UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

FACULTAD DE ENFERMERÍA
ESCUELA PROFESIONAL DE ENFERMERÍA

TEMA

Prácticas de laboratorio: fraccionamiento subcelular, determinación de aminoácidos

y proteínas del plasma: albumina y globulinas y efecto de inhibidores sobre la
cadena de óxido reducción biológicas

 EXPERIENCIA CURRICULAR: Bioquímica

 ESTUDIANTE:

 Otiniano Castillo, Estrella

 DOCENTE: Anabelle Gonzales Siccha

 CICLO: IV

TRUJILLO – PERU
2019
 BIOQUIMICA: PRACTICAS DE LABORATORIO

PRACTICA # 1: FRACCIONAMIENTO SUBCELULAR

 Objetivos

1. Identificarlas fracciones celulares a partir de hígado de pollo.

2. Deducir el rendimiento y pureza de cada fracción.
3. Conocer la técnica de fraccionamiento celular para el estudio de las organelas
celulares.

 RESULTADOS

 Fracción Nuclear de Hígado de pollo Microscopia Óptica de campo claro

 Aumento ocular: 10X
 Aumento objetivo: 40X
 Aumento Total: 400X
 Tipo de muestra: Temporal y fresca
 Tipo de tinción: Azul de metileno
 Observaciones: En la muestra, gracias a la tinción de Azul de metileno, se logran
identificar concretamente los núcleos de la célula, dado que la tinción azul de
metileno marca el ADN dentro de esta.

 DISCUSIÓN DE RESULTADOS

 Al momento de la experimentación, cuando echamos agua fría a nuestra mezcla es

necesario que este fría y ¿Por qué? Lo que pasa en que la estructura de hígado de
pollo tiene enzimas que puede afectar la muestra y deteriorarla al momento de
echar agua fría lo que hacemos es neutralizar estas enzimas para que no causen
ningún efecto.
 ¿Por qué es necesario que juntar ciertos colorantes con ciertas estructuras, ejemplo,
queremos examinar los núcleos del hígado de pollo, pero no podemos poner
cualquier colorante, tiene que ser uno con carácter básico, ya que, los núcleos
portan ADN y lo que hace que sea acido es el grupo fosfato y al echar un colorante
básico como el azul de metileno lo neutraliza haciendo que la muestra sea más
visible?
 Es necesario hacer todo el proceso de fraccionamiento celular; ya que, en este caso
el hígado tiene muchas estructuras que no queremos visualizar y necesitamos
centrarnos en lo que realmente queremos por eso tenemos que homogenizar, filtrar
y purificar nuestra muestra para separar todo lo que no nos interesa.
  En un microscopio de fluorescencia se pueden apreciar las estructuras mejor, ya
que, este se centra en las estructuras internas específicas.

 CONCLUSIONES

 En esta práctica de laboratorio aprendimos que el procedimiento debe hacerse en

temperatura fría para mantener el buffer tris y este a su vez nos ayuda a limpiar
unas encimas de la célula para que sea más fácil observarla.
 Aprendimos que algunos colorantes como es el azul de metileno le da un color a
la célula, pero por ser una solución base esta puede ser absorbida mejor por
algunas organelos para reconocerlas de mejor manera.
 Se de buscar el equilibrio del pH para que las muestras reaccionen mejor, que
sean de carácter básico o alcalino con ácido.

 ACTIVIDADES EXTRA AULA

 Esquematizar una célula vegetal y animal

  Funciones de los organelos subcelulares

 Núcleo: Controlar la expresión genética y mediar en la replicación del ADN

durante el ciclo celular.
 Membrana plasmática: Mantener el medio interno separado de la capa
fosfolipica y las funciones de transporte que desempeñan en las proteínas.
 Aparato Golgi: Modificar, almacenar y exportar proteínas sintetizadas en el
retículo endosplamatico a distintas partes del cuerpo.
 Mitocondria: Oxidación del ATP mediante la fosforilacion oxidativa.
 Cloroplasto: Realización de fotosíntesis y sirven como lugares de
almacenamiento de almidón y de síntesis de algunas proteínas.

 Extracción de biomoléculas

 Explica la toma de muestra de sangre

1. Desinfectar el brazo con alcohol

2. Pinchar con una aguja y tomar la muestra de sangre en un tubo de ensayo.
3. Sella los capilares con plastilina
4. Centrifugar a 5,000 rpm x 6 minutos
5. Separamos el suero
6. Finalmente lo guardamos.

 Funciones de las biomoléculas

 Ácidos nucleicos: Duplicación del ADN, expresión del mensaje genético y

transcripción del ADN para formar ARNm.
 Proteínas: Determinan la forma y loa estructura de las células y dirigen casi
todos los procesos vitales.
 Carbohidratos: Contribuir en el almacenamiento y en la obtención de
energía de forma inmediata.
 Lípidos: Almacenar energía, regula la temperatura del cuerpo, transmisor de
impulsos nerviosos y emisores de señales.
 Vitaminas: Ayuda a reforzar y fortalecer los huesos, sanar heridas y a reforzar
el sistema inmunitario.

 Definir

 Sangre: Es un tejido líquido que recorre el organismo, atreves de los vasos

sanguíneos transportando células.
  Suero: Sustancia acuosa que se separa de un líquido orgánico cuando este se
encuentre fuera del organismo y se ha coagulado.
 Plasma. Es la fracción liquida y acelular de la sangre.

PRACTICA #2: DETERMINACION DE AMINOACIDOS Y PROTEINAS DEL

PLASMA: ALBUMINA Y GLOBULINAS

 RESULTADOS

 Reconocimiento de aminoácidos: Reactivo Ninhidrina

En el tubo de ensayo dos que específicamente debió presentar color azul violeta
al reaccionar con la ninhidrina cambio de color casi inmediatamente, lo cual nos
revela la presencia de aminoácidos.

En el tubo de ensayo tres se dio un cambio de color celeste bajo, al reaccionar con
la ninhidrina, pero a diferencia del otro tubo este demoro más tiempo en cambiar
de color y la presencia de aminoácidos fue menos que la del tubo de ensayo dos.

 Reconocimiento de aminoácidos: Reactivo Biuret

En un tubo de ensayo se echó 2 mL de solución de clara de huevo, agregar 1 mL

de NaOH al 40%, luego se añadió gota a gota la solución de sulfato cúprico al
1%, se agitó y se continuó añadiendo hasta notar cambio. Luego se repitió el
ensayo con la solución de caseína y con los aminoácidos.

La albumina, cistina y esparacina reaccionan con el sulfato de cobre en medio

alcalino, dando soluciones en diferentes tonos azules. El resto de las muestras
(caseina, glicina y lisina) no reaccionan con el sulfato de cobre quedando
soluciones de color en tonos celestes.
  DISCUSION

El reactivo Ninhidrina: Los aminoácidos libres en solución acuosa al ser calentados

con ninhidrina dan una coloración violeta o violeta azulado debido a la formación de
condensación entren el aminoácido y el reactivo.

Con este reactivo podemos identificar grupos de aminoácido libres en la posición alfa.

El reactivo de Biuret reacciona frente a las proteínas y aminoácidos dando a la

solución una coloración azul.

 CONCLUSIÓN

Existen diferentes pruebas para la identificación de proteínas y aminoácidos que

permiten establecer un resultado positivo o negativo de acuerdo a las
características y composición de cada una de ellas, evidenciado en coloraciones,
presencia de anillos, etc. Se establecieron las características de estas pruebas para
y se logró la identificación cualitativa de sustancias que pueden contener
aminoácidos, proteínas o péptidos.

Por otro concluimos que la albumina si presenta aminoácidos libres.

 ACTIVIDADES EXTRA – AULA

 Funciones de la albumina

 Regulación de la presión oncotica

 Mantenimiento de pH de la sangre y medio principal de transporte.

 Causas de:

 Hipoalbuminemia:
 Cirrocis hepática
 Síndrome nefrosico
 Enfermedades crónicas y malabsorción
 Hiperalbumnemia:
 La deshidratación
 Vih
 Transtorno de la medula ósea
 Miolema múltiple etc
 Funciones de las proteínas plasmáticas

 Mantiene la presión oncotica del plasma

 Transporte de moléculas
 Coagulación
 Respuesta inmune etc.

 Funciones de las globulinas

 Coagulación de la sangre
 Regulación de la presión oncotica
 Transporte de compuestos endógenos y exógenos poco saludables en agua.
 Balance intravasal y extravasal de agua control de la infección etc.

 Enuncie 5 aminoácidos esenciales

 Leucina
 Triptófano
 Isoleucina
 Valina
 Metionin
 Fenilalanina

 Esquematice la estructura del aminoácido glicina

 Reacción del aminoácido con la ninhidrina

A esta reacción también se le conoce como condensación ninhidrinica.

El grupo alfa- amino de los aminoácidos forma complejos coloreados con la

ninhidrina: Violeta azuloso en la mayoría de los aminoácidos cuyo grupo amino
es primario.
 La ninhidrina a PH 4 y 8 es un oxidante muy fuerte y siempre relaciona con los
grupos a- amino liberando amonio.

 Enuncie 5 proteínas intracelulares

 Gelsolina
 Histonas
 Beta tubulina
 Alfa tubulina
 Gliproteinas
 Nucleasas
 No histonas

 Describa la estructura de la proteína albumina

La albumina es una proteína globular con proteína terciaria. Esta contuido por
alrededor de 585 aminoácido con 17 puentes de disulfuro.

 Reacción de la proteína albumina con reactivo biuret

El reactivo de Biuret contiene CuSo4 en solución acuosa alcalina. La reacción
se basa en la formación de un compuesto de color violeta debido a la formación
de un complejo en coordinación entre los iones Cu +2 y los pares de electrones
no compartidos del nitrógeno que forma parte de los enlaces peptídicos este si la
reacción es positiva.

PRACTICA #3: EFECTO DE INHIBIDORES SOBRE LA CADENA DE OXIDO–

REDUCCION BIOLOGICAS

 RESULTADOS

1. Sistema usando 2,6 diclorofenolindofenol

 Tubo I
 Cambio de color: Color azul
 Interpretación: No hay enzimas por lo tanto no hay reacción.

 Tubo II
 Cambio de color: Color azul
 Interpretación: Si hay sustrato, pero no enzimas por lo tanto no hay
reacción
  Tubo III
 Cambio de color: Color celeste blanquecino
 Interpretación: Si hay sustrato y enzimas, pero no hay inhibidor, por lo
tanto, si hay reacción.

 Tubo IV
 Cambio de color: Color azul
 Interpretación: Si hay sustrato enzimas e inhibidor (rotenona).La
rotenona actúa a nivel del complejo I no permite la reducción del 2,6-
diclorofenolindofenol

 Tubo V
 Cambio de color: Color verde azulado
 Interpretación: Si hay sustrato, enzimas e inhidor. El barbiturato de sodio
actúa a nivel del complejo I inhibiendo el paso de electrones al bloquear la
transferencia desde Fe-s hacia Q, pero el 2,6 diclorofenolindofenol actúa
primero lo cual permite cambiar parcial de color.

 Tubo VI
 Cambio de color: Cambia de azul a blanquecino
 Interpretación: Si hay sustrato, enzimas e inhibidor, la azida de sodio actúa
a nivel del complejo IV, inhibiendo el paso de electrones de Cit c a hem a
a3, pero hay reacción debido a que el 2,6 – diclorofenolindofenol actúa a
nivel del complejo I.

2. Sistema usando p-Fenilendiamina

 Tubo I
 Cambio de color: Marrón claro
 Interpretación: Si hay sustrato, pero no enzimas por lo tanto no hay
reacción.

 Tubo II
 Cambio de color: Marrón oscuro
 Interpretación: Si hay sustrato y enzimas, pero no hay inhibidor, por
lo tanto, si hay reacción.

 Tubo III
 Cambio de color: Marrón claro
  Interpretación: Si hay sustrato, enzimas e inhibidor, la azida de sodio
actúa a nivel del complejo IV, inhibiendo el paso de electrones por lo
tanto si hay reacción.

 Tubo IV
 Cambio de color: Marrón oscuro
 Interpretación: Si hay sustrato, enzimas e inhidor. El barbiturato de
sodio actúa a nivel del complejo I inhibiendo el paso de electrones al
bloquear la transferencia desde Fe-s hacia Q, pero el p- fenilendiamina
actúa en el cit C, por lo que se deduce que si hay reacción.

 Tubo V
 Cambio de color: Marrón claro
 Interpretación: Si hay sustrato enzimas e inhibidor. La rotenona actúa
a nivel del complejo I, pero el p- fenilendiamina actúa en el cit. C por
lo tanto si hay reacción.

 DISCUSION

El 2,6-diclorofenolindofenol es un derivado clorado del fenol con la fórmula

química C6H4Cl2O el cuál actúa como un indicador, cuyo estado normal es
oxidado a un color azul, y cuando se reduce ocurre un cambio a blanquecino. En
la cadena respiratoria, este compuesto actúa en el complejo I, entre el FMN y la
ubiquinona (coenzima Q).

El p-fenilendiamina es un indicador redox, cuyo estado normal es reducido a un

color marrón claro, y cuando se oxida ocurre un cambio a color marrón oscuro.En
la cadena respiratoria, este compuesto actúa cediendo electrones al citocromo C.

 CONCLUSIONES

 La cadena respiratoria puede ser inhibida por algunas sustancias que actúan
en complejas especificas impidiendo el paso de electrones.
 El 2,6 – diclorofenolindofenol y el p- fenilendiamina actúan como
indicadores de inhibición de la cadena respiratoria.
 La rotenona inhibe el complejo I, el barbiturato de sodio inhibe el complejo
II y la azida de sodio inhibe el complejo IV.
 ACTIVIDADES EXTRA – AULA

 Describir el transporte de electrones de la cadena respiratoria

Esta embebida en la membrana mitocondrial y la constituyen 5 complejos

multienzimaticos (I, II, III, IV, V, 2 transportadores móviles, coenzima Q y
citocromo). Este proceso genera que es utilizado para transportar protones de la
matriz mitocondrial.

 Describe las vías metabólicas que intervienen en la respiración celular

Sucesión de reacciones químicas donde el sustrato inicial se transforma y da

lugar a productos finales atreves de una serie de metabolitos intermediarios y
están catalizados por enzimas y ocurren en el interior de la célula.

Referencias bibliográficas

 Alberts, Bray, Hopkin, Johnson, Lewis, Raff,Roberts,Walter, Introducción a la Biología

Celular.(2011). Panamericana, 3ª edición. España.
 Lodish, Berk, Matsudaria, Káiser, Morigerarse, Scooter, Zipursky, Darnell, Biología
Celular y Molecular.(1986). Editorial Panamericana, 5ª Edición,United States of
America.
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