Introducción

Debido a la aplicabilidad general de las pruebas de citotoxicidad in vitro y su uso generalizado en la evaluación de una
amplia gama de dispositivos y materiales, es el propósito de esta parte de ISO 10993, en lugar de especificar una sola
prueba, definir un esquema de pruebas que requiere que las decisiones se tomen en una serie de pasos. Esto debería
conducir a la selección de la prueba más adecuada.
Se enumeran tres categorías de prueba: prueba de extracto, prueba de contacto directo, prueba de contacto indirecto.
La elección de una o más de estas categorías depende de la naturaleza de la muestra a evaluar, del lugar potencial de uso
y de la naturaleza del uso.
Esta elección determina entonces los detalles de la preparación de las muestras a ensayar, la preparación de las células
cultivadas y la forma en que las células se exponen a las muestras de sus extractos.
Al final del tiempo de exposición, se lleva a cabo la evaluación de la presencia y extensión del efecto citotóxico.
Es la intención de esta parte de la ISO 10993 dejar abierta la elección del tipo de evaluación. Tal estrategia pone a
disposición una batería de pruebas, que refleja el enfoque de muchos grupos que abogan por las pruebas biológicas in
vitro.
Los numerosos métodos utilizados y los criterios de valoración medidos en la determinación de la citotoxicidad pueden
agruparse en las siguientes categorías de evaluación:
⎯ Evaluación del daño celular por medios morfológicos;
⎯ Medidas del daño celular;
⎯ Mediciones del crecimiento celular;
⎯ Mediciones de aspectos específicos del metabolismo celular.
Hay varias formas de producir resultados en cada una de estas cuatro categorías. El investigador debe ser consciente de
las categorías de prueba y en qué categoría se ajusta una técnica particular, a fin de que las comparaciones puedan
hacerse con otros resultados en dispositivos o materiales similares, tanto a nivel intra e interlaboratorio.
En los anexos se dan ejemplos de protocolos de ensayo cuantitativos. En esta parte de la norma ISO 10993 se dan
orientaciones para la interpretación de los resultados.

Evaluación biológica de dispositivos médicos

Parte 5:
Pruebas de citotoxicidad in vitro
1 Alcance
Esta parte de ISO 10993 describe métodos de prueba para evaluar la citotoxicidad in vitro de dispositivos médicos.
Estos métodos especifican la incubación de células cultivadas en contacto con un dispositivo y / o extractos de un
dispositivo, ya sea directamente oa través de la difusión.
Estos métodos están diseñados para determinar la respuesta biológica de células de mamífero in vitro usando parámetros
biológicos apropiados.

2 Referencias normativas
Los siguientes documentos de referencia son indispensables para la aplicación de este documento. Para las referencias
con fecha, sólo se aplica la edición citada. Para referencias sin fecha, se aplica la última edición del documento de
referencia (incluyendo cualquier enmienda).
ISO 10993-1, Evaluación biológica de dispositivos médicos - Parte 1: Evaluación y pruebas dentro de un sistema de gestión
de riesgos
ISO 10993-12, Evaluación biológica de dispositivos médicos - Parte 12: Preparación de muestras y materiales de referencia

3 Términos y definiciones
A los efectos de este documento, se aplican los términos y definiciones que figuran en la ISO 10993-1 y los siguientes.
3.1 Recipientes de cultivo
Recipientes apropiados para el cultivo celular incluyendo placas de petri de vidrio, matraces de cultivo de plástico o
multipocillos de plástico y placas de microtitulación
NOTA Estos pueden usarse indistintamente en estos métodos siempre que cumplan los requisitos del grado de cultivo de
tejidos y sean adecuados para uso con células de mamífero.
3.2 Material de control positivo
Material que, cuando se prueba de acuerdo con esta parte de ISO 10993, proporciona una respuesta citotóxica reproducible
NOTA El propósito del control positivo es demostrar una respuesta apropiada del sistema de prueba. Por ejemplo, se ha
utilizado un poliuretano estabilizado con organoestaño1) como control positivo para materiales sólidos y extractos. Las
diluciones de fenol, por ejemplo, se han utilizado como control positivo para los extractos. Además de un material, los
productos químicos puros también se pueden utilizar para demostrar el funcionamiento del sistema de prueba.
3.3 Blanco
Vehículo de extracción que no contenga la muestra de ensayo, retenido en un recipiente idéntico al que contiene la muestra
de ensayo y sometido a condiciones idénticas a las a las que se somete la muestra de ensayo durante su extracción
NOTA El propósito de la pieza en blanco es evaluar los posibles efectos de confusión debidos al recipiente de extracción,
al vehículo y al proceso de extracción.
3.4 Material de control negativo
Material que, cuando se ensaya de acuerdo con esta parte de ISO 10993, no produce una respuesta citotóxica
NOTA El propósito del control negativo es demostrar la respuesta de fondo de las células. Por ejemplo, polietileno de alta
densidad2) para polímeros sintéticos y barras de cerámica de óxido de aluminio para material dental se han utilizado como
controles negativos.
3.5 Muestra de prueba
Material, dispositivo, parte del dispositivo, componente, extracto o parte de la misma que se somete a pruebas o
evaluaciones biológicas o químicas
3.6 Subconfluencia
Aproximadamente 80% de confluencia, es decir, el final de la fase logarítmica de crecimiento

4 Preparación de muestras y control

4.1 General
El ensayo se realizará en
a) un extracto de la muestra de ensayo y / o
b) la propia muestra de ensayo.
La preparación de la muestra deberá estar de acuerdo con la norma ISO 10993-12.
Se incluirán controles negativos y positivos en cada ensayo.
4.2 Preparación de extractos líquidos de material
4.2.1 Principios de extracción
Las condiciones de extracción deben intentar simular o exagerar las condiciones de uso clínico para determinar el peligro
toxicológico potencial sin causar cambios significativos en la muestra de prueba, como fusión, fusión o cualquier alteración
de la estructura química, a menos que se espere durante la aplicación clínica. Debido a la naturaleza de ciertos materiales
(por ejemplo, materiales biodegradables), puede producirse una alteración de la estructura química durante el
procedimiento de extracción.
NOTA La concentración de cualquier sustancia endógena o extraña en el extracto, y por lo tanto la cantidad expuesta a las
células de ensayo, depende del área interfacial, el volumen de extracción, pH, solubilidad química, velocidad de difusión,
osmolaridad, agitación, temperatura, tiempo y otros factores.
Para los dispositivos que implican mezclar dos o más componentes en el paciente para llegar al dispositivo final (por
ejemplo cemento óseo), el dispositivo final no debe ser lavado antes de la extracción. Lavar la muestra de ensayo puede
reducir o eliminar los residuos presentes en el dispositivo. Si se va a utilizar la muestra de ensayo en un ambiente estéril,
se debe utilizar una muestra de ensayo esterilizada para extraer los componentes químicos.
4.2.2 Vehículo de extracción
La elección del (de los) vehículo (s) de extracción teniendo en cuenta las características químicas de la muestra de ensayo
deberá justificarse y documentarse. Para los ensayos con células de mamíferos se utilizará uno o más de los siguientes
vehículos:
a) medio de cultivo con suero;
b) solución salina fisiológica;
c) otro vehículo adecuado.
La elección del vehículo debe reflejar el objetivo de la extracción. Se tendrá en cuenta el uso de un vehículo polar y otro
no polar. El medio de cultivo con suero es el vehículo de extracción preferido. Se prefiere el uso de medio de cultivo con
suero para la extracción debido a su capacidad para soportar el crecimiento celular así como para extraer tanto las
sustancias polares como las no polares. Además del medio de cultivo con suero, se debe considerar el uso de medio sin
suero para extraer específicamente sustancias polares (por ejemplo, compuestos iónicos). Otros vehículos adecuados
incluyen agua purificada y dimetilsulfóxido (DMSO). El DMSO es citotóxico en sistemas de ensayo seleccionados a más
de 0,5% (fracción volumétrica). La concentración de exposición celular de extractables en DMSO será menor debido a la
mayor dilución en comparación con la extracción en medio de cultivo con suero.
NOTA 1 Se pueden usar diferentes tipos de suero (por ejemplo, suero fetal, bovino / de ternera, suero de ternero recién
nacido) y la elección del suero depende del tipo de célula.
NOTA 2 Es importante reconocer que se sabe que las proteínas de suero se unen, hasta cierto punto, a extractables.
4.2.3 Condiciones de extracción
4.2.3.1 La extracción se realizará en recipientes estériles, químicamente inertes y cerrados, utilizando técnicas asépticas,
de acuerdo con la norma ISO 10993-12.
4.2.3.2 Salvo en los casos indicados a continuación, la extracción se efectuará en una de las siguientes condiciones y se
aplicará según las características del dispositivo y las condiciones específicas de utilización:
a) (24 ± 2) h at (37 ± 1) °C;
b) (72 ± 2) h at (50 ± 2) °C;
c) (24 ± 2) h at (70 ± 2) °C;
d) (1 ± 0,2) h at (121 ± 2) °C.
Las condiciones de extracción descritas anteriormente, que se han utilizado para proporcionar una medida del potencial
de riesgo para la estimación del riesgo del dispositivo o material, se basan en precedentes históricos. Otras condiciones,
p. se pueden utilizar tiempos de extracción prolongados o acortados a 37 ° C, que simulan la extracción que se produce
durante el uso clínico o proporcionan una medida adecuada del potencial de peligro, pero deben estar justificados y
documentados. Para los dispositivos médicos que están en contacto de corta duración (duración de contacto acumulativa
no superior a 4 h) con piel o mucosa intactas y que no están implantados, esto puede incluir tiempos de extracción de
menos de 24 h pero no menos de 4 h, según se indica en a) a c).
El medio de cultivo celular con suero sólo debe usarse de acuerdo con a) debido a que las temperaturas de extracción
mayores que (37 ± 1) ° C pueden afectar adversamente la química y / o la estabilidad del suero y otros constituyentes en
el medio de cultivo.
Para las muestras de ensayo poliméricas, la temperatura de extracción no debe exceder la temperatura de transición vítrea
ya que la temperatura más alta puede cambiar la composición del agente de extracción.
4.2.3.3 Si el extracto es filtrado, centrifugado o procesado por otros métodos antes de ser aplicado a las celdas, estos
detalles se registrarán en el informe final junto con una justificación para los pasos adicionales (véase la Cláusula 9). Se
indicará cualquier ajuste del pH del extracto. Debe evitarse la manipulación del extracto, como el ajuste del pH, porque
podría influir en el resultado.
4.3 Preparación del material para pruebas de contacto directo
4.3.1 Forma de las muestras de ensayo
Los materiales que tienen diversas formas, tamaños o estados físicos (es decir, líquidos, geles, sólidos, etc.) pueden
ensayarse sin modificación en los ensayos de citotoxicidad.
La muestra de ensayo preferida de un material sólido debe tener al menos una superficie plana. Si no es así, se deben
hacer ajustes para lograr superficies planas.
4.3.2 Esterilidad de las muestras de ensayo
4.3.2.1 Se tendrá en cuenta la esterilidad de la muestra de ensayo.
4.3.2.2 Las muestras de ensayo de dispositivos esterilizados se manipularán asépticamente durante todo el procedimiento
de ensayo.
4.3.2.3 Las muestras de ensayo de los dispositivos que normalmente se suministran no estériles pero que se esterilizan
antes del uso se esterilizarán mediante el método recomendado por el fabricante y se manipularán asépticamente durante
todo el procedimiento de prueba.
El efecto de los métodos o agentes de esterilización en el dispositivo debe considerarse al definir la preparación de la
muestra de ensayo antes de su uso en el sistema de ensayo.
4.3.2.4 Las muestras de ensayo de los dispositivos que no se requieran estériles en uso se utilizarán tal como se
suministran y se manipularán asépticamente durante todo el procedimiento de ensayo. Puede ser justificable esterilizar el
material de ensayo con el fin de evitar la contaminación microbiana del cultivo celular; sin embargo, el proceso de
esterilización no deberá alterar las propiedades del material de ensayo.
Si se utilizan muestras de ensayo no estériles, se debe comprobar la contaminación bacteriana porque la contaminación
puede conducir a una falsa evaluación de la citotoxicidad.
4.3.3 Muestras de ensayo líquido
Las muestras de ensayo de líquidos se someterán a
a) deposición directa o
b) deposición sobre una matriz absorbente biológicamente inerte.
Se ha encontrado que los discos de filtro son adecuados para su uso como matrices absorbentes inertes.
4.3.4 Muestras de muestras absorbentes
Si es apropiado, las muestras de ensayo que son absorbentes deben empaparse con medio de cultivo antes de la prueba
para evitar la adsorción del medio de cultivo en el recipiente de ensayo.
4.4 Preparación de los controles
Los controles deben seleccionarse de modo que puedan prepararse por el mismo procedimiento que la muestra de ensayo.

5 Líneas celulares
Se prefieren las líneas celulares establecidas y donde se usará se obtendrá de los repositorios reconocidos3).
Cuando se requiera una sensibilidad específica, sólo se utilizarán cultivos celulares primarios, líneas celulares y cultivos
organotípicos obtenidos directamente de tejidos vivos si se puede demostrar la reproducibilidad y la exactitud de la
respuesta.
Si se almacena un cultivo común de una línea celular, el almacenamiento debe ser a -80ºC o inferior en el medio de cultivo
correspondiente pero que contiene un crioprotector, p. dimetilsulfóxido o glicerol. El almacenamiento a largo plazo (varios
meses hasta muchos años) sólo es posible a -130 ° C o menos.
Únicamente las células libres de micoplasma se utilizarán para la prueba. Antes de su uso, los cultivos de reserva deben
ser probados para la ausencia de micoplasma.
Es importante verificar las células regularmente (por ejemplo, morfología, tiempo de duplicación, número de cromosomas
modales) porque la sensibilidad en las pruebas puede variar con el número de pasaje.
Se deben utilizar buenas prácticas de cultivo celular.

6 Medio de cultivo
El medio de cultivo deberá ser estéril.
El medio de cultivo con o sin suero deberá satisfacer los requerimientos de crecimiento de la línea celular seleccionada.
Pueden incluirse antibióticos en el medio siempre que no afecten negativamente a los ensayos.
Se validarán las condiciones de almacenamiento.
NOTA La estabilidad del medio de cultivo varía con la composición y las condiciones de almacenamiento.
El medio de cultivo se mantendrá a un pH entre 7,2 y 7,4.

7 Preparación de cultivos celulares

Usando la línea celular y el medio de cultivo elegidos, preparar suficientes células para completar la prueba. Si las células
se han de cultivar a partir de cultivos extraídos del almacenamiento, retirar el crioprotector, si está presente. Subculture las
células por lo menos una vez antes de usar.
Cuando al subcultivar las células, eliminar y resuspender las células por desagregación enzimática y / o mecánica utilizando
un método apropiado para la línea celular.

8 Procedimientos de prueba
8.1 Número de repeticiones
Se utilizará un mínimo de tres repeticiones para las muestras de ensayo y los controles.
8.2 Prueba de los extractos
8.2.1 Esta prueba permite la evaluación cualitativa y cuantitativa de la citotoxicidad.
8.2.2 Pipetear una alícuota de la suspensión de células continuamente agitada en cada una de un número suficiente de
recipientes para exposición a los extractos. Distribuya uniformemente las células sobre la superficie de cada vaso mediante
una suave rotación.
8.2.3 Incubar los cultivos a (37 ± 1) ° C en aire con o sin dióxido de carbono según sea apropiado para el sistema de
amortiguación elegido para el medio de cultivo.
La prueba debe realizarse en una monocapa subconfluente o en células recién suspendidas.
En el ensayo de formación de colonias sólo se utilizará una densidad de células baja apropiada.
8.2.4 Verificar la subconfluencia y la morfología de los cultivos con un microscopio antes de iniciar la prueba.
En casos excepcionales, las células que crecen exponencialmente (por ejemplo, células primarias, células de alta
proliferación) pueden sembrarse en el punto de partida del ensayo.
8.2.5 Realizar la prueba en
a) el extracto original y / o
b) el extracto original y una serie de diluciones de los extractos utilizando el vehículo de extracción como diluyente.
Alternativamente, cuando se conocen o se sospecha que hay materiales de solubilidad limitada, la dilución debe alcanzarse
variando la relación de extracción original de la muestra de ensayo al medio de extracción.
Si se utilizan monocapas para el ensayo, retirar y descartar el medio de cultivo de los cultivos y añadir una alícuota del
extracto o dilución de los mismos en cada uno de los recipientes.
Si se usan células suspendidas para el ensayo, añadir el extracto o la dilución del mismo en cada uno de los recipientes
replicados, inmediatamente después de la preparación de la suspensión celular.
8.2.6 Cuando se utiliza un extracto no fisiológico, p. agua, el extracto deberá ser ensayado a la concentración
fisiológicamente compatible más alta después de la dilución en medio de cultivo.
NOTA Medio de cultivo concentrado, p. 2 ×, 5 ×, se recomienda para su uso en la dilución de extractos acuosos.
8.2.7 Añadir alícuotas conocidas del blanco y los controles negativos y positivos a recipientes replicados adicionales.
NOTA También puede ensayarse un control de medio de cultivo fresco, si es apropiado.
8.2.8 Incubar los recipientes utilizando las mismas condiciones que se describen en 8.2.3 para un intervalo apropiado
correspondiente al ensayo específico seleccionado.
8.2.9 Después de un período de incubación de al menos 24 h, determinar los efectos citotóxicos de acuerdo con 8.5.
8.3 Prueba por contacto directo
8.3.1 Esta prueba permite la evaluación cualitativa y cuantitativa de la citotoxicidad.
8.3.2 Pipetear una alícuota conocida de la suspensión de células continuamente agitada en cada una de un número
suficiente de recipientes para exposición directa a la muestra de ensayo. Distribuya uniformemente las células sobre la
superficie de cada vaso mediante una suave rotación horizontal.
8.3.3 Incubar el cultivo a (37 ± 1) ° C en aire, con o sin dióxido de carbono, según sea apropiado para el sistema de
amortiguación elegido para el medio de cultivo, hasta que los cultivos hayan crecido a subconfluencia.
8.3.4 Verificar la subconfluencia y la morfología de los cultivos con un microscopio antes de iniciar la prueba.
En casos excepcionales, las células que crecen exponencialmente (por ejemplo, células primarias, células de alta
proliferación) pueden sembrarse en el punto de partida del ensayo.
8.3.5 Retire y deseche el medio de cultivo. A continuación, agregue medio de cultivo fresco a cada recipiente.
8.3.6 Colocar con cuidado los especímenes individuales de la muestra de prueba en la capa celular en el centro de cada
uno de los recipientes replicados. Asegúrese de que la muestra cubre aproximadamente una décima parte de la superficie
de la capa celular.
Si se justifica, pueden usarse otras relaciones entre la superficie de la muestra y la superficie de la capa celular.
Tenga cuidado para evitar el movimiento innecesario de los especímenes, ya que esto podría causar trauma físico a las
células. Por ejemplo, parches de células desalojadas pueden resultar de movimientos innecesarios.
NOTA Cuando sea apropiado, la muestra puede colocarse en el recipiente de cultivo antes de la adición de las células.
8.3.7 Preparar recipientes de replicación tanto para el control negativo como para el material de control positivo.
8.3.8 Incubar los recipientes en las mismas condiciones descritas en 8.3.3 para un intervalo apropiado (un mínimo de 24
h) correspondiente al ensayo específico seleccionado.
8.3.9 Desechar el medio de cultivo sobrenadante antes de añadir productos químicos / colorantes para determinar los
efectos citotóxicos de acuerdo con 8.5.
8.4 Prueba por contacto indirecto
8.4.1 Difusión de agar
8.4.1.1 Este ensayo permite una evaluación cualitativa de la citotoxicidad. Este ensayo no es apropiado para lixiviables
que no pueden difundirse a través de la capa de agar, o que pueden reaccionar con agar. Se justificará la utilización del
ensayo de difusión en agar para la evaluación de la citotoxicidad.
8.4.1.2 Pipetear una alícuota conocida de la suspensión de células continuamente agitada en cada uno de un número
suficiente de recipientes replicados para el ensayo. Distribuya uniformemente las células sobre la superficie de cada vaso
mediante una suave rotación horizontal.
8.4.1.3 Incubar los cultivos a (37 ± 1) ° C en el aire, con o sin dióxido de carbono según sea apropiado para el sistema
tampón elegido para el medio de cultivo, hasta que los cultivos hayan crecido hasta aproximarse a la subconfluencia al
final de la fase logarítmica de la curva de crecimiento.
8.4.1.4 Verificar la subconfluencia y la morfología de los cultivos con un microscopio antes de iniciar la prueba.
8.4.1.5 Retire y deseche el medio de cultivo del recipiente. A continuación, mezclar el medio de cultivo fresco que contiene
suero con agar fundido para obtener una concentración de masa final de agar de 0,5% a 2% y pipetear un volumen
apropiado en cada recipiente. Use sólo agar que sea adecuado para el crecimiento de células de mamíferos en cultivo. La
mezcla de agar / medio de cultivo debe estar en estado líquido ya una temperatura que sea compatible con células de
mamífero.
NOTA El agar está disponible en diversos rangos y purezas de peso molecular.
8.4.1.6 Colocar cuidadosamente los especímenes replicados de la muestra de ensayo en la capa de agar solidificado en
cada recipiente.
Asegúrese de que la muestra cubre aproximadamente una décima parte de la superficie de la capa celular.
Si se justifica, pueden usarse otras relaciones entre la superficie de la muestra y la superficie de la capa celular.
Pre-empapar cualquier material absorbente con el medio de cultivo antes de colocarlo en el agar para evitar la
deshidratación del agar.
8.4.1.7 Prepare recipientes de replicación con el control negativo y el material de control positivo.
8.4.1.8 Incubar los recipientes en las mismas condiciones descritas en 8.4.1.3 durante 24 h a 72 h.
8.4.1.9 Examinar las células para determinar el efecto citotóxico antes y después de retirar cuidadosamente los
especímenes del agar.
El uso de una tinción vital, p. rojo neutro, puede ayudar en la detección de citotoxicidad. La tinción vital puede añadirse
antes o después de la incubación con la muestra. Si la mancha se añade antes de la incubación, proteger los cultivos de
la luz para evitar el daño celular provocado por la fotoactivación de la mancha.
8.4.2 Difusión del filtro
8.4.2.1 Esta prueba permite una evaluación cualitativa de la citotoxicidad.
8.4.2.2 Colocar un filtro libre de tensioactivo con un tamaño de poro de 0,45 μm en cada recipiente y añadir una alícuota
conocida de la suspensión de células continuamente agitada en cada uno de un número suficiente de recipientes replicados
para el ensayo.
Distribuya uniformemente las células sobre la superficie de cada filtro mediante una suave rotación.
8.4.2.3 Incubar los cultivos a (37 ± 1) ° C en el aire, con o sin dióxido de carbono según sea apropiado para el sistema de
amortiguación elegido para el medio de cultivo, hasta que los cultivos hayan crecido hasta aproximarse a la subconfluencia
al final de la fase logarítmica de la curva de crecimiento.
8.4.2.4 Retire y deseche el medio de cultivo de los recipientes. A continuación, transferir los filtros, con el lado de la celda
hacia abajo, sobre una capa de agar solidificado (véase 8.4.1.5).
8.4.2.5 Colocar cuidadosamente los especímenes replicados de la muestra de prueba en el lado acelular (superior) del
filtro.
Conservar los extractos líquidos y los compuestos recién mezclados en los anillos no reactivos colocados en el filtro.
8.4.2.6 Prepare los filtros de replicación con el control negativo y el material de control positivo.
8.4.2.7 Incubar los recipientes utilizando las mismas condiciones descritas en 8.4.2.3 durante 2 h ± 10 min.
8.4.2.8 Retire con cuidado los especímenes del filtro y separe cuidadosamente el filtro de la superficie del agar.
8.4.2.9 Determinar los efectos citotóxicos utilizando un procedimiento de tinción apropiado.
8.5 Determinación de la citotoxicidad
8.5.1 Determinar los efectos citotóxicos por medios cualitativos o cuantitativos. La evaluación cuantitativa de la citotoxicidad
es preferible. Los medios cualitativos son adecuados para los fines de la evaluación.

Evaluación cualitativa: Examinar las células microscópicamente usando tinción citoquímica si se desea. Evaluar los
cambios en, por ejemplo, morfología general, vacuolización, descomposición, lisis celular e integridad de la membrana.
El cambio de la morfología normal se registrará en el informe de ensayo de forma descriptiva o numérica. En las tablas 1
y 2 se presenta una forma útil de clasificar las muestras de ensayo.
Tabla 1 - Clasificación morfológica cualitativa de la citotoxicidad de los extractos

El método de evaluación y los resultados de la evaluación se incluirán en el informe del ensayo.

El logro de un grado numérico mayor que 2, basado en las Tablas 1 y 2, se considera un efecto citotóxico.
Evaluación cuantitativa: Mide la muerte celular, la inhibición del crecimiento celular, la proliferación celular o la formación
de colonias.
El número de células, la cantidad de proteína, la liberación de enzimas, la liberación de colorante vital, la reducción del
colorante vital o cualquier otro parámetro medible pueden cuantificarse por medios objetivos. La medida objetiva y la
respuesta se registrarán en el informe del ensayo.
La reducción de la viabilidad celular en más del 30% se considera un efecto citotóxico. Otros criterios, incluidos los
diferentes puntos de corte o una proporción aceptable de resultados de ensayo a control, se justificarán para líneas
celulares alternativas o construcciones de tejidos multicapa. Los criterios se justificarán y documentarán.
Los protocolos descritos en los anexos A a D pueden utilizarse para la determinación cuantitativa de la citotoxicidad de los
extractos.
NOTA Se ha demostrado que los protocolos A y B son adecuados para los productos químicos en los estudios
internacionales de validación y para los dispositivos médicos en una prueba internacional de prueba en grupo. Para los
materiales citotóxicos, permiten la graduación del efecto citotóxico mediante el cálculo de un valor de IC50 (la concentración
inhibidora estimada afecta al punto final en cuestión en un 50%). Los anexos C y D describen otros protocolos ampliamente
utilizados para la cuantitativa de la citotoxicidad.
ISO 10993-5:2009(E)
Para métodos particulares de determinación de la citotoxicidad, puede ser necesario un control de cultivo de células de
tiempo cero o basal.
8.5.2 Asegúrese de tener cuidado en la elección de los métodos de evaluación, ya que los resultados de la prueba pueden
ser inválidos si la muestra de ensayo libera sustancias que interfieren con el sistema de prueba o la medición.
Los materiales que pueden liberar formaldehído sólo pueden ser probados con fiabilidad cuando se evalúa la viabilidad
celular.
8.5.3 Si hay diferencias evidentes en el resultado de la prueba para recipientes de cultivo repetidos, entonces la prueba es
inadecuada o no es válida. En este caso, se repetirá el ensayo, o se utilizará una metodología alternativa.
8.5.4 Si los controles negativo, positivo y cualquier otro (referencia, medio, blanco, reactivo, etc.) no tienen la respuesta
esperada en el sistema de prueba, repita el ensayo completo. 9 Informe de prueba
El informe de ensayo incluirá al menos los siguientes datos:
a) nombre y dirección de la instalación de ensayo;
b) nombre de la persona o personas que realizaron la prueba;
c) fechas de inicio y final del ensayo;
d) descripción de la muestra;
e) línea celular, justificación de la elección y fuente (es) celular (es);
f) nombre de la empresa y lote de medio, suero y antibióticos, cuando se añada;
g) método de ensayo y justificación;
h) procedimiento de extracción (si procede) y, si es posible, naturaleza y concentración de la (s) sustancia (s) lixiviada (s);
i) controles negativos, positivos y otros;
j) respuesta celular y otras observaciones;
k) cualquier otro dato pertinente necesario para la evaluación de los resultados.
10 Evaluación de los resultados
La evaluación global de los resultados será realizada por una persona capaz de tomar decisiones informadas basadas en
los datos de la prueba. Los datos de citotoxicidad se evaluarán en relación con otros datos de biocompatibilidad y el uso
previsto del producto.
La interpretación de los resultados de la prueba de citotoxicidad tendrá en cuenta la clasificación del dispositivo según la
norma ISO 10993-1. Si hay un efecto citotóxico, se puede realizar una evaluación adicional, por ejemplo:
a) pruebas adicionales (presencia / ausencia de suero, cambio del nivel de suero en el medio de cultivo);
b) extraer el análisis (por ejemplo, residuos de la esterilización y otros procesos de producción), cuando sea apropiado;
c) análisis de la concentración de respuesta de las diluciones;
d) caracterización química de componentes lixiviables,
e) otros procedimientos de prueba.
Cualquier efecto citotóxico puede ser motivo de preocupación. Sin embargo, es principalmente una indicación de potencial
para toxicidad in vivo y el dispositivo no puede necesariamente ser determinado como inadecuado para una aplicación
clínica dada basándose únicamente en datos de citotoxicidad.