PRACTICA DE BIOQUIMICA PARA VETERINARIA No.

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ACIDOS NUCLEICOS: AISLAMIENTO DE ADN A PARTIR DE

HEPATOCITOS

OBJETIVO:

El alumno aislara el ácido nucleico desoxiribonucleico (ADN) a partir de células

hepáticas (hepatocitos) e identificara por pruebas colororimétricas algunos de sus
componentes básicos.

INFORMACIÓN GENERAL:

Existen 2 tipos principales de ácidos nucleicos: El ADN ( ácido

desoxiribonucleico) y el ARN (acido ribonucleico).Los ácidos nucleicos son
biopolímeros sumamente importantes dentro de las células, su principal función es
participar en la síntesis de proteínas, y además, participar en los fenómenos de
reproducción celular, en cuanto a su estructura química, los ácidos nucleicos constan de
la unión de numerosos nucleótidos, estos nucleótidos estan formados por una base
nitrogenada que puede ser ; purica ( adenina o guanina) o bien pirimidinica (citosina,
timina o uracilo), constan también de un azúcar pentosa (ribosona o desoxirribosa ), y
además fósforo.

El ácido desoxiribonucleico o ADN para el caso de las células eucarióticas

se encuentra principalmente dentro del núcleo, aunque una pequeña porción del mismo
se encuentra dentro de las mitocondrias, el ADN tiene una estructura tridimensional de
una doble hélice, en la cual las bases nitrogenadas se encuentran siempre apareadas
Guanina con Citosina y Adenina con Timina, se estima que el genoma humano haploide
contiene alrededor de 3,000 millones de pares de bases.

Materiales Reactivos
Trozo de Hígado Sal común
Cuchillo Solución detergente sulfato lauril
Licuadora sódico
Gasa Proteasa
Embudo Buchner Alcohol etílico
Bomba de vacío Äcido sulfúrico
Vaso pp 250 ml (2) Reactivo de Bial
Varilla de vidrio Molibdato de amonio
Probeta 50 ml (2) Reactivo de Fiske-Subarow
3 tubos ensayo 10x12 mm
Pipeta Pasteur
3 pipetas 1 ml
Centrífuga
 Tubos de polirtileno50 ml para
centrífuga
Palillo de madera (largo)
Hielo

Desarrollo del experimento

1.-Pesar 50 gramos de hígado, cortarlo en trozos pequeños, pasarlos a un vaso de

licuadora y añadir 100 ml de agua destilada fría más 10 gramos de sal común.

2.-Licuar a máxima velocidad por aproximadamente 30 segundos

3.-Filtrar a través de una capa fina de gasa colocada sobre un embudo Buchner, usar
bomba de succión en caso de que sea necesario

4.-Pasar el filtrado a un vaso de precipitados de 250 ml y añadir 25 ml de solución

detergente.

5.-Mezclar por 3 minutos lentamente y con cuidado el filtrado y la solución detergente

usando una varilla de vidrio, IMPORTANTE TRATAR DE NO HACER ESPUMA
AL MEZCLAR

5.-Dejar reposar la mezcla durante mínimo 10 minutos

6.-Pasar la mezcla a un 2 tubos grandes llenando solamente 1/3 del volumen de cada
tubo, y añadir ( a cada tubo) una pizca o pequeña cantidad de enzima proteasa, agitar el
tubo suavemente. PRECAUCIÓN SI SE AGITA CON VIOLENCIA SE VA A
ROMPER EL ADN, VA A SER DIFICIL VERLO

7.-Ladear cada tubo el tubo y lentamente y por las paredes del tubo ir virtiendo
alcohol etílico frío en una cantidad igual al volumen del filtrado que ya hay en el tubo.
PRECAUCION, LA ADICIÓN DEL ALCOHOL SE HACE LENTAMENTE Y
POR LAS PAREDES DEL TUBO.

8.-Dejar reposar la mezcla por 30 minutos mínimo

9.- Colectar el ADN de cada usando un palillo largo de madera para extraerlo del tubo y
mezclar ambas muestras en un tubo de ensayo

Resultados esperados

Si el procedimiento fue llevado a cabo de manera apropiada tal y como se

describe en la práctica , observaras que el ADN (en forma de una sustancia blanca
filamentosa, de aspecto viscoso) se desprendió de la muestra y se eleva hasta la
superficie de la capa de alcohol, desde donde puede ser recuperada usando el palillo.
HIDRÓLISIS DEL ADN E IDENTIFICACIÓN DE SUS COMPONENTES

A.- IDENTIFICACIÓN DEL AZUCAR PENTOSA

1. Retire todo el sobrenadante obtenido, colocarlo en un tubo de ensayo y añadirle

3 ml. De H2SO4 13 N.

2. Hierva a la flama del mechero ( suavemente ), agitando , durante el tiempo

suficiente para que la solución hierva.

3. Retire con una pipeta aprox. 1.5 ml del hidrolizado (conserve el resto del
hidrolizado)

4. Transfiera el hidrolizado a un segundo tubo de ensayo

5. Añada 0.5 ml de reactivo de Bial y agite.

RESULTADOS ESPERADOS

La presencia de azúcar pentosa (desoxiribosa), que contiene el ADN, se manifiesta por

la aparición de un color verde azuloso, debido a la reacción del furfural (producido al
usar H2SO4 sobre el carbohidrato), mas el orcinol que contiene el reactivo de Bial.

B.- IDENTIFICACIÓN DE FOSFATO

1. Tome el tubo que aún contiene el resto del hidrolizado obtenido

2. Añada 0.5 ml. H2SO4 10 N y 1 ml. de molibdato de amonio al 2.5%

3. Añada 1 ml. de reactivo de fiske-subarow y dejar reposar 10 min.

RESULTADOS ESPERADOS

Se debe desarrollar un color azul, debido a la reacción del naftol-sulfonato sodio con el
fosfato presente en el ADN (el naftol-sulfonatol es el principal componente del reactivo
de Fiske-Subarow)