Septiembre 18 de 2018

Clase No. 11.1

Docente: Aurora Londoño

Herramientas de Diagnóstico virológico y Virus Epstein-Barr: faringitis virales.

Como apoyo para realizar un diagnóstico contamos usualmente, paralelo a la presentación

de los síntomas, con la producción de viriones que permite detectar el virus mediante
antígenos, es decir proteínas del virus principalmente, y también a través de la detección de
los ácidos nucleicos del virus; mientras que ya pasado el tiempo y para fines
epidemiológicos principalmente, aunque a veces se sobrelapan un poco la ventana de los
síntomas con la producción de IgM e IgG, vamos a querer detectar la producción de
anticuerpos específicos, usualmente de IgG -a veces M también- después de la infección, o
sea haber generado células de memoria que producen IgG y que se detectan incluso años y
décadas después de la infección. La detección de éstas células nos permite hacer dos tipos
de seguimiento: detectar si ha habido infección o, en caso de haber hecho un proceso de
inmunización, verificar que sí se produjo la inmunidad humoral que se necesitaba.
Para la detección de virus las pruebas que seleccionen deben tener sensibilidad alta,
especificidad, ser rápidas y no ser costosas.

Especificidad: ​Una patología puede estar causada específicamente por una especie
miembro de un grupo taxonómico particular de un género y necesitamos ser capaces de
diferenciar la especie particular de patógeno que está presente, porque de esto depende el
manejo y el tratamiento.
Sensibilidad​: ​capacidad de detectar una concentración mínima del agente patógeno en
una muestra en particular.
Cuando se trata de (no se escucha, en ese momento mueven una silla) se espera entonces
que el método de detección del agente viral sea específico y sensible, pero estas muestras
se pueden almacenar y no se requiere para iniciar el tratamiento del paciente, y cuando se
trata de diversidad hay un poco más de flexibilidad porque se trata de estudiar ​diversidad
genética​ o biológica de los agentes infecciosos.

Dependiendo del sistema u órgano donde se estén presentando las patologías hay
diferentes pruebas:
Tracto respiratorio​: lo ideal es el aspirado nasofaríngeo​, pero también hay hisopado
nasal, lavado nasal o broncoalveolar. Estamos hablando de virosis del tracto respiratorio
donde en los fluidos hay contenidas células epiteliales o viriones depositados en el
moco,además se tienen el antígeno,
el ácido nucléico o las células
infectadas
Tracto digestivo​: en las heces se
encuentran células que contienen a
los viriones, igual en vómito. La
muestra para tracto digestivo es
vómito.
Piel​: en infecciones cutáneas se
pueden tomar biopsias y raspados.
Raspado de -Tzanck : corresponde a
un raspado de la vesícula o erupción,
al que se le realiza una tinción simple
con colorante Giemsa. Se observa al
microscopio y se identifican algunos
efectos citopáticos de algunos virus en particular.

Conjuntiva​: se debe tomar un muestra de tipo hisopal (hisopado conjuntival).

SNC​: se inicia con lo menos invasivo posible. Algunos virus pueden llegar a encontrarse en
ganglios a nivel de faringe, algunos pueden liberar viriones en heces o sangre. Si ya no
sirven estas, se toma LCR, biopsia o cortes de tejidos de autopsia.

Tracto genital:​ raspados, hisopados, muestra de fluidos vesiculares, extendidos de Tzanck.

Órganos vitales​: cuando hay viremia se puede tomar muestra de sangre o suero. Pueden
encontrarse en orina cuando se filtran a través del riñón, dependiendo de su tamaño y si no
se manejan las biopsias.

Nota​ : recuerden que en la imagen el segundo índice es tracto digestivo no respiratorio.

como les decía no todos los virus hacen viremia y no todos están, a pesar de ser
infecciones sistémicas, en todo tipo de muestra. En esta tabla vemos que en un lado
aparece a qué tipo de muestra se le puede hacer una prueba buscando antígenos o ácido
nucléico viral y para cuáles virus se puede hacer un diagnóstico que esté basado en
anticuerpos, ya no entonces para vigilancia epidemiológica de si tuvo o no la infección, o si
fue vacunada o no, sino cuando la presencia de anticuerpos me puede decir el estado de la
infección y me puede ayudar al diagnóstico.
Tenemos entonces que la presencia de anticuerpos se puede utilizar como herramienta
diagnóstica en: hepatitis B y C, en herpes, en ébola, virus Zóster en niños, VIH, pero hay
casos en los que no y se debe buscar el antígeno o ácido nucléico en la muestra
correspondiente.

Este es el espectro de metodologías

diagnósticas que tenemos y están en orden,
empezando por la que tiene la mayor
sensibilidad, especificidad y robustez, ésta
última es una característica adicional que se
agrega la cual tiene que ver con la capacidad de
que una técnica detecte múltiples patógenos en
el mismo procedimiento.
Las pruebas menos sensibles y menos
específicas serían las ​histológicas y
aglutinación. Luego siguen el ​cultivo viral​, las
pruebas de ​inmunocromatografía e
inmunofluorescencia​, ​ELISA, Western Blot y
después las pruebas que detectan ácidos nucleicos: reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) para el ADN y la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción
reversa (RT-PCR) para los que tienen ácido nucleico de RNA. Además, existe una prueba
de amplificación de ácido nucleico que se llama amplificación mesotérmica y se diferencia
de las otras por el tipo de equipos que utiliza. Está también la ​secuenciación del ácido
nucleico por diferentes metodologías, una es ​secuenciación Sanger ​que es la más
simple; existe una más sofisticada y que da mas información llamada secuenciación
masiva y están los microarreglos.
 Pruebas histológicas: son
pruebas rápidas que se pueden
hacer en el laboratorio de
patología al momento en el que
el paciente consulta. Entre sus
desventajas se encuentran que
pueden ser ​intrusivas, tienen
baja especificidad ya que
cuando se realiza esta prueba lo
que se busca es ver en la
pequeña muestra de tejido el
efecto citopático del virus, pero
no todos los virus tienen un
efecto citopático característico y exclusivo, sino que algunos tienen efectos muy similares o
relacionados con otras especies dentro del mismo género, además para ver este efecto se
necesita tener el ojo entrenado. Por ejemplo, tenemos dos tipos de virus que hacen efecto
citopático: el ​coronaviru​s que causa el síndrome respiratorio agudo y grave (SARS) y
causa células fusionadas, o sea sincitios y estos (se refiere a la imagen de la prueba Tzanck
para herpes) son los ​herpes virus que causan también (no se escucha). ¿Cual es la
diferencia? ​Una muestra es tomada de la vesícula herpética que se forma como erupción
cutánea y la otra muestra es de efecto citopático en el tejido pulmonar.
Otro caso en el que la histología puede servir es en del virus Epstein-Barr. En éste, el
conteo de linfocitos que tienen una morfología anómala es un indicativo importante de que
puede haber mononucleosis.
En todo caso, cuando se hace histología el resultado es una condición sugerente de la
infección por determinado virus y​ no es una prueba confirmatoria.​ Además, su
sensibilidad es baja.

Cultivo viral: necesita que la muestra

contenga viriones, es decir, partículas virales
viables con todas sus características,
capaces de establecerse en un cultivo viral
en unas células, por ende se necesita un
linaje precisamente de células que sean
susceptibles a ese virus, o sea que tengan
los receptores apropiados.
Para que estos virus se establezcan en las
células del cultivo y se pueda evaluar su
presencia mediante la aparición de un efecto
citopático característico, puede tardarse
entre 3 a 30 días dependiendo de la especie viral. Además, no para todos los virus
patógenos de humanos existe un linaje celular conocido donde se pueda cultivar.
Lo que se observa en el microscopio al inicio del cultivo es una monocapa de células
creciendo homogéneamente, después cuando se da la infección viral éstas células
adquieren un núcleo agrandado, hay intrusiones citoplasmáticas y otras características que
dependen de las células del cultivo y del virus.
El resultado siempre va a ser presencia o ausencia de efectos citopáticos de acuerdo a la
línea celular.

La forma comercial que existe

ahora se llama Shell vial. Es un
tubo que contiene células de
una línea específica listas para
inocular con el virus, entonces
se manda la muestra del
paciente y se inyecta el virus a
través de la tapa del vial y
después se espera que el virus
crezca y se observa la
presencia de un efecto
citopático. Entre sus
desventajas se encuentran que es muy tardado dependiendo del virus, hay que tener un
sistema de mantenimiento de las células que usualmente incluye criopreservación y
medios de crecimiento para líneas celulares, además se necesita un entrenamiento
específico en cultivo viral y ​un sistema de bioseguridad en el laboratorio dado que se
están multiplicando agentes infecciosos.
Sus ventajas son que se considera económico una vez que se tiene montado el sistema de
cultivo celular y en algunas líneas que están preseleccionadas como las células Vero y
HeLa el efecto citopático es muy específico, entonces sí puede dar un diagnóstico
característico cuando uno asocia esto con el tipo de tejido del cual se tomó la muestra
sumado a la sintomatología específica del paciente.

Pruebas rápidas de inmunocromatografía: van a reportar la presencia o ausencia del

virus buscado a través de la detección de antígeno viral, es decir, de proteínas del virus, ya
sean estructurales o no. Entre sus ventajas se encuentran que ​son muy simples
metodológicamente, son de fácil interpretación, dan resultados rápidos, su costo es
razonablemente bajo, y con una sola muestra se pueden hacer varias pruebas rápidas para
diferentes agentes infecciosos.
La desventaja es que tienen una sensibilidad que depende mucho del tipo de antígeno y
tienden a tener reacción cruzada porque los virus del mismo género suelen tener el mismo
tipo de proteínas estructurales y son muy parecidos en las proteínas no estructurales.
Además, como sobre la inmunotira vienen antígenos o anticuerpos que son de proteínas del
virus, esto tiene un tiempo de caducidad corto porque estas proteínas se van
desnaturalizando y las reacciones enzimáticas ya no ocurren entonces tenemos falsos
negativos o pruebas que ya no dan resultado.

Pregunta estudiante​: ¿Son anticuerpos del virus?

Respuesta profesora: En esta inmunotira si nosotros estamos buscando un antígeno,
vamos a identificarla con un anticuerpo específico más una reacción coloreada. En la
imagen anticuerpo virus se refiere a anticuerpo contra el virus.
Pregunta estudiante:​ ¿El anticuerpo es de célula humana?
Respuesta profesora​: Necesitamos siempre en estas tiras, un control positivo y un control
de que la tira está funcionando. Entonces en estas tiras de inmunocromatografía, hay un
anticuerpo contra una proteína de origen humano y un anticuerpo contra el antígeno
específico que estoy buscando del virus. El antígeno del virus se une con su anticuerpo
específico y genera la reacción enzima- sustrato y nos da color en la banda donde está el
anticuerpo contra el virus. Y el antígeno humano o la proteína humana, reacciona con su
anticuerpo específico contra proteína humana, ocurre la reacción enzimática con su sustrato
y se genera la banda coloreada que nos indica: 1. que la muestra corresponde a humano y
2. la tira está funcionando. Entonces cuando aparecen las dos bandas es una prueba válida
y positiva; cuando aparece una banda, la de anticuerpo contra antígeno humano, es una
prueba válida y negativa; si no aparecen bandas es una prueba inválida.

Inmunofluorescencia: se necesita que la muestra tenga células. Éstas células se colocan

sobre el portaobjetos y se tiñen con anticuerpos específicos: un anticuerpo específico contra
una proteína celular, que indicará dónde están las células, y un anticuerpo específico contra
un antígeno viral, en este caso usualmente son proteínas no estructurales o contra la
cápside que está siendo producidas dentro de las células en el momento que se recolectó la
muestra. Para detectar la fluorescencia, se necesita un microscopio detector de
fluorescencia, que tiene que excitar a estas moléculas, no por medio de una reacción
enzima - sustrato, sino que es un colorante que fluoresce. ¿Qué es fluorescer? emitir luz por
encima de la longitud de onda en la que entra el rayo de luz de excitación. Estos
anticuerpos marcados con estos compuestos fluorescentes, recibe un rayo de luz en una
longitud de onda específica y cuando los átomos se excitan o se mueven los electrones
alrededor del colóforo, se emite de nuevo un rayo de luz más “intenso” (vamos a decirlo
así), que es detectado por unos lentes en el microscopio. Entonces lo que terminamos
viendo es la fluorescencia que produce el anticuerpo contra célula, usualmente contra el
núcleo, por lo que en el microscopio se ven los núcleos celulares; y la fluorescencia que
emite el anticuerpo contra el virus, si detecta su antígeno, y se ve como un segundo color
alrededor de donde estaba viendo el color de las células. Lo más común es que los
antígenos virales se coloquen alrededor del núcleo o en otro lugar específico del citoplasma.
Hay virus cuyo antígeno está dentro del núcleo y se verían como puntos sobre el núcleo. El
resultado es: “positivo o negativo para el virus buscado” . Las desventajas de esta prueba
son: de ​muy baja sensibilidad porque es muy subjetivo al tener que diferenciar un color
de otro a nivel microscópico cuando la tinción no es muy intensa, por ejemplo cuando no
hay un efecto citopático importante entonces no se ven los núcleos gigantes o no se ve una
producción grande de las proteínas de inclusión citoplasmática. Hay que revisar varios
campos, no sólo una vez sino aproximadamente 10 áreas del portaobjetos, lo que lo hace
muy fatigante y lo convierte en un examen en el que se necesita un ojo muy entrenado.
¿Pueden ver un núcleo y alrededor hay señal del anticuerpo fluorescente? Pues con esta
imagen, alrededor del 30% no lo vieron. (se refiere a la imagen anexada al inicio del tema).
La ventaja es que no es tan costoso, se pueden dar resultados (procesar portaobjetos) en
aproximadamente 3 horas y se pueden hacer múltiples portaobjetos al mismo tiempo con la
misma muestra y detectar varios patógenos, pero cada uno va a necesitar su propio juego
de anticuerpos. La especificidad depende del tipo; por ejemplo para tracto respiratorio hay
un paquete que tiene sensibilidad alta y especificidad alta, pero no para todos los sistemas
existe eso.

Ensayo de Inmunoabsorbancia
ligado a enzima - ELISA: También
funciona a base de anticuerpos y
reacciones enzimáticas. La
diferencia entre esta prueba y la
inmunocromatografía es el formato
en la que se realiza ,ya que se
realiza en microplacas o pozos
donde ocurre la reacción antígeno -
anticuerpo. Entonces cuando se
realiza ELISA para diagnóstico,
normalmente se busca una muestra que contenga viriones que son la fuente de antígeno. El
antígeno reacciona con un anticuerpo en la forma más sencilla, que se llama anticuerpo
primario, con el que se da la reacción enzima - sustrato que produce, en este caso, niveles
de color variables que se pueden comparar con una curva de calibración y establecer de
forma semicuantitativa el nivel de viriones que había en esa muestra. En general para
diagnóstico, se dice si la reacción enzimática fue positiva o negativa, que sería indicador de
la presencia del antígeno viral que se estaba buscando.
 Hay una modalidad de
ELISA indirecta​, donde se
agrega un segundo
anticuerpo que aumenta la
señal de la reacción
enzimática.

Pregunta: ¿En esta prueba

si se encuentra el antígeno
cambiaría de color la
reacción enzimática?
Respuesta profesora: Sí,
en el procedimiento primero
se pone el antígeno,
después se lava para que queden bloqueadas las áreas que no tienen antígeno y así no se
una un anticuerpo por ahí. Después se agrega el anticuerpo específico y ahí se lava de
nuevo para soltar los anticuerpos que se quedaron por ahí y no están unidos a antígeno, y
luego ya se realiza la reacción enzimática. La reacción enzimática produce la coloración
solo cuando hay anticuerpos unidos a su antígeno, cuando no hay anticuerpos unidos a su
antígeno, en el segundo lavado todos los anticuerpos se van, desaparecen y entonces yo
no tengo la reacción de la enzima que está unida al anticuerpo con su sustrato.

Esta es la ELISA indirecta donde contra el anticuerpo primario, yo tengo un segundo

anticuerpo que me ayuda a mejorar la señal, y se llama anticuerpo secundario.

Esta es ​ELISA sándwich que es una modalidad en la que yo tengo dos anticuerpos
específicos contra el antígeno, eso aumenta la especificidad de la prueba.

Y para buscar los anticuerpos,

primero se cubre la microplaca con
unos antígenos conocidos y la
muestra ya no necesita tener
viriones, va a ser muestra de suero
donde voy a tener anticuerpos. Y
entonces yo tengo un antígeno
conocido, busco los anticuerpos que
se le unen a él y esos anticuerpos
pueden ser de tipo IgG, IgM,
isotipos dentro de cada una de
estas inmunoglobulinas, y si yo uso
un segundo anticuerpo o anticuerpo
secundario, para detectar el tipo de inmunoglobulina, entonces ahora puede recortar de
manera semi-cuantitativa, la cantidad de IgG o IgM o IgA, pero para eso entonces necesito
anticuerpos específicos contra los anticuerpos humanos.
Hay ventajas y desventajas ​en esto, en general son pruebas rápidas y económicas, la
versión con un solo anticuerpo ​(ELISA directa)​, ​ti​ ene menor señal, o sea que produce
menos color, ​es más difícil de marcar, es más complicado conseguir los anticuerpos que se
necesitan y tiene una baja sensibilidad; en la ​ELISA indirecta (sándwich) se le aumenta la
sensibilidad y se aumenta la señal de la reacción enzima-sustrato, pero necesita mayor
tiempo de procesamiento, sin embargo, ​las desventajas son que puede haber reactividad
cruzada del segundo anticuerpo, o es difícil conseguirla.

El Western Blot: ​es una prueba que se sigue usando en el país, aunque en otros países no
la usen tanto, principalmente para el diagnóstico de ​VIH​, y se basa en la purificación de
proteínas y la separación de esas proteínas en geles de acuerdo a su peso molecular, las
proteínas más pequeñas se van a la parte de abajo del gel, y las proteínas que son más
pesadas se van quedando arriba. Y luego, este es un gel donde en el caso de las proteínas
se llama gel de poliacrilamida, esas proteínas se pueden transferir a una película que es
normalmente papel de microcelulosa, eso es como imprimir en tinta húmeda y ponerlo sobre
una servilleta humedecida, se pasa la tinta de un papel al otro. Y ahora conecto las
proteínas en el papel de microcelulosa y las puedo buscar con anticuerpos específicos para
una proteína particular, entonces yo puedo sacar todas las proteínas de las células
humanas, y si tengo células infectadas con VIH, va a haber ahí proteínas que son de VIH, si
yo tengo un anticuerpo que es específico contra alguna de esas proteínas de VIH, ese
anticuerpo me va a decir en qué parte del gel estaba esa proteína; y como las habíamos
separado por peso molecular, si sabemos cuál es el peso molecular de esas proteínas,
podemos saber cuál proteína es. En la práctica, a ustedes les venden la tira de
microcelulosa con las proteínas ya separadas, y les indican en dónde está cada tipo de
proteína, y se agrega la muestra en la que estamos buscando la presencia de anticuerpos
contra virus de VIH, y después de que se hace la reacción antígeno-anticuerpo, se revela el
resultado que puede ser por la reacción enzimática y le da color sobre el papel de
microcelulosa y cuando se revelan aparecen varias bandas y esas bandas indican la
presencia, en cada paciente puede haber un tipo diferente de la proteína de VIH. Entonces
hay unos criterios que vamos a ver más adelante que si se tienen al menos tres de estas
proteínas se considera positivo para VIH, y si tiene menos de tres se manda a repetir las
reacciones.

Pregunta estudiante ​: A parte de VIH, ¿para qué otras enfermedades se utiliza Western
Blot como prueba diagnóstica?
Respuesta: En países en vía de desarrollo, solo se usa para VIH. Es más fácil detectar el
ácido nucléico, en VIH es importante conocer la cantidad de viriones. Es una prueba
presuntiva para VIH, que necesita una prueba confirmatoria, en el caso de VIH lo ideal sería
una prueba cuantitativa que diga qué cantidad de viriones hay por mililitro, para tomar
decisiones de manejo.

Después viene la población de ácidos nucléicos. ​PCR sirve para ADN, RT-PCR (RT:
Transcriptasa reversa) para ARN​, y se necesita una muestra que contenga los viriones,
pero en los virus que se integran también lo puedo hacer buscando el material genético, ahí
ya en los cromosomas, que se llama ​provirus ¿recuerdan? y entonces lo que se hace es
purificar ese DNA o RNA y se mezcla con unas enzimas que sintetizan DNA y esa reacción
se pone en un equipo que se llama termociclador que hace unos ciclos de amplificación -
ya vamos a ver para qué sirven esos ciclos de amplificación - y después el resultado se
observa en una electroforesis en gel que es separar esas moléculas que se amplificaron y
que se multiplicaron en esta reacción de
acuerdo a su peso molecular; lo que
estamos buscando es la presencia de
una banda o de un conjunto de
moléculas de DNA de un tamaño
específico que son las que uno esperaba
y que corresponden a una porción del
ácido nucléico de ese patógeno en
particular. El resultado va a ser
entonces positivo o negativo para el
patógeno y siempre hay que tener la
muestra acompañada de un control
positivo que va a decir de qué tamaño
debía ser la banda que tenía que
identificar en ese gel y un control negativo que le va a indicar que eso no se contaminó en el
procedimiento.

¿De dónde sale la especificidad de esto y por qué es tan alta? Esa es la pregunta que
hay​. La especificidad sale de que dentro del tubo de reacción se está buscando una porción
muy particular del ácido nucléico de ese agente patógeno, en este caso el virus, y para
buscar esa porción particular que es una porción pequeña que tiene una secuencia y un
tamaño característicos, yo determino cuál es esa región utilizando un panel de pequeñas
moléculas de DNA que se llaman ​cebadores o primers​. Esas moléculas van a tener una
secuencia única que no existe sino en el genoma del patógeno que voy a buscar, no existe
en el genoma de las células humanas, no existe en el genoma de los otros agentes
infecciosos que me dan la misma patología, es decir, que si estamos buscando un virus
respiratorio como el virus sincitial respiratorio, la secuencia no existe en ningún otro virus o
bacteria que cause infección respiratoria. Entonces ​estos cebadores son exclusivos y
específicos del agente infeccioso que voy a buscar y se ponen en un tubo de reacción
donde están: la muestra del ácido nucleico purificado, una enzima que sintetiza DNA (que
es la DNA polimerasa), esa DNA polimerasa necesita magnesio para funcionar entonces se
pone y los bloques de construcción de DNA que son Citosina, Adenina, Timina y Guanina, y
se pone a estos cebadores específicos o primers u oligonucleótidos específicos. Cuando
pongo esto a unas temperaturas en un ciclos de amplificación, lo que estoy haciendo es que
la polimerasa me construya este pedazo en rojo que está delimitado por eso, entonces, este
cebador de este lado y el segundo cebador del otro lado. La polimerasa sintetiza millones y
millones de copias de esto y eso es lo que veo en la banda de la electroforesis en gel. Para
eso entonces, las reacciones en cadena de la polimerasa (PCR) requieren de un aparato
que se llama termociclador que aumenta o manipula la temperatura haciendo que las dobles
hélices se abran para que las polimerasas puedan ir y hacer su función de síntesis y que
cada uno de estos cebadores se una a la región que les corresponde; ya después lo que es
el proceso de síntesis de ese pequeño fragmento y de los millones de copias de ese
fragmento, ocurre usualmente como a 32°C.

La ​amplificación isotérmica es una técnica muy parecida a la PCR, se necesitan

cebadores específicos para detectar una porción del ácido nucléico pero se hace con unas
enzimas que no necesitan todos estos procesos de subir y bajar la temperatura para abrir la
doble hélice sino que ​hay enzimas
adicionales que hacen este trabajo y
entonces no se requiere un
termociclador. La especificidad y la
sensibilidad son las mismas, el costo
es diferente.

Pregunta de una compañera: ¿En

esa amplificación isotérmica también
trabaja la DNA polimerasa?
Respuesta de la profesora: Sí. Pero
acompañada de otras enzimas que
abren la doble hélice, como si
estuvieran dentro de una célula
normal ¿quién abre la doble hélice en
la célula? ¿se acuerdan de la replicación del ácido nucléico? Topoisomerasas y Helicasas.

La ​PCR cuantitativa o ​PCR en

tiempo real que su abreviación es
una “q” no una “r” y una “t” (PCRq),
es también una muestra en la que se
producen muestras del ácido nucléico
pero en lugar de ser un gen,
detectamos que sí se están
produciendo las copias a través de
fluorescencia​, se evalúa la forma en la que se agreguen los fluorocromos. Tengo esta
misma reacción pero agrego un fluorocromo a los primers o aquí y entonces yo tengo señal
de fluorescencia cada vez que tengo la formación de dobles hélices o cada vez que estos
primers se me unen aquí, cada vez que estos cebadores se unen a su región blanco y
empiezan un ciclo de amplificación. Eso se convierte entonces en que, si yo repito el
proceso de unión del primer y de síntesis que hace la DNA polimerasa varias veces en el
tiempo, voy a obtener una curva de amplificación que voy a detectar por el aumento de la
señal de fluorescencia que se da y esto me sirve para decir que si tengo esta curva
característica se sabe si la muestra es positiva o negativa para el patógeno, pero si se fijan,
esta curva también va a decir la cantidad de virus que había allí porque a medida que, si yo
tengo una sola copia o una sóla molécula del DNA inicial - en el primer ciclo se genera sólo
una copia de ese fragmento - en el siguiente ciclo se duplica la cantidad o sea que esas
dos, la original y primera copia, ahora se convierten en 8 copias porque cada una genera 2
y así sucesivamente aumenta y yo puedo con ecuaciones, volviendo hacia atrás, decir cuál
era la cantidad original de virus. Estas curvas tienen unas características que son: están los
ciclos de amplificación y la cantidad de fluorescencia que había y hay un umbral a partir del
cual uno dice si fue positivo o negativo, entonces uno siempre tiene una fluorescencia basal
que tienen todas las reacciones porque las enzimas y los nucleótidos fluorescen un poquito
y uno siempre tiene un control positivo que le tiene que decir a uno si hubo fluorescencia en
esa reacción y un control negativo que le tiene que decir a uno que hubo cosas que no
amplificaron, que no dieron una curva que creció de manera exponencial.
Cuando uno tiene diluciones de la muestra puede generar una curva en la que cuando uno
mete una muestra y tiene diluciones seriadas del control positivo en el momento en el que
se ubica la muestra en estos sitios le va a decir la cantidad de virus que había. ​Esta es la
prueba cuantitativa que le dice a usted la carga viral: cuantos virus hay por mililitro en
una muestra. Entonces para hacer eso necesito: Termociclador de tiempo real, la reacción
de tiempo de real con la fluorescencia y una dilución seriada del control positivo para que
cada muestra en esa dilución, cada dilución me dice en qué ciclo obtengo amplificación. Las
diluciones más concentradas dan señal o cruzan ese umbral al principio de la reacción y las
muy diluidas lo cruzan muy al final (el control negativo nunca cruza ese umbral); y mi
muestra se queda en un cierto punto T y tiene una correlación para la cual existen unas
ecuaciones que me permite determinar la concentración. Esas ecuaciones van a permitir
que la carga viral se exprese en log en base 10 de copias por mililitro (se van a encontrar
eso probablemente en la literatura).
[Invitación para matricularse en las electivas de investigación y métodos moleculares en
enfermedades infecciosas para profundizar en este tema]
Infecciones virales necesitan que se determine la carga viral como proceso para determinar
el tratamiento:
· VIH
· Hepatitis C
· Citomegalovirus
· Virus Epstein-Barr (en algunas circunstancias)
· Virus BK

Ventajas y desventajas
En general tienen las mismas ventajas las PCR y
las PCR tiempo real en cuanto su sensibilidad y
especificidad porque todas están basadas en esos
cebadores específicos.
Las PCR pueden hacerse en multiplex para
manejar los geles, es fácil hasta unas cuatro
reacciones distintas por muestra, y los reactivos
son de uso flexible. Las desventajas son que no
son cuantitativas, se necesita entrenamiento en
biología molecular, se necesitan termocicladores y
equipo de electroforesis: hacer las electroforesis
es tardado y cuando se hacen las electroforesis se
abren los tubos después de que se hizo la
amplificación y esa es una fuente altísima de
contaminación.

En las qPCR, las ventajas es que disminuimos la

contaminación porque la fluorescencia la lee el
equipo y aquí no hay procesamiento después de
que se hace la reacción de amplificación; también
se puede hacer cuantitativo y resulta muy útil para
casos específicos, el Múltiplex se puede hacer
hasta por 12 fragmentos blanco que pueden ser de
agentes infecciosos distintos que se dejan manejar
con facilidad ​. ​Desventajas es que esto va a
requerir equipos costosos y el diseño de un
Multiplex de 12 requiere muchos reactivos
costosos.

Pregunta compañero:​ ¿Entonces la carga viral se saca a partir del PCR?

Respuesta profesora: Si, a partir del PCR tiempo real. Y con unas especificidades de ese
PCR en tiempo real y es que se necesitan unas concentraciones conocidas del control
positivo.
Pregunta compañera: ​¿ese PCR cuantitativo es la misma prueba sólo que están
cuantificando?
Respuesta profesora: ​Si, es el mismo aparato del PCR tiempo real y se hace cuantitativo
cuando yo tengo unas concentraciones conocidas del control positivo para poder
compararlo con la muestra que estoy probando.
Pregunta compañera: usted ahora dijo que uno era para ARN y ADN, ¿el procedimiento es
el mismo?
Respuesta profesora: ​Más o menos, hay una diferencia en el primer paso: cuando yo
tengo ADN empezamos con los cebadores uniéndose a su molécula de ADN y la DNA
polimerasa haciendo el proceso de síntesis. Cuando yo tengo ARN empezamos en un paso
anterior cuando la molécula es de ARN entonces, esa molécula de ARN tiene que
convertirse en ADN antes de hacer esta reacción y para que mi ARN se convierta en ADN
se usa la transcriptasa reversa.
Cuando mi patógeno tiene el genoma de RNA la reacción va a ser RT-PCR cuantitativa o no
cuantitativa con gel o sin gel, como la queramos.

La secuenciación es un
proceso que también lleva una
ronda de amplificación pero
después se necesita un sistema
de detección de señal de
fluorescencia, pero lo que va a
hacer no es detectar la cantidad
de dobles hélices que se están
produciendo por ciclo sino, en
un solo ciclo, se detecta el tipo
de nucleótido que se puso en
un momento específico de la
reacción o en qué orden se
puso el tipo nucleótido. Aquí no
vamos a entrar en detalle sino que vamos a pensar en que el resultado de la reacción de
secuenciación es una secuencia y el sistema no le dice que secuencia es esa sino que
usted debe ir a una base de datos y comparar esa secuencia contra la de patógenos de
referencia, y cuando la compara eso le da un porcentaje o un número de cuánto se parece a
la secuencia que usted obtuvo con esos patógenos de referencia, que puede ser un virus,
bacterias o parásitos (cualquiera que tenga ácidos nucleicos que se puedan secuenciar).
En la Secuenciación Sanger el detalle es que esta es una PCR y yo parto de Primers o
Cebadores específicos y secuenció solamente un pedacito de un gen específico dentro de
un género o dentro de una especie en particular de agente infeccioso. En esta también se
necesita procedimiento de amplificación, cebadores específicos y después en el proceso de
secuenciación me arroja el orden de lo nucleótidos que corresponden a ese fragmento de
ADN que se amplifico, y está secuencia de este orden de nucleótidos se compara con una
base de datos y se da como resultado un porcentaje que muestra cuanto esa secuencia se
parece a un virus de referencia.

En la secuenciación masiva la diferencia es que se parte de la muestra que contiene los

viriones, se hace purificacion de acido nucleico (sin amplificación), si no que todo el ácido
nucleico que se saque purificado, incluso el ADN de la célula o el ARN de todas las células
que estaban, por ejemplo, en una muestra de suero o que estaban en una muestra de
sangre completa; se saca todo, y se fragmenta en pedacitos, se manda a secuenciar todos
esos pedacitos, posteriormente salen estas porciones(refiriéndose a la imagen) y estas
porciones de piezas cortas ( porque todo está fragmentado) y todo eso se compara con otra
secuencia genoma de referencia de todos los agentes patógenos que existen para los
humanos; Se puede secuenciar absolutamente todo y encontrar sin estar buscando una
bacteria , un parásito , y sin saber que se está buscando; pero el sistema bioinformático
me va a decir que había. Entonces se obtiene todo este montón de secuencias, se
compara con la base de datos de los patogenos parasitos, virus y bacterias patógenas
humanas y el resultado consiste en la cantidad de esas secuencias cortas que al
compararse se parecen a un agente infeccioso.
Por ejemplo, se tiene una Encefalitis en la que no se sabe cuál es el agente causal, porque
es muy atípica, y se manda a secuenciar, posteriormente se revisa (se compara) todas las
piezas cortas de secuencias con todas las bacterias, parásitos o virus que podrían causar
encefalitis; encuentro el virus y tengo un punto de partida para empezar con el tratamiento
a ese paciente.
¿Esto cuando sirve? Es costoso, porque secuenciar todo tiene altos precios, pero sirve
cuando la sintomatología es atípica, cuando todas las pruebas previas de diagnóstico han
fallado,cuando se ha buscado específicamente de manera consecutiva y todos los
resultados han sido inconclusos.
Pregunta compañera ​:¿profe entonces allí no se amplifica (refiriéndose a la secuenciación
masiva?
Responde la profesora: Aquí no se amplifica, solo se corta sin amplificación , solo se
purifica todo el ácido nucleico, se puede hacer un Transcriptoma de RNA solamente y no
ADN o se pueden hacer los dos, y todo eso se corta en pedacitos, se manda a secuenciar y
se compara a través de la bioinformática; ¿que se necesita entonces para hacer esto bien?
un buen bioinformático.

Entonces para la ​secuenciación Sanger

● tiene siempre la prueba confirmatoria de cualquier PCR en tiempo real y de
cualquier amplificación isotérmica, después de que usted obtiene la secuencia ,
usted puede reportar eso en cualquier reporte de caso , en cualquier publicación y
queda entonces en un reporte de una calamidad en donde se confirmó el agente
infeccioso.
● Tiene como posibles fallas de la sensibilidad y especificidad siempre van a hacer la
misma del proceso de amplificación.
● Secuenciar requiere un equipo costoso; aqui en colombia hay pocos centros que
hacen secuenciación, esto se puede hacer muy rápido si su propia institución tiene
un equipo de secuenciación.
● Requiere análisis bioinformático posterior.
Secuenciación masiva
● tiene una alta especificidad que detecta patógenos emergentes, o virus emergentes
(organismos que nunca antes se pensó que podría ser agentes causales de una
patología específica ).
● Sirve como apoyo de los casos atípicos.
● Requiere unos costos de herramienta en bioinformática y mucho análisis de
secuencias.

Epstein Barr.

Aquí tenemos una faringitis, esta que está

aquí, no es viral, es por ​Estreptococos;
pero entonces es para que tengan en
cuenta que hay diversas causas de
infeccion e inflamaciónn en la faringe y
entonces siempre se va a necesitar un diferencial entre la faringitis bacteriana con la que
es viral, entre los virus que causan faringitis tenemos: Adenovirus, Enterovirus, Herpes
simple en su infección primaria, Epstein-Barr ,VIH. La infección aguda inicial que causa este
virus.
Se debe diferenciar de infecciones ​bacterianas​ por: ​Streptococcus,Fusobacterium,
Arcanobacterium,Haemophilus,Mycoplasma,Chlamydea.

Vamos a hablar de éste

porque es una virosis
que no solo está
involucrada en causar
molestias del sistema
respiratorio superior
sino que se manifiesta
como una infección
sistémica cuando la
célula se infecta con
mononucleosis
infecciosa en un
paciente
inmunosuprimido
puede causar la
leucoplasia vellosa​, y
además causa infecciones latentes que resultan en linfomas como el ​linfoma de Burkitt,
carcinoma nasofaríngeo, enfermedad linfoproliferativa (post-trasplante).
La infección inicial que causa la faringitis e infecta linfocitos es la ​mononucleosis
infecciosa, ​los que más la desarrollan son los adolescentes y adultos jóvenes, y tiene una
distribución mundial. También hay mononucleosis infecciosa por citomegalovirus.
El ​linfoma de Burkitt ​se presenta normalmente en África subsahariana (100% de casos de
linfoma de Burkitt con Epstein-Barr), en América el 30% de los casos tiene asociación y se
da en niños (4-12 años).
El ​carcinoma nasofaríngeo ​se da en adultos especialmente en China con asociación del
100%
Las enfermedades que vemos aquí están relacionadas con el background genético de las
poblaciones.
La ​enfermedad linfoproliferativa ​se da en niños y adultos después del trasplante, ocurre
una reactivación de la forma latente del virus EBV y se da gracias al estado de
inmunosupresión​ que tiene el paciente en ese estado post-trasplante.
En algunos casos se ha relacionado el EBV con el ​linfoma de Hodgkin ​pero es una
relación poco frecuente.

El EBV es un ​herpes virus, ​eso significa que está genéticamente relacionado con el virus
herpes simple, con el herpes 2 que es el principal responsable de herpes genital y
citomegalovirus.
Acá (imagen superior) vemos los diferentes grupos en los que se divide herpesviridae, y
vemos que compartimos los herpes virus con varios primates tanto de África como en
América, y de ellos podemos seguir adquiriendo especies de herpes virus.
En este grupo también están Varicela zóster. En particular, el EBV está dentro de un género
que se llama ​Gammaherpesvirinae que se caracteriza porque tiene una tasa de
multiplicación rápida, pocos hospederos y el EBV es exclusivo de los humanos; y la
característica principal es que éstos hacen latencia en los linfocitos, y eso significa que
hacen viremia y que tienen la oportunidad de diseminarse a diferentes regiones del cuerpo y
estar involucrados en varias patologías.
 La ​vía de transmisión ​es por contacto
directo por las ​secreciones orofaríngeas ​(por
ejemplo, las que aparecen en la diapositiva)
porque ​el primer sitio de multiplicación del
virus herpes ​es el epitelio de la faringe ​y, a
partir de ahí, busca su ​segunda unidad de
células blanco​ que son los ​LB.
En los países desarrollados ocurre,
generalmente, en los niños en guarderías y
entre adultos jóvenes muy “compartidores”.
El 90% de la población mundial es seropositiva
y, de ese 90%, 15% son adultos sanos
portadores de la forma latente.

Les presento al Virión Epstein Barr, este virus es

un virus envuelto con glicoproteínas asociadas a
su membrana, una cápside interna + una matriz
que contiene algunos elementos de carbohidratos
y dentro de esta cápside está en ácido nucleico
que es de ​ADN DE DOBLE CADENA​.
¿Que es importante? Dijimos que sus células
blanco son epiteliales y son células que tienen
CD21 y las integrinas para los linfocitos B y
también se necesita un co receptor en el epitelio
es el HLA -1 y en los linfocitos B una segunda subpoblación de integrinas.

La ​mononucleosis infecciosa: se
va a presentar con unos signos
particulares que es donde resalta el
dolor faríngeo por la inflamación de
la faringe en el 100% de los casos,
pero además lo pacientes pueden
aparecer con dolor de garganta,
fatiga, dolor de cabeza, fiebre,
alguna mialgia, falta de apetito
asociada con el dolor de garganta
y la inflamación faríngea, y además
de eso puede presentar molestia
del nódulo linfático cervical,
hepatomegalia, esplenomegalia, edemas en párpados.

El periodo de incubación suele ser de ​4-7 semanas ​y después los síntomas típicos de
mononucleosis que duran entre ​3-4 semanas ​y después se da la persistencia por latencia
que no ocurre en todos los casos si no cuando el sistema inmunológico no logra cumplir
todas sus funciones.
Este es lo que está pasando en el proceso patogénico, durante la mononucleosis infecciosa
el virus llega inicialmente a replicarse en las células epiteliales faríngeas → pasa a
multiplicarse en linfocitos B donde induce diferenciación o activación de clonas en el nódulo
linfático de ahí viene la ​linfadenopatía y estas poblaciones de linfocitos B pasan a circular
en el torrente sanguíneo y pueden llegar hasta la médula ósea.

En estos linfocitos que sufren activación policlonal o que maduran ocurren 2 cosas:

1. Se da un cambio de isotipo, empiezan a producir unos Acs “contra cosas raras” y

entonces si se diera la infección desde el punto de vista inmunológico aparece el
aumento de ​Acs heterólogos ​que no son específicos contra el virus Epstein Barr pero
que son Acs que van a tener unos epítopos desconocidos y que van a estar circulando.
2. Linfocitos sufren cambios morfológicos, que son los que nos ayudan después como
herramienta inicial de diagnóstico presuntivo.

Después de que se da el proceso de la mononucleosis infecciosa, el virus puede quedarse

en estado latente y persistir, eso puede originar después: ​linfoma de Burkitt, linfoma
nasofaríngeo, leucoplasia vellosa, o la enfermedad linfoproliferativa.
Para entender cómo se da el diagnóstico del virus Epstein Barr y como se da la latencia,
tenemos que repasar brevemente como es la organización genómica de estos virus y lo que
nos interesa son las proteínas resaltadas.​ EA: ​antígeno temprano
Es un genoma grande tiene 145.000 pares de bases, en este genoma se producen
diferentes genes que dan origen a diferentes tipos de proteínas:
· Proteínas de expresión temprana: cuando el virus entra a la célula
· Proteínas de expresión tardía:
· Una Región donde todas las proteínas que se producen están relacionadas con la
latencia

Estas proteínas tempranas y tardías en el ciclo de replicación viral en la célula, hacen parte
de una región genómica que se llama ​zona u ori lítico​, quiere decir que cuando se están
produciendo, la multiplicación del virus termina con la lisis de células blanco, habíamos
dicho que dentro de las tempranas, las que se producen inmediatamente después de que el
virus pierde su cápside y se instala en el núcleo, entonces está la proteína ​EA (​Ag
temprano), las proteínas ​EBNA ( ​son proteínas que se aglomeran en el núcleo esto traduce
antígenos nucleares del virus Epstein Barr) y las que están en la zona tardía que son ​LMP 1
y 2, ​son proteínas que se producen durante el estado de latencia y además se transportan
mediante el sistema de transporte de la célula y se expresan en la membrana.

Entonces las células que tienen virus latente tienen marcadores de membrana que son las
proteínas ​LMP ​derivadas del virus. Y las proteínas de la cápside se abrevian ​VCA, ​estas
proteínas de la cápside, nos sirven como Ags de diagnóstico para cuando se están
produciendo los viriones.
Estar en latencia es producir una cantidad muy poca o ninguna de viriones.

Estar reactivado es cuando se están produciendo viriones entonces hay proteínas VCA.

Y la proteína ​TyK (tirosin quinasa) es una proteína tardía, se encuentra en la región de

latencia pero que también se produce en algún momento durante el proceso tardío o sea
durante la multiplicación, este es el blanco de los antivirales que se utiliza para Epstein Barr
y para otro tipos de Herpes virus.

Pregunta de compañera​: ¿El origen se da en los Linfocitos B?

Respuesta de la profesora​: El Herpes se da en ambos casos, tanto en las células
epiteliales como en los Linfocitos B, y es durante la infección aguda, cuando se están
multiplicando y en procesos de producción de viriones, destruyendo al salir a las células
epiteliales y a los LB’s; ​no es cuando están haciendo latencia​.
La latencia tendrá que ver con que ​persista el genoma viral​, no los viriones, y ese genoma
viral se mantiene en una forma que llamaremos ​episoma​, que se da cuando el genoma viral
se queda en el núcleo pero no se integra, ​sino que se mantiene como si fuera un
minicromosoma adicional que adquirió el núcleo​; dentro de los LB’s.
Cuando se queda en el núcleo, gracias a el sistema de renovación de la cromatina, el cual
está compuesto por una serie de proteínas que se encargan de unirse a regiones de los
cromosomas y apagar los genes por medio de las histonas. Estas histonas también van a ir
sobre el material genético del virus Epstein-Barr, ​inactivando algunos genes,​ que darán
origen a ​diferentes tipos de latencia​.
En la latencia que da origen al linfoma de ​Linfoma de Burkitt, ​mononucleosis o la
enfermedad linfoproliferativa​, donde solamente se están expresando unos genes
particulares.
● En la latencia que está asociada al ​Linfoma de Burkitt y al Carcinoma nasofaríngeo
se están produciendo unas proteínas distintas a partir de ese episoma; en este caso
dos antígenos nucleares y las dos proteínas tardías que se van a la membrana de la
célula de su hospedero, por ello seran marcadores de estos carcinomas.
● Mientras que en ​Leucoplasia Vellosa y Enfermedad Linfoproliferativa, en el estadio
de latencia de tipo 3 se están expresando muchas más proteínas que en los otros
casos.
● Apagar todos los genes sería la estrategia para evitar la latencia.

Se había dicho entonces que los antígenos

VCA (que son los de la cápside) nos
permiten guiar el diagnóstico inicial, al igual
que las proteínas tempranas (​EA​) porque
son ​marcadores de latencia.
Las proteínas ​LMP son marcadores de
estados tardíos de latencia.
Por lo cual nos ayudan a entender el
conjunto de ayudas diagnósticas que hay.
La línea roja aquí representa los viriones de Epstein-Barr en sangre, y sus características
son: en los linfocitos está en antígeno temprano y hay cápsides virales, por lo cual tenemos
la cadena ​VCA​, que puede ser detectado por ELISA (por antígenos específicos contra la
VCA), y con pruebas rápidas contra esos antígenos.
● La ​IgG contra EBNA (Epstein-Barr nuclear antigens. ​Línea Azul.​) no es detectable
hasta pasados 120 días después de la infección, por ello ​no es prueba para
diagnóstico inicial de mononucleosis.
● La IgG contra VCA (Viral Capsid Antigens. ​Línea Verde​) se pueden encontrar los
antígenos contra la proteína desde antes de los 120 días, por lo tanto ​está si es una
prueba para el diagnóstico inicial de la mononucleosis.
● Se había dicho que la ​principal fuente de transmisión es la saliva​, a través de las
secreciones orofaríngeas​, y cuando la muestra tomada es la saliva ​se pueden
encontrar la VCA y el antígeno temprano (EA)​; también asociado con un lapso de
tiempo que está relacionado con el tiempo de duración de la expresión de la
mononucleosis infecciosa, y se puede encontrar el virus en la células de los epitelios
orales.

Diagnóstico de Mononucleosis Infecciosa​.

La prueba más útil para cuando se habla de Mononucleosis Infecciosa es la prueba llamada
“Monospot”. Está prueba busca los ​anticuerpos heterofilos​, o sea cuando se activaron
todos esos linajes de linfocitos.
 Se tienen una gran variedad
de anticuerpos que no se
sabe que es lo que hacen, y
que son capaces de aglutinar
glóbulos rojos de cabra u otro
animal vertebrado, por la cual
se hace una prueba de
aglutinación y se determina
(​la cantidad de aglutininas?,
no se logra escuchar bien.​)
haciendo una dilución seriada
del suero del paciente hasta
llegar a 1:80.
Si se observa que los
glóbulos rojos se rompieron y fueron al fondo y ​da un título mayor de 1:50 esto me indica
que es sugerente de la presencia del virus Epstein-Barr y de la presencia de anticuerpos
heterófilos​.

Entre las desventajas que posee la prueba es que su sensibilidad está mediana a alta y
una especificidad que también es entre mediana a alta. Los anticuerpos heterófilos duran
menos de seis meses y ​hay un 10% de los casos de adultos mayores, adultos jóvenes
y niños que nunca producen anticuerpos heterófilos​, y ​con ello se pierde la sensibilidad
diagnóstica de esta estrategia inicial de prueba Monospot rápida como diagnóstico para
Mononucleosis Infecciosa.

La segunda herramienta es el ​extendido sanguíneo​, con ​conteo de los linfocitos atípicos y

para ello hay unos criterios particulares, donde se hace el extendido sanguíneo y se
cuentan los linfocitos para determinar linfocitosis (aumento significativo de la cantidad de
linfocitos). Sí hay más del 50% de aumento (de linfocitos) se miran los monocitos. Sí hay un
aumento del 10% de monocitos con presencia de núcleos atípicos, quiere decir que son
anormales, o sea que: hay monocitos más grandes, con proporción diferente
núcleo/citoplasma (más núcleo que citoplasma) o núcleo poco denso. Esto tiene una
sensibilidad entre el 75% y 90%, lo que la hace una prueba sugestiva muy práctica para
decidir o revisar mononucleosis infecciosa, después de una consulta con fiebre y dolor de
garganta en adultos jóvenes.

El problema con el
conteo de linfocitos
atípicos, en particular
los monocitos, es que
todas las mononucleosis
infecciosas, también la
causada por
citomegalovirus, van a
producir estas
características. La
herramienta diagnóstica,
entonces, es western blot contra antígeno temprano, o western blot contra el antígeno
nuclear o western blot contra la proteína de la cápside. Este último (la proteína de la
cápside) y el ​antígeno temprano detectan el proceso lítico de la infección, pero el ​antígeno
nuclear​ ​NO ​diferencia entre la latencia y una infección activa.

Las herramientas
diagnósticas adicionales son:
la detección del ácido
nucleico en sangre o en
saliva. En sangre, no
diferencia tampoco la latencia
de la infección activa; y en
saliva, se puede pensar en
producción de viriones en
activa, porque la mayoría de
material genético presente es
de viriones que están siendo
liberados por las células
endoteliales. El problema es que habrá portadores asintomáticos, cuya saliva es positiva.

Hay pruebas serológicas que

buscan IgM contra el antígeno
temprano, también sirve para las
fases en donde se producen los
viriones e IgG contra el antígeno
temprano o contra el antígeno
nuclear. Esta no es de las mejores
pruebas porque ​no diferencia una
latente de una no latente y a veces
tampoco detecta todo el tiempo los
anticuerpos contra antígenos
nucleares, entonces depende de la
conveniencia y del tiempo que se sospeche que está la infección. Encontrar IgG contra el
antígeno de la cápside es una prueba que tiene sus complicaciones pero necesita de una
prueba adicional para confirmar que hay infección activa o multiplicación de los viriones, por
esto, es mejor detectar directamente al antígeno. La idea es siempre diferenciar una
latencia de una infección activa y saber qué va pasar con la latente.

Siempre que halle IgM contra el antígeno de la cápside es porque hay antígeno de la
cápside y es una infección activa. Pero cuando hay Ig contra los otros antígenos es que se
está entrando en otros procesos: ya sea de latencia, cuando hay anticuerpos contra todos
los antígenos; cuando hay anticuerpos IgG contra antígeno nuclear y contra de la cápside,
es sugerente de que hubo una infección pasada (posiblemente hay latencia) pero se
necesita diferenciar si hay la infección latente o hay células de memoria; cuando todas las
pruebas de ELISA son negativas, así haya faringitis, no es virus Epstein Barr.

El manejo siempre
incluye​:
● Manejo de la
fiebre y el malestar
con antipiréticos,
cuando sea necesario.
● Prevenir
ruptura de bazo, evitar
los deporte de
contacto, donde la
esplenomegalia se
convierte en un
problema.
● Antivirales: antiherpéticos, cuyo blanco es la enzima tirosin quinasa, enzima
involucrada en la multiplicación del virus. Este "paquete" incluye: Aciclovir (el más
común), Valaciclovir, Ganciclovir, Foscarnet y Penciclovir. Estos tienen la
característica de que ​solo funcionan en la etapa lítica activa​, o sea cuando se
producen viriones, cuando se multiplica el virus.
● En los casos de latencia el manejo se hace por la enfermedad subyacente que se da
en consecuencia de la latencia.
● El objetivo de los antivirales ​NO es disminuir la sintomatología de la enfermedad sino
evitar la latencia, o sea detener la multiplicación del virus para que no haya material
genético que se quede en forma de episoma y haga el proceso de latencia.

Como complicaciones se puede

presentar, de la faringitis, una
inflamación abundante que produzca
obstrucción de la vía aérea, se puede
propiciar el establecimiento de
microorganismos, y resulta además en
meningoencefalitis, pueden afectar en
trombocitopenia y anemia hemolítica, como consecuencia relacionada con los anticuerpos
heterófilos que pueden hacer blanco en
plaquetas, por ejemplo.

Para manejar la obstrucción se usan

corticosteroides que disminuyen la inflamación
en la zona.

En los padecimientos asociados​, tendría que

ver con:

- Linfoma de Burkitt
- Enfermedad linfoproliferativa, el carcinoma.

Entonces, el manejo ya no tiene tanto que ver con

el manejo de la infección por herpes, sino por las circunstancias atenuantes, por lo tanto,
para el linfoma de Burkitt siempre se realizará quimioterapia con ​Metotrexato​,
Ciclofosfamida ​y ​Rituximab​; y para la enfermedad linfoproliferativa están disponibles unos
LT citotóxicos que son específicos contra las células que están presentando en su
membrana a esas proteínas tardías, las NMPs.

Existe una vacuna de péptidos derivado de la proteína NMP2, que sirven de vacunación
terapéutica a personas que tienen alto riesgo de desarrollar carcinoma nasofaríngeo.

Pregunta:​ En la anterior, ¿Inyectaban con linfocitos T?

Respuesta: Si, estas dos terapias son modernas, y que están en desarrollo, y que han sido
ya probadas en unos casos exitosos, pero que no se han extendido al uso general por la
comunidad médica internacional, pero han sido casos exitosos que tienen una validación
avanzada por parte de su aprobación por la FDA.

Entonces, en los países donde estas enfermedades son frecuentes y que elegimos por
ejemplo, el carcinoma nasofaríngeo, en China, y el linfoma de Burkitt, en África, estos
procedimientos si constituyen procesos ya de rutina, y son bastantes disponibles.

Nosotros aquí no tenemos eso, pero, podemos contar con el control ahora si, de la
multiplicación del virus Epstein-Barr a través de los antiherpéticos, aquí podemos agregar,
Foscarnet ​y esto nos sirve entonces para manejar la enfermedad linfoproliferativa o
trasplante, se puede incluso tener esto como una profilaxis (si sabemos que es un grupo en
alto riesgo). También se puede reducir la población de episomas con ​hidroxiurea y esto se
hace cuando tenemos linfomas en SNC, donde estos linfocitos T citotóxicos no van a lograr
llegar. Sin embargo, la hidroxiurea es un compuesto con efectos secundarios importantes y
con efectos sobre la misma célula blanco.

Pregunta: ​Profe, ¿Usted dijo que podíamos ​agregar AIT?

Respuesta: ​Podrian agregar aquí los otros antiherpéticos que son ​Foscarnet​, ​Penciclovir​,
que son fármacos de nueva generación, hay mucha resistencia ahora a ​aciclovir​, entonces
los otros.

Bueno, este ejercicio se los voy a mandar

después.

Los linfomas, tienen unas características

adicionales que no solamente me están
derivadas de la latencia del linfoma y
carcinoma - de la latencia del virus
Epstein-Barr en las células - sino que se
necesitan procesos adicionales, como en
cualquier proceso oncogénico.

El linfoma de Burkitt es muy

frecuente en África, se presenta
también en menores de edad, pero
con una tendencia a ser muy
abundante en hombres, (en el sexo
masculino). Tiene una progresion
rapida, osea, que la forma tumoral,
todo este proceso de patogénesis,
ocurre en un tiempo corto, tiene
afinidad por los huesos
mandibulares, además, suele ser
unilateral.

Lo que está pasando ahí, dijimos siempre que había una asociación del 100% en áfrica,
entre la presencia del linfoma de Burkitt y la presencia del virus de Epstein-Barr, entonces,
tener la infección por virus Epstein-Barr es como un paso obligado para desarrollar linfoma
de Burkitt.

Lo primero que se da es la proliferación y diferenciación de los linfocitos B, con expresión

abundante de antígeno nuclear del virus de Epstein-Barr de tipo 1 (EBNA-1), esta célula
entonces llegan al nódulo linfático, y allá mientras están multiplicando les ocurren
translocaciones cromosómicas, que terminan en aumento de la proliferación celular, con
mutaciones acompañantes en los genes ​c-myc y p53, MDM2​. Estos marcadores de linfoma
más una expresión aumentada de las proteínas NMPs en los linfocitos en el nódulo linfático
que contienen los episomas o la forma latente del virus, es lo que termina con la expansión
de todas esas clonas del LB en el nódulo linfático y que terminan entonces, apoyándose
sobre los huesos mandibulares.
El carcinoma nasofaríngeo tiene una
frecuencia muy alta en los países asiáticos.
Lo que sucede es que la infección por virus
Epstein-Barr no es lo primero que sucede,
sino al revés, primero se tienen unas células
epiteliales normales en las que hay cambios
de la regulación de los oncogenes ​p53 y
p21ras​, con la disminución de las proteínas
p16 y p17​, y eso resulta en una hiperplasia
epitelial. Esa hiperplasia cuando se
acompaña con la llegada del virus
Epstein-Barr y aumento de la ​Ciclina B2​,
resulta en la aparición de displasias
epiteliales de alto grado, que cuando se acompañan de inserciones y deleciones en
cromosomas 11,12 y 13 resultan en un carcinoma nasofaríngeo en esas poblaciones.

La tendencia a tener estas inserciones, deleciones y desregulaciones en p53 es por

arreglos característicos de estas proteínas que circulan predominantemente en las regiones
asiáticas y algunos países africanos.

Leucoplasia vellosa

Es una manifestación donde las células epiteliales de la cavidad oral se vuelven

queratinosas por la presencia acumulada, latencia o reactivación del virus Epstein barr, que
se da en condiciones de inmunosupresión.

Hay otros factores que causan leucoplasia vellosa como:

● El tabaquismo
● La presencia de cándida albicans
● VPH

Entonces también se manifiesta la queratosis corrugada que le da la apariencia blanquecina

a la superficie de la lengua.

Cuando es candidiasis la característica particular es que: estos se quitan de ella, se

mueven, porque la levadura está creciendo sobre la superficie y si se hace un mini raspado
se quita y ya con eso se puede establecer si es una candidiasis o no.

Diagnóstico

Confirmar con biopsia y por histopatología que muestre las diferencias en una infección por
virus Epstein barr y el virus del VPH que puede ser otro agente causal o por la presentación
específica.
Ejercicio de estudio