Práctica No. 4 – Aislamiento de bacteriófagos de fuentes naturales. Traducción: Q.B.P. Alexis Salvador Prieto Escamilla.

Journal de Virología, Octubre 1979, pp. 268-275 Vol. 32, No. 1

0022-538X/79/10-0268/08$02.00/0

Propiedades estructurales y biológicas de Mycoplasmavirus

MVL3: Una inusual interacción virus-procariote
KLAUS HABERER,1,2 GUNTHER KLOTZ,2 JACK MANILOFF,1 * AND ALBRECHT K. KLEINSCHMIDT2
Departamento de Microbiología, Universidad de Rochester, Centro Médico Rochester, New York 14642,1 y Departamento de Microbiología,
Universidad Ulm, D 7900 Ulm, Alemania2

Recibido para publicación 26 de Abril de 1979

La cinética de adsorción y crecimiento de Mycoplasmavirus MVL3 en células huésped de

Acholeplasma laidlawii 1305/68, han sido estudiadas con los experimentos de crecimiento en un solo
paso, lisis prematura, y de estallido simple. Se encontró que el virus mata a las células huésped
infectadas. La liberación del virus comienza 90 minutos después de la infección y continúa cerca de
10 a 15 horas. Por lo tanto, la producción del virus es diferente a los bacteriófagos líticos clásicos y
en cambio se asemeja a los virus citocidas no líticos de animales. Los detalles estructurales del virus
son descritos, y el peso molecular del DNA lineal viral se ha encontrado que es de 2.6𝑥10$ Da.

Tres diferentes tipos de Mycoplasmavirus MATERIALES Y MÉTODOS

infectando a Acholeplasma laidlawii fueron
originalmente aislados por Gourley (7, 8 y 10). Éstos y
los aislamientos posteriores forman tres grupos
(revisados por Maniloff et al,.15): (i) el grupo 1 de los
aislados, son viriones desnudos en forma de bala. Un
aislado, MVL51, se demostró que contiene una
molécula circular de DNA monocatenario de
1.5𝑥10& Daltons. (17) (ii) El grupo 2 de los virus son
partículas esféricas envueltas. El aislado MVL2,
contiene una cadena doble de DNA en una súper hélice
circular cerrada covalentemente de alrededor de
7.8x10& Da (13, 16) (iii) El único aislado del grupo 3
es MVL3. Este virus es una partícula poliédrica
desnuda (alrededor de 60 nm. de diámetro) con una
cola corta (alrededor de 25 nm. de largo) que contiene
una hebra doble de DNA.
Estudios de los ciclos infecciosos de los grupos 1 y
2 de los Mycoplasmavirus (revisado por Maniloff et al.,
15) han mostrado que ambos grupos son virus no
citocidas: las células infectadas continúan creciendo
mientras liberan la progenie de los virus. En un reporte
preliminar sobre el ciclo de infección del MVL3, Liss
(13) notó que las células infectadas mueren.
Aquí reportamos los estudios sobre el ciclo
infeccioso del MVL3 mostrando que, mientras las
células infectadas ya no son viables (es decir, ya no son
capaces de formar colonias) la progenie del virus
continua siendo liberada de éstas células durante varias
horas. Este tipo de ciclo infeccioso se asemeja a los
virus citocidas de animales no líticos en lugar de los
bacteriófagos líticos. También se presentan datos sobre
la estructura del virión y del DNA viral.
Medios y reguladores (solución amortiguadora).
Caldo triptosa (contenido por litro: 20 g. de triptosa
[Difco], 5 g. de Tris, 5 g. de NaCl, 10 g. de glucosa y
10 mL. de suero fracción PPLO [Difco], y las placas de
agar triptosa (contienen: agar al 1% [Difco] en caldo
triptosa) fueron utilizados para cultivar células según lo
descrito por Maniloff (14).
Solución reguladora Tris-EDTA-NaCl (TES) (Tris-
hidrocloruro 0.01 M, EDTA 0.001 M, NaCl 0.001 M
[pH 8.0]) fue usado para lavar a las células y para el
procedimiento de purificación del MVL3.
Células y virus. A. laidlawii 1305.K2 fue utilizada
como célula huésped en todos los experimentos. Este
clon fue aislado de la cepa A. laidlawii M1305/68, que
fue amablemente proporcionada por Gourlay (9). El
clon 1305.K2 (referido como K2) fue seleccionada por
su alta eficacia de siembra, con Mycoplasmavirus
MVL3 de un número al azar de clones M1305/68
aislados.
En todos los experimentos, un cultivo de toda una
noche de K2 (fase estacionaria) fue diluido 1:5 en un
medio fresco e incubado por 4 horas a 37°C antes de
que el virus fuera agregado.
El Mycoplasmavirus MVL3 fue cultivado a partir de
una muestra del aislado original de Gourley y Wyld
(10). Para preparar una solución madre de virus, 200
mL de un cultivo de toda una noche de K2 fueron
agregados a 800 mL de caldo triptosa, y después de dos
horas de incubación a 37°C, MVL3 fue agregado en
una multiplicidad de infección (MOI) de uno. El
cultivo fue incubado a 37°C por 24 horas.
Práctica No. 4 – Aislamiento de bacteriófagos de fuentes naturales.
La suspensión resultante fue precipitada por la adición
de polietilenglicol 6000 (Fisher Scientific Co.) a una
concentración final del 10%. Después de dejarlo
reposar toda la noche de 3 a 5°C, el precipitado fue
sedimentado por centrifugación a 5°C, a 15,000 x g por
30 minutos. Después resuspender el precipitado en
10% del volumen original de TES, los componentes
celulares restantes fueron solubilizados por tratamiento
con Triton X-100 0.1% a 37°C por 2 horas. El lisado
fágico fue dializado toda la noche con dos litros de
TES. La solución resultante fue ajustada a una
densidad de 1.48 g/𝑐𝑚 ) por adición de CsCl y
centrifugado para equilibrarlo a 40,000 rpm en un rotor
Beckman tipo 42.1.
El virus se observaba después de la centrifugación
como una banda cerca de la mitad del gradiente y fue
removido recolectando fracciones de la parte superior
del gradiente. La preparación del virus se almacenó a
4°C sin remover el CsCl y fue estable por lo menos un
año bajo estas condiciones. El rendimiento del virus
estaba en el intervalo de 10*) a 5𝑥10*, unidades
infecciosas por litro de cultivo.
Determinación del título viral y celular. El
número de células viables fueron determinadas
contando las unidades formadoras de colonias (UFC)
en agar triptosa. Para minimizar el posible error de
conteo debido a la tendencia de los mycoplasmas de
agregarse en un medio líquido, antes de sembrar en
placas la suspensión de células fue suavemente
sonicada, colocando el tubo el cultivo, en un baño de
sonificación (industrias de ultrasonidos). La dispersión
de los agregados multicelulares fue seguida por
microscopía de contraste de fases. Las colonias
generalmente eran visibles después de 4 días de
incubación en agar triptosa a 37°C, fueron contadas
después de teñirlas con colorante de Dienes diluido
(18).
Las partículas del virus MVL3 se evaluaron como
UFP (unidades formadoras de placa) en un agar blando
recubriendo placas de agar triptosa: 0.1 mL de
muestras de virus diluidas fueron mezclados con 0.1
mL de un cultivo celular de una noche y 1 mL de caldo
triptosa. La mezcla se calentó brevemente a 45°C y se
agregó 1 mL de agar al 0.7% en TES mantenido a
45°C. La suspensión resultante fue vertida en una placa
con agar triptosa. Las placas pudieron ser contadas por
este método después de 24 horas de incubación a 37°C.
Adsorción del virus. El virus (diluido 1:5) fue
añadido a las células con una MOI de uno. Las
muestras fueron tomadas cada 5 minutos, filtradas a
través de un filtro membranal de 0.2 μm (Sartorius)
para remover células y virus adsorbidos, y analizada
para UFP. Se calcularon las constantes de adsorción de
primer orden según lo descrito por Sten (19).
Traducción: Q.B.P. Alexis Salvador Prieto Escamilla.
Crecimiento en un sólo paso. Se utilizó el
protocolo de Delbrück (2). El virus (diluido 1:5) se
añadió a las células en un MOI de alrededor de 0.1,
después 30 minutos a 37°C, para permitir la adsorción
del virus, el cultivo infectado se diluyó 10& veces en
caldo triptosa fresco precalentado para reducir
infecciones posteriores. Las muestras fueron tomadas
en varios tiempos y sembradas para UFP.
Producción del virus en tiempos largos. Para estos
experimentos, las células fueron infectadas con una
MOI de 10, para asegurarse de que cada célula
estuviera infectada, y la producción del virus fue
seguida por 42 horas, las muestras fueron tomadas y
analizadas para UFP a intervalos de 30 minutos entre
una y cuatro horas, y después de eso, en intervalos de 2
horas. Un cultivo idéntico fue infectado comenzadas
12 horas después de iniciado el primer cultivo para así
permitir que la producción del virus fuera
continuamente monitoreado durante el día.
Inactivación de UFC. El título de las células fue
determinado antes, y, a los 15 minutos, 30 minutos, y 9
horas después de la infección (en un MOI de 10). Las
placas de agar fueron incubadas durante 3 semanas en
una cámara húmeda para asegurarse de que las colonias
de crecimiento lento no se perdieran.
Lisis artificial. Estos experimentos siguieron lo
primero descrito por Doemann (3). Las células fueron
infectadas con una MOI de 0.1 y, después de 30
minutos de adsorción a 37°C, fueron diluidas 100 veces
en caldo triptosa. Las muestras fueron tomadas por
duplicado en varios tiempos. Una fue sembrada
directamente para analizar a las células infectadas y al
virus libre. A la otra muestra se le añadió Triton X-100
a una concentración final de 0.1%. Este tratamiento lisa
las células pero no afecta la viabilidad del virus. La
muestra lisada fue diluida 10, a 10- veces para reducir
la concentración de Triton y sembrar para el análisis de
virus libre e intracelular.
Experimento modificado de estallido simple. El
tamaño de estallido medio se determinó por una
modificación del experimento de estallido simple
descrito por Ellis y Delbrück (4). Aunque el protocolo
original de estallido simple utiliza un MOI muy bajo, el
experimento con MVL3 tuvo que utilizar una MOI más
alta debido a los grandes tiempos de incubación
requeridos. Las células fueron infectadas con un MOI
de 1. Después de 30 minutos la suspensión de células
fue diluida 10. veces para un volumen final de 200
mL. Éste fue divido en 200 muestras de 1 mL: 100
muestras de 1 mL fueron analizadas para UFP después
de 8 horas de la infección y 100 fueron analizadas
después de 48 horas de infección.
Práctica No. 4 – Aislamiento de bacteriófagos de fuentes naturales.
Cinética de estallido simple. Para medir la cinética
de la producción del virus, solo por células infectadas;
20 unidades de filtrado Millex (Millipore Co: tamaño
del poro, 0.2 µm) fueron cada una inoculada con un
promedio de menos de una célula infectada. Para esto,
se preparó una solución de células diluidas como se
describe en el experimento de estallido simple y fue
filtrada a través de cada unidad Millex. Por lo tanto,
cada filtro recibió cero o una célula infectada. Una
jeringa de 20 mL con caldo triptosa fue montada en la
parte superior de la unidad de filtro, y una jeringa vacía
de 5 mL fue conectada en el fondo del filtro por una
pieza estéril de tubería Tygon. (Fig.1). Después de 4, 8
y 24 horas de incubación, 1 mL de caldo triptosa se
utilizó a través del filtro, usando la jeringa inferior para
generar una filtración con presión negativa y
analizarlas para UFP. En cada tiempo con 5 mL de
caldo triptosa, fue vertido a través del filtro para lavar
cualquier virus libre restante del filtro. Se encontró que
la mayoría de la progenie del virus fue removida del
filtro en el primer mL de muestra que se retiró en cada
tiempo. Después de 5 mL subsecuentes de lavado (que
contenía de 0 a 5 UFP/5mL) no se pudieron remover
más UFP. Por lo tanto, el virus removido de un filtro en
tiempos posteriores representa que recién se liberaba el
virus.
Microscopía electrónica. (i) Tinción negativa. El
virus purificado fue adsorbido en las redes del
microscopio de electrónico de carbono recubierto y
teñido negativamente con ácido fosfotúngstico (pH
7.0). Se obtuvieron micrografías electrónicas similares
con acetato de uranilo acuoso (80.5%). Las fotografías
fueron tomadas a 50,000x con iluminación de campo
brillante en un Siamens Emilskop 102 en 80kV con un
objetivo de 40 μm de apertura.
(ii) Medida del DNA. Para la medida del DNA, se
usó el procedimiento de Kleinschmidt (11). El virus
purificado fue disociado en una reserva conteniendo
10** UFP/mL, por adición de dodecil sulfato-fenol de
sodio al 1% (1:1) y agitando suavemente. Después de
la separación de fases, el dodecil sulfato-fenol de sodio
fue removido por diálisis contra TES. La solución
resultante del DNA fue diluida 1:10 en una solución
conteniendo acetato de amonio 0.5 M (concentración y
0.1 mg de Citocromo C por mL. Una cantidad de 50 μ
L de esta solución fue difundida en una hipofase de
acetato de amonio 0.25 M y recogida con rejillas
revestidas de carbono. Estas fueron teñidas con
5𝑥10/, de acetato de uranilo en etanol 50%. La
observación en el Siemens Emilskop 102 fue hecha sin
estar en campo oscuro o en campo brillante después de
rotar sombreadamente con Pt-Pd. El microscopio se
calibró con una rejilla replica.
Traducción: Q.B.P. Alexis Salvador Prieto Escamilla.
Se midieron las moléculas de negativos proyectados
con una computadora Wang 2200 equipada con un
digitalizador PenX (Zscherbel, Germany).
RESULTADOS
Estudios estructurales. Las partículas del virus
teñidas negativamente son poliédricas, cerca de 60 nm
de diámetro (Fig. 2). Los viriones tiene una cola corta,
cerca 20 nm de largo y 10 nm de diámetro, adjuntados
en un collar de alrededor 8 nm de espesor y 16 nm de
ancho. Frecuentemente las fibras son vistas,
generalmente aparecen estar fijadas en el collar. Aún
no ha sido posible determinar ya sea la longitud, o el
número de fibras por virión.
Las moléculas de DNA purificadas del MVL3 son
lineales. Las mediciones de la longitud del contorno de
93 moléculas (Fig.3) dio un peso molecular estimado
de (26 ± 0.6) 𝑥10& . No se observaron moléculas
circulares.
Adsorción del virus. La adsorción del virus MVL3
sigue una cinética de primer orden, el número de UFP
no adsorbidas durante la adsorción disminuye
exponencialmente (datos no mostrados). La tasa de
primer orden de la constante K fue calculada de estos
experimentos y se encontró que es de
3𝑥10/*1 𝑐𝑚 ) /min.
Crecimiento de un solo paso. El crecimiento del
MVL3 en células K2 fue estudiado por 5 horas después
de la infección (Fig. 4). Posterior a un periodo latente
de 90 minutos, el número de UFP comenzó a elevarse.
Ninguna meseta fue alcanzada durante el tiempo de
este experimento.
Puesto que la cinética de liberación del virus bajo
las condiciones de crecimiento de un solo paso son de
orden cero con respecto al virus libre, la gráfica
semilogarítmica (Fig. 4) suele utilizarse para trazar
datos ocultos lineales de la liberación del virus.
Una gráfica lineal de estos datos, aunque menos
conveniente para mostrar un amplio rango de valores
de UFP, muestra que la liberación del virus continua
como una función lineal del tiempo. (Fig. 4, inserto).
Crecimiento en tiempos largos del virus. Puesto
que el MVL3 mata a su célula huésped (experimentos
descritos a continuación) la producción del virus debe
parar eventualmente. Esto no fue observado durante los
experimentos de crecimiento en un solo paso de 5
horas (Fig. 4). Por lo tanto el protocolo de crecimiento
de un solo paso tuvo que ser modificado. Debido al alto
rendimiento del virus en las células infectadas, junto
con el continuo crecimiento de células no infectadas, si
el experimento se lleva a cabo en una MOI baja, se
espera que además, la infección ocurra durante
experimentos largos.
Práctica No. 4 – Aislamiento de bacteriófagos de fuentes naturales.
Para experimentos de crecimiento de virus en
tiempos largos, una MOI de 10, fue usada para
asegurarse de que no había una cantidad significativa
de células infectadas. Las mediciones del crecimiento
del virus durante tiempos largos (Fig. 5) indican que las
partículas del virus son liberadas de las células
infectadas en un periodo de 10 a 15 horas. Cerca de 10
a 15 horas después de la infección se alcanza una
meseta en título de virus que permanece sin cambios
por al menos otras 27 horas. Puesto que el título final
de virus es 120 veces más alto que el número de
centros infecciosos medidos después de la adsorción, el
rendimiento promedio del virus fue alrededor de 120.
Después de 42 horas de infección, el cultivo sigue
ligeramente turbio. En un microscopio de contraste de
fases, partículas del tamaño de células de A. laidlawii
aún podrían ser reconocidas junto con esferas
translucidas de diámetros arriba de 10 μm. Ningún
aumento adicional en la turbidez fue observado
después de varios días de incubación.
Lisis artificial. La posible existencia de partículas
infecciosas intracelulares del virus durante el periodo
latente fue examinada por lisis artificial de células
infectadas (Fig. 6). Considerando la liberación
fisiológica del virus como se muestra en los
experimentos de crecimiento de un solo paso, comienza
90 minutos después de la infección, las partículas
maduras pueden ser demostradas alrededor de los 70
minutos después de la infección por lisis artificial de
las células infectadas. Durante 3 horas de este
experimento, el título del virus intracelular fue siempre
más alto que el título del virus libre, indicando que la
maduración y la liberación del virus continúa en estas
células infectadas. El experimento no fue continuado
por más de tres horas, puesto que después de este
tiempo la reinfección podría afectar la cinética
observada.
Estallido simple. Las células infectadas en una
MOI baja, fueron diluidas en 200 tubos, tales que cada
tubo recibía un promedio de menos de una célula
infectada (Tabla 1). La mitad de los tubos fueron
analizados para UFP después de 8 horas y la otra mitad
fue analizada después de 24 horas. Los datos se
muestran en la Tabla 1 y en la Fig. 7. Los análisis de
estos datos (como los descritos por Ellis y Delbruck
[4]) muestran que cada tubo había recibido un
promedio de 0.63 células infectadas; por lo tanto,
estadísticamente en cada tiempo, 37 tubos recibían 1
célula, 9 recibían 2 células, y 1 recibía 3 células. De
estos datos, el promedio del rendimiento del virus por
célula infectada fue de 140 después de 8 horas de la
infección y 236 después de 24 horas. Esto es más alto
que lo estimado por el experimento de crecimiento a
tiempos largos (Fig. 5) donde la MOI alta podría haber
reducido el rendimiento del virus.
Traducción: Q.B.P. Alexis Salvador Prieto Escamilla.
Los datos de estallido simple indican que los virus
MVL3 son liberados de las células infectadas durante
un tiempo extendido por mecanismos de liberación no
líticos en lugar de una sola explosión.
Cinética de estallido simple. Para confirmar la
conclusión de que las células infectadas individuales
producen virus durante un periodo extendido, la
producción del virus en células infectadas individuales
fue analizada numerosas veces durante 24 horas.
Veinte filtros fueron inoculados cada uno con muestras
de 1 mL preparadas como se describe en el
experimento de estallido simple. El filtrado de cada
filtro fue analizado para UFP a 3, 8 Y 24 horas de
infección. Los datos obtenidos en un experimento
típico son mostrados en la Tabla 2. Puesto que en siete
de los filtros se encontró que no contenían células
infectadas (Tabla 2), estadísticamente por una
distribución de Poisson, siete filtros recibieron una
célula infectada, cuatro recibieron dos células
infectadas, uno recibió tres células infectadas, y uno
recibió cuatro células infectadas. Puede verse que la
aparición y la tasa de liberación del virus de células
individuales como en función del tiempo de infección
son altamente variables. Cada célula que comienza a
producir el virus durante el transcurso de un
experimento continúa haciéndolo a través del último
punto de los datos.
La viabilidad de células infectadas con MVL3.
Las células K2 y el virus se mezclaron en una MOI de
10 y se incubaron a 37°C. Se tomaron muestras justo
antes de la adición del virus, durante la infección y
analizadas para UFC. El número de UFCs disminuyó
rápidamente después de la adición del virus (Fig. 8): la
fracción superviviente fue de 10/) después de 30
minutos y de 10/- después de 9 horas. La producción
del virus fue medida a lo largo de la infección, y los
resultados fueron similares a la curva de crecimiento a
largo plazo mostrada en la Figura 4. Por lo tanto,
aunque una célula infectada no pueda formar una
colonia, la producción del virus continúa por varias
horas.
DISCUSIÓN
Las partículas del virus MVL3 tienen una cabeza
poliédrica de alrededor de 60 nm y una cola corta
(cerca de 20 nm de largo) con un collar, probablemente
fibras, y contiene una molécula de DNA lineal de
alrededor de 26𝑥10& Da. Observaciones morfológicas
similares han sido reportadas por Garwes et al. (6) and
R.M. Cole (personal communication). El MVL3 se
asemeja al grupo de bacteriófagos de cola corta para el
cual el colifago T7 es la especie. (Revisado por Fenner
5).
Práctica No. 4 – Aislamiento de bacteriófagos de fuentes naturales.
Las características de estos fagos es que son de
cápsides isométricas alrededor de 65 nm de diámetro
con colas cortas y DNA lineal de doble hebra de
alrededor de 25𝑥10& Daltones.
El MVL3 es el único Mycoplasmavirus que
contiene DNA lineal (en lugar de circular) y en tener
una estructura de cola (cf. Maniloff et al., 15). La
función de las colas en los bacteriófagos es la fijación
de las partículas del virus a los componentes de la
pared celular bacteriana y la penetración del ácido
nucleico viral a través de la pared. Sin embargo, el
MVL3 infecta a A. laidlawii, una célula que no tiene
pared y está limitada por una simple membrana de
lipoproteínas de 7 nm. (1). Por lo tanto, el papel de la
cola del MVL3 y las estructuras fibrilares, que
aparecen para ser fijadas al collar, en la fijación del
virus a los componentes de la membrana huésped y la
penetración del DNA viral en las células es de especial
interés.
En estos estudios, la constante tasa de adsorción del
MVL3 fue experimentalmente encontrada de 3𝑥10/*1
𝑐𝑚 ) /𝑚𝑖𝑛. Para comparar esto con el número de
colisiones virus-células, en una tasa constante de
primer orden fue calculado de las colisiones cinéticas
(descritos por Stent, 19). Este cálculo asume que cada
colisión virus-célula conduce a la adsorción y, por lo
tanto, el cómputo está basado en el número de
colisiones entre aproximadamente un virus esférico de
60 nm y 1 esfera (1 μm de diámetro) cuya área de
superficie es igual a una célula de Mycoplasma. La tasa
constante teórica es de 2𝑥10/7 𝑐𝑚 ) /𝑚𝑖𝑛, que se trata
de un orden de magnitud mayor que los resultados
experimentales. Esto indica que la adsorción requiere
un alto grado de especificidad en la interacción virus-
célula.
Diferente de otros Mycoplasmavirus que han sido
descritos (e.g., Maniloff et al., 15), el MVL3 mata a sus
células huésped. Pero en contraste con otros
bacteriófagos, el MVL3 no tiene un ciclo lítico clásico.
Tablas
Tabla 1. Datos del experimento de estallido simple.
Muestra Número de tubos Número
Sin 1 >1 total de
Total
UFP UFP UFPa UFP
8h 100 53 4 43 8,904
24 h 100 53 1 46 15,005
a
Valores mostrados en la Fig. 8
b
Calculado como lo describieron Ellis y Delbrück (4).
Traducción: Q.B.P. Alexis Salvador Prieto Escamilla.
En su lugar, las células infectadas con MVL3, aunque
ya no son viables (en el sentido de ser UFC) continúan
para liberar la progenie del MVL3 durante varias horas.
Una examinación individual de células infectadas en un
estudio de cinética de estallido simple, mostró que la
tasa de liberación del virus fluctuó durante el tiempo
que la célula estuvo produciendo el virus. Esto podría
ser explicado por un modelo en el cual una célula
infectada, en lugar de continuar liberando la progenie
del virus, libera a los virus en pulsos, en cada pulso
siendo la liberación de un número variado de virus.
Coherente con este modelo, nuestros estudios
preliminares de microscopia electrónica sugieren que
un fragmento de una célula infectada podría producir
vesículas de membranas rodeando partículas de los
virus separadas del resto de las células. Por lo tanto, la
interacción virus-célula infectada del MVL3 se asemeja
a esos virus citocidas no líticos de animal.
La liberación total de virus por célula infectada
(medida en experimentos de estallido simple) se
encontró que varía sobre un rango de 100 veces de
célula a célula. Además el rendimiento para este virus
es diferente entre las células, el experimento de
estallido simple mostró que el tiempo en que una célula
individual infectada comienza a liberar el virus varía de
célula en célula.
Al comienzo de estos estudios, utilizando lo que
sabemos, las condiciones de crecimiento celular han
sido ligeramente favorables, un periodo de latencia más
largo y una producción de virus más pequeña fueron
observados y dados en un reporte preliminar. (K.
Haberer, 1978 Fourth Int. Congr. Virol. Abstr., p. 173).
Problemas fisiológicos similares y células huésped de
diferentes cepas podrían explicar la pequeña
producción del virus MVL3 reportado por Lyss (12).
En el desarrollo el protocolo experimental usado en los
estudios reportados aquí, se encontró que, para obtener
curvas de crecimiento del virus, reproducibles y buenas
producciones del virus, se debe tener cuidado de
asegurar que las células huésped estén creciendo
activamente en el tiempo de infección.
No. promedio de Producción promedio
células infectadas de virus por célula
b b
por tubo infectada
0.63 140
0.63 236
Práctica No. 4 – Aislamiento de bacteriófagos de fuentes naturales. Traducción: Q.B.P. Alexis Salvador Prieto Escamilla.
Tabla 2. Datos de la cinética de estallido simple (de 20 filtros, 7 fueron sin virus).

No. de UFP liberadas de otros

Filtro filtros

3 horas 8 horas 24 horas

1 1 55 >1,000
2 1 24 416
3 0 43 768
4 10 19 96
5 0 90 7
6 3 18 66
7 13 22 18
8 6 16 348
9 33 86 >1,000
10 24 105 503
11 43 116 223
12 0 32 640
13 19 47 39
Figuras

Figura 1. Ensamble filtro-jeringa usado para medir la cinética de estallido simple. Se filtró una cantidad de alrededor
de 1 mL de una suspensión celular altamente diluida a través de una unidad de filtro Millex. Después se montó la
jeringa de 20 mL en la parte superior de la unidad de filtro y sirvió como un reservorio para el caldo de triptosa. Se
conectó una jeringa de 5 ml al fondo por medio de una pieza estéril de tubo Tygon y se usó para generar presión
negativa para extraer caldo de triptosa a través del filtro, removiendo así el virus y lavar las células.
Práctica No. 4 – Aislamiento de bacteriófagos de fuentes naturales. Traducción: Q.B.P. Alexis Salvador Prieto Escamilla.

Figura 2. Viriones MVL3 teñidos negativamente con ácido fosfotúngstico al 2%. Las fotografías se tomaron a una
magnificación de 50,000x. Los viriones tienen una cabeza poliédrica y una cola corta, conectada a la cabeza por medio
de un cuello. Las fibras que parecen originarse en el cuello son visibles en los viriones de la fila superior. Aumento de
250,000x.
Número de moléculas

Longitud (μm)

Figura 3. Histograma de las mediciones de DNA del MVL3. El histograma muestra la distribución de la longitud del
contorno de 93 moléculas. A partir de estas mediciones, se calculó un peso molecular de (26 + 0.6) x 106.
Práctica No. 4 – Aislamiento de bacteriófagos de fuentes naturales. Traducción: Q.B.P. Alexis Salvador Prieto Escamilla.

UFP/mL

9
UFP/mL x 10 Horas

Horas

Figura 4. Crecimiento en un paso del MVL3. En el tiempo cero, las células y los virus se mezclaron a una MOI de
alrededor de 0.1 y se incubaron a 37°C. El cultivo se diluyó después de 30 minutos. Se tomaron las muestras a varios
tiempos y se analizaron para UFP. La gráfica semilogarítmica claramente muestra el comienzo de la liberación del
virus después de un periodo latente de 90 minutos. La liberación de los virus continúa como una función lineal del
tiempo a través de todo este experimento, como se puede ver desde la gráfica lineal de los datos (inserto).
UFP/mL

Horas

Figura 5. Crecimiento a largo plazo del MVL3. Las células se infectaron a una MOI de 10, y se analizaron como se
describe para el experimento de crecimiento en un paso. El título final del virus es alrededor de 120 veces el número de
unidades infecciosas medidas después de 1 hora de infección.
 Práctica No. 4 – Aislamiento de bacteriófagos de fuentes naturales. Traducción: Q.B.P. Alexis Salvador Prieto Escamilla.

UFP/mL

Horas

Figura 6. Lisis artificial del MVL3. Las células se infectaron a una MOI de 0.1, y después de 30 minutos el cultivo se
diluyó en un orden de 100. Se tomaron muestras duplicadas en diferentes tiempos. Una se sembró directamente para
analizarla con las células infectadas y los virus libres (O). La otra se lisó por medio de la adición de Tritón X-100. El
Tritón se removió por una dilución y la muestra se sembró para analizarla con los virus intracelulares y libres (•).

UFP/tubo

Figura 7. Distribución de los datos de los experimentos de estallido simple. Como se describe en el texto, 100 tubos se
analizaron después de 8 horas y otros 100 se analizaron después de 24 horas de incubación. El experimento se resume
en la Tabla 1, y el número de UFP en cada tubo que contenía >1 UFP se muestra aquí. Cada barra vertical representa
un tubo; una barra de doble altura representa dos tubos con el mismo número de UFP. Las puntas de flecha muestran la
producción de virus por célula infectada en cada tiempo (calculado como se describe en la Tabla 1).
Práctica No. 4 – Aislamiento de bacteriófagos de fuentes naturales. Traducción: Q.B.P. Alexis Salvador Prieto Escamilla.

UFC/mL

Horas

Figura 8. Viabilidad de las células infectadas con MVL3. Al tiempo cero un cultivo se rompió. Una parte fue
desinfectada (O) y la otra se infectó a una MOI de 10 (•). Las unidades formadoras de colonias (UFC) de ambas partes
se midieron después de varios tiempos de incubación a 37°C.