die Bedingungen festgelegt sind, unter denen
dieser Europäischen Norm ohne jede Änderung der Status einer nationalen Norm zu geben ist. Auf dem letzten Stand befindliche Listen
dieser nationalen Normen mit ihren bibliographischen Angaben sind beim Management-Zentrum des CEN-CENELEC oder bei jedem CEN-
Mitglied auf Anfrage erhältlich.

Diese Europäische Norm besteht in drei offiziellen Fassungen (Deutsch, Englisch, Französisch). Eine Fassung in einer anderen Sprache,
die von einem CEN-Mitglied in eigener Verantwortung durch Übersetzung in seine Landessprache gemacht und dem Management-Zentrum
mitgeteilt worden ist, hat den gleichen Status wie die offiziellen Fassungen.

CEN-Mitglieder sind die nationalen Normungsinstitute von Belgien, Bulgarien, Dänemark, Deutschland, der ehemaligen jugoslawischen
Republik Mazedonien, Estland, Finnland, Frankreich, Griechenland, Irland, Island, Italien, Kroatien, Lettland, Litauen, Luxemburg, Malta,
den Niederlanden, Norwegen, Österreich, Polen, Portugal, Rumänien, Schweden, der Schweiz, der Slowakei, Slowenien, Spanien, der
Tschechischen Republik, der Türkei, Ungarn, dem Vereinigten Königreich und Zypern.

EUROPÄISCHES KOMITEE FÜR NORMUNG


EUROPEAN COMMITTEE FOR STANDARDIZATION
COMITÉ EUROPÉEN DE NORMALISATION

CEN-CENELEC Management-Zentrum: Avenue Marnix 17, B-1000 Brüssel

© 2013 CEN Alle Rechte der Verwertung, gleich in welcher Form und in welchem Ref. Nr. EN 13727:2012+A1:2013 D
Verfahren, sind weltweit den nationalen Mitgliedern von CEN vorbehalten.
DIN EN 13727:2014-03
EN 13727:2012+A1:2013 (D)

Inhalt
Seite

Vorwort ................................................................................................................................................................3
Einleitung .............................................................................................................................................................4
1 Anwendungsbereich .............................................................................................................................5
2 Normative Verweisungen ......................................................................................................................5
3 Begriffe ...................................................................................................................................................5
4 Anforderungen .......................................................................................................................................6
5 Prüfverfahren .........................................................................................................................................7
5.1 Kurzbeschreibung .................................................................................................................................7
5.2 Materialien und Reagenzien .................................................................................................................7
5.2.1 Prüfkeime................................................................................................................................................7
5.2.2 Kulturmedien und Reagenzien .............................................................................................................8
5.3 Apparate und Glasgeräte ....................................................................................................................10
5.3.1 Allgemeines ..........................................................................................................................................10
5.3.2 Übliche mikrobiologische Laborausrüstung ...................................................................................11
5.4 Herstellung der Prüfkeimsuspensionen und der Produktprüflösungen........................................12
5.4.1 Prüfkeimsuspensionen (Prüf- und Validierungssuspension) .........................................................12
5.4.2 Produktprüflösungen ..........................................................................................................................14
5.5 Verfahrensablauf zur Beurteilung der bakteriziden Wirkung des Produkts ..................................14
5.5.1 Allgemeines ..........................................................................................................................................14
5.5.2 Verdünnungs-Neutralisations-Verfahren .........................................................................................16
5.5.3 Membranfiltrationsverfahren .............................................................................................................18
5.5.4 Modifiziertes Verfahren für gebrauchsfertige Produkte .................................................................20
5.6 Versuchsdaten und Berechnung .......................................................................................................22
5.6.1 Erläuterung von Begriffen und Abkürzungen ...................................................................................22
5.6.2 Berechnung ..........................................................................................................................................22
5.7 Verifizierung des Verfahrens ..............................................................................................................27
5.7.1 Allgemeines ..........................................................................................................................................27
5.7.2 Kontrolle der gewichteten mittleren Keimzahlen .............................................................................27
5.7.3 Grundlegende Grenzwerte ..................................................................................................................28
5.8 Angabe der Ergebnisse und Präzision ..............................................................................................28
5.8.1 Keimreduktion ......................................................................................................................................28
5.8.2 Kontrolle der wirksamen und der unwirksamen Produktprüflösung (5.4.2) .................................29
5.8.3 Limitierender Prüfkeim und bakterizide Konzentration ...................................................................29
5.8.4 Präzision, Wiederholungen.................................................................................................................29
5.9 Interpretation der Ergebnisse — Schlussfolgerung ........................................................................29
5.9.1 Allgemeines ..........................................................................................................................................29
5.9.2 Bakterizide Wirkung von Produkten zur Händedesinfektion und Händewaschung .....................29
5.9.3 Bakterizide Wirkung von Produkten zur Instrumentendesinfektion ..............................................30
5.9.4 Bakterizide Wirkung von Produkten zur Oberflächendesinfektion ................................................30
5.9.5 Qualitätsnachweis für bestimmte Anwendungsgebiete ..................................................................30
5.10 Prüfbericht ............................................................................................................................................30
Anhang A (informativ) Referenzstämme in nationalen Sammlungen ..........................................................32
Anhang B (informativ) Neutralisationsmedien und Spülflüssigkeiten ........................................................33
Anhang C (informativ) Graphische Darstellung der Prüfverfahren ..............................................................35
Anhang D (informativ) Beispiel eines typischen Prüfberichts .....................................................................43
Anhang E (informativ) Präzision des Prüfergebnisses .................................................................................47
Anhang ZA (informativ) Zusammenhang zwischen dieser Europäischen Norm und den
grundlegenden Anforderungen der EU-Richtlinie 93/42/EWG ........................................................50
Literaturhinweise ..............................................................................................................................................51

2
DIN EN 13727:2014-03
EN 13727:2012+A1:2013 (D)

Vorwort
Dieses Dokument (EN 13727:2012+A1:2013) wurde vom Technischen Komitee CEN/TC 216 „Chemische
Desinfektionsmittel und Antiseptika“ erarbeitet, dessen Sekretariat vom AFNOR gehalten wird.

Diese Europäische Norm muss den Status einer nationalen Norm erhalten, entweder durch Veröffentlichung
eines identischen Textes oder durch Anerkennung bis Mai 2014, und etwaige entgegenstehende nationale
Normen müssen bis Mai 2014 zurückgezogen werden.

Es wird auf die Möglichkeit hingewiesen, dass einige Elemente dieses Dokuments Patentrechte berühren
können. CEN [und/oder CENELEC] sind nicht dafür verantwortlich, einige oder alle diesbezüglichen
Patentrechte zu identifizieren.

Dieses Dokument enthält die Änderung A1, die vom CEN am 2013-10-14 angenommen wurde.

Dieses Dokument ersetzt EN 13727:2012.

Anfang und Ende der durch die Änderung eingefügten oder geänderten Texte sind jeweils durch
Änderungsmarken !" angegeben.

Dieses Dokument wurde unter einem Mandat erarbeitet, das die Europäische Kommission und die
Europäische Freihandelszone dem CEN erteilt haben, und unterstützt grundlegende Anforderungen der
EU-Richtlinien.

Zum Zusammenhang mit EU-Richtlinien siehe informativen Anhang ZA, der Bestandteil dieses Dokuments ist.

Dieses Dokument wurde überarbeitet, um dieses an den letzten Stand der Wissenschaften anzupassen,
Fehler und Mehrdeutigkeiten zu korrigieren, es mit der Struktur und dem Wortlaut der anderen existierenden
und in Vorbereitung befindlichen Prüfmethoden des CEN/TC 216 zu harmonisieren, die Lesbarkeit zu
verbessern und dadurch den Text besser verständlich zu machen. Nachfolgenden werden die wesentlichen
technischen Änderungen seit der letzten Ausgabe aufgelistet:
Der Anwendungsbereich wurde auf die folgenden Anwendungsfelder im medizinischen Bereich erweitert;
auf Produkte für die chirurgische und/oder hygienische Händewaschung und/oder Händedesinfektion
sowie auf Produkte für andere Flächen als Instrumentenflächen.
„Obligatorische Prüfbedingungen“ wurden durch „Mindestprüfbedingungen“ (Prüftemperatur und
Einwirkzeit können in Grenzen beliebig ausgewählt werden), die zum Bestehen einer Prüfung absolviert
werden müssen, ersetzt.
Eine zusätzlich modifizierte Methode zur Prüfung von gebrauchsfertigen Produkten mit einer höheren
Konzentration als 80 %, z. B. 97 %, wurde beschrieben.
Der Anhang ZA wurde neu formuliert, um eine genauere Beschreibung der Beziehung zur
Medizinproduktrichtlinie zu geben.
!Die Neutralisationszeit wurde auf 10 s reduziert für Produkte mit einer Einwirkzeit von 10 min oder
weniger."

!Daten, die auf Grundlage einer früheren Ausgabe der EN 13727 erlangt wurden, können weiter verwendet
werden, wenn die Neutralisationszeit von 10 s für alle Produkte mit einer Einwirkzeit von 10 min oder weniger
ausreichend nachgewiesen wurde. Daten, die auf Grundlage der prEN 12054 erlangt wurden, dürfen nicht
verwendet werden, da dieses Normungsprojekt 2001 beendet wurde."

Entsprechend der CEN-CENELEC-Geschäftsordnung sind die nationalen Normungsinstitute der folgenden


Länder gehalten, diese Europäische Norm zu übernehmen: Belgien, Bulgarien, Dänemark, Deutschland, die
ehemalige jugoslawische Republik Mazedonien, Estland, Finnland, Frankreich, Griechenland, Irland, Island,
Italien, Kroatien, Lettland, Litauen, Luxemburg, Malta, Niederlande, Norwegen, Österreich, Polen, Portugal,
Rumänien, Schweden, Schweiz, Slowakei, Slowenien, Spanien, Tschechische Republik, Türkei, Ungarn,
Vereinigtes Königreich und Zypern.

3
DIN EN 13727:2014-03
EN 13727:2012+A1:2013 (D)

Einleitung
Diese Europäische Norm legt einen Suspensionsversuch fest zur Feststellung, ob ein chemisches
Desinfektionsmittel oder ein Antiseptikum in den im Anwendungsbereich beschriebenen Bereich und Gebieten
eine bakterizide Wirkung aufweist.

Dieser Laboratoriumsversuch berücksichtigt praktische Anwendungsbedingungen des Produkts, zu denen die


Einwirkzeit, die Temperatur, die Prüfkeime und die Belastungssubstanzen gehören, d. h. Bedingungen, die
dessen Wirkung in praktischen Situationen beeinflussen können. Jede durch diese Prüfung ermittelte
Gebrauchskonzentration des chemischen Desinfektionsmittels oder Antiseptikums entspricht den gewählten
Versuchsbedingungen.

4
DIN EN 13727:2014-03
EN 13727:2012+A1:2013 (D)

1 Anwendungsbereich
Diese Europäische Norm legt ein Prüfverfahren für und die Mindestanforderungen an die bakterizide Wirkung
von chemischen Desinfektionsmitteln und Antiseptika fest, die bei Verdünnung mit Wasser standardisierter
Härte als homogene, physikalisch stabile Zubereitung vorliegen, bzw. bei gebrauchsfertigen Produkten bei der
Verdünnung mit Wasser. Die Produkte können nur bei einer Konzentration von 80 % oder weniger (97 % bei
einem modifizierten Verfahren für Sonderfälle) geprüft werden, da durch Zugabe der Prüfkeime und der
Belastungssubstanz immer eine gewisse Verdünnung bewirkt wird.

Diese Europäische Norm gilt für Produkte, die im medizinischen Bereich auf den Gebieten der hygienischen
Händedesinfektion, hygienischen Händewaschung, chirurgischen Händedesinfektion, chirurgischen Hände-
waschung, Instrumentendesinfektion durch Eintauchen und Oberflächendesinfektion durch Abwischen,
Besprühen, Überfluten oder auf sonstige Weise verwendet werden.

Diese Europäische Norm gilt für Bereiche und unter Bedingungen, wo eine Desinfektion oder Antiseptik aus
medizinischen Gründen angezeigt ist. Indikationen dieser Art liegen z. B. bei der Patientenbetreuung in:

Krankenhäusern, kommunalen medizinischen Einrichtungen und im Dentalbereich;

medizinischen Einrichtungen in Schulen, Kindergärten und Heimen;

vor und können auch am Arbeitsplatz und im häuslichen Bereich gegeben sein. Eingeschlossen sein können
auch Einrichtungen wie Wäschereien und Küchen, die der direkten Versorgung der Patienten dienen.

ANMERKUNG 1 Das beschriebene Verfahren dient zur Bestimmung der Wirkung handelsüblicher Zubereitungen oder
Wirkstoffe unter den Bedingungen, unter denen sie angewendet werden.

ANMERKUNG 2 Dieses Verfahren entspricht einer Prüfung der Phase 2, Stufe 1.

ANMERKUNG 3 Dieses Verfahren kann nicht angewendet werden, um die Wirkung von Produkten gegen Legionella in
wasserführenden Systemen, gegen Mykobakterien und bakterielle Sporen zu bewerten.

EN 14885 legt im Einzelnen die Beziehung der verschiedenen Prüfungen untereinander sowie zu den
„Anwendungsempfehlungen“ fest.

2 Normative Verweisungen
Die folgenden Dokumente, die in diesem Dokument teilweise oder als Ganzes zitiert werden, sind für die
Anwendung dieses Dokuments erforderlich. Bei datierten Verweisungen gilt nur die in Bezug genommene
Ausgabe. Bei undatierten Verweisungen gilt die letzte Ausgabe des in Bezug genommenen Dokuments
(einschließlich aller Änderungen).

EN 12353, Chemische Desinfektionsmittel und Antiseptika — Aufbewahrung von Testorganismen für die
Prüfung der bakteriziden (einschließlich Legionella), mykobakteriziden, sporiziden, fungiziden und viruziden
(einschließlich Bakteriophagen) Wirkung

EN 14885, Chemische Desinfektionsmittel und Antiseptika — Anwendung Europäischer Normen für


chemische Desinfektionsmittel und Antiseptika

3 Begriffe
Für die Anwendung dieses Dokuments gelten die Begriffe nach EN 14885.

5
DIN EN 13727:2014-03
EN 13727:2012+A1:2013 (D)

4 Anforderungen
Bei Prüfung in Übereinstimmung mit Tabelle 1 und Abschnitt 5 muss für das Produkt eine dezimal-
logarithmische Reduktion (lg) um mindestens fünf Stufen (bei der hygienischen Händewaschung eine
lg-Reduktion um mindestens 3 Stufen) nachgewiesen werden.

Tabelle 1 — Mindest- und zusätzliche Prüfbedingungen

Prüfbedingungen Hygienische Chirurgische Instrumenten- Oberflächen-


Händedesinfektion Händedesinfektion desinfektion desinfektion
und und Händewaschung
Händewaschung
Mindestspektrum P. aeruginosa, P. aeruginosa, P. aeruginosa, P. aeruginosa,
von Prüfkeimen S. aureus, S. aureus, S. aureus, S. aureus,
E. hirae, E. hirae, E. hirae, E. hirae
E. coli K12 E. coli K12 wenn die Temperatur
40 °C oder mehr
beträgt: nur E. faecium
zusätzlich Jeder zutreffende Prüfkeim
Prüftemperatur entsprechend der Empfehlung des Herstellers, jedoch zwischen
20 °C und 20 °C 20 °C und 20 °C 20 °C und 70 °C 4 °C und 30 °C
Einwirkzeit entsprechend der Empfehlung des Herstellers
jedoch zwischen jedoch nicht länger als
30 s und 60 s 1 min und 5 min 60 min 5 min oder 60 mina
Belastungssubstanz
Bedingungen 0,3 g/l Rinderserum- 0,3 g/l Rinderserum- 0,3 g/l Rinderserum- 0,3 g/l Rinderserum-
niedriger Belastung albuminlösung albuminlösung albuminlösung albuminlösung
(hygienische (chirurgische und/oder und/oder
Händedesinfektion)b Händedesinfektion)b
Bedingungen 3,0 g/l Rinderserum- 3,0 g/l Rinderserum- 3,0 g/l Rinderserum- 3,0 g/l Rinderserum-
hoher Belastung albuminlösung plus albuminlösung plus albuminlösung plus albuminlösung plus
3,0 ml/l Erythrozyten 3,0 ml/l Erythrozyten 3,0 ml/l Erythrozyten 3,0 ml/l Erythrozyten
(hygienische (chirurgische
Händewaschung)c Händewaschung)c
zusätzlich niedrige oder hohe niedrige oder hohe jede zutreffende jede zutreffende
Belastung; Belastung; Substanz Substanz
jede zutreffende jede zutreffende
Substanz Substanz
a Die in dieser Tabelle angegebenen Einwirkzeiten für Oberflächendesinfektionsmittel werden auf der Grundlage der praktischen
Anwendungsbedingungen des Produkts ausgewählt. Die empfohlene Einwirkzeit für die Anwendung des Produkts liegt in der
Verantwortung des Herstellers. Produkte, die zur Desinfektion von Oberflächen vorgesehen sind, die wahrscheinlich mit dem
Patienten und/oder dem medizinischen Personal in Kontakt kommen, und Oberflächen, die häufig von verschiedenen Personen
berührt werden, was zu einer Übertragung von Mikroorganismen auf den Patienten führt, sind mit einer Einwirkzeit von höchstens
5 min zu prüfen. Das Gleiche gilt für Fälle, bei denen die Einwirkzeit des Produktes aus praktischen Gründen begrenzt sein muss.
Produkte für alle weiteren, als die oben angeführten Oberflächen dürfen mit einer Einwirkzeit von höchstens 60 min geprüft
werden.
b Die Mittel für die hygienische und chirurgische Händedesinfektion müssen mindestens unter den Bedingungen niedriger Belastung
geprüft werden.
c Die Mittel für die hygienische und chirurgische Händewaschung müssen mindestens unter den Bedingungen hoher Belastung
geprüft werden.
ANMERKUNG Für die zusätzlichen Bedingungen kann die als ein Ergebnis festgelegte Konzentration geringer sein
als eine unter den Mindestprüfbedingungen erhaltene Konzentration.

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DIN EN 13727:2014-03
EN 13727:2012+A1:2013 (D)

5 Prüfverfahren

5.1 Kurzbeschreibung

5.1.1 Einer Prüfsuspension von Bakterien in einer Lösung einer Belastungssubstanz wird eine Probe des
Produkts im Lieferzustand und/oder des mit Wasser standardisierter Härte (oder Wasser bei gebrauchs-
fertigen Produkten) verdünnten Produkts gegeben. Das Gemisch wird bei einer der in Abschnitt 4 und 5.5.1.1
festgelegten Temperaturen und Einwirkzeiten gehalten. Nach dem Ende dieser Einwirkzeit wird ein aliquoter
Anteil entnommen; die bakterizide und/oder bakteriostatische Wirkung in dieser Probenmenge wird sofort
nach einem validierten Verfahren neutralisiert oder unterdrückt. Das Verfahren der Wahl ist das Verdünnungs-
Neutralisations-Verfahren. Wenn kein geeignetes Neutralisationsmedium gefunden werden kann, wird die
Membranfiltration angewendet. Die Anzahl der überlebenden Bakterien wird in jeder Probe bestimmt und die
Keimreduktion berechnet.

ANMERKUNG Handwaschprodukte werden immer mit Wasser standardisierter Härte (5.2.2.7) vorverdünnt. Die sich
ergebende Lösung wird als gebrauchsfertiges Produkt (5.4.2) angesehen.

5.1.2 Die Prüfung wird unter Verwendung von Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus,
Enterococcus hirae und bei bestimmten Produktarten mithilfe von Escherichia coli K12 als Prüfkeime
durchgeführt (Abschnitt 4, Tabelle 1).

5.1.3 Andere Einwirkzeiten und Temperaturen können innerhalb bestimmter in Abschnitt 4, Tabelle 1
festgelegter Grenzen verwendet werden. Zusätzliche Belastungssubstanzen und Prüfkeime dürfen verwendet
werden.

5.2 Materialien und Reagenzien

5.2.1 Prüfkeime

Die bakterizide Wirkung ist unter Verwendung der folgenden als Prüfkeime ausgewählten Stämme nach
Abschnitt 4 (Tabelle 1) zu bewerten 1):

a) Escherichia coli K12, NCTC 10538;

b) Pseudomonas aeruginosa, ATCC 15442;

c) Staphylococcus aureus, ATCC 6538;

d) Enterococcus hirae, ATCC 10541;

e) Enterococcus faecium, ATCC 6057.

ANMERKUNG Zum Verweis auf Stämme in einigen anderen Kultursammlungen siehe Anhang A.

Die geforderte Bebrütungstemperatur für diese Prüfkeime beträgt (36 1) °C oder (37 1) °C (5.3.2.3). Die
gleiche Temperatur (entweder 36 °C oder 37 °C) ist für alle Bebrütungen während einer Prüfung und deren
Kontrolle und Validierung anzuwenden.

Wenn zusätzliche Prüfkeime verwendet werden, sind diese unter den im Prüfbericht vermerkten optimalen
Wachstumsbedingungen (Temperatur, Dauer, Atmosphäre, Medien) zu bebrüten. Wenn die ausgewählten
zusätzlichen Prüfkeime nicht den festgelegten Stämmen entsprechen, ist deren Eignung zur Bereitstellung der
geforderten Inokula zu verifizieren. Wenn diese zusätzlichen Prüfkeime nicht an einem Referenzzentrum
klassifiziert wurden, sind deren Identifizierungsmerkmale anzugeben. Darüber hinaus müssen sie von dem
Prüflaboratorium oder der nationalen Kultursammlung für fünf Jahre als Referenzprobe zurückgestellt werden.

1) Die NCTC- und ATTC-Nummern sind die Sammlungsnummern von Stämmen, die von diesen Kultursammlungen
geliefert werden. Diese Information dient lediglich zur Unterrichtung der Anwender dieser Europäischen Norm und
bedeutet keine Anerkennung des genannten Produkts durch CEN.

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DIN EN 13727:2014-03
EN 13727:2012+A1:2013 (D)

5.2.2 Kulturmedien und Reagenzien

5.2.2.1 Allgemeines

Alle in dieser Europäischen Norm angegebenen Massen chemischer Substanzen beziehen sich auf die
wasserfreien Salze. Hydratisierte Formen dürfen als Alternative verwendet werden, aber die erforderlichen
Massen müssen angepasst werden, um daraus folgende Differenzen in den relativen Molekülmassen zu
berücksichtigen

Die Reagenzien müssen analysenrein und/oder für mikrobiologische Zwecke geeignet sein. Sie müssen frei
von Substanzen sein, die toxisch oder hemmend auf die Prüfkeime wirken.
ANMERKUNG 1 Zur Verbesserung der Reproduzierbarkeit wird empfohlen, dass zur Herstellung von Kulturmedien
handelsübliche wasserfreie Materialien verwendet werden. Die Anweisungen des Herstellers zur Verarbeitung dieser
Erzeugnisse sollten genau befolgt werden.

ANMERKUNG 2 Für jedes Kulturmedium und Reagens sollte eine zeitliche Begrenzung der Verwendung festgelegt
werden.

Alle festgelegten pH-Werte werden bei (20 1) °C gemessen.

5.2.2.2 Wasser

Das Wasser muss frisch in einer Glasapparatur destilliertes und darf nicht entmineralisiertes Wasser sein.
Falls kein destilliertes Wasser geeigneter Qualität zur Verfügung steht, darf Wasser für Injektionszwecke
(siehe Literaturhinweis [1]) verwendet werden.

Die Sterilisation erfolgt im Autoklaven [5.3.2.1 a)]. Die Sterilisation ist nicht erforderlich, falls das Wasser z. B.
für die Herstellung von Kulturmedien verwendet und anschließend sterilisiert wird.
ANMERKUNG Hinsichtlich des Verfahrens zur Herstellung von Wasser standardisierter Härte siehe 5.2.2.7.

5.2.2.3 Caseinpepton-Sojamehlpepton-Agar (Trypton-Soja-Agar (TSA))

Trypton-Soja-Agar, bestehend aus:

Trypton, tryptisch verdautes Casein 15,0 g

Sojapepton, Papain-Aufschluss von Sojabohnenmehl 5,0 g

Natriumchlorid (NaCl) 5,0 g

Agar 15,0 g

Wasser (5.2.2.2) bis auf 1 000,0 ml

Die Sterilisation erfolgt im Autoklaven [5.3.2.1 a)]. Nach der Sterilisation muss der pH-Wert (5.3.2.4) des
Mediums 7,2 0,2 betragen.
ANMERKUNG Wenn Probleme mit der Neutralisation (5.5.1.2 und 5.5.1.3) auftreten, ist es möglicherweise erforderlich,
dem TSA Neutralisationsmedium zuzusetzen. Anhang B enthält eine Anleitung zu Neutralisationsmedien, die verwendet
werden dürfen. Es wird empfohlen, kein Neutralisationsmedium zu verwenden, das zu einer Trübung im Agar führt.

5.2.2.4 Verdünnungsmittel

Trypton-Natriumchlorid-Lösung, bestehend aus:

Trypton, tryptisch verdautes Casein 1,0 g


Natriumchlorid 8,5 g
Wasser (5.2.2.2) bis auf 1 000,0 ml
Die Sterilisation erfolgt im Autoklaven [5.3.2.1 a)]. Nach der Sterilisation muss der pH-Wert (5.3.2.4) des
Verdünnungsmittels 7,0 0,2 betragen.

8
DIN EN 13727:2014-03
EN 13727:2012+A1:2013 (D)

5.2.2.5 Neutralisationsmedium

Das Neutralisationsmedium muss für das zu prüfende Produkt nach 5.5.1.2, 5.5.1.3 und 5.5.2 validiert sein.
Das Neutralisationsmedium muss steril sein.
ANMERKUNG In Anhang B sind Angaben zu Neutralisationsmedien angeführt, die sich für einige Arten von Produkten
als geeignet erwiesen haben.

5.2.2.6 Spülflüssigkeit (für die Membranfiltration)

Die Spülflüssigkeit muss für das zu prüfende Produkt nach 5.5.1.2, 5.5.1.3 und 5.5.3 validiert sein. Sie muss
steril, mit der Filtermembran kompatibel und unter den in 5.5.3 beschriebenen Prüfbedingungen durch die
Filtermembran filtrierfähig sein.
ANMERKUNG In Anhang B sind Angaben zu Spülflüssigkeiten angeführt, die sich für einige Arten von Produkten als
geeignet erwiesen haben.

5.2.2.7 Wasser standardisierter Härte zur Verdünnung der Produkte

Die Vorgehensweise bei der Herstellung von 1 l Wasser standardisierter Härte ist wie folgt:

Herstellung von Lösung A: Es werden 19,84 g Magnesiumchlorid (MgCl2) und 46,24 g Calciumchlorid
(CaCl2) in Wasser (5.2.2.2) gelöst und auf 1 000 ml aufgefüllt. Die Sterilisation erfolgt durch Membran-
filtration (5.3.2.7) oder im Autoklaven [5.3.2.1 a)]. Sofern das Autoklavieren angewendet wird, kann dies
zu einem Flüssigkeitsverlust führen. In diesem Fall ist mit Wasser (5.2.2.2) unter aseptischen
Bedingungen auf 1 000 ml aufzufüllen. Die Lösung lässt sich im Kühlschrank (5.3.2.8) bis zu einem
Monat aufbewahren.

Herstellung Lösung B: Es werden 35,02 g Natriumhydrogencarbonat (NaHCO3) in Wasser (5.2.2.2)


gelöst und auf 1 000 ml aufgefüllt. Die Lösung wird durch Membranfiltration (5.3.2.7) sterilisiert. Die
Lösung lässt sich im Kühlschrank (5.3.2.8) bis zu einer Woche aufbewahren.

600 ml bis 700 ml Wasser (5.2.2.2) werden in einen 1 000-ml-Messkolben (5.3.2.12) gegeben, dazu
gegeben werden 6,0 ml (5.3.2.9) Lösung A und danach 8,0 ml Lösung B. Nach Durchmischen wird mit
Wasser (5.2.2.2) auf 1 000 ml aufgefüllt. Der pH-Wert des Wassers standardisierter Härte muss 7,0 ! 0,2
betragen (5.3.2.4). Falls erforderlich, wird der pH-Wert mittels einer Lösung von etwa 40 g/l (etwa 1 mol/l)
Natriumhydroxid (NaOH) oder etwa 36,5 g/l (etwa 1 mol/l) Salzsäure (HCl) eingestellt.

Das Wasser standardisierter Härte ist unter aseptischen Bedingungen frisch herzustellen und innerhalb von
12 h zu verbrauchen.
ANMERKUNG Bei Herstellung der Produktprüflösungen (5.4.2) führt die Zugabe des Produkts zum Wasser
standardisierter Härte zu einer unterschiedlichen endgültigen Wasserhärte in jedem Reagenzglas. In jedem Fall liegt die
endgültige Wasserhärte, angegeben als Calciumcarbonat (CaCO3), im Reagenzglas unter 375 mg/l.

5.2.2.8 Belastungssubstanz

5.2.2.8.1 Allgemeines

Die Belastungssubstanz muss nach den für das Produkt festgelegten Anwendungsbedingungen ausgewählt
werden.

Die Belastungssubstanz muss steril sein und in einer Konzentration hergestellt werden, die dem 10-Fachen
der in der Prüfung verwendeten Endkonzentration entspricht (dem 50-Fachen im Falle der modifizierten
Methode, 5.2.2.8.4).

Die Ionenzusammensetzung (z. B. pH-Wert, Calcium- und/oder Magnesiumhärte) und die chemische
Zusammensetzung (z. B. Mineralstoffe, Proteine, Kohlenhydrate, Lipide und Detergenzien) müssen festgelegt
sein.
ANMERKUNG Der Begriff „Belastungssubstanz“ wird auch dann verwendet, wenn es sich um mehrere Substanzen
handelt.

9
DIN EN 13727:2014-03
EN 13727:2012+A1:2013 (D)

5.2.2.8.2 Bedingungen niedriger Belastung (Rinderserumalbuminlösung — geringe Konzentration)

In 100 ml Verdünnungsmittel (5.2.2.4) werden 0,30 g Rinderserumalbumin Fraktion V (für mikrobiologische


Zwecke geeignet) gelöst.

Die Sterilisation erfolgt durch Membranfiltration (5.3.2.7), die Lösung ist in einem Kühlschrank (5.3.2.8)
aufzubewahren und innerhalb von einem Monat zu verbrauchen.

Die Endkonzentration des Rinderserumalbumins in dem Prüfverfahren (5.5) muss 0,3 g/l betragen.

5.2.2.8.3 Bedingungen hoher Belastung (Gemisch von Rinderserumalbuminlösung in hoher


Konzentration mit Schaf-Erythrozyten)

In 97 ml Verdünnungsmittel (5.2.2.4) werden 3,00 g Rinderserumalbumin Fraktion V (für mikrobiologische


Zwecke geeignet) gelöst.

Die Sterilisation erfolgt durch Membranfiltration (5.3.2.7).

Es werden mindestens 8,0 ml frisches defibriniertes Schafsblut (5.2.2.9) hergestellt. Die Erythrozyten werden
bei 800 gN für 10 min (5.3.2.13) abzentrifugiert. Nach Verwerfen des Überstandes werden die Erythrozyten in
Verdünnungsmittel (5.2.2.4) resuspendiert. Dieser Vorgang wird mindestens dreimal wiederholt, bis der
Überstand farblos ist.

3 ml der angereicherten (gepackten) Schaf-Erythrozyten werden in den 97 ml sterilisierter Rinderserum-


albuminlösung (siehe oben) resuspendiert. Um eine spätere Kontamination zu verhindern, sollte dieses
Gemisch in Portionen aufgeteilt werden, die wahrscheinlich an einem Tag verwendet werden, und in
gesonderten Behältern in einem Kühlschrank (5.3.2.8) für höchstens 7 Tage gelagert werden.

Die Endkonzentration des Rinderserumalbumins und der Schaf-Erythrozyten im Prüfverfahren (5.5) muss 3 g/l
bzw. 3 ml/l betragen.

5.2.2.8.4 Bedingungen geringer und hoher Belastung bei dem modifizierten Verfahren für
gebrauchsfertige Produkte (5.5.4)

Es sind die Verfahrensweisen zum Herstellen nach 5.2.2.8.2 und 5.2.2.8.3 einzuhalten, die
Belastungssubstanz ist jedoch in einer fünffach höheren Konzentration herzustellen, für die Bedingungen
hoher Belastung höchstens 50 ml um Probleme bei der Filtration zu vermeiden.

a) Bedingungen geringer Belastung (5.2.2.8.2) — 1,50 g Rinderserumalbumin (anstelle von 0,3 g) werden in
100 ml Verdünnungsmittel gelöst;

b) Bedingungen hoher Belastung (5.2.2.8.3) — 7,5 g Rinderserumalbumin (anstelle von 1,5 g) werden in
42,5 ml Verdünnungsmittel (anstelle von 48,5 ml) gelöst. Es ist mindestens 20 ml (anstelle von 4,0 ml)
Schafsblut herzustellen. 7,5 ml (anstelle von 1,5 ml) gepackte Schaf-Erythrozyten werden in 42,5 ml
sterilisierter Rinderserumalbuminlösung resuspendiert, um 50 ml zu erhalten.

5.2.2.9 Defibriniertes Schafsblut

Das defibrinierte Schafsblut sollte steril sein (aseptischer Aderlass und Vorbereitung), aus mehr als einem
Schaf gewonnen sein und kann von einem kommerziellen Lieferanten bezogen werden.

5.3 Apparate und Glasgeräte

5.3.1 Allgemeines

Mit Ausnahme steril gelieferter sind alle Glasgeräte und alle Geräteteile, die mit den Kulturmedien und
Reagenzien oder der Probe in Berührung kommen, nach einem der folgenden Verfahren zu sterilisieren:

a) durch feuchte Hitze im Autoklaven [5.3.2.1 a)];

b) durch trockene Hitze im Heißluftsterilisator [5.3.2.1 b)].

10
DIN EN 13727:2014-03
EN 13727:2012+A1:2013 (D)

5.3.2 Übliche mikrobiologische Laborausrüstung 2)

und insbesondere folgende Geräte:

5.3.2.1 Geräte zur Sterilisation (feuchte und trockene Hitze)


3
a) zur Dampfsterilisation ein Autoklav, der für eine Mindesthaltezeit von 15 min bei ( 121 0) °C gehalten
werden kann;

b) zur Sterilisation durch trockene Hitze ein Heißluftsterilisator, der für eine Mindesthaltezeit von 30 min bei
( 180 50 ) °C, für eine Mindesthaltezeit von 1 h bei ( 170 50 ) °C oder für eine Mindesthaltezeit von 2 h bei
( 160 50 ) °C gehalten werden kann.

5.3.2.2 Wasserbäder, einstellbar auf (20 ! 1) °C, (45 ! 1) °C (um den TSA im Fall des Gussplatten-
verfahrens im verflüssigten Zustand zu halten) und zusätzliche Prüftemperaturen ! 1 °C (5.5.1).

5.3.2.3 Brutschrank, einstellbar auf (36 ! 1) °C oder (37 ! 1) °C (5.2.1). Bei allen Bebrütungen während
einer Prüfung und deren Kontrolle und Validierung muss die gleiche Temperatur verwendet werden.

5.3.2.4 pH-Messgerät, mit einer Kalibrierungenauigkeit von nicht mehr als ! 0,1 pH-Einheiten bei
(20 ! 1) °C.
ANMERKUNG Zur Messung des pH-Wertes der Agarmedien (5.2.2.3) sollte eine Einstichelektrode oder eine flache
Membranelektrode verwendet werden.

5.3.2.5 Stoppuhr.

5.3.2.6 Schüttelgeräte

a) Elektromechanisches Rührwerk, z. B. Vortex®-Mischer 3);

b) mechanisches Schüttelgerät.

5.3.2.7 Membranfiltrationsgerät, hergestellt aus einem Material, das mit den zu filtrierenden
Substanzen verträglich ist, mit einem Filterhalter von mindestens 50 ml Nutzvolumen und geeignet zur
Verwendung von Filtern mit einem Durchmesser von 47 mm bis 50 mm und einer Porenweite von 0,45 µm für
die Sterilisation von Wasser standardisierter Härte (5.2.2.7), Rinderserumalbumin (5.2.2.8.2, 5.2.2.8.3 und
5.2.2.8.4) und für den Fall der Anwendung des Membranfiltrationsverfahrens (5.5.3).

Die verwendete Vakuumquelle muss eine stetige Filtrationsdurchflussrate ermöglichen. Um eine gleichmäßige
Verteilung der Mikroorganismen auf der Membran zu erreichen und um einen zu lange dauernden Filtrations-
vorgang zu verhindern, muss das Gerät so eingestellt werden, dass 100 ml der Spülflüssigkeit in 20 s bis 40 s
filtriert werden.

5.3.2.8 Kühlschrank, einstellbar auf 2 °C bis 8 °C.

5.3.2.9 Messpipetten mit Nennvolumina von 10 ml, 1 ml, 100 µl und 1 µl oder kalibrierte automatische
Pipetten.

5.3.2.10 Petrischalen, (Platten) in den Größen 90 mm bis 100 mm.

5.3.2.11 Glasperlen (Durchmesser 3 mm bis 4 mm).

5.3.2.12 Messkolben.

5.3.2.13 Zentrifuge (800 gN).

2) Sterile Einweggeräte sind eine annehmbare Alternative zu wiederverwendbaren Glasgeräten.


3) Vortex®-Mischer ist ein Beispiel für ein geeignetes handelsübliches Produkt. Diese Information dient lediglich zur
Unterrichtung der Anwender dieser Europäischen Norm und bedeutet keine Anerkennung des genannten Produkts
durch CEN.

11
DIN EN 13727:2014-03
EN 13727:2012+A1:2013 (D)

5.4 Herstellung der Prüfkeimsuspensionen und der Produktprüflösungen

5.4.1 Prüfkeimsuspensionen (Prüf- und Validierungssuspension)

5.4.1.1 Allgemeines

Für jeden Prüfkeim sind zwei unterschiedliche Suspensionen herzustellen: die „Prüfsuspension“ zur
Durchführung der Prüfung und die „Validierungssuspension“ zur Durchführung der Kontrollversuche und der
Verfahrensvalidierung.

5.4.1.2 Aufbewahrung und Stammkulturen von Prüfkeimen

Die Prüfkeime und deren Stammkulturen sind nach EN 12353 herzustellen und aufzubewahren.

5.4.1.3 Gebrauchskultur der Prüfkeime

Um die Gebrauchskultur der Prüfkeime (5.2.1) herzustellen, ist eine Subkultur von der Stammkultur (5.4.1.2)
durch Ausstrich auf TSA-Schrägagarröhrchen oder -Platten (5.2.2.3) anzulegen und zu bebrüten (5.3.2.3).
Nach 18 h bis 24 h wird aus der ersten Subkultur auf die gleiche Weise eine zweite Subkultur angelegt und
18 h bis 24 h bebrütet. Aus dieser zweiten Subkultur darf auf gleiche Weise eine dritte Subkultur angelegt
werden. Die zweite und (sofern angelegt) dritte Subkultur ist (sind) die Gebrauchskultur(en).

Wenn es nicht möglich ist, eine zweite Subkultur an einem bestimmten Tag anzulegen, darf eine
48-h-Subkultur für die nachfolgenden Subkulturen unter der Voraussetzung verwendet werden, dass die
Subkultur während der 48 h im Brutschrank (5.3.2.3) verblieben ist.

Eine vierte Subkultur darf niemals hergestellt und verwendet werden.

5.4.1.4 Prüfsuspension (N)

a) Es werden 10 ml Verdünnungsmittel (5.2.2.4) mit 5 g Glasperlen (5.3.2.11) in einen 100-ml-Kolben


gefüllt. Von der Gebrauchskultur (5.4.1.3) werden ösenweise Zellen in das Verdünnungsmittel (5.2.2.4)
überführt. Das Suspendieren der Zellen im Verdünnungsmittel sollte durch Reiben der Öse an der
feuchten Wand des Kolbens erfolgen, um die Zellen vor dem Eintauchen in das Verdünnungsmittel
voneinander zu trennen. Unter Verwendung eines mechanischen Schüttelgeräts [5.3.2.6 b)] wird der
Kolben 3 min geschüttelt. Die Suspension wird durch Absaugen von den Glasperlen getrennt und in ein
Röhrchen überführt.

b) Die Anzahl der Zellen in der Suspension wird mit dem Verdünnungsmittel (5.2.2.4) auf
1,5 108 KBE/ml 4) bis 5,0 108 KBE/ml (1,5 109 KBE/ml bis 5,0 109 KBE/ml im Fall des modifizierten
Verfahrens — 5.5.4) eingestellt, wobei die Anzahl der KBE mit einem geeigneten Verfahren abgeschätzt
wird. Diese Prüfsuspension ist im Wasserbad bei 20 °C aufzubewahren und innerhalb von 2 h zu
verwenden. Die Temperatur ist nach 5.5.1.1 a) und 5.5.1.4 erst unmittelbar vor Prüfbeginn einzustellen.

ANMERKUNG Die Verwendung eines Spektrophotometers zur Einstellung der Zellzahl wird dringend empfohlen
(Wellenlänge etwa 620 nm, Küvette mit 10 mm optischer Weglänge). Jedes Laboratorium sollte deshalb für jeden
Prüfkeim Kalibrierdaten erarbeiten, wobei bekannt ist, dass geeignete Werte der optischen Dichte im Allgemeinen
zwischen 0,150 und 0,460 zu finden sind. Um reproduzierbare Ergebnisse dieser Messung zu erreichen, kann es
erforderlich sein, die Prüfsuspension zu verdünnen, z. B. 1 ! 9. Ein Kolorimeter ist eine geeignete Alternative.

c) Zur Auszählung werden von der Prüfsuspension mit dem Verdünnungsmittel (5.2.2.4) Verdünnungen von
10"6 und 10"7 (Verdünnungen von 10"7 und 10"8 im Fall des modifizierten Verfahrens — 5.5.4)
hergestellt. Es wird durchmischt [5.3.2.6 a)].

4) KBE/ml # koloniebildende Einheit(en) je Milliliter.

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DIN EN 13727:2014-03
EN 13727:2012+A1:2013 (D)

Von jeder Verdünnung wird eine Probe von 1,0 ml als Doppelbestimmung entnommen und im
Gussplatten- oder Oberflächenverfahren abgeimpft.

1) Bei Anwendung des Gussplattenverfahrens wird jede 1,0-ml-Probe in gesonderte Petrischalen


überführt und es werden 15 ml bis 20 ml verflüssigter und auf (45 1) °C abgekühlter TSA (5.2.2.3)
zugegeben.

2) Bei Anwendung des Oberflächenverfahrens wird jede 1,0-ml-Probe in Anteile etwa gleicher Größe
aufgeteilt und auf einer geeigneten Anzahl (mindestens zwei) von an der Oberfläche getrockneten
TSA-Platten (5.2.2.3) ausgestrichen.

Die zur Auszählung der Prüfsuspension angewendete Verfahrensweise ist bei allen anderen Auszählungen,
5.4.1.5 d), 5.5.2.2 c) und d), 5.5.2.3 b), 5.5.2.4 b) und 5.5.2.5 b), anzuwenden.

Zur Bebrütung und Auszählung siehe 5.4.1.6.

5.4.1.5 Validierungssuspension (NV, NVB)

a) Zur Herstellung der Validierungssuspension (NV) wird die Prüfsuspension (5.4.1.4) mit dem Verdün-
nungsmittel (5.2.2.4) so verdünnt, dass sich 3,0 ! 102 KBE/ml bis 1,6 ! 103 KBE/ml ergeben [etwa ein
Viertel (1 " 3) der Verdünnung 10#5].
ANMERKUNG Im Fall des modifizierten Verfahrens (5.5.4) handelt es sich um die gleiche Verfahrensweise,
aber nur ein Viertel (1+3) der Verdünnung 10#4 wird verwendet, dies entspricht 3,0 ! 103 KBE/ml bis
1,6 ! 104 KBE/ml.

b) Zur Herstellung der Validierungssuspension für die Kontrolle des Neutralisationsmediums (NVB) (5.5.2.4)
wird die Prüfsuspension (5.4.1.4) mit dem Verdünnungsmittel (5.2.2.4) verdünnt, um 3,0 ! 104 KBE/ml bis
1,6 ! 105 KBE/ml zu erhalten [etwa ein Viertel (1 " 3) der Verdünnung 10#3] (NVB).

c) Diese Validierungssuspensionen (NV und NVB) sind auf die gleiche Weise wie die Prüfsuspension
[5.4.1.4 b)] zu erhalten und zu verwenden.

d) Zur Auszählung wird mit Verdünnungsmittel (5.2.2.4) eine Verdünnung von 10#1 [im Fall des modifizierten
Verfahrens eine Verdünnung von 10#2] hergestellt, für die Auszählung der Kontrolle des Neutralisations-
mediums ist jedoch eine Verdünnung der Validierungssuspension von 10#3 herzustellen [siehe b)].

Es ist zu durchmischen [5.3.2.6 a)].

Eine Probe von 1,0 ml wird als Doppelbestimmung entnommen und zur Beimpfung im Gussplatten- oder
Oberflächenverfahren [5.4.1.4 c)] verwendet.

Zur Bebrütung und Auszählung siehe 5.4.1.6.

5.4.1.6 Bebrüten und Auszählen der Prüf- und Validierungssuspensionen

a) Die Platten werden für 20 h bis 24 h bebrütet (5.3.2.3). Alle Platten, die aus irgendeinem Grund nicht
auszählbar sind, werden verworfen. Die Platten werden ausgezählt und die Anzahl der koloniebildenden
Einheiten (KBE) wird bestimmt. Danach werden die Platten für weitere 20 h bis 24 h bebrütet. Platten, die
keine gut voneinander abgesetzten Kolonien mehr aufweisen, dürfen nicht erneut ausgezählt werden. Die
verbleibenden Platten werden erneut ausgezählt. Wenn sich die Anzahl erhöht hat, darf nur die höhere
Koloniezahl für die weitere Auswertung verwendet werden.

b) Für jede Platte wird die genaue Anzahl der Kolonien aufgezeichnet, aber es wird $ 330 für alle
Koloniezahlen über 330 aufgezeichnet; die Vc-Werte werden nach 5.6.2.2 bestimmt.

c) Die Anzahl der KBE/ml in der Prüfsuspension N und in den Validierungssuspensionen NV und NVB
(Kontrolle des Neutralisationsmediums 5.5.2.4) wird nach den in 5.6.2.3 und 5.6.2.5 angegebenen
Verfahren berechnet. Die Verifizierung erfolgt nach 5.7.

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DIN EN 13727:2014-03
EN 13727:2012+A1:2013 (D)

5.4.2 Produktprüflösungen

Die Konzentration einer Produktprüflösung muss das 1,25-Fache der gewünschten Prüfkonzentration
( tatsächliche Prüfkonzentration) betragen, weil sie während der Prüfung und der Verfahrensvalidierung
(5.5.2 oder 5.5.3) auf 80 % verdünnt wird.

Produktprüflösungen sind in mindestens drei unterschiedlichen Konzentrationen in Wasser standardisierter


Härte (5.2.2.7) herzustellen, um eine Konzentration im Wirkungsbereich und eine Konzentration im
unwirksamen Bereich (5.8.2) zu erfassen. Das Produkt im Lieferzustand darf als eine der Produkt-
prüflösungen verwendet werden; in diesem Fall beträgt die höchste geprüfte Konzentration 80 %.
!Gebrauchsfertige Produkte dürfen bei 97 % geprüft werden (siehe 5.5.4)." In diesem Fall beträgt die
„tatsächliche Prüfkonzentration“ 97 %.

Verdünnungen gebrauchsfertiger Produkte sind in Wasser (5.2.2.2) anstatt in Wasser standardisierter Härte
herzustellen. Handwaschprodukte werden immer mit Wasser standardisierter Härte (5.2.2.7) vorverdünnt, um
eine Lösung von 62,5 % zu erhalten. Diese Lösung simuliert die Zugabe von Leitungswasser in der
Praxis (1:1). Ein derartiges Produkt wird dennoch als ein „gebrauchsfertiges Produkt“ angesehen. Das
modifizierte Verfahren (5.5.4) kann nicht angewendet werden, da 62,5 % die höchstzulässige Konzentration
(50 %) multipliziert mit 1,25 darstellt.

Bei festen Produkten wird das Produkt im Lieferzustand gelöst, indem mindestens 1,0 g ! 10 mg des Produkts
in einen Messkolben eingewogen werden und mit Wasser standardisierter Härte (5.2.2.7) aufgefüllt wird. Die
nachfolgenden Verdünnungen ( niedrigere Konzentrationen) sind in Messkolben (5.3.2.12) im Verhältnis
Volumen zu Volumen mit Wasser standardisierter Härte (5.2.2.7) herzustellen.

Bei flüssigen Produkten müssen die Verdünnungen des Produkts mit Wasser standardisierter Härte im
Verhältnis Volumen zu Volumen in Messkolben (5.3.2.12) hergestellt werden.

Die Produktprüflösungen sind frisch herzustellen und innerhalb von 2 h in der Prüfung zu verwenden. Sie
müssen eine physikalisch homogene Zubereitung ergeben, die während des gesamten Verfahrensablaufs
stabil bleibt. Wenn im Verlauf des Verfahrens eine sichtbare Inhomogenität durch Bildung einer Ausfällung
oder Ausflockung auftritt (z. B. infolge der Zugabe der Belastungssubstanz), muss dies im Prüfbericht
angegeben werden.

ANMERKUNG Die Auszählung in einer Ausfällung oder Ausflockung eingebetteter Mikroorganismen ist schwierig und
unzuverlässig.

Die im Prüfbericht angegebene Konzentration des Produkts muss die gewünschte Prüfkonzentration sein. Die
Prüfkonzentration ist als Massenkonzentration oder als Volumenkonzentration anzugeben, ebenso
Einzelheiten der Produktprobe im Lieferzustand.

5.5 Verfahrensablauf zur Beurteilung der bakteriziden Wirkung des Produkts

5.5.1 Allgemeines

5.5.1.1 Versuchsbedingungen

Die Versuchsbedingungen dürfen entsprechend der für das Produkt vorgesehenen praktischen Anwendungs-
bedingungen (Abschnitt 4) ausgewählt werden:

a) Temperatur, " (in °C):


Die Prüftemperaturen sind in Abschnitt 4, Tabelle 1 festgelegt.
Die zulässige Abweichung für jede gewählte Temperatur beträgt ! 1 °C.

b) Einwirkzeit, t (in min):


Die zu prüfenden Einwirkzeiten sind in Abschnitt 4, Tabelle 1 festgelegt.
Die zulässige Abweichung für jede gewählte Einwirkzeit beträgt ! 10 s, außer bei 1 min oder weniger, wo
sie ! 5 s beträgt.

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EN 13727:2012+A1:2013 (D)

c) Belastungssubstanz:
Die zu prüfende Belastungssubstanz ist 0,30 g/l Rinderserumalbuminlösung (5.2.2.8.2) bei Bedingungen
niedriger Belastung oder bei Bedingungen hoher Belastung ein Gemisch von 3 ml/l Schaf-Erythrozyten
und 3,0 g/l Rinderserumalbuminlösung (5.2.2.8.3), nach Abschnitt 4, Tabelle 1 und nach den praktischen
Anwendungsbedingungen. Zusätzliche Belastungssubstanzen dürfen entsprechend den spezifischen
Anwendungsgebieten geprüft werden.
d) Prüfkeime:
Escherichia coli K12, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Enterococcus hirae,
Enterococcus faecium , wie in Abschnitt 4, Tabelle 1 und 5.2.1 festgelegt. Zusätzliche Prüfkeime dürfen
geprüft werden.
5.5.1.2 Auswahl des Prüfverfahrens
Das Verfahren der Wahl ist das Verdünnungs-Neutralisations-Verfahren. Um ein geeignetes Neutralisations-
medium zu ermitteln, wird die Validierung des Verdünnungs-Neutralisations-Verfahrens (5.5.2.3, 5.5.2.4 und
5.5.2.5 in Verbindung mit 5.5.2.6) unter Verwendung eines Neutralisationsmediums durchgeführt, das nach
der Erfahrung des Laboratoriums und veröffentlichten Daten ausgewählt wird.

Sollte dieses Neutralisationsmedium nicht valide sein, ist die Validierungsprüfung mit einem alternativen
Neutralisationsmedium unter Berücksichtigung der Angaben in Anhang B zu wiederholen.

Falls sich beide Neutralisationsmedien als nicht valide erweisen, darf das Membranfiltrationsverfahren (5.5.3)
angewendet werden.
ANMERKUNG Unter besonderen Umständen kann es erforderlich sein, dem TSA (5.2.2.3) ein Neutralisationsmedium
zuzusetzen.

5.5.1.3 Allgemeine Anweisungen für Validierungs- und Kontrollverfahren


Die Neutralisation und/oder Aufhebung der bakteriziden und/oder bakteriostatischen Wirkung des Produkts
muss für jeden der verwendeten Prüfkeime und für jede Versuchsbedingung (Belastungssubstanz,
Temperatur, Einwirkzeit) kontrolliert und validiert werden, jedoch nur bei der höchsten Produktprüf-
konzentration. Diese Verfahren (Kontrolle der Versuchsbedingungen, Kontrolle des Neutralisationsmediums
oder Filtrationskontrolle und Verfahrensvalidierung) müssen gleichzeitig mit der Prüfung und mit dem gleichen
Neutralisationsmedium — bzw. der gleichen Spülflüssigkeit — wie in der Prüfung durchgeführt werden.

Im Fall gebrauchsfertiger Produkte ist Wasser (5.2.2.2) anstelle von Wasser standardisierter Härte zu
verwenden, wobei jedoch die Ausnahme bei Handwaschprodukten (5.5.1, ANMERKUNG) zu berücksichtigen
ist.

Wenn aufgrund von Problemen bei der Neutralisation dem für die Validierungs- und Kontrollverfahren
verwendeten TSA (5.5.1.2) ein Neutralisationsmedium zugesetzt wurde, muss der in der Prüfung verwendete
TSA ebenfalls die gleiche Menge dieses Neutralisationsmediums enthalten.

5.5.1.4 Temperaturangleichung
Alle Reagenzien [Produktprüflösungen (5.4.2), Prüfsuspension (5.4.1.4), Validierungssuspension (5.4.1.5),
Verdünnungsmittel (5.2.2.4), Wasser standardisierter Härte (5.2.2.7) und Belastungssubstanz (5.2.2.8)]
werden vor der Prüfung im auf eingestellten Wasserbad (5.3.2.2) auf die Prüftemperatur [5.5.1.1 a)]
eingestellt. Zu beachten sind die Festlegungen in 5.4.1.4 b). Die Stabilisierung der Temperatur der
Reagenzien auf ist zu überprüfen.

Das Neutralisationsmedium (5.2.2.5) oder die Spülflüssigkeit (5.2.2.6) sowie das Wasser (5.2.2.2) sind auf
eine Temperatur von (20 ! 1) °C einzustellen.

Im Fall gebrauchsfertiger Produkte muss zusätzlich das Wasser (5.2.2.2) auf die Prüftemperatur eingestellt
werden.

5.5.1.5 Vorsichtsmaßnahmen beim Umgang mit Prüfkeimen

Bei der Zugabe der Prüf- oder Validierungssuspensionen (5.4.1) darf der obere Teil der Innenseiten der
Reagenzgläser nicht berührt werden.

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5.5.2 Verdünnungs-Neutralisations-Verfahren 5)

5.5.2.1 Allgemeines

Das Prüfverfahren sowie die Kontroll- und Validierungsverfahren (5.5.2.2 bis 5.5.2.5) müssen gleichzeitig
durchgeführt werden.

5.5.2.2 Prüfung Na — Bestimmung der bakteriziden Konzentrationen

Das Verfahren zur Bestimmung der bakteriziden Konzentrationen ist wie folgt:

a) 1,0 ml Belastungssubstanz (5.2.2.8) werden in ein Röhrchen pipettiert. Es wird 1,0 ml Prüfsuspension
(5.4.1.4) zugegeben. Die Stoppuhr (5.3.2.5) wird sofort in Gang gesetzt, es wird durchmischt [5.3.2.6 a)]
und das Röhrchen für 2 min 10 s in ein auf die gewählte Prüftemperatur ! [5.5.1.1 a)] eingestelltes
Wasserbad gestellt.

b) Nach Ablauf dieser Zeit werden 8,0 ml einer der Produktprüflösungen (5.4.2) zugegeben. Die Stoppuhr
wird bei Beginn der Zugabe erneut in Gang gesetzt. Es wird durchmischt [5.3.2.6 a)] und das Röhrchen
für die gewählte Einwirkzeit t [5.5.1.1 b)] in ein auf ! eingestelltes Wasserbad gestellt. Unmittelbar vor
dem Ende von t wird erneut durchmischt [5.3.2.6 a)].

c) Nach Ablauf von t wird eine 1,0-ml-Probe des Prüfgemischs Na in ein Röhrchen mit 8,0 ml
Neutralisationsmedium (5.2.2.5) und 1,0 ml Wasser (5.2.2.2) überführt. Es wird durchmischt [5.3.2.6 a)]
und der Ansatz in ein auf (20 1) °C eingestelltes Wasserbad gestellt. Nach einer Neutralisationszeit von
5 min 10 s [bei Einwirkzeiten von 10 min oder weniger nur (10 1) s] wird durchmischt [5.3.2.6 a)] und
sofort eine Probe von 1,0 ml des neutralisierten Prüfgemischs Na (das Neutralisationsmedium, Produkt-
prüflösung, Belastungssubstanz und Prüfsuspension enthält) als Doppelbestimmung entnommen und im
Gussplatten- oder Oberflächenverfahren abgeimpft.

1) Bei Anwendung des Gussplattenverfahrens wird jede 1,0-ml-Probe in gesonderte Petrischalen


pipettiert und es werden 15 ml bis 20 ml verflüssigter und auf (45 1) °C abgekühlter TSA (5.2.2.3)
zugegeben.

2) Bei Anwendung des Oberflächenverfahrens wird jede 1,0-ml-Probe in etwa gleiche Anteile geteilt
und auf einer geeigneten Anzahl (mindestens zwei) an der Oberfläche getrockneter TSA-Platten
(5.2.2.3) ausgestrichen.

d) Zusätzlich werden 0,5 ml dieses Gemischs in ein Röhrchen überführt, das 4,5 ml des Neutralisations-
mediums enthält, um eine Verdünnung von 10"1 von Na zu erhalten; bei Handwaschprodukten wird
zusätzlich mit Neutralisationsmedium gemischt und verdünnt, um eine Verdünnung von 10"2 von Na zu
erhalten. Von jedem Verdünnungsröhrchen werden Proben von 1,0 ml als Doppelbestimmung
entnommen und im Gussplatten- oder Oberflächenverfahren abgeimpft.

Zur Bebrütung und Auszählung siehe 5.5.2.6.

e) Die Arbeitsgänge a) bis d) werden unter Verwendung der anderen Produktprüflösungen zeitgleich
durchgeführt.

f) Die Arbeitsgänge a) bis e) werden unter Anwendung der anderen Mindestprüfbedingungen und
gegebenenfalls von anderen zusätzlichen Versuchsbedingungen (5.5.1.1) durchgeführt.

5) Zu einer grafischen Darstellung dieses Verfahrens siehe Anhang C, Bilder C.1 und C.2.

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DIN EN 13727:2014-03
EN 13727:2012+A1:2013 (D)

5.5.2.3 Kontrolle der Versuchsbedingungen A — Validierung der gewählten Versuchsbedingungen


und/oder Verifizierung des Nichtvorliegens keimabtötender Wirkungen unter den
Prüfbedingungen

Zur Validierung der gewählten Versuchsbedingungen und/oder Verifizierung des Nichtvorliegens keim-
abtötender Wirkungen unter den Prüfbedingungen wird wie folgt verfahren:

a) 1,0 ml der in der Prüfung verwendeten Belastungssubstanz (5.5.2.2) wird in ein Röhrchen pipettiert. Es
wird 1,0 ml Validierungssuspension (5.4.1.5) zugegeben. Die Stoppuhr wird sofort in Gang gesetzt, es
wird durchmischt [5.3.2.6 a)] und das Röhrchen für 2 min 10 s in ein auf ! eingestelltes Wasserbad
gestellt.

b) Nach Ablauf dieser Zeit werden 8,0 ml Wasser standardisierter Härte (5.2.2.7) zugegeben. [Im Fall
gebrauchsfertiger Produkte (außer bei Handwaschprodukten (5.4.2)): Wasser (5.2.2.2) anstelle des
Wassers standardisierter Härte.] Die Stoppuhr wird bei Beginn der Zugabe erneut in Gang gesetzt. Es
wird durchmischt [5.3.2.6 a)] und das Röhrchen wird für die Dauer t in ein auf ! eingestelltes Wasserbad
gestellt. Unmittelbar vor dem Ende von t wird erneut durchmischt [5.3.2.6 a)].

c) Nach Ablauf von t wird eine 1,0-ml-Probe dieses Gemischs A als Doppelbestimmung entnommen und im
Gussplatten- oder Oberflächenverfahren abgeimpft [5.5.2.2 c)].

Zur Bebrütung und Auszählung siehe 5.5.2.6.

5.5.2.4 Kontrolle des Neutralisationsmediums B — Verifizierung des Nichtvorliegens einer Toxizität


des Neutralisationsmediums

Zur Verifizierung des Nichtvorliegens einer Toxizität des Neutralisationsmediums wird wie folgt verfahren:

a) 9,0 ml des in der Prüfung verwendeten Neutralisationsmediums (5.5.2.2) werden in ein Röhrchen
pipettiert. Es wird 1,0 ml Validierungssuspension (NVB) [5.4.1.5 b)] zugegeben, die 3,0 " 104 KBE/ml bis
1,6 " 105 KBE/ml enthält. Die Stoppuhr wird bei Beginn der Zugabe in Gang gesetzt, es wird durchmischt
[5.3.2.6 a)]. 0,5 ml dieses Gemischs werden in ein Röhrchen mit 4,5 ml Neutralisationsmedium überführt,
um eine Verdünnung von NVB von 10#1 zu erhalten, diese Verfahrensweise wird wiederholt, um eine
Verdünnung von NVB von 10#2 zu erhalten. Die Röhrchen mit der Verdünnung von NVB von 10#2 werden
für 5 min 10 s [bei Einwirkzeiten von 10 min oder weniger nur für (10 1) s] in ein auf (20 1) °C
eingestelltes Wasserbad gestellt. Unmittelbar vor dem Ende dieser Zeit wird durchmischt [5.3.2.6 a)].

ANMERKUNGDer hohe Gehalt an Neutralisationsmedium im Vergleich zu den Prüfkeimen widerspiegelt die


zusätzlichen Verdünnungen mit Neutralisationsmedium $ im Fall von Na [5.5.2.2 d)] 10#1 und bei Handwasch-
produkten 10#1 und 10#2.

b) Nach Ablauf dieser Zeit wird eine 1,0-ml-Probe dieses Gemischs B (Verdünnung von NVB von 10#2) als
Doppelbestimmung entnommen und im Gussplatten- oder Oberflächenverfahren abgeimpft [5.5.2.2 c)].

Zur Bebrütung und Auszählung siehe 5.5.2.6.

5.5.2.5 Verfahrensvalidierung C — Validierung des Verdünnungs-Neutralisations-Verfahrens

Zur Validierung des Verdünnungs-Neutralisations-Verfahrens wird wie folgt verfahren:

a) 1,0 ml der in der Prüfung verwendeten Belastungssubstanz (5.5.2.2) wird in ein Röhrchen pipettiert. Es
wird 1,0 ml Verdünnungsmittel (5.2.2.4) zugegeben, anschließend wird die Stoppuhr in Gang gesetzt und
8,0 ml Produktprüflösung nur der höchsten in der Prüfung verwendeten Konzentration (5.5.2.2) werden
zugegeben. Es wird durchmischt [5.3.2.6 a)] und das Röhrchen für die Dauer t in ein auf ! eingestelltes
Wasserbad gestellt. Unmittelbar vor dem Ende von t wird erneut durchmischt [5.3.2.6 a)].

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DIN EN 13727:2014-03
EN 13727:2012+A1:2013 (D)

b) Nach Ablauf von t wird 1,0 ml des Gemischs in ein Röhrchen mit 8,0 ml (in 5.5.2.2 verwendetem)
Neutralisationsmedium überführt. Die Stoppuhr wird bei Beginn der Zugabe erneut in Gang gesetzt. Es
wird durchmischt [5.3.2.6 a)] und das Röhrchen wird 5 min 10 s [bei Einwirkzeiten von 10 min oder
weniger nur (10 1) s] in ein auf (20 1) °C eingestelltes Wasserbad gestellt. Es wird 1,0 ml der
Validierungssuspension (5.4.1.5) hinzugefügt. Die Stoppuhr wird bei Beginn der Zugabe gestartet und es
wird durchmischt [5.3.2.6 a)]. Das Röhrchen wird für (30 1) min in ein auf (20 1) °C eingestelltes
Wasserbad gestellt. Unmittelbar vor dem Ende dieser Zeit wird erneut durchmischt [5.3.2.6 a)]. Nach
Ablauf dieser Zeit wird eine 1,0-ml-Probe dieses Gemischs C als Doppelbestimmung entnommen und im
Gussplatten- oder Oberflächenverfahren abgeimpft [5.5.2.2 c)].

Zur Bebrütung und Auszählung siehe 5.5.2.6.

5.5.2.6 Bebrütung und Auszählung des Prüfgemischs und der Kontroll- und Validierungsgemische

Beim Bebrüten und Auszählen des Prüfgemisches sowie der Kontroll- und Validierungsgemische wird wie
folgt verfahren:

a) Die Platten werden 20 h bis 24 h bebrütet (5.3.2.3). Alle Platten, die (aus irgendeinem Grund) nicht
auszählbar sind, werden verworfen. Die Platten werden ausgezählt und die Anzahl der koloniebildenden
Einheiten (KBE) wird bestimmt. Danach werden die Platten weitere 20 h bis 24 h bebrütet. Platten, die
keine gut voneinander abgesetzten Kolonien mehr aufweisen, dürfen nicht erneut ausgezählt werden. Die
verbleibenden Platten werden erneut ausgezählt. Wenn sich die Anzahl erhöht hat, darf nur die höhere
Koloniezahl für die weitere Auswertung verwendet werden.

b) Für jede Platte wird die genaue Anzahl der Kolonien aufgezeichnet, aber es wird ! 330 für alle Kolonie-
zahlen über 330 aufgezeichnet; die Vc-Werte werden nach 5.6.2.2 bestimmt.

c) Die Anzahl der KBE/ml im Prüfgemisch Na und in den Validierungsgemischen A, B und C wird nach dem
in 5.6.2.4 bzw. 5.6.2.6 angegebenen Verfahren berechnet. Die Verifizierung erfolgt nach 5.7.

5.5.3 Membranfiltrationsverfahren 6)

5.5.3.1 Allgemeines

Das Prüfverfahren und die Kontroll- und Validierungsverfahren (5.5.3.2 bis 5.5.3.5) müssen gleichzeitig
durchgeführt werden.

Jedes Membranfiltrationsgerät (5.3.2.7) wird mit 50 ml Spülflüssigkeit (5.2.2.6) gefüllt. Die für das Filtrieren
erforderliche Zeit muss — sofern sie in Ausnahmefällen mehr als eine Minute beträgt — im Prüfbericht
angegeben werden. Beim Überführen der Membranen auf die Oberfläche einer Agarplatte sollte sorgfältig
darauf geachtet werden, dass sichergestellt wird, dass sich die Prüfkeime beim Auflegen auf die Platte auf der
oberen Seite der Membran befinden und ein Lufteinschluss zwischen Membran und Agaroberfläche
vermieden wird.

5.5.3.2 Prüfung Na — Bestimmung der bakteriziden Konzentrationen

Die Vorgehensweise bei der Bestimmung der bakteriziden Konzentrationen ist wie folgt:

a) Siehe 5.5.2.2 a).

b) Nach Ablauf von t wird eine 0,1-ml-Probe des Prüfgemischs Na (bei Handwaschprodukten 1 µl) als
Doppelbestimmung entnommen und jede 0,1-ml-Probe (1-µl-Probe) wird in ein gesondertes Membran-
filtrationsgerät (5.5.3.1) überführt. Die Filtration erfolgt sofort. Es werden mindestens 150 ml, jedoch nicht
mehr als 500 ml Spülflüssigkeit (5.2.2.6) durchfiltriert. Falls die Spülflüssigkeit nicht Wasser ist, wird das
Verfahren damit beendet, dass 50 ml Wasser (5.2.2.2) filtriert werden. Anschließend werden sämtliche
Membranen auf die Oberfläche gesonderter TSA-Platten überführt.

6) Zu einer grafischen Darstellung dieses Verfahrens siehe Anhang C, Bilder C.3 und C.4.

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DIN EN 13727:2014-03
EN 13727:2012+A1:2013 (D)

ANMERKUNG Die Menge von 1 µl berücksichtigt die 100-fache Verdünnung von Na [Verdünnung von 10 2 in
5.5.2.2 d)], die die Messung einer lg-Reduktion um drei Stufen ermöglicht. Wenn es nicht möglich ist, 1µl zu
pipettieren, darf zum Beispiel vorab 1 ml in 1 000 ml verdünnt werden (oder 100 µl in 100 ml) und 1 ml dieses
Gemischs in das Membranfiltrationsgerät gegeben werden.

Zur Bebrütung und Auszählung siehe 5.5.3.6.

c) Siehe 5.5.2.2 e).

d) Siehe 5.5.2.2 f).

5.5.3.3 Kontrolle der Versuchsbedingungen A — Validierung der gewählten Versuchsbedingungen


und/oder Verifizierung des Nichtvorliegens keimabtötender Wirkungen unter den
Prüfbedingungen

Zur Validierung der gewählten Versuchsbedingungen und/oder zur Verifizierung des Nichtvorliegens keim-
abtötender Wirkungen unter den Prüfbedingungen wird wie folgt verfahren:

a) Siehe 5.5.2.3 a) und b).

b) Nach Ablauf von t wird eine 1,0-ml-Probe des Gemischs A als Doppelbestimmung entnommen und jede
1,0-ml-Probe wird in ein gesondertes Membranfiltrationsgerät (5.5.3.1) überführt. Die Filtration erfolgt
sofort sowie zusätzlich mit 50 ml Wasser (5.2.2.2). Dann werden alle Membranen auf die Oberfläche
gesonderter TSA-Platten (5.2.2.3) überführt.

Zur Bebrütung und Auszählung siehe 5.5.3.6.

5.5.3.4 Kontrolle der Filtration B — Validierung des Filtrationsverfahrens

Zur Validierung des Filtrationsverfahrens wird wie folgt verfahren:

Es wird 0,1 ml der Validierungssuspension NV [5.4.1.5 a)] (Achtung: nicht NVB, wie in 5.5.2.4 beschrieben.)
als Doppelbestimmung entnommen (Kontrollsuspension B) und jede 0,1-ml-Probe wird in ein gesondertes
Membranfiltrationsgerät überführt (5.5.3.1).

Die Filtration erfolgt sofort. Die Spülflüssigkeit (5.2.2.6) wird auf gleiche Weise durchfiltriert wie in der Prüfung
[5.5.3.2 b)]. Falls die Spülflüssigkeit nicht Wasser ist, wird das Verfahren damit beendet, dass 50 ml Wasser
(5.2.2.2) filtriert werden. Anschließend werden sämtliche Membranen auf die Oberfläche gesonderter
TSA-Platten (5.2.2.3) überführt.

Zur Bebrütung und Auszählung siehe 5.5.3.6.

5.5.3.5 Verfahrensvalidierung C — Validierung des Membranfiltrationsverfahrens oder Zählung der


Bakterien auf den Membranen, die vorher mit dem Gemisch aus Produkt und
Belastungssubstanz in Kontakt gewesen sind

Zur Validierung des Membranfiltrationsverfahrens oder Zählung der Bakterien auf den Membranen, die vorher
mit dem Gemisch aus Produkt und Belastungssubstanz in Kontakt gewesen sind, wird wie folgt verfahren:

a) Siehe 5.5.2.5 a).


b) Nach Ablauf von t wird 0,1 ml des Gemischs als Doppelbestimmung entnommen und jede 0,1-ml-Probe
wird in ein gesondertes Membranfiltrationsgerät (5.5.3.1) überführt. Die Filtration erfolgt sofort. Die Spül-
flüssigkeit (5.2.2.6) wird auf gleiche Weise durchfiltriert wie in der Prüfung [5.5.3.2 b)], dann werden die
Membranen mit 50 ml Spülflüssigkeit (5.2.2.6) bedeckt und 0,1 ml Validierungssuspension NV [5.4.1.5 a)]
wird zugegeben. Es wird erneut sofort filtriert und zusätzlich mit 50 ml Wasser (5.2.2.2), dann werden alle
Membranen auf die Oberfläche gesonderter TSA-Platten (5.2.2.3) überführt.
Zur Bebrütung und Auszählung siehe 5.5.3.6.

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DIN EN 13727:2014-03
EN 13727:2012+A1:2013 (D)

5.5.3.6 Bebrütung und Auszählung des Prüfgemischs und der Validierungsgemische

Beim Bebrüten und Auszählen des Prüfgemisches sowie der Kontroll- und Validierungsgemische wird wie
folgt verfahren:

a) Die Platten werden 20 h bis 24 h bebrütet (5.3.2.3). Alle Platten, die (aus irgendeinem Grund) nicht
auszählbar sind, werden verworfen. Die Platten werden ausgezählt und die Anzahl der koloniebildenden
Einheiten wird bestimmt. Danach werden die Platten weitere 20 h bis 24 h bebrütet. Platten, die keine gut
voneinander abgesetzten Kolonien mehr aufweisen, dürfen nicht erneut ausgezählt werden. Die
verbleibenden Platten werden erneut ausgezählt. Wenn sich die Anzahl erhöht hat, darf für die weitere
Auswertung nur die höhere Koloniezahl verwendet werden.
b) Für jede Platte wird die genaue Anzahl der Kolonien festgehalten, aber es wird 165 für alle Kolonie-
zahlen über 165 aufgezeichnet; die Vc-Werte werden nach 5.6.2.2 bestimmt.
c) Die Anzahl der KBE/ml im Prüfgemisch Na und in den Validierungsgemischen A, B und C wird nach dem
in 5.6.2.4 bzw. 5.6.2.6 angegebenen Verfahren berechnet. Die Verifizierung erfolgt nach 5.7.

5.5.4 Modifiziertes Verfahren für gebrauchsfertige Produkte 7)

5.5.4.1 Allgemeines

!Gebrauchsfertige Produkte dürfen nach dem nachfolgend beschriebenen modifizierten Prüfverfahren


geprüft werden, wenn das geprüfte Produkt die Prüfung nach 5.5.2 oder 5.5.3 nicht bestanden hat." Die
Prüfsuspension N und die Validierungssuspension Nv sind mit zehnfach höherer Keimzahl als in 5.4.1.4 und
5.4.1.5 beschrieben, herzustellen.

Die Belastungssubstanz ist in fünffach höheren Konzentrationen als in 5.2.2.8.4 beschrieben herzustellen.
ANMERKUNG Die Konzentration des Produkts beträgt in dem modifizierten Verfahren 97 %.

5.5.4.2 Modifiziertes Verdünnungs-Neutralisations-Verfahren

Im Folgenden werden nur die Änderungen gegenüber 5.5.2 beschrieben. Siehe auch Bilder C.5 und C.6.

5.5.4.2.1 Prüfung Na

0,2 ml der fünffach konzentrierten Belastungssubstanz (5.2.2.8.4) werden in ein Röhrchen pipettiert. Es wird
0,1 ml der zehnfach konzentrierten Prüfsuspension (5.4.1.4) zugegeben. Die Stoppuhr (5.3.2.5) wird sofort in
Gang gesetzt, es wird durchmischt [5.3.2.6 a)] und das Röhrchen für 2 min ! 10 s in ein auf die gewählte
Prüftemperatur [5.5.1.1 a)] eingestelltes Wasserbad gestellt.

Nach Ablauf dieser Zeit werden 9,7 ml der unverdünnten Produktprüflösung (5.4.2) zugegeben.

Die Stoppuhr wird bei Beginn der Zugabe wieder in Gang gesetzt. Es wird durchmischt [5.3.2.6 a)] und das
Röhrchen wird für die gewählte Einwirkzeit t [5.5.1.1 b)] in ein auf " eingestelltes Wasserbad gestellt.
Unmittelbar vor dem Ende von t wird erneut durchmischt [5.3.2.6 a)]. Die Anweisungen in 5.5.2.2 c), d) und
wo geeignet f) sind zu befolgen.

5.5.4.2.2 Kontrolle der Versuchsbedingungen A — Validierung der gewählten Versuchsbedingungen


und/oder Verifizierung des Nichtvorliegens keimabtötender Wirkungen unter den
Prüfbedingungen

0,2 ml der in der Prüfung verwendeten Belastungssubstanz (5.5.4.2.1) werden in ein Röhrchen pipettiert. Es
wird 0,1 ml der zehnfach konzentrierten Validierungssuspension [5.4.1.5 a)], wie für dieses modifizierte
Verfahren beschrieben, zugegeben. Die Stoppuhr wird sofort in Gang gesetzt, es wird durchmischt [5.3.2.6 a)]
und das Röhrchen wird für 2 min ! 10 s in ein auf " eingestelltes Wasserbad gestellt.

7) Zu einer grafischen Darstellung dieses Verfahrens siehe Anhang C, Bilder C.5 bis C.8.

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DIN EN 13727:2014-03
EN 13727:2012+A1:2013 (D)

Nach Ablauf dieser Zeit werden 9,7 ml Wasser (5.2.2.2) zugegeben. Die Stoppuhr wird bei Beginn der Zugabe
erneut in Gang gesetzt. Die Anweisungen in 5.5.2.3 b) (die letzten beiden Sätze) und c) sind zu befolgen.

5.5.4.2.3 Kontrolle des Neutralisationsmediums B — Verifizierung des Nichtvorliegens einer


Toxizität des Neutralisationsmediums

Das in 5.5.2.4 beschriebene Verfahren ist zu befolgen.

5.5.4.2.4 Verfahrensvalidierung C — Validierung des Verdünnungs-Neutralisations-Verfahrens


a) 0,2 ml der in der Prüfung verwendeten Belastungssubstanz (5.5.4.2.1) werden in ein Röhrchen pipettiert.
Es wird 0,1 ml Verdünnungsmittel (5.2.2.4) zugegeben, anschließend wird die Stoppuhr in Gang gesetzt
und 9,7 ml Produktprüflösung werden zugegeben. Es wird durchmischt [5.3.2.6 a)] und das Röhrchen
wird für die Dauer t in ein auf eingestelltes Wasserbad gestellt. Unmittelbar vor dem Ende von t wird
erneut durchmischt [5.3.2.6 a)].

b) Nach Ablauf von t werden 1,1 ml des Gemischs in ein Röhrchen mit 8,8 ml (in 5.5.4.2.1 verwendetem)
Neutralisationsmedium überführt. Die Stoppuhr wird bei Beginn der Zugabe erneut in Gang gesetzt. Es
wird durchmischt [5.3.2.6 a)] und das Röhrchen 5 min ! 10 s [bei Einwirkzeiten von 10 min oder weniger
nur (10 ! 1) s] in ein auf (20 ! 1) °C eingestelltes Wasserbad gestellt. Wie für dieses modifizierte
Verfahren beschrieben, wird 0,1 ml der zehnfach konzentrierten Validierungssuspension [5.4.1.5 a)]
hinzugefügt. Die Stoppuhr wird bei Beginn der Zugabe gestartet und es wird durchmischt [5.3.2.6 a)]. Das
Röhrchen wird für (30 ! 1) min in ein auf (20 ! 1) °C eingestelltes Wasserbad gestellt. Unmittelbar vor
dem Ende dieser Zeit wird erneut durchmischt [5.3.2.6 a)]. Nach Ablauf dieser Zeit wird eine 1,0-ml-Probe
des Gemischs C als Doppelbestimmung entnommen und im Gussplatten- oder Oberflächenverfahren
abgeimpft [5.5.2.2 c)].

Zur Bebrütung und Auszählung siehe 5.5.2.6.

5.5.4.3 Modifiziertes Membranfiltrationsverfahren


Im Folgenden werden nur die Änderungen gegenüber 5.5.3 beschrieben. Siehe auch Bilder C.7 und C.8.

5.5.4.3.1 Prüfung Na
Siehe 5.5.4.2.1, aber anschließend am Ende von t sind nach der Durchmischung 5.5.2.2 b), c) und e) zu
befolgen.

5.5.4.3.2 Kontrolle der Versuchsbedingungen A — Validierung der gewählten Versuchsbedingungen


und/oder Verifizierung des Nichtvorliegens keimabtötender Wirkungen unter den
Prüfbedingungen
Siehe 5.5.4.2.2, aber es ist nicht 5.5.2.3 c) zu befolgen, sondern5.5.3.3 b).

5.5.4.3.3 Kontrolle der Filtration B — Validierung des Filtrationsverfahrens


Es wird 0,01 ml der Validierungssuspension NV [5.4.1.5 a)] (Achtung: nicht NVB, wie in 5.5.2.4 beschrieben.)
als Doppelbestimmung entnommen (Kontrollsuspension B) und jede 0,01-ml-Probe wird in ein gesondertes
Membranfiltrationsgerät überführt (5.5.3.1).

5.5.3.4 ist zu befolgen.

5.5.4.3.4 Verfahrensvalidierung C — Validierung des Membranfiltrationsverfahrens oder Zählung der


Bakterien auf den Membranen, die vorher mit dem Gemisch aus Produkt und
Belastungssubstanz in Kontakt gewesen sind
a) 5.5.4.2.4 a) ist zu befolgen.
b) Nach Ablauf von t wird 0,01 ml des Gemischs als Doppelbestimmung entnommen und jede
0,01-ml-Probe wird in ein gesondertes Membranfiltrationsgerät (5.5.3.1) überführt. Die Filtration erfolgt
sofort. Die Spülflüssigkeit (5.2.2.6) wird auf gleiche Weise durchfiltriert wie in der Prüfung [5.5.4.3.1, d. h.
5.5.3.2 b)], dann werden die Membranen mit 50 ml Spülflüssigkeit (5.2.2.6) bedeckt und 0,01 ml der
zehnfach konzentrierten Validierungssuspension [5.4.1.5 a)] wird zugegeben. Es wird erneut sofort filtriert

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EN 13727:2012+A1:2013 (D)

und zusätzlich mit 50 ml Wasser (5.2.2.2), dann werden alle Membranen auf die Oberfläche gesonderter
TSA-Platten (5.2.2.3) überführt.
Zur Bebrütung und Auszählung siehe 5.5.3.6.

5.6 Versuchsdaten und Berechnung

5.6.1 Erläuterung von Begriffen und Abkürzungen

5.6.1.1 Überblick über die verschiedenen Suspensionen und Prüfgemische

N, NV und NVB stellen die Bakteriensuspensionen dar; Na steht für das bakterizide Prüfgemisch; A (Kontrolle
der Versuchsbedingungen), B (Kontrolle des Neutralisationsmediums oder Filtrationskontrolle) und C
(Verfahrensvalidierung) sind die verschiedenen Kontrollprüfgemische.

N, NV, NVB, N0, NV0, Na sowie A, B, C sind die Anzahlen der je ml in den verschiedenen Prüfgemischen
ausgezählten Zellen nach Tabelle 2.

Tabelle 2 — Anzahl der je ml in den verschiedenen Prüfgemischen ausgezählten Zellen

Anzahl der Zellen je ml in Anzahl der Zellen je ml in Anzahl der überlebenden


den den Prüfgemischen zu Zellen je ml in den
Bakteriensuspensionen Beginn der Einwirkzeit Prüfgemischen am Ende der
(Zeit 0) Einwirkzeit t (A) oder nach
5 min (B) bzw. 30 min (C)
Prüfung N N0a ( N/10) Na (vor der Neutralisation oder
Prüfsuspension Filtration)
Kontrollen NV NV0a ( NV /10) A, B, C
Validierungssuspension
NVB/1 000)
NVB
Validierungssuspension für
Kontrolle B
a Im Fall des modifizierten Verfahrens — 5.5.4 N0 ist N/100 und NV0 ist NV /100.

5.6.1.2 Vc-Werte

Alle Versuchsdaten werden im Bericht als Vc-Werte angegeben:

a) beim Verdünnungs-Neutralisations-Verfahren (Prüfung und Kontrollen) ist ein Vc-Wert die Anzahl der je
1,0 ml Probe gezählten KBE;

b) beim Membranfiltrationsverfahren ist ein Vc-Wert die Anzahl der je 0,1 ml Probe des Prüfgemisches Na,
(1 µl im Fall der hygienischen Händewaschung), für die Filtrationskontrolle (B) und die Verfahrens-
validierung (C) und je 1,0 ml Probe für die Kontrolle der Versuchsbedingungen A gezählten KBE (bei dem
modifizierten Verfahren 5.5.4.3 sind das 0,1 ml von Na, 1,0 ml von A und 0,01 ml von B und C).

5.6.2 Berechnung

5.6.2.1 Allgemeines

Der erste Schritt bei der Berechnung ist die Bestimmung der Vc-Werte, der zweite die Berechnung von N, N0,
Na, NV, NV0, NVB, A, B und C. Der dritte Schritt ist die Berechnung der Keimreduktion R (5.8).

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5.6.2.2 Bestimmung der Vc-Werte

Die Vc-Werte werden wie folgt bestimmt.

a) Die üblichen Grenzwerte für die Auszählung von Bakterien auf Agarplatten liegen zwischen 15 und 300
Kolonien. In dieser Europäischen Norm ist eine Abweichung von 10 % zulässig, so dass die Grenzwerte
14 und 330 Kolonien betragen. Auf Membranen sind die üblichen oberen Grenzwerte anders: 150, d. h.
mit der Abweichung von 10 %: 165.

ANMERKUNG 1 Grundlage des unteren Grenzwertes (14) ist die Tatsache, dass die Variabilität zunimmt, je
kleiner die in der Probe (1 ml oder 0,1 ml) gezählten Keimzahlen sind, und daher können nachfolgende Berech-
nungen zu falschen Ergebnissen führen. Der untere Grenzwert bezieht sich nur auf die Probe (und nicht notwen-
digerweise auf die Keimzahl auf einer Platte), z. B. ergeben drei Platten je 1 ml Probe mit 3 KBE, 8 KBE und 5 KBE
einen Vc-Wert von 16. Die oberen Grenzwerte (330, 165) spiegeln die Ungenauigkeit beim Zählen zusammen-
fließender Kolonien wider und die Wachstumshemmung durch Erschöpfung der Nährsubstanzen. Sie beziehen sich
nur auf die Auszählung auf einer Platte und nicht notwendigerweise auf die Probe.

b) Für die Auszählung der Prüfsuspension N (5.4.1.6), der Validierungssuspensionen NV und NVB (5.4.1.6)
und für alle Auszählungen beim Verdünnungs-Neutralisations-Verfahren (5.5.2.6) werden die Vc-Werte
nach der Anzahl der je 1 ml Probe (oder andere Volumen für die Membranfiltration und/oder
Handwaschprodukte) verwendeten Platten (5.6.1.2) bestimmt und aufgezeichnet.

ANMERKUNG 2 Wenn mehr als eine Platte je 1 ml Probe zur Bestimmung des VC-Werts verwendet worden ist,
sollten die Keimzahlen je Platte aufgezeichnet werden.

Wenn die Keimzahl auf einer Platte höher ist als 330, wird die Keimzahl im Prüfbericht als „ 330“
angegeben. Wenn mehr als eine Platte je 1 ml Probe verwendet worden ist und mindestens eine von
ihnen eine höhere Keimzahl als 330 aufweist, wird dieser Vc-Wert im Prüfbericht als „ Summe der
Keimzahlen“ angegeben, z. B. wird für „ 330, 310, 302“ im Prüfbericht „ 942“ angegeben.

Wenn ein VC-Wert kleiner als 14 ist, wird die Zahl angegeben (für die weiteren Berechnungen im Fall von
Na wird jedoch „! 14“ eingesetzt).

Beim Membranfiltrationsverfahren (5.5.3) sind die Keimzahlen auf den Membranen die Vc-Werte
(5.6.1.2). Die Vc-Werte unterhalb des unteren Grenzwerts (14) oder oberhalb des oberen
Grenzwerts (165) werden wie vorstehend beschrieben angegeben.

c) Es werden nur Vc-Werte innerhalb der Auszählgrenzen für die weitere Berechnung berücksichtigt, außer
im Fall von Na (5.6.2.4)

5.6.2.3 Berechnung von N und N0

N ist die Anzahl der Zellen je ml in der Prüfsuspension (5.4.1.4; 5.6.1.1).

Da zwei Verdünnungen der Prüfsuspension (5.4.1.4 in Verbindung mit 5.4.1.6) ausgewertet werden, wird die
Anzahl der KBE/ml als gewichteter Mittelwert der Keimzahl nach folgender Gleichung berechnet:

c
N$ (1)
( n1 # 0,1 n2 ) 10 " 6

Dabei ist

c die Summe der berücksichtigten Vc-Werte;

n1 die Anzahl der bei der geringeren Verdünnung, d. h. 10"6, berücksichtigten Vc-Werte;

n2 die Anzahl der bei der stärkeren Verdünnung, d. h. 10"7, berücksichtigten Vc-Werte;

10"6 der der geringeren Verdünnung entsprechende Verdünnungsfaktor.

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DIN EN 13727:2014-03
EN 13727:2012+A1:2013 (D)

! ANMERKUNG 1 Für das modifizierte Verfahren (5.5.4) ist die geringere Verdünnung 10 7 und die stärkere
Verdünnung 10 8."

Die berechneten Ergebnisse werden auf zwei signifikante Stellen gerundet. Dabei wird, wenn die letzte Ziffer
kleiner als 5 ist, die vorhergehende Ziffer nicht verändert; wenn die letzte Ziffer 5 oder größer als 5 ist, wird die
vorhergehende Ziffer um eine Einheit vergrößert; wenn die letzte Ziffer gleich 5 ist, wird die vorhergehende
Ziffer auf die nächstliegende gerade Zahl gerundet. Es ist schrittweise vorzugehen, bis zwei signifikante
Stellen erreicht sind. Im Ergebnis wird die Anzahl der KBE je ml als Zahl zwischen 1,0 und 9,9, multipliziert mit
der entsprechenden Zehnerpotenz, angegeben.

BEISPIEL

168 % 213 % 20 % 25 426


N $ $ $ 1,936 3 # 108 $ 1,9 # 108 (KBE/ml)
!2 % 0,1 # 2"10 6
2,2 # 10 6

ANMERKUNG !2" Für das modifizierte Verfahren (5.5.4) ist N zehnfach höher und deshalb sind auch die
Verdünnungen, die ausgewertet werden sollen, zehnfach höher (10 7 anstelle von 10 6 und 10 8 anstelle von 10 7). Die
oben angegebene Gleichung is entsprechend zu ändern.

N0 ist die Anzahl der Zellen je ml im Prüfgemisch [5.5.2.2 a)] am Anfang der Einwirkzeit (Zeit „null“ $ 0). Sie
beträgt ein Zehntel des gewichteten Mittelwerts von N aufgrund der zehnfachen Verdünnung durch die
Zugabe des Produkts und der Belastungssubstanz. Sie beträgt im Fall des modifizierten Verfahrens (5.5.4)
ein Hundertstel, da nur 0,1 ml von N in der Prüfung verwendet werden.

5.6.2.4 Berechnung von Na

Na ist die Anzahl der überlebenden Zellen je ml im Prüfgemisch [5.5.2.2 a) oder 5.5.3.2 a)] am Ende der
Einwirkzeit und vor der Neutralisation oder Membranfiltration. Sie ist zehnmal so hoch wie die Vc-Werte
aufgrund der Zugabe von Neutralisationsmedium und Wasser [5.5.2.2 b)] bzw. aufgrund des Probenvolumens
von 0,1 ml [5.5.3.2 b)] beim Membranfiltrationsverfahren.

a) Der Mittelwert für jede Verdünnungsstufe N a0 , N a 1 und bei Handwaschprodukten zusätzlich N a 2 wird
nach der folgenden Gleichung berechnet:

N a0 , N a 1, N a 2 $ 10 c / n (2)

Dabei ist

c die Summe der berücksichtigten Vc-Werte;

n die Anzahl der berücksichtigten Vc-Werte.

Wenn ein Vc-Wert oder beide Vc-Werte der Doppelbestimmung unterhalb des unteren oder oberhalb des
oberen Grenzwerts liegen, werden die Ergebnisse als „weniger als“ oder „mehr als“ angegeben.

BEISPIELE

a1 Vc-Werte der Doppelbestimmung N a 1 : 2, 16

( & 14 % 16 )
! Na 1 $ $ & 150 # 101 $ & 1500 $ & 1,5 # 103"
2
2
a2 Vc-Werte der Doppelbestimmung N a (Membranfiltration): ' 165, ' 165

( ' 165 % ' 165 )


! Na 2 $ $ ' 1650 # 102 $ ' 165 000 $ ' 1,65 # 105"
2

24
DIN EN 13727:2014-03
EN 13727:2012+A1:2013 (D)

a3 Vc-Werte der Doppelbestimmung (2 Ausstrichplatten je Probe von 1,0 ml): 660, 600

( 660 " 600 ) ! 10


N a0 # # 6300 # 6,3 ! 103
2
b) Zur Berechnung von Na sind nur die Ergebnisse für N a0 , N a$1 , N a$2 zu verwenden, bei denen ein Vc-Wert
oder beide Vc-Werte innerhalb der Auszählgrenzen liegt (liegen). Ausnahmen und Regeln für Sonderfälle:

ANMERKUNG Obwohl Verdünnungen von 10$2 nur hergestellt werden, wenn Handwaschprodukte geprüft werden,
schließen die folgenden Beispiele diese Verdünnungsstufe ein.

b1 Wenn alle nachfolgenden Verdünnungen von Na Mittelwerte von „mehr als“ aufweisen, ist nur die stärkste
Verdünnung (10$1, bei Handwaschprodukten 10$2) als Ergebnis für Na zu nehmen.
BEISPIEL 1
Vc1 Vc2 Mittelwert ! 10

N a0 660 660 6600


Na # 6600 ! 102 # 6,6 ! 105
N a$1 660 660 6600

N a$2 660 660 6600

b2 Wenn alle nachfolgenden Verdünnungen von Na Mittelwerte von „weniger als“ aufweisen, ist nur die
geringste Verdünnung (100) als Ergebnis für Na zu nehmen.
BEISPIEL 2
Vc1 Vc2 Mittelwert ! 10

N a0 % 14 18 % 160
Na # % 160 ! 100 # % 1,6 ! 102
N a$1 % 14 % 14 % 140

N a$2 % 14 % 14 % 140

b3 Wenn ein Vc-Wert oder beide Vc-Werte der Doppelbestimmung bei nur einer Verdünnung von Na
innerhalb der Auszählgrenzen liegt (liegen), ist dieses Ergebnis als Na zu verwenden.

BEISPIEL 3
Vc1 Vc2 Mittelwert ! 10

N a0 660 660 6600


Na # 1015 ! 101 # 1,0 ! 104
N a$1 96 107 1015

N a$2 % 14 % 14 140

b4 Wenn die stärkere Verdünnung bei zwei aufeinanderfolgenden Verdünnungen von Na einen Mittelwert
von „weniger als“ und die geringere Verdünnung einen Mittelwert von „mehr als“ zeigt, ist nur die
geringere Verdünnung als Wert für Na zu nehmen.

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DIN EN 13727:2014-03
EN 13727:2012+A1:2013 (D)

BEISPIEL 4
Vc1 Vc2 Mittelwert 10

N a0 " 660 " 660 " 6600


Na ! " 6600 100 ! " 6,6 103
N a#1 $ 14 29 $ 215

N a#2 $ 14 $ 14 $ 140

c) Zur Berechnung von Na als gewichteter Mittelwert werden höchstens zwei aufeinanderfolgende Verdün-
nungen verwendet. Ausnahmen und Regeln für Sonderfälle:

c1 Wenn ein Vc-Wert oder beide Vc-Werte der Doppelbestimmung bei drei oder mehr aufeinanderfolgenden
Verdünnungen von Na (einschließlich N a0 ) innerhalb der Auszählgrenzen liegt (liegen) (z. B. N a#2 : 17, 23;
N a#1 : 120, 135; N a0 : 308, " 330), ist die gesamte Prüfung ungültig (5.7.1).

c2 Wenn zwei aufeinanderfolgende Verdünnungen von Na Vc-Werte der Doppelbestimmung innerhalb der
Auszählgrenzen aufweisen, wird Na nach der Gleichung (3) als gewichteter Mittelwert berechnet:
c 10
Na ! (3)
2,2 10 Z
Dabei ist
c die Summe der berücksichtigten Vc-Werte;

Z der der geringeren Verdünnung entsprechende Verdünnungsfaktor, z. B. ist N a0 im Vergleich mit


N a#1 die geringere Verdünnung.

c3 Wenn in zwei aufeinanderfolgenden Verdünnungen von Na beide Vc-Werte der stärkeren Verdünnung
innerhalb der Auszählgrenzen liegen und ein Vc-Wert der geringeren Verdünnung ist „mehr als“, dann
wird Na nach der Gleichung (3) als gewichteter Mittelwert berechnet, siehe c2.

BEISPIEL 5
Vc1 Vc2 Mittelwert 10

N a0 " 538 320 " 4290


Na !
%" 538 ' 320 ' 46 ' 57 & 10
! " 4368,18 ! " 4,4 10 3
0
N a#1 46 57 515 2,2 10

N a#2 $ 14 $ 14 $ 140

c4 Wenn in zwei aufeinanderfolgenden Verdünnungen von Na einer der höheren Verdünnungswerte der
Doppelbestimmung „$ 14“ anzeigt, ist nur die niedrigere Verdünnung als Ergebnis für Na zu nehmen.

BEISPIEL 6
Vc1 Vc2 Mittelwert 10

N a0 " 660 " 660 " 6600


Na ! " 6145 101 ! " 6,1 104
N a#1 569 " 660 " 6145

N a#2 $ 14 26 $ 200

26
DIN EN 13727:2014-03
EN 13727:2012+A1:2013 (D)

5.6.2.5 Berechnung von NV, NV0 und NVB

NV ist die Anzahl der Zellen je ml in der Validierungssuspension [5.4.1.5 a)]. Sie ist aufgrund der
Verdünnungsstufe von 10 1 [5.4.1.5 b)] zehnmal höher als die in Vc-Werten angegebenen Keimzahlen.

NV0 ist die Anzahl der Zellen je ml in den Gemischen A, B und C am Anfang der Einwirkzeit (Zeit „0“) (5.6.1.1).
Im Fall der Kontrolle des Neutralisationsmediums B im Verdünnungs-Neutralisations-Verfahren (5.5.2.4), ist
es die Anzahl der Zellen je ml nach einer 100-fachen Verdünnung. NV0 beträgt ein Zehntel des Mittelwerts der
berücksichtigten Vc-Werte von Nv [5.4.1.6 c)], im Fall von NVB ist es ein Tausendstel.

NV, NVB und NV0 werden nach den folgenden Gleichungen berechnet:

NV ! 10c/n (4)

NVB ! 1000c/n (5)

NV0 ! c/n (6)

Dabei ist

c die Summe der berücksichtigten Vc-Werte;

n die Anzahl der berücksichtigten Vc-Werte.

5.6.2.6 Berechnung von A, B und C

A, B und C sind die Anzahlen der überlebenden Zellen bei der Kontrolle der Versuchsbedingungen A (5.5.2.3
oder 5.5.3.3), der Kontrolle des Neutralisationsmediums B (5.5.2.4) oder der Filtrationskontrolle (5.5.3.4) und
der Verfahrensvalidierung C (5.5.2.5 oder 5.5.3.5) am Ende der Einwirkzeit t (A) oder der festgelegten Zeiten
von 5 min (B) und 30 min (C). Sie entsprechen dem Mittelwert der berücksichtigten Vc-Werte der Gemische A,
B und C.

A, B und C werden nach folgender Gleichung berechnet:

A, B, C ! c/n (7)

Dabei ist

c die Summe der berücksichtigten Vc-Werte;

n die Anzahl der berücksichtigten Vc-Werte.

5.7 Verifizierung des Verfahrens

5.7.1 Allgemeines

Eine Prüfung ist valide, wenn:

" alle Ergebnisse die Kriterien von 5.7.3 erfüllen, und

" wenn sie nicht durch ein in 5.6.2.4 c), erster Sonderfall (c1) beschriebenes Ergebnis ungültig gemacht
wird.

5.7.2 Kontrolle der gewichteten mittleren Keimzahlen

Bei Ergebnissen, die unter Anwendung des gewichteten Mittelwertes zweier aufeinanderfolgender Verdün-
nungen berechnet werden (z. B. N), darf der Quotient aus den Mittelwerten der beiden Ergebnisse nicht
größer sein als 15 und nicht kleiner als 5. Bei Ergebnissen unterhalb des unteren Grenzwerts wird die Zahl

27
DIN EN 13727:2014-03
EN 13727:2012+A1:2013 (D)

des unteren Grenzwerts (14) verwendet. Bei Ergebnissen oberhalb des jeweiligen oberen Grenzwerts
[5.6.2.2 b)] wird die Zahl des oberen Grenzwerts verwendet.

BEISPIEL

Für N: Verdünnung 10 6: (168 ! 215) KBE/ml, Verdünnung 10 7: (20 ! " 14) KBE/ml;
(168 ! 215)/(20 ! 14) # 383/34 # 11, 26 # das Ergebnis liegt zwischen 5 und 15.

ANMERKUNG Wenn eine Reihe von Platten derselben Verdünnung (2 oder 4) außerhalb der für die Bestimmung der
Vc-Werte [5.6.2.2 b)] festgelegten Grenzwerte liegt, wird der Quotient des Mittelwertes der beiden Ergebnisse nicht
berechnet.

5.7.3 Grundlegende Grenzwerte

Es ist für jeden Prüfkeim zu überprüfen, ob:

a) N zwischen 1,5 $ 108 und 5,0 $ 108 liegt (8,17 % lg N % 8,70)


N (modifiziertes zwischen 1,5 $ 109 und 5,0 $ 109 liegt (9,17 % lg N % 9,70)
Verfahren 5.5.4)
N0 zwischen 1,5 $ 107 und 5,0 $ 107 liegt (7,17 % lg N0 % 7,70)

b) NV0 zwischen 30 und 160 liegt (3,0 $ 101 und 1,6 $ 102)
NV zwischen 3,0 $ 102 und 1,6 $ 103 liegt

NV (modifiziertes zwischen 3,0 $ 103 und 1,6 $ 104 liegt


Verfahren 5.5.4)
NVB (5.5.2.4) zwischen 3,0 $ 104 und 1,6 $ 105 liegt

c) A, B und C gleich oder größer als 0,5 $ NV0 sind


B (Verdünnungs-Neutralisations- gleich oder größer als 0,000 5 $ NVB ist
Verfahren) (halbes Eintausendstel)

d) Kontrolle der gewichteten mittleren Keinzahlen (5.7.2): der Quotient ist nicht kleiner als 5 und nicht
größer als 15.

ANMERKUNG Im Fall der Anwendung des modifizierten Verfahrens bei gebrauchsfertigen Produkten (5.5.4) sind die
Grenzwerte für N und NV zehnfach höher, N0, NV0 und NVB bleiben jedoch unverändert.

5.8 Angabe der Ergebnisse und Präzision

5.8.1 Keimreduktion

Die (Keim-)Reduktion (R # N0/Na) wird in logarithmischen Werten angegeben.

Für jeden Prüfkeim werden die Anzahl der KBE/ml in der Prüfsuspension N (5.6.2.3) und die Ergebnisse der
Prüfung Na (5.6.2.4) aufgezeichnet. N0 wird berechnet (5.6.2.3).

Für jede Produktkonzentration und jede Versuchsbedingung wird die dezimal-logarithmische (lg-)Reduktion
gesondert nach folgender Gleichung berechnet und aufgezeichnet:

lg R # lg N0 lg Na

Für die Kontrollen und die Validierung des Verdünnungs-Neutralisations-Verfahrens oder des Membran-
filtrationsverfahrens werden NV0 (5.6.2.5), die Ergebnisse von A, B und C (5.6.2.6) und deren Vergleich
mit NV0 [5.7.3 c)] aufgezeichnet.

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DIN EN 13727:2014-03
EN 13727:2012+A1:2013 (D)

5.8.2 Kontrolle der wirksamen und der unwirksamen Produktprüflösung (5.4.2)

Mindestens eine Konzentration je Prüfung [5.5.2.2 a) bis c) oder 5.5.3.2 a) bis c) oder 5.5.4] muss eine
lg-Reduktion um 5 Stufen oder mehr (bei !hygienischen" Handwaschprodukten eine lg-Reduktion um
3 Stufen oder mehr) aufweisen und mindestens eine Konzentration muss eine lg-Reduktion um weniger als
5 Stufen aufweisen (bei !hygienischen" Handwaschprodukten weniger als 3 Stufen).

5.8.3 Limitierender Prüfkeim und bakterizide Konzentration

Für jeden Prüfkeim wird die niedrigste Konzentration des Produkts, die die Prüfung besteht (lg R 5 oder bei
Handwaschprodukten lg R 3) aufgezeichnet. Als limitierender Prüfkeim wird der Prüfkeim aufgezeichnet, der
die höchste dieser Konzentrationen erfordert (es handelt sich um den Prüfkeim, der unter den gewählten
Versuchsbedingungen gegenüber dem Produkt am wenigsten empfindlich ist).

Die niedrigste Konzentration des Produkts, die noch auf den limitierenden Prüfkeim wirkt, ist die nach dieser
Europäischen Norm bestimmte bakterizide Konzentration.

5.8.4 Präzision, Wiederholungen

Unter Berücksichtigung der Präzision des Verfahrens, die durch eine statistische Analyse auf der Grundlage
der durch einen Ringversuch gelieferten Daten ermittelt wurde, wird eine Wiederholung der Prüfung
empfohlen [für eine Präzision von einer lg-Reduktion um ! 1 Stufe: es werden 4 Wiederholungen im
günstigsten Fall, 6 Wiederholungen im ungünstigsten Fall empfohlen (Anhang E)]. Die Entscheidung
hinsichtlich der Anzahl der Wiederholungen muss in Abhängigkeit dem geforderten Grad der Präzision
getroffen werden, wobei die vorgesehene Verwendung der Prüfergebnisse zu berücksichtigen ist.

Wiederholung bedeutet die Durchführung des vollständigen Prüfverfahrens mit gesondert hergestellten Prüf-
und Validierungssuspensionen. Die Wiederholungen dürfen auf den limitierenden Prüfkeim beschränkt
werden. Der Mittelwert (d. h. vor dem Logarithmieren) der Ergebnisse der Wiederholungen — nicht jedes
einzelne Ergebnis — muss eine lg-Reduktion um mindestens 5 Stufen (im Fall von Handwaschprodukten 3 lg)
nachweisen und ist ebenfalls zu berechnen und aufzuzeichnen.

5.9 Interpretation der Ergebnisse — Schlussfolgerung

5.9.1 Allgemeines

Entsprechend den gewählten Versuchsbedingungen können die nach dieser Norm ermittelten bakteriziden
Konzentrationen sich voneinander unterscheiden (Abschnitt 4). Ein Produkt kann nur die Prüfung bestehen,
wenn die Anforderungen nach 5.8.2 erfüllt sind.

5.9.2 Bakterizide Wirkung von Produkten zur Händedesinfektion und Händewaschung

Das Produkt wird für die Norm EN 13727 als bestanden gewertet, wenn es sich bei den Prüfkeimen um
Escherichia coli K12, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus und Enterococcus hirae handelt und
wenn in einer validen Prüfung von Produkten zur Händedesinfektion und Händewaschung bei 20 °C unter den
in dieser Norm festgelegten Bedingungen mindestens Folgendes nachgewiesen wird:

a) eine lg-Reduktion von 5 Stufen innerhalb von höchstens 1 min unter Bedingungen niedriger Belastung
(Mittel für die hygienische Händedesinfektion);

b) eine lg-Reduktion von 5 Stufen innerhalb von höchstens 5 min unter Bedingungen niedriger Belastung
(Mittel für die chirurgische Händedesinfektion);

c) eine lg-Reduktion von 3 Stufen innerhalb von höchstens 1 min unter Bedingungen hoher Belastung
(Mittel für die hygienische Händewaschung);

d) eine lg-Reduktion von !5 Stufen" innerhalb von höchstens 5 min unter Bedingungen hoher
Belastung (Mittel für die chirurgische Händewaschung).

29
DIN EN 13727:2014-03
EN 13727:2012+A1:2013 (D)

5.9.3 Bakterizide Wirkung von Produkten zur Instrumentendesinfektion

Das Produkt wird für die Norm EN 13727 als bestanden gewertet, wenn in einer validen Prüfung von
Produkten zur Instrumentendesinfektion eine lg-Keimreduktion um mindestens 5 Stufen innerhalb von
höchstens 60 min bei der vom Hersteller empfohlenen Mindesttemperatur, mindestens 20 °C und höchstens
70 °C, mit der gewählten Belastungssubstanz (Bedingungen niedriger oder hoher Belastung) unter den in
dieser Norm festgelegten Bedingungen nachgewiesen ist; dabei sind die Prüfkeime Pseudomonas
aeruginosa, Staphylococcus aureus und Enterococcus hirae (bei einer Temperatur von 40 °C oder mehr wird
nur E. faecium als Prüfkeim eingesetzt).

5.9.4 Bakterizide Wirkung von Produkten zur Oberflächendesinfektion

Das Produkt wird für die Norm EN 13727 als bestanden gewertet, wenn in einer validen Prüfung von
Produkten zur Oberflächendesinfektion eine lg-Keimreduktion um mindestens 5 Stufen innerhalb von
höchstens 5 min (oder zwischen 6 min und 60 min bei Produkten zur Anwendung auf Oberflächen, die keine
Einwirkung innerhalb von 5 min oder weniger erfordern) bei mindestens 4 °C und höchstens 30 °C mit der
gewählten Belastungssubstanz (Bedingungen niedriger oder hoher Belastung) unter den in dieser Norm
festgelegten Bedingungen nachgewiesen ist; dabei sind die Prüfkeime Pseudomonas aeruginosa,
Staphylococcus aureus und Enterococcus hirae.

5.9.5 Qualitätsnachweis für bestimmte Anwendungsgebiete

Siehe EN 14885.

5.10 Prüfbericht
Der Prüfbericht muss auf diese Europäische Norm (EN 13727) verweisen.

Der Prüfbericht muss mindestens folgende Angaben enthalten:

a) Identität des Prüflaboratoriums:

b) Identität des Auftraggebers;

c) Identifizierung der Probe:

1) Bezeichnung des Produkts;

2) Chargennummer und — falls vorliegend — Verfallsdatum;

3) Hersteller — sofern nicht bekannt: Lieferant;

4) Lieferdatum;

5) Lagerbedingungen;

6) vom Hersteller empfohlenes Verdünnungsmittel für das Produkt;

7) Wirksubstanz(en) und deren Konzentration(en) (optional);

8) Aussehen des Produkts;

d) Prüfverfahren und dessen Validierung:

1) bei Anwendung des Verdünnungs-Neutralisations-Verfahrens sind die vollständigen Einzelheiten der


Validierungsprüfung für das Neutralisationsmedium anzugeben;

2) bei Anwendung des Membranfiltrationsverfahrens sind die vollständigen Einzelheiten des Verfahrens
anzugeben, das zur Begründung der Anwendung des Membranfiltrationsverfahrens durchgeführt
wurde;

30
DIN EN 13727:2014-03
EN 13727:2012+A1:2013 (D)

e) Versuchsbedingungen:

1) Datum (Daten) der Prüfung (Analysenzeitraum);

2) für die Produktprüflösung verwendetes Verdünnungsmittel (Wasser standardisierter Härte oder


destilliertes Wasser);

3) Produktprüfkonzentrationen ( gewünschte Prüfkonzentrationen nach 5.4.2);

4) Aussehen der Produktverdünnungen;

5) Einwirkzeit(en);

6) Prüftemperatur(en);

7) Belastungssubstanz;

8) Stabilität und Aussehen des Gemisches während des Prüfablaufs (die Bildung irgendwelcher
Ausfällungen oder Ausflockungen ist zu dokumentieren);

9) Bebrütungstemperatur;

10) Neutralisationsmedium oder Spülflüssigkeit;

11) Identität der verwendeten Bakterienstämme;

f) Prüfergebnisse:

1) Kontroll- und Validierungsprüfungen;

2) Bewertung der bakteriziden Wirkung;

3) Anzahl der Wiederholungen je Prüfkeim;

g) besondere Bemerkungen;

h) Schlussfolgerung;

i) Ort, Datum und Unterschrift mit Namen.

ANMERKUNG Ein Beispiel eines typischen Prüfberichts ist Anhang D zu entnehmen.

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DIN EN 13727:2014-03
EN 13727:2012+A1:2013 (D)

Anhang A
(informativ)

Referenzstämme in nationalen Sammlungen

Escherichia coli K12 CIP 54.117


NCIMB 10083
CCUG 46621
NCTC 10538

Pseudomonas aeruginosa ATCC 15442


CIP 103467
DSM 939
NCIMB 10421
CCUG 2080

Staphylococcus aureus ATCC 6538


CIP 4.83
DSM 799
NCTC 10788
NCIMB 9518
CCUG 10778

Enterococcus hirae ATCC 10541


CIP 58.55
DSM 3320
NCIMB 8192
CCUG 32258

Enterococcus faecium ATCC 6057


DSM 2146

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DIN EN 13727:2014-03
EN 13727:2012+A1:2013 (D)

Anhang B
(informativ)

Neutralisationsmedien und Spülflüssigkeiten

Beispiele für Neutralisationsmedien für die verbleibende antimikrobielle Wirkung von chemischen
Desinfektionsmitteln und Antiseptika sowie Spülflüssigkeiten.

WICHTIG — Neutralisationsmedien für die verbleibende antimikrobielle Wirkung von chemischen


Desinfektionsmitteln und Antiseptika sowie Spülflüssigkeiten müssen nach den Vorgaben der Norm
validiert werden.

Tabelle B.1 — Neutralisationsmedien und Spülflüssigkeiten

Antimikrobieller Wirkstoff Chemische Verbindungen, die in der Lage Beispiele von geeigneten Neutralisationsmedien
sind, die verbleibende antimikrobielle und von Spülflüssigkeiten (für
Wirkung zu neutralisieren Membranfiltrationsverfahren)a

Quaternäre Ammoniumver- Lecithin, Saponin, Polysorbat 80, Natrium- 30 g/l Polysorbate 80 + 30 g/l Saponin + 3 g/l
bindungen und Fettamine laurylsulfate, Ethylenoxidkondensat aus
Lecithin.
Fettalkoholen (nichtionische Tenside)b
Amphotere Verbindungen
30 g/l Polysorbat 80 + 4 g/l Natriumlauryl-
sulfat + 3 g/l Lecithin.

3 g/l Ethylenoxidkondensat aus Fett-


alkoholen + 20 g/l Lecithin + 5 g/l Polysorbat 80.

Spülflüssigkeit: 1 g/l Trypton + 9 g/l NaCl; 5 g/l


Polysorbat 80.

Biguanide und ähnliche Ver- Lecithinc, Saponin, Polysorbat 80 30 g/l Polysorbat 80 + 30 g/l Saponin + 3 g/l
bindungen
Lecithin.

Spülflüssigkeit: 1 g/l Trypton + 9 g/l NaCl; 5 g/l


Polysorbat 80.

Oxidierende Verbindungen Natriumthiosulfatd 3 g/l bis 20 g/l Natriumthiosulfate + 30 g/l


(Chlor, Iod, Wasserstoffperoxid,
Katalase [für Wasserstoffperoxid oder Polysorbat 80 + 3 g/l Lecithin.
Peressigsäure, Hypochlorite,
usw.) Produkte, die Wasserstoffperoxid freisetzen]
50 g/l Polysorbat 80 + 0,25 g/l Katalase + 10 g/l
Lecithin.

Spülflüssigkeit: 3 g/l Natriumthiosulfat.

Aldehyde L-Histidin 30 g/l Polysorbat 80 + 3 g/l Lecithin + 1 g/l


Glycin L-Histidin (oder + 1 g/l Glycin).

30 g/l Polysorbat 80 + 30 g/l Saponin + 1 g/l


L-Histidin (oder + 1 g/l Glycin).

Spülflüssigkeit: 5 g/l Polysorbat 80 + 0,5 g/l L-Histidin


(oder + 1 g/l Glycin).

Phenolverbindungen und Lecithin 30 g/l Polysorbat 80 + 3 g/l Lecithin.


ähnliche Verbindungen:
2-Phenylphenol, Polysorbat 80 7 g/l Ethylenoxidkondensat aus Fett-
Phenoxyethanol, Triclosan,
Ethylenoxidkondensat aus Fettalkoholenb alkoholen + 20 g/l Lecithin + 4 g/l Polysorbat 80.
Phenylethanol, usw.
Spülflüssigkeit: 1 g/l Trypton + 9 g/l NaCl; 5 g/l
Anilide
Polysorbat 80.

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DIN EN 13727:2014-03
EN 13727:2012+A1:2013 (D)

Tabelle B.1 (fortgesetzt)

Antimikrobieller Wirkstoff Chemische Verbindungen, die in der Lage Beispiele von geeigneten Neutralisationsmedien
sind, die verbleibende antimikrobielle und von Spülflüssigkeiten (für
Wirkung zu neutralisieren Membranfiltrationsverfahren)a

Alkohole Lecithin, Saponin, Polysorbat 80e 30 g/l Polysorbat 80 + 30 g/l Saponin + 3 g/l
Lecithin.

Spülflüssigkeit: 1 g/l Trypton + 9 g/l NaCl; 5 g/l


Polysorbat 80.
a Der pH-Wert des Neutralisationsmediums oder der Spülflüssigkeit darf entsprechend dem pH-Wert des geprüften Produktes auf
einen geeigneten Wert eingestellt werden oder in Phosphatpuffer hergestellt werden [0,25 mol/l Phosphatpuffer aus: 34 g Kalium-
dihydrogenphosphat (KH2PO4); destilliertes Wasser (500 ml); eingestellt auf pH-Wert 7,2 ! 0,2 mit 1 mol/l Natriumhydroxid
(NaOH); aufgefüllt mit destilliertem Wasser auf 1 000 ml].
b Die Länge der Kohlenstoffkette variiert von C12 bis C18 Kohlenstoffatomen.
c Ei und Soja; Ei ist vorzuziehen.
d Der toxische Effekt des Natriumthiosulfats unterscheidet sich von einem Prüfkeim zum anderen.
e Zur Neutralisation von kurzkettigen Alkoholen (weniger als C5) kann eine einfache Verdünnung geeignet sein. Es sollte darauf
geachtet werden, ob die alkoholbasierten Produkte zusätzliche antimikrobielle Wirkstoffe enthalten.

ANMERKUNG 1 Andere Gemische von Neutralisationsmedien können für Produkte erforderlich sein, die mehr als
einen antimikrobiellen Wirkstoff enthalten.

ANMERKUNG 2 Die Konzentrationen der verschiedenen neutralisierenden Verbindungen oder des Neutralisations-
mediums an sich sind möglicherweise nicht ausreichend, um hohe Konzentrationen der Produkte zu neutralisieren.

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DIN EN 13727:2014-03
EN 13727:2012+A1:2013 (D)

Anhang C
(informativ)

Graphische Darstellung der Prüfverfahren

Bild C.1 — Verdünnungs-Neutralisations-Verfahren — Prüfverfahren (Na)

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DIN EN 13727:2014-03
EN 13727:2012+A1:2013 (D)

Bild C.2 — Verdünnungs-Neutralisations-Verfahren — Validierung

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DIN EN 13727:2014-03
EN 13727:2012+A1:2013 (D)

Bild C.3 — Membranfiltrationsverfahren — Prüfverfahren (Na)

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EN 13727:2012+A1:2013 (D)

Bild C.4 — Membranfiltrationsverfahren — Validierung

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EN 13727:2012+A1:2013 (D)

Bild C.5 — Verdünnungs-Neutralisations-Verfahren (modifiziertes Verfahren für gebrauchsfertige Produkte) — Prüfverfahren (Na)

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DIN EN 13727:2014-03
EN 13727:2012+A1:2013 (D)

Bild C.6 — Verdünnungs-Neutralisations-Verfahren (modifiziertes Verfahren für gebrauchsfertige Produkte) — Validierung

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DIN EN 13727:2014-03
EN 13727:2012+A1:2013 (D)

Bild C.7 — Membranfiltrationsverfahren (modifiziertes Verfahren für gebrauchsfertige Produkte) — Prüfverfahren (Na)

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DIN EN 13727:2014-03
EN 13727:2012+A1:2013 (D)

Bild C.8 — Membranfiltrationsverfahren (modifiziertes Verfahren für gebrauchsfertige Produkte) — Validierung

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DIN EN 13727:2014-03
EN 13727:2012+A1:2013 (D)

Anhang D
(informativ)

Beispiel eines typischen Prüfberichts

ANMERKUNG 1 Alle Namen/Bezeichnungen und Beispiele in Anhang D, mit Ausnahme der in dieser Europäischen
Norm verwendeten, sind frei erfunden.

ANMERKUNG 2 Als Beispiel sind nur die Prüfergebnisse für eine Wiederholung mit Pseudomonas aeruginosa
angegeben.

ANMERKUNG 3 Als zusätzliches Beispiel werden die Ergebnisse eines nach dem modifizierten Verfahren in 5.5.4
geprüften Produktes zur hygienischen Händedesinfektion angegeben, ohne dass ein vollständiger Prüfbericht erfolgt.

______________________________________________________________________________________

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Tel.: 011.57 83 62-0
Fax: 011-57 83 62-19
E-Mail: h.h.Q.lab@net.com

PRÜFBERICHT
EN 13727, BAKTERIZIDE WIRKUNG
(Mindest- und zusätzliche Bedingungen)
Auftraggeber: Cult Formulations Inc., Mannheim/Euroland
Desinfektionsmittelprobe
Bezeichnung des Produkts: JN (Instrumente und Oberflächen)
Chargennummer: 10-10-76
Hersteller oder — wenn nicht bekannt — Lieferant: MDI Formulations Inc. (Hersteller)
Lagerbedingungen (Temperatur und sonstige): Raumtemperatur, Dunkelheit
Aussehen des Produkts: flüssig, klar, gelblich
Wirksubstanz(en) und deren Konzentration(en): nicht angegeben
Vom Hersteller zur Anwendung empfohlenes Produktverdünnungsmittel: Trinkwasser
Prüfzeitraum
Lieferdatum des Produkts: 2010-05-01 Prüfdaten: siehe „Prüfergebnisse“ (beigefügt)
Versuchsbedingungen
Verdünnungsmittel für das Produkt: Wasser standardisierter Härte; Konzentrationen des geprüften
Produkts: siehe „Prüfergebnisse“ (beigefügt)
Prüfkeime: Pseudomonas aeruginosa ATCC 15442, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Enterococcus hirae
ATCC 10541, Enterococcus faecium ATCC 6057

Prüftemperatur: 25 °C, Einwirkzeit: 45 min; ( 50 °C, 60 min)

43
DIN EN 13727:2014-03
EN 13727:2012+A1:2013 (D)

Belastungssubstanz: 0,3 g/l Rinderserumalbumin Bedingungen mit niedriger Belastung; (! 3,0 g/l Rinder-
serumalbumin plus 3,0 ml/l Erytrozyten Bedingungen hoher Belastung)

Bebrütungstemperatur: 36 °C.

Prüfergebnisse: siehe beigefügte Blätter

Besondere Bemerkungen zu den Prüfergebnissen:

1. Alle Kontroll- und Validierungsergebnisse lagen innerhalb der grundlegenden Grenzwerte.


2. Mindestens eine Produktkonzentration wies eine lg-Reduktion um weniger als 5 Stufen auf.
3. Während des Prüfablaufs trat keine Ausfällung auf (die Prüfgemische waren homogen).

Schlussfolgerung:

Für das Produkt JN (Charge 10-10-76) beträgt die nach der Norm EN 13727 unter Bedingungen niedriger
Belastung innerhalb von 45 min bei 25 °C bestimmte bakterizide Konzentration für die Instrumenten- und
Oberflächendesinfektion:

1,0 % (Volumenanteil)

(die mittlere Reduktion bei sechs Wiederholungen mit dem limitierenden Prüfkeim Pseudomonas aeruginosa
betrug 1,2 " 105. Staphylococcus aureus und Enterococcus hirae wurden einmal geprüft und wiesen eine
lg-Reduktion um 5 oder mehr Stufen bei einer geringeren Konzentration als bei Pseudomonas aeruginosa
auf.)

Für das Produkt JN (Charge 10-10-76) beträgt die unter Verwendung von Enterococcus faecium ATCC 6057
als Prüfkeim nach der Norm EN 13727 unter Bedingungen hoher Belastung bei 40 °C und einer Einwirkzeit
von 60 min bestimmte bakterizide Konzentration für die spezifische Instrumentendesinfektion:

0,50 % (Volumenanteil)

Antiseptville, 2010-11-11

Alexander May, MD, PhD, Wissenschaftlicher Direktor

44
DIN EN 13727:2014-03
EN 13727:2012+A1:2013 (D)

Prüfergebnisse (quantitativer Suspensionsversuch auf bakterizide Wirkung)


EN........ 13727 ....... (Phase 2, Stufe 1) Produktbezeichnung: JN .... (Instrumente und Chargennummer: .... 10-10-76
Oberflächen)
Bemerkungen:
Verdünnungs-Neutralisations- X Gussplatten- Oberflächen- X Anzahl der Platten............... 2/ml
Verfahren verfahren verfahren
Neutralisationsmedium: ................. 3,0 g/l Lecithin in Verdünnungsmittel...............................................................................
Membranfiltrationsverfahren Spülflüssigkeit: .............................................................................................................
Prüftemperatur: ....... 25 °C Belastungssubstanz: ...........0,3 g/l Rinderserumalbumin ..................
Prüfkeim: Pseudomonas aeruginosa ATCC 15442 Bebrütungstemperatur: ....... 36 °C
Interne Lab.-Nr.: QS 68/00 .... Prüfdatum: ....2010-06-06 Verantwortlicher: ........... Fang..... Unterschrift: ... Fang ........
Verdünnungsmittel für die Produktprüflösungen: Wasser Aussehen der Produktprüflösungen: ............... klar ...............

Validierung und Kontrollen


Validierungs- Kontrolle der Versuchs- Kontrolle des Neutralisations- Verfahrensvalidierung (C)
suspension (NV0) bedingungen (A) mediums oder Produktkonzentration: 10 ml/l
Filtrationskontrolle (B)
86 79 86 75
VC1 VC1 VC1 VC1
(40 46) (43 36) (42 44) (35 40)
x ! 89 x ! 81,5 x ! 88,5 x ! 81
92 84 91 87
VC2 VC2 VC2 VC2
(47 45) (39 45) (43 48) (41 46)
x von B ist # 0,5 $ x
x von A ist # 0,5 $ x von NV0 x von C ist # 0,5 $ x
30 " x von NV0 " 160?
von NV0? von NV0?
(oder NVB/1 000)?
X ja nein X ja nein X ja nein X ja nein
VC1 99 VC2 71 30 " x von NVB /1 000 " 160 ?
Validierungssuspension (NVB) x ! 85
(49 50) (39 32) ja nein

Prüfsuspension und Prüfsuspension N VC1 VC2 xwm ! 193,64 $ 106 ! lg N 8,29


Prüfung (N und N0):
10!6 168 213 N0 N/10 lg N0 7,29

10!7 20 25 7,17 " N0 " 7,70? X ja nein

Tatsächliche Verdün- VC1 VC2 Na ( x oder lg Na lg R Einwirkzeit


Produkt- nungsstufe x wm # 10) (lg N0 7,29) (min)
konzen-
tration %
100 $ 660 $ 660 8 100 3,91 3,38 45
0,50
10–1 77 85
100 122 154 1 395,5 3,15 4,14 45
0,75
10–1 14 17
100 7 0 % 140 % 2,15 $ 5,14 45
1,00
10–1 0 0
Auszählung je Platte für:
N 10!6: 80 & 88; 105 & 108 10!7: 9 & 11; 15 & 10
Na 0,50 %: 10!1: 42 & 35; : 44 & 41; 0,75 % 100: 66 & 56; : 71 & 83 10!1: 3 & 11 10 & 7
1,00 %: 10!0: 1 & 6
Erläuterungen:
VC Keimzahl je ml (eine Platte oder mehr) xwm gewichteter Mittelwert von x
x Mittelwert von VC1 und VC2 (1. und 2. Doppelbestimmung) R Keimreduktion (lg R lg N0 - lg Na)

45
DIN EN 13727:2014-03
EN 13727:2012+A1:2013 (D)

Prüfergebnisse (Suspensionsprüfung auf bakterizide Wirkung). Die Prüfergebnisse für die anderen
beiden geprüften Konzentrationen sind in diesem Beispiel nicht enthalten.
EN ........ 13727 ....... (Phase 2, Stufe 1)
Produktname: .............. BU Chargennummer: .... 26-01-48
........ (hygienische Händedesinfektion)..
Bemerkungen: Gebrauchsfertiges Produkt siehe 5.5.4.
Verdünnungs-Neutralisations- X Gussplatten- Oberflächen- X Anzahl der Platten .............. 2/ml
Verfahren verfahren verfahren
Neutralisationsmedium: ................. 3,0 g/l Lecithin in Verdünnungsmittel ...............................................................................
Membranfiltrationsverfahren Spülflüssigkeit: .............................................................................................................
Prüftemperatur: ....... 20 °C Belastungssubstanz: .......... 0,3 g/l Rinderserumalbumin .................
Prüfkeim: Pseudomonas aeruginosa ATCC 15442 Bebrütungstemperatur: ....... 36 °C
Interne Lab.-Nr.: QS 68/12 .... Prüfdatum: .... 2010-05-27 Verantwortlicher: ........... Fang ..... Unterschrift: ... Fang .......
Verdünnungsmittel für die Produktprüflösungen: Aussehen der Produktprüflösungen: ............... klar ...............
Wasser standardisierter Härte ..............................................

Validierung und Kontrollen

Validierungs- Kontrolle der Versuchs- Kontrolle des Verfahrensvalidierung (C)


suspension (NV0) bedingungen (A) Neutralisationsmediums Produktkonzentration: unverdünnt
oder Filtrationskontrolle (B)

86 VC1 30 s 79 86 VC1 30 s 75 (35 40)


VC1 x ! 81,5 VC1 x ! 81
(40 46) VC2 30 s 84 (42 44) VC2 30 s 87 (41 46)
x ! 89 x ! 88,5
VC1 1 min 75 VC1 1 min 82 (37 45)
92 91
VC2 x ! 78,5 VC2 x ! 80,5
(47 45) VC2 1 min 82 (43 48) VC2 1 min 79 (35 44)
x von B ist # 0,5 $ x
x von A ist # 0,5 $ x von NV0 x von C ist # 0,5 $ x
30 " x von NV0 " 160?
von NV0? von NV0?
(oder NVB/1 000) ?
X ja nein X ja nein ja nein X ja nein
VC1 99 VC2 71 30 " x von NVB /1 000 " 160 ?
Validierungssuspension (NVB) x ! 85
(49 50) (39 32) ja nein

Prüfsuspension und Prüfsuspension N VC1 VC2 xwm ! 193,64 $ 107 ; lg N 9,29


Prüfung (N und N0):
10!7 168 213 N0 N/100; lg N0 7,29

10!8 20 25 7,17 " lgN0 " 7,70? X ja nein

Tatsächliche Verdün- VC1 VC2 Na ( x oder lg Na lg R Einwirkzeit


Produktkonzen- nungsstufe (lg N0 7,29) (min)
xwm # 10)
tration %
100 $ 660 $ 660 8 100 3,91 3,38 0,5 (30 s)
10!1 77 85
97
100 7 0 % 140 % 2,15 $ 5,14 1
10!1 0 0
Auszählung je Platte für:

N 10!7: 80 & 88; 105 & 108 10!8: 9 & 11; 15 & 10 Na 0,5 min: 42 & 35; : 44 & 41; 1 min: 1 & 6
A 30 s: 43 & 36; 39 & 45 1 min: 45 & 30; 43 & 39
Erläuterungen:
VC Keimzahl je ml (eine Platte oder mehr) xwm gewichteter Mittelwert von x
x Mittelwert von VC1 und VC2 (1. und 2. Doppelbestimmung) R Keimreduktion (lg R lg N0 - lg Na)

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DIN EN 13727:2014-03
EN 13727:2012+A1:2013 (D)

Anhang E
(informativ)

Präzision des Prüfergebnisses

Der Anwendungsbereich der Studie besteht in der Bestimmung der Präzision des Prüfverfahrens innerhalb
und zwischen einer Zufallsstichprobe von Laboratorien. Es wird der Probenumfang bestimmt, der zum
Erreichen einer Präzision der lg-Reduktion von 1 Stufe erforderlich ist.

Für die Bestimmung des geforderten Probenumfangs ist es notwendig, die unerklärte Restvarianz bei
unterschiedlichen Versuchen mengenmäßig zu bestimmen. Diese Varianz wird abgeschätzt mithilfe eines
statistischen Mischmodells unter Einbeziehung des zufälligen Effekts von Laboratorien und des festen Effekts
der Kombination aus einem festgelegten Prüfkeim, einem Produkts und einer Einwirkzeit. Die Reduktion wird
durch unterschiedliche Produktkonzentrationen ermittelt, die mit R_1, R_2, R_3 (und in diesem Fall R_4)
beschriftet werden. Für jede Reduktion werden getrennte statistische Analysen durchgeführt.

Die statistischen Analysen erfolgen unter Verwendung verschiedener Datensätze. Im Gegensatz zum
„eingeschränkten“ Fall, bei dem eine gemessene Reduktion aus der statistischen Analyse ausgeschlossen
wird, wenn der Wert unter 0 oder über 5 liegt, werden im „uneingeschränkten“ Fall alle zur Verfügung
stehenden Daten verwendet.

An dieser Studie waren zehn Laboratorien aus verschiedenen europäischen Ländern beteiligt und sie wurde
während der Jahre 2000 bis 2002 durchgeführt. Jedes Laboratorium hat die Prüfung mindestens dreimal
wiederholt.

Neben dem zufälligen Effekt der Laboratorien wurde eine mögliche Einflussnahme des Prüfkeims, des
Produkts und der Einwirkzeit auf die unabhängige variable Reduktion untersucht.

Der Versuchsaufbau ist nicht ausgewogen, d. h., nicht alle möglichen Kombinationen wurden geprüft. Aus
diesem Grund wurde eine neue, als Einfluss bezeichnete Variable geschaffen, die alle drei Variablen
(Prüfkeim, Produkt und Einwirkzeit) mit deren verschiedenen möglichen Ausprägungsformen kombiniert, z. B.
P. aeruginosa - Glutaraldehyd - 5 min in den einen Einfluss „1“ (siehe Tabelle E.1).

Tabelle E.1 — Anzahl der Wiederholungen (uneingeschränkter Datensatz) für eine Vorgabe von
Prüfkeim, Produkt, Einwirkzeit und Laboratorium sowie unabhängige Variablen R_1, R_2 und R_3.
Jede Zelle zeigt die Anzahl der Wiederholungen für die durch ein Semikolon getrennten vorgegebenen
Reduktionen R_1, R_2 und R_3

Kennnummer des Laboratoriums


Geprüftes Einwirk- Ein-
Prüfkeim 3 6 9 10 11 14 20 26 30 34
Produkt zeit fluss

Glutar-
P. aeruginosa 1 -;-;- 6;6;- 6;6;- -;5;- 6;6;- 4;4;- 3;6;- -;-;- -;-;- 6;6;-
aldehyd
5
Peressig-
S. aureus 2 -;-;- 12;12;12 12;12;12 5;6;6 6;6;- 6;6;6 -;-;- 6;-;6 7;8;8 6;6;6
säure

E. hirae 3 -;-;- 6;6;- 12;12;- 6;6;- 6;6;- 6;6;- 6;6;- 4;4;- 6;6;- 6;6;-
Glutar-
P. aeruginosa 60 4 -;-;- 6;6;- 12;12;- 6;6;- 6;6;- 5;5;- 5;3;- 6;6;- 6;6;- 6;-;-
aldehyd
S. aureus 5 6;6;- 6;6;- 12;12;- 6;6;- 6;6;- 6;6;6 5;6;- 6;6;- 5;5;- 6;6;6

Tabelle E.1 zeigt, dass die Kombination von Glutaraldehyd, 60 min und E. hirae, P. aeruginosa und S. aureus
in allen Laboratorien, mit Ausnahme von Laboratorium 3, geprüft wurde. Das Letztgenannte wurde von der
statistischen Analyse ausgeschlossen, da die Abschätzung der Varianzkomponenten Datensätze mit vollem
Rang erfordert.

47
DIN EN 13727:2014-03
EN 13727:2012+A1:2013 (D)

Tabelle E.1 macht auch deutlich, dass die Laboratorien nicht alle geforderten Prüfungen, insbesondere im Fall
von „Einfluss 1“ (Pseudomonas aeruginosa/Glutaraldehyd/Einwirkzeit 5 min) durchgeführt haben. Ungeachtet
dessen ist der neue Aufbau die beste Möglichkeit, die für die Berechnung der Präzision der Prüfergebnisse
und deren Abhängigkeit von der Anzahl der Wiederholungen benötigte Restvarianz abzuschätzen.

Ergebnisse

Uneingeschränkte und eingeschränkte Mischeffektmodelle, die R_1 bis R_3 als abhängige Variable sowie
Einfluss als festen und Laboratorium als zufälligen Effekt verwenden, kommen zum Einsatz, um die Varianz-
komponenten abzuschätzen.

Tabelle E.2 — Ergebnisse der statistischen Analysen („Est. Var“: geschätzte Varianz; „SE“:
Standardfehler; „Z“: Prüfwert; „Pr Z“: Signifikanz; N Anzahl der eingeschlossenen Ergebnisse)
Uneingeschränkt Eingeschränkt

Varianz- Est.Var. SE Z Pr Z Varianz- Est. SE Z Pr Z


komponente komponente Var.

R_1 Laboratorium 0,510 9 0,324 4 1,57 0,0576 Laboratorium 0,472 5 0,302 6 1,56 0,0592

Rest 0,196 3 0,018 6 10,58 ! 0,000 1 Restwert 0,178 2 0,017 1 10,41 ! 0,000 1

N 265 N 285

Varianz- Est. SE Z Pr Z Varianz- Est. SE Z Pr Z


komponente Var. komponente Var.

R_2 Laboratorium 0,708 9 0,537 4 1,32 0,0936 Laboratorium 0,511 4 0,471 5 1,08 0,139 0

Rest 0,376 1 0,035 3 10,65 ! 0,000 1 Restwert 0,329 3 0,033 0 9,98 ! 0,000 1

N 268 N 237

Varianz- Est. SE Z Pr Z Varianz- Est. SE Z Pr Z


komponente Var. komponente Var.

R_3 Laboratorium 1,348 7 0,909 7 1,48 0,0691 Laboratorium 0,580 3 0,658 4 0,88 0,189 1

Rest 0,865 7 0,166 7 5,19 ! 0,000 1 Restwert 0,788 9 0,170 8 4,62 ! 0,000 1

N 62 N 52

„Laboratorium“ in Tabelle E.2 bedeutet die Varianz zwischen den Laboratorien und „Rest“ bedeutet die
unerklärte Restvarianz innerhalb der Laboratorien.

Der feste Effekt des Einflusses auf die Reduktion kann für R_3 aufgrund unzureichender Daten nicht
abgeschätzt werden. Für R_1 und R_2 ist dieser Effekt signifikant, außer wenn bei R_2 der eingeschränkte
Datensatz verwendet wird.

Die in Tabelle E.2 angegebenen geschätzten Restvarianzen werden verwendet, um die Präzision der
Prüfergebnisse zu bestimmen. Die zur Berechnung der Präzision der Prüfergebnisse verwendete Gleichung
kann EN 1040:2005, Anhang E entnommen werden. Abgeleitet wird der ungünstigste Fall (größte Varianz)
aus dem „uneingeschränkten“ R_3, Var. Est. 0,865 7 und der günstigste Fall (kleinste Varianz) aus dem
„eingeschränkten“ R_1, Var. Est. 0,178 2.

Wie aus nachstehend angeführtem Bild E.1 zu entnehmen ist, ergibt die Anzahl der Wiederholungen von vier
(günstigster Fall) oder sechs (ungünstigster Fall) oder mehr Wiederholungen eine Präzision der Reduktion
von " 1 lg oder weniger.

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DIN EN 13727:2014-03
EN 13727:2012+A1:2013 (D)

Legend

X Anzahl der Wiederholungen


Y Präzision [in lg-Stufen]

schlechtester Fall
bester Fall

Bild E.1 — Abhängigkeit der Präzision der Reduktion (y Achse) vom Probenumfang (x Achse) für den
ungünstigsten und den günstigsten Fall

49
DIN EN 13727:2014-03
EN 13727:2012+A1:2013 (D)

Anhang ZA
(informativ)

Zusammenhang zwischen dieser Europäischen Norm und den


grundlegenden Anforderungen der EU-Richtlinie 93/42/EWG

Diese Europäische Norm wurde im Rahmen eines Mandates, das dem CEN von der Europäischen
Kommission und der Europäischen Freihandelszone erteilt wurde, erarbeitet, um ein Mittel zur Erfüllung der
grundlegenden Anforderungen der Richtlinie nach der neuen Konzeption 93/42/EWG bereitzustellen.

Sobald diese Norm im Amtsblatt der Europäischen Union im Rahmen der betreffenden Richtlinie in Bezug
genommen und in mindestens einem der Mitgliedstaaten als nationale Norm umgesetzt worden ist, berechtigt
die Übereinstimmung mit den in Tabelle ZA.1 aufgeführten Abschnitten dieser Norm innerhalb der Grenzen
des Anwendungsbereichs dieser Norm zu der Annahme, dass eine Übereinstimmung mit den entsprechenden
grundlegenden Anforderungen der Richtlinie und der zugehörigen EFTA-Vorschriften gegeben ist.

Tabelle ZA.1 — Zusammenhang zwischen dieser Europäischen Norm und der Richtlinie 93/42/EWG

Abschnitte dieser Grundlegende Anforderungen der


Erläuterungen/Anmerkungen
Europäischen Norm Richtlinie 93/42/EWG
1, 2, 3 und 4 6a (in Verbindung mit Anhang X, 1,1d) Diese Norm ist vorgesehen für
Produkte, deren hauptsächlicher
Wirkungsanspruch mikrobiozider
Natur ist, z. B. für chemische Des-
infektionsmittel und Antiseptika.
Ein Vergleich mit den Anfor-
derungen dieser Norm weist die
bakterizide Wirksamkeit eines
Produktes nach. Im Allgemeinen
muss mindestens eine zusätzliche
Europäische Norm (Phase 2,
Stufe 2) eingehalten werden, um
eine ausreichende Bewertung
solcher Produkte nachzuweisen.

WARNHINWEIS — Für Produkte, die in den Anwendungsbereich dieser Norm fallen, können weitere
Anforderungen und weitere EU-Richtlinien anwendbar sein.

50
DIN EN 13727:2014-03
EN 13727:2012+A1:2013 (D)

Literaturhinweise

[1] Europäische Pharmacopoeia (EP), Ausgabe 1997 Ergänzung 2000, Wasser für Injektionszwecke.

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