MÉTODO COLORIMÉTRICO PARA LA DETERMINACIÓN DE LOS

COMPUESTOS ORTODIFENÓLICOS EN LOS ACEITES DE OLIVA

MÉTODO REVISADO: diciembre de 2007

Arturo Cert, Ana Romero y R. Cert

Instituto de la Grasa, (CSIC), Sevilla (España)

1.- Material y aparatos

1.1.- Equipo para extracción en fase sólida (SPE)

1.2.- Cartuchos de diol (fase ligada) de 6 ml (0,5 g) (Waters o similar)
1.3.- Filtro de jeringa de acetato de celulosa; tamaño del poro: 0,45 µm (Alltech,
Scharlab o similar)
1.4.- Evaporador rotatorio bajo vacío
1.5.- Espectrofotómetro UV-visible a λ = 370 nm, provisto de cubetas de
absorción de cuarzo con recorrido de 10 mm

2.- Disolventes y reactivos

2.1.- N-hexano para análisis

2.2.- Mezcla de n-hexano y acetato de etilo 90:10 (v/v)
2.3.- Metanol para espectrometría UV
2.4.- Agua destilada o desionizada
2.5.- Molibdato sódico dihidratado para análisis (Merck o similar)
2.6.- Pirocatecol (catecol) (≥ 99%) (Aldrich o similar)
2.7.- Solución de metanol y agua 1:1 (v/v)
2.8.- Solución A de metanol y agua 1:1 acidificada con ácido clorhídrico y
preparada mediante la adición de 0,5 ml de 6N HCl a 100 ml de solución
de metanol y agua 1:1 (2.7)
2.9.- Solución de molibdato sódico dihidratado al 5% en metanol y agua 1:1
(2.7)

3.- Línea de calibrado

Obtener una línea de calibrado (concentración, expresada en mmol/ml, en

relación con la absorbancia) mediante la medición de las soluciones de pirocatecol en la
solución A (2.8). Preparar las soluciones de pirocatecol dentro del intervalo de 0,02 a
0,07 mg/ml. Preparar estas soluciones en el momento y protegerlas de la luz. Con ayuda
de una pipeta, tomar 2 ml de solución fenólica y verterlos en una probeta. A
continuación, añadir 0,5 ml de solución de molibdato sódico (2.9) y agitar la mezcla.
Medir la absorbancia a λ = 370 nm. Corregir la absorbancia de la solución fenólica
mediante la absorbancia de un blanco obtenido mezclando 2 ml de solución fenólica y
0,5 ml de mezcla de metanol y agua 1:1 (2.7).

1
 Con las soluciones de catecol, hidroxitirosol y acetato de hidroxitirosol se
obtuvo la siguiente ecuación para el intervalo de absorbancia de entre 0,2 y 0,8:

Concentración de o-difenoles (mmol/ml) = (-0,170 + 8,236 * ABS) * 10-4

siendo ABS = absorbancia de la solución fenólica – absorbancia del blanco.

4.- Aislamiento del extracto fenólico

Disolver una muestra de aceite de oliva (6 ± 0,001 g) en 6 ml de hexano (2.1).

Colocar un cartucho de diol con fase ligada de 6 ml (1.2) en un aparato de
elución en vacío y acondicionarlo pasando 9 ml de metanol (2.3) y luego 9 ml de
hexano (2.1). A continuación, liberar el vacío par evitar que se seque la columna.
Inyectar la solución de aceite en la columna para su paso por el cartucho. Lavar
el recipiente de la muestra con dos dosis de 4 ml de hexano extraídos del cartucho.
Volver a lavar el recipiente de la muestra con 3 ml de la mezcla de hexano y acetato de
etilo (90:10, v/v) (2.2) extraídos del cartucho y desechados. A continuación, colocar un
matraz cónico de 25 ml y eluir la columna con 15 ml de metanol (2.3). Evaporar el
disolvente en un evaporador rotatorio a temperatura ambiente bajo vacío hasta secarlo.
Disolver el residuo en 5 ml de solución A acidificada (2.8).

5.- Determinación espectrofotométrica

Con ayuda de una pipeta provista de un filtro de jeringa de acetato de celulosa,

tomar 2 ml del extracto fenólico y verterlos en una probeta. A continuación, añadir
0,5 ml de solución de molibdato sódico (2.9) y agitar la mezcla. Medir la absorbancia a
λ = 370 nm. Corregir la absorbancia de la solución fenólica mediante la absorbancia de
un blanco obtenido mezclando 2 ml del extracto fenólico y 0,5 ml de mezcla de metanol
y agua 1:1 (2.7).

Si la absorbancia de la solución fenólica es superior a 0,8, ha de obtenerse y

disolverse un nuevo extracto fenólico en 10 ml de solución A (2.8) en lugar de 5 ml.
Una alternativa puede ser la extracción a partir de 3 g de aceite.

Si la absorbancia de la solución fenólica es inferior a 0,2, se han de mezclar los

extractos fenólicos de dos o más cartuchos y disolverlos en 5 ml de solución A (2.8).
Utilizando un solo cartucho, la concentración mínima determinada es de 0,15 mmol/kg
de aceite.

2
5.- Cálculos

La concentración de o-difenoles en los aceites, expresada en milimoles/kg, se

calcula como sigue:

[C] en aceite (mmol/kg) = (Cextr * 2,5 * Vextr * 1.000) / 2 * Waceite

siendo:
Cextr (mmol/ml) = concentración en el extracto calculada aplicando la
absorbancia a la línea de calibrado;
2,5 = volumen (ml) de la mezcla de reacción;
Vextr = volumen total (ml) de la solución de extracción (normalmente, 5 ml);
2 = volumen (ml) de la solución de extracción para la reacción;
Waceite = peso (g) de la muestra de aceite.

Los resultados han de expresarse en milimoles de o-difenoles por kg de aceite.

_____