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Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación
UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

FACULTAD DE INGENIERÍA QUÍMICA
ica
ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA QUÍMICA
m
uí
Q
“EFECTO DEL SOPORTE DE INMOVILIZACIÓN EN LOS PARÁMETROS
ría
CINÉTICOS DE LA REDUCCIÓN DE ACETOFENONA EMPLEANDO
ie
Gongronella butleri COMO BIOCATALIZADOR”
g en
TESIS
In
PARA OPTAR EL TÍTULO DE

de
INGENIERO QUÍMICO
ca
AUTORES:
te
Br. ELIZABETH DEL JEHOVA CALLE MORALES

lio
Br. ERICKA ELIZABETH SEGURA CASANOVA

ASESOR:
b
Dr. MEDARDO ALBERTO QUEZADA ALVAREZ

Bi
TRUJILLO - PERÚ
2015
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú.
Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/
ÍNDICE
ica
I. INTRODUCCION Pág.
m
1.1. Problemática 2
uí
1.2. La Química y el Desarrollo Sostenible 4
1.3. Química Sostenible 5
Q
1.4. Química Sostenible y Biotecnología Blanca 7
ría
1.5 Biotransformaciones 9
1.6. Ventajas de las Biotransformaciones 10
ie
1.7. Reducción de Aldehídos y Cetonas usando Células Enteras 11
en
1.7.1. ADH Deshidrogenasas 12
g
1.7.2 Regeneración de la Coenzima 13

In
1.8. Gongronella butleri 16

de
1.9. Inmovilización de Células 17
1.9.1. Tipos de Inmovilizaciones 21

ca
1.10. Objetivos 25
te
1.10.1. Objetivo General 26

lio
1.10.2. Objetivos Específicos 26

b
Bi
II. MATERIALES Y MÉTODO Pág.
2.1 Materiales y Equipos 27
ica
2.2 Métodos. 29
2.2.1. Estado de la colección 29
m
2.2.1.1. Medio de cultivo 30
uí
2.2.1.2. Preparación del medio sólido de cultivo 30
Q
3.2.1.3. Esterilización del medio de cultivo 31
3.2.1.4 .Reacción test catalizada por Gongronella butleri en
ría
condiciones de no crecimiento (resting cells). 31
2.2.2. Cualificación de los equipos de Instrumentación Analítica 32
ie
2.2.2.1. Cualificación de la balanza analítica 32
en
2.2.2.2. Cualificación del Espectrofotómetro UV 32
g
2.2.2.3. Cualificación del HPLC 33

In
2.2.3. Validación y Cualificación del Método de Análisis 38
2.2.3.1 Determinación de la Longitud de Onda Óptima 39

de
2.2.3.2. Obtención de las Curvas de Calibración para Acetofenona
y 1-Feniletanol. 40
ca
2.2.3.3 Obtención de las Concentraciones de Acetofenona

te
y 1-Feniletanol durante la Reacción de Reducción 41

lio
2.2.4. Metodología Experimental para el Proceso de Biotransformación con

b
Gongronella butleri. 43
Bi
2.2.4.1. Asentamiento de la Colección. 43
2.2.4.2. Crecimiento del Ascomiceto Gongronella butleri 44
2.2.4.3. Replicación del Ascomiceto Gongronella butleri 46
2.2.4.4. Curva de Crecimiento del Ascomiceto Gongronella butleri 47
ica
2.2.4.5. Preparación del Medio de Reacción 48
2.2.4.6. Inmovilización del Ascomiceto Gongronella butleri 51
m
2.2.5. Estudio Cinético de Bioreducción 53
uí
2.2.5.1. Velocidad Inicial de Reacción Observada (Vo) 54
Q
2.2.5.2. Orden de reacción (n) 57
ría
2.2.5.3. Otras variables de cinética de reacción 58
III. RESULTADOS Y DISCUSIONES

ie Pág.
en
3.1. Cualificación de los Instrumentos Analíticos 60
g
3.1.1. Cualificación de Balanza Analítica 60

In
3.1.2. Cualificación de Espectrofotómetro Ultravioleta- Visible 62

de
3.1.3 Cualificación del Cromatógrafo de Líquidos de

Alta Performancia 64
ca
3.1.3.1 Cualificación de la Bomba Cuaternaria 64

3.1.3.2. Cualificación de Sistema de Inyección 68
te
3.1.3.3. Cualificación del detector UV-Visible 72

3.1.3.4 Cualificación de la Columna 74
lio
b
Bi
3.2 Validación del Método de Análisis. 76

3.2.1. Longitud de Onda Óptima de Análisis. 76
3.2.2. Validación de Método de Análisis Cromatográfico 77
ica
3.2.3. Curvas de Calibración para Acetofenona y 1-Feniletanol 78
m
3.3. Proceso de Biorreducción con Gongronella butleri 80
uí
3.3.1. Curva de Crecimiento 80
3.3.2. Estudio Cinético 82
Q
3.3.3. Parámetros Cinéticos 96
3.3.4. Productividad de la Biotransformación 98
ría
IV. CONCLUSIONES 100
ie
g en
In
de
ca
te
lio
b
Bi
RESUMEN
ica
m
En el presente trabajo se investigó la capacidad reductora del ascomiceto
Gongronella butleri en condiciones sostenibles con la finalidad de obtener un
uí
método alternativo de sustitución de los catalizadores tradicionales basados en
Q
metales y boranos, los cuales generan bajas productividades y contaminación
debido a los subproductos. La actividad reductasa del ascomiceto se evaluó con
ría
la reacción test de reducción de acetofenona. Se empleó una cepa de
Gongronella butleri en cultivo discontinuo con células libres e inmovilizadas en
ie
Espuma de Poliuretano y Agar Pterocladia 2,5% p/v para poder evaluar el efecto
de estos soportes de inmovilización en los parámetros cinéticos de la reducción
en
de acetofenona y comparar los resultados obtenidos en cada uno de los
soportes con el uso del ascomiceto en su forma libre. El crecimiento del
g
ascomiceto se llevó a cabo en medio de cultivo PDA (Papa dextrosa agar) y la

In
reacción tuvo lugar en la fase estacionaria de crecimiento del ascomiceto. Los

ensayos se realizaron empleando un equipo de cromatografía líquida de alta
de
eficiencia (HPLC). Los mejores resultados se obtuvieron cuando se utilizó

células inmovilizadas en Espuma de Poliuretano como soporte de inmovilización
llegándose a obtener mayor productividad, mejor rendimiento y conversión en
ca
menos tiempo; la cinética de reacción fue de pseudo primer orden. En base a los
resultados obtenidos podemos concluir que emplear espuma de poliuretano
te
como soporte de inmovilización es la mejor alternativa para lograr nuestra

lio
reacción de reducción en condiciones sostenibles, pues sucede a temperatura

ambiente y en medios acuosos.
b
Bi
I. INTRODUCCIÓN
ica
m
uí
Q
ría
ie
en
I. INTRODUCCIÓN
g
In
de
ca
te
lio
b
Bi
I. INTRODUCCIÓN
I. INTRODUCCIÓN
ica
1.1 Problemática
m
En la última década ha sido creciente el interés en el campo científico e
uí
industrial, por los procesos de biotransformación de sustratos orgánicos,
debido a la posibilidad de obtener sustancias con valor agregado, como
Q
precursores sintéticos y moléculas bioactivas a partir de sustratos
económicos, abundantes y disponibles comercialmente (1-4). La
ría
importancia del empleo de los sistemas biológicos en la síntesis orgánica
radica en las ventajas de esta tecnología comparada con los métodos
químicos clásicos. Las
ie
reacciones catalizadas por enzimas son
en
frecuentemente más quimio-, regio- y estereoselectivas (5); por esta razón,
el uso de los sistemas biológicos en la química ha llegado a ser una
alternativa económica para la preparación de compuestos ópticamente
g
activos. La principal aplicación de las biotransformaciones en síntesis

In
orgánica está en la preparación de compuestos enantiopuros, pero también

es posible aprovechar las condiciones suaves (temperatura ambiente y
de
presión atmosférica) en las cuales se llevan a cabo estos procesos

biotecnológicos, para efectuar transformaciones de grupos funcionales
ca
quirales, evitando condiciones de reacción extremas, que pueden conducir

a la formación de productos secundarios (1).
te
Esta tecnología utiliza condiciones de reacción amigables con el ambiente,

ya que las biotransformaciones se realizan principalmente en medios
lio
acuosos y los subproductos son biodegradables o reutilizables. Los

aspectos mencionados anteriormente contribuyen a la generación de una
b
química verde, de bajo impacto ambiental (6). Los microorganismos,

Bi
plantas y organismos superiores poseen la capacidad de realizar

modificaciones estructurales sobre los sustratos orgánicos e inorgánicos de
I. INTRODUCCIÓN
origen sintético o natural. La Biotecnología Blanca es un campo emergente
ica
dentro de la moderna Biotecnología, que está implicado en procesos
industriales de producción. Su desarrollo viene determinado por el
cumplimiento de las nuevas normativas de la Unión Europea sobre control
m
del medio ambiente y producción de bienes y servicios en condiciones
uí
sostenibles. La Biotecnología Blanca se suele definir como la producción
de productos de alto valor añadido o de servicios, en condiciones
Q
sostenibles tanto desde el punto de vista del empleo de disolventes y de
reactivos así como en la obtención de productos no contaminantes y/o no
ría
agresivos con el medio ambiente, utilizando biocatalizadores no
patógenos.(7,8,9)
ie
en
Los biocatalizadores (enzimas o células, libres o inmovilizadas) son ahora
instrumentos indispensables para químicos y biotecnólogos, y están siendo
cada vez más empleados en la síntesis asimétrica de productos
g
farmacéuticos, agroquímicos, vitaminas y fragancias. (10,11)

In
La reducción de cetonas empleando biocatalizadores para obtener

alcoholes constituye una alternativa eficiente y atractiva, que opera a
de
condiciones de pH y temperaturas mucho más suaves. La ventaja de las

reacciones biocatalíticas sobre las reacciones químicas tradicionales
ca
consiste en que aquellas son estereoselectivas y pueden realizarse a

presión atmosférica y temperatura ambiente. Dado que muchos procesos
te
biocatalíticos se pueden llevar a cabo en medio acuoso u orgánico/ acuoso

empleando disolventes poco tóxicos, justifica que la biocatálisis sea una de
lio
las líneas fundamentales en el desarrollo de la Química Sostenible.

Además, de las enzimas y células microbianas se pueden inmovilizar y
b
reutilizar lo cual rebaja los costes de producción. (12)

Bi
I. INTRODUCCIÓN
Debido a la enorme importancia de este tipo de compuestos en la síntesis
ica
de moléculas bioactivas , la reducción estereoselectivas de cetonas ha
adquirido un enorme interés industrial , y a este efecto se han descrito
numerosas rutas catalíticas ; así, la hidrogenación asimétrica de cetonas
m
catalizadas por metales (13) o el empleo de boranos(14,15) constituyen
uí
procesos que han sido descritos de manera eficiente a escala industrial ;
no obstante se suelen precisar condiciones poco compatibles con la
Q
Química Sostenible (Green Chemistry & Engineering) (16, 20), tales como
temperaturas elevadas, el empleo de disolventes y/o reactivos tóxicos y
ría
obtener productos concomitantes.
ie
En este sentido, la presente tesis para obtener el título de Ingeniero
en
Químico, pretende contribuir en la determinación de los parámetros
cinéticos de la reducción de Acetofenona empleando Gongronella butleri
como biocatalizador midiendo la influencia del soporte de inmovilización.
g
In
1.2. La Química y el Desarrollo Sostenible

de
Básicamente el término desarrollo sostenible tiene dos implicaciones:

ca
- El uso de recursos naturales a ritmos suficientemente bajos como para

que no se agote el suministro de largo plazo. (7)
te
- La generación y disipación de los recursos y emisiones a velocidades

suficientemente bajas, de forma que puedan ser asimiladas por el
lio
medio natural. (7,16)

El desarrollo sostenible envuelve tres ámbitos fundamentales de acción:
b
el bienestar humano, el bienestar ecológico y sus interrelaciones. Se

Bi
trata de un enfoque sistémico o integrador del desempeño económico y

medioambiental, en el que el crecimiento económico debe ser suficiente
I. INTRODUCCIÓN
para resolver el problema de la pobreza y, al mismo tiempo, ser
ica
sustentable para evitar una crisis medioambiental. Igualmente, se toma
en consideración la equidad entre generaciones, esto es, una toma de
conciencia por parte de la generación actual, de que sus acciones
m
pueden poner en riesgo la calidad de vida de las generaciones futuras.
uí
(18)
Q
Con esta perspectiva, el reto para el químico es desarrollar nuevos
productos y nuevos procesos de acuerdo con los beneficios del
ría
desarrollo sostenible. Ello requiere una nueva aproximación consistente
en la reducción de la intensidad material y energética utilizada durante
ie
las reacciones químicas, minimizando o eliminando la liberación de
en
sustancias químicas nocivas para la salud y el medio ambiente, y
maximizando el uso de recursos renovables y la durabilidad de los
productos obtenidos. (16,20)
g
In
1.3 Química Sostenible

de
La Química Sostenible o Química Verde, nueva filosofía en el ejercicio de

la Química, concentra sus esfuerzos en minimizar o eliminar la
ca
contaminación derivada de las actividades industriales, mediante la

elaboración de productos químicos que no atenten contra la salud o el
te
medioambiente. Los objetivos que persiguen son:

lio
 Minimizar la generación de subproductos en las trasformaciones

químicas (economía atómica), mediante el desarrollo y rediseño
b
de reacciones químicas. En este sentido, las reacciones libres

Bi
de solventes, surgen como alternativas viables para rediseñar

procesos químicos sustentables.
I. INTRODUCCIÓN
 Reducir el uso de solventes, especialmente los que entran en la
ica
clasificación de tóxicos o persistentes en el medioambiente.
Aquí se enfocan los esfuerzos en optimizar los procesos de
extracción, utilizados comúnmente en los procesos químicos
m
industriales.
uí
 Diseñar procesos químicos basados en el uso de materias
primas renovables (derivadas de plantas), en lugar de aquellos
Q
procesos basados en materias primas derivadas del petróleo.
 Mejorar los procesos químicos con tecnologías que contribuyan
ría
a la disminución de las emisiones que contaminan el aire, el
suelo y las aguas.

ie
Adelantar el desarrollo de protocolos y métodos con el fin de
en
monitorear la contaminación en tiempo real. (16)
g
El desarrollo de la Química Sostenible se basa en una serie de principios

In
que se enumeran a continuación: (20)
1. Es mejor prevenir la formación de residuos que tratarlos o

de
eliminarlos tras su formación.

2. Los métodos sintéticos deben ser diseñados para conseguir la
ca
máxima incorporación en el producto final de todas las materias

usadas en el proceso.
te
3. En tanto sea posible, se deben diseñar metodologías sintéticas

para el uso y la generación de substancias de escasa toxicidad
lio
humana y ambiental.
4. Se deben diseñar productos químicos que, preservando la eficacia
b
de su función presenten una toxicidad escasa.

Bi
I. INTRODUCCIÓN
5. Las sustancias auxiliares (disolventes, agentes de separación, etc.)
ica
deben resultar innecesarias en lo posible o cuanto menos deben ser
inocuas.
6. Las necesidades energéticas deben ser consideradas en relación a
m
sus impactos ambientales y económicos, y deben ser minimizadas.
uí
Los métodos de síntesis deben llevarse a cabo en condiciones de
temperatura ambiente y presión atmosférica.
Q
7. Las materias de partida deben ser renovables y no extinguibles, en
la medida en que esto sea posible técnica y económicamente.
ría
8. Evitar derivaciones innecesarias (bloqueo de grupos,
protección/desprotección, etc.)
ie
9. Los reactivos catalíticos deben ser tan selectivos como sea posible.
en
10. Los productos químicos han de ser diseñados de manera que al final
de su función no persistan en el medio ambiente, sino que se
fragmenten en productos inocuos para el medio ambiente.
g
11. Se deben desarrollar las metodologías analíticas que permitan el

In
seguimiento en tiempo real del proceso y el control previo de la

posible formación de substancias peligrosas.
de
12. Las sustancias y las formas de su uso en un proceso químico deben

ser elegidas de manera que resulte mínima la posibilidad de
ca
accidentes químicos incluyendo emisiones, explosiones e incendios.
1.4 Química Sostenible y Biotecnología Blanca

te
La Biotecnología Blanca es la que se aplica a la industria y sus procesos.

lio
Engloba muchos sectores industriales (químico, alimentación, energía,

medioambiente, etc.) y tiene como objetivo sustituir tecnologías
b
contaminantes por otras limpias. Utiliza organismos vivos, biocatalizadores

Bi
y enzimas para obtener productos más fáciles de degradar, que requieran

menos energía y generen menos residuos. Las ventajas de utilizarlos son
I. INTRODUCCIÓN
que mejoran la eficiencia de los procesos químicos. Así, mientras que los
ica
procesos químicos convencionales requieren alta presión y temperatura,
los microorganismos y sus enzimas trabajan a presión y temperaturas
normales, son biodegradables y pueden trabajar en condiciones
m
extremas. (21)
uí
Los procesos industriales basados en procesos biotecnológicos suelen ser
altamente sostenibles. Así lo reconoce la OCDE en sus publicaciones
Q
como la ya clásica “Biothecnology for clean industrial products & products:
towards industrial sustainability” de 1998, donde hace notar que la
ría
biotecnología es una herramienta poderosa para alcanzar el desarrollo
industrial sostenible. Ello se debe a que muchos de sus desarrollos están
basados en: (21)
ie
en
- El uso directo de materias primas obtenidas de fuentes sostenibles.
- La obtención de productos como los polímeros biodegradables, de un
g
alto valor añadido a partir de aceites vegetales, fibras, hidratos de

In
carbono, etc.
- La conversión de la biomasa en productos intermedios de síntesis tales
de
como la glucosa, etanol, etc.

- La potencial producción por semisíntesis de productos agroindustriales
ca
o farmacéuticos.
te
Existe una estrecha relación entre las Biotransformaciones y la Química

Sostenible debido en concreto a los siguientes puntos fundamentales
lio
del trabajo en Biotecnología: (16-21)

b
Bi
- Minimización de residuos y control de eluyentes.

- Simplificación de los procesos de purificación del producto final.
I. INTRODUCCIÓN
- Obtención de buenos rendimientos.
ica
- Reducción al mínimo de la formación de los productos concomitantes.
- Trabajar con disolventes no contaminantes.
- Evitar o reducir al mínimo el riesgo de producción de fuegos,
m
explosiones o emisiones contaminantes.
uí
1.5 Biotransformaciones
Q
Las biotransformaciones son reacciones químicas catalizadas por células
ría
o enzimas aisladas en las que se aprovechan las cualidades propias de los
biocatalizadores, principalmente su regio- y estereoespecificidad y su
ie
capacidad para llevar a cabo reacciones en condiciones no extremas de
en
pH y temperaturas. Las biotransformaciones pueden ser usadas para lograr
conversiones específicas de sustratos complejos usando células vegetales,
animales o microbianas o enzimas purificadas. (22)
g
In
Además, la biocatálisis al emplear células enteras como biocatalizadores

en las aplicaciones comerciales se ha limitado en gran medida a casos
de
especiales en que el microorganismo contiene la enzima necesaria para

reacciones de una sola etapa o donde la célula es un productor natural de
ca
una sustancia química como el etanol o un producto complejo natural,

como la tetraciclina. (22)
te
Esta utilidad reducida se ha asociado con la falta de herramientas

lio
experimentales generales y eficaces para desarrollo de cepas microbianas

para aplicaciones industriales. Sin embargo, los enormes avances en
b
ingeniería metabólica, la genómica, la metabólica, la proteínica, la

Bi
evolución dirigida, etc., en los últimos años han abierto la puerta a la

creación apropiada de microorganismos con fines industriales.(22). Estos
I. INTRODUCCIÓN
avances están a favor de la introducción de procesos con células enteras
ica
llamándose entonces biotecnología blanca. Hoy en día, algunos procesos
industriales están utilizando células enteras como biocatalizadores, por
ejemplo: nicotinamida a partir de 3-cianopirdina utilizando Rhodococcus
m
rhodochrous, acrilamida a partir del acrilonitrilo utilizando R. rhodochrous,
uí
entre otros. (23)
Q
Los procesos de biotransformación pueden ser diseñados en bioreactores
específicos para cada requerimiento, algunos procesos se llevan a cabo
ría
mediante enzimas solubles o inmovilizadas en un soporte, lo cual permite
realizar procesos en continuo, en ocasiones también se utilizan células
ie
procariotas o eucariotas, ya sea en crecimiento o en reposo, en suspensión
en
o inmovilizadas. Los procesos de biotransformación pueden ser muy útiles
para reciclar sustancias de desecho de las industrias y originar productos
de mayor valor añadido. (23)
g
In
1.6. Ventajas de las Biotransformaciones
Entre las principales ventajas que presentan las Biotransformaciones

de
(Biotecnología) con respecto a los procesos químicos tradicionales

podemos mencionar: (6-22)
ca
te
a) Reduce el número de pasos de síntesis dada la gran selectividad de los

biocatalizadores.
lio
b) Evita la producción de subproductos. Esto es importante en la síntesis

de productos quirales dada la gran estereoselectividad de los
b
biocatalizadores.
Bi
10
I. INTRODUCCIÓN
c) Necesitan condiciones suaves de proceso pues los catalizadores
ica
trabajan a temperatura ambiente, presión atmosférica, en medio acuoso
o en disolventes poco contaminantes.
d) Utiliza catalizadores muy activos y lo más selectivo posible, siendo los
m
biocatalizadores poco contaminantes.
uí
e) Desarrolla metodologías analíticas que permiten el seguimiento en
tiempo real del proceso y el control previo de la posible formación de
Q
substancias peligrosas.
ría
1.7. Reducción de Aldehídos y Cetonas usando Células Enteras
En vez del aislamiento, el cual requiere de una sofisticada regeneración de
ie
la coenzima, se emplean mayormente células microbianas. Ellas
en
contienen múltiples deshidrogenasas, las cuales están aptas de aceptar
sustratos no naturales, además tienen todas las coenzimas necesarias y
las rutas metabólicas para su regeneración. Por lo tanto la regeneración o
g
reciclado de la coenzima puede ser omitida ya que se realiza

In
automáticamente gracias al metabolismo de la célula viva.

de
Además, fuentes económicamente cómodas del carbono tales como

sacarosa o glucosa pueden ser usados como sustratos auxiliares para
reacciones asimétricas de reducción. Por otro lado, todas las enzimas y
ca
coenzimas están bien protegidas dentro de su entorno celular natural. (23)

te
Sin embargo, estas ventajas tienen que ser tomadas en cuenta junto con
algunos inconvenientes importantes:
lio
 La productividad de las conversiones microbianas son generalmente

b
bajas, ya que la mayoría de los sustratos no naturales son tóxicos

Bi
para los organismos vivos, y por lo tanto solo son toleradas a bajas
concentraciones (0,1-0,3% por volumen a prox.)
11
I. INTRODUCCIÓN
 La gran cantidad de biomasa presente en el medio de reacción
ica
causa bajos rendimientos y la recuperación del producto se torna
problemático, sobre todo cuando el producto es almacenado dentro
de las células y no se elimina al medio de reacción. Debido a que
m
solo una menor fracción (normalmente 0,5-2,0%) del sustrato auxiliar
uí
se utiliza para la regeneración de la coenzima, la mayor parte se
metaboliza, formando subproductos polares, que a menudo impiden
Q
la purificación del producto. Por lo tanto, el control de la reacción se
hace más dificultoso.
ría
 Finalmente, es más probable que diferentes cepas de un
microorganismo cuenten con diferentes especificidades, por lo que
ie
es importante usar exactamente el mismo cultivo para obtener
en
resultados comparables con la literatura. (23)
1.7.1. ADH Deshidrogenasas

g
Las alcohol deshidrogenasas son un grupo de enzimas deshidrogenasas

In
que facilitan la interconversión entre alcoholes y aldehídos o cetonas con

la reducción de dinucleótido de nicotinamida y adenina. Son un grupo de
de
siete enzimas que están frecuentemente presentes en muchos

organismos y facilitan la interconversión entre alcoholes y aldehídos o
ca
cetonas con la reducción de NAD⁺ a NADH. (24)
La reacción catalizada es:

te
lio
Alcohol + NAD⁺ Aldehído o Cetona + NADH

b
Como cofactores en la reacción es posible la utilización de zinc o hierro

Bi
dependiendo del tipo de alcohol deshidrogenasa. Son enzimas muy

interesantes y de gran proyección industrial catalizan las reacciones red-
ox ya que son enzimas intracelulares. Estas enzimas tienen gran número
12
I. INTRODUCCIÓN
de aplicaciones en el campo de las Biotransformaciones. El proceso
ica
permite la creación de alcoholes homoquirales de gran interés como
intermedios de síntesis. Al ser enzimas intracelulares, dependen de una
coenzima como NAD(P)H, PPQ, etc. que se consume en cantidades
m
equimoleculares respecto al sustrato a reducir. Esto implica que la
uí
regeneración de la coenzima hace al proceso económicamente inviable
con enzimas libres sin la regeneración del cofactor (el precio aproximado
Q
de un mol de NADH es de 3 000$ USA y el de un mol de NADPH
25 000$ USA). (30)
ría
En la biotransformación, alcohol deshidrogenasas se utilizan a menudo
ie
para la síntesis de los estereoisómeros enantioméricamente puros de
alcoholes quirales. A menudo, se pueden lograr alta quimio y
en
enantioselectividad. Un ejemplo es la alcohol deshidrogenasa de
Lactobacillus brevis, que se describe como un biocatalizador versátil. (30)
g
1.7.2 Regeneración de la Coenzima

In
La principal función de las coenzimas es actuar como intermediarios

de
metabólicos. El metabolismo conlleva una amplia gama de reacciones

químicas, pero la mayoría corresponden a unos tipos básicos de
reacciones que implican la transferencia de grupos funcionales. Esta
ca
química común permite a las células utilizar un pequeño conjunto de

intermediarios metabólicos para transportar grupos químicos entre las
te
diferentes reacciones. Estos intermediarios en la transferencia de grupos

lio
son las coenzimas. (25)
Cada clase de reacción de transferencia de grupo se lleva a cabo por una

b
coenzima particular, que es el sustrato de un conjunto de enzimas que la

Bi
producen, y un conjunto de enzimas que la consumen. Un ejemplo de esto

son las deshidrogenasas, que utilizan la nicotinamida adenina dinucleótido
13
I. INTRODUCCIÓN
(NADH) como cofactor. Aquí, cientos de enzimas diferentes eliminan los
ica
electrones de sus sustratos y reducen el NAD⁺ a NADH. Esta coenzima
reducida es entonces un sustrato para cualquiera de las reductasas
presentes en la célula que necesitan reducir sus sustratos. (25)
m
Estos cofactores se consumen de manera equimolecular con el sustrato,
uí
por lo que, debido a su elevado precio, requieren el diseño de sistemas
Q
que permitan su reciclado. Debido a este hecho, se suelen utilizar en
forma de células enteras, puesto que de esta forma el propio
ría
metabolismo celular se encarga de la regeneración de los cofactores; el
proceso resulta, por tanto, mucho más ventajoso desde el punto de vista
ie
económico, no sólo por este hecho, sino también porque se reducen los
costes implicados en el aislamiento y purificación de la enzima. (26)
en
Es por ello por lo que se utilizan células enteras como
biocatalizadores ya que éstas poseen sistemas para la
g
regeneración de la coenzima. El único problema existente es

In
que dentro de las células suele haber más de una enzima que
cataliza el proceso, obteniéndose en algunos casos bajos
de
e.e. (27)
ca
te
lio
b
Bi
14
I. INTRODUCCIÓN
ica
m
uí
Q
ría
ie
en
Figura 1.1. Sistema de Reciclado del Cofactor
g
In
de
ca
te
lio
b
Bi
15
I. INTRODUCCIÓN
ica
1.8. Gongronella butleri
Gongronella butleri es un ascomiceto aislado en Indonesia descrito como
m
productor de numerosas sustancias entre las que cabe destacar el
uí
quitosano y cuatro antibióticos derivados del ácido pentanodioico. (27)
Q
Es un microorganismo mesófilo teniendo en cuenta sus necesidades de
crecimiento óptimo. Este ascomiceto pertenece a un grupo taxonómico
ría
que presentan mayor actividad reductasa mientras que las bacterias y
levaduras son poco activos frente a la reacción test propuesta. Posee
colonia blanca de micelio denso, algodonoso, margen de crecimiento de
color crema. (27) ie
en
Gongronella butleri se ha usado en reducción estereoselectiva de cetonas
por ejemplo en la reacción de reducción de ciclohexanona transformada
g
con alta conversión para obtener ciclohexanol dado que presenta una
In
buena actividad enzimática obteniéndose buenos resultados lo cual indica

la alta afinidad de este ascomiceto por este sustrato. (30)
de
Para la reducción estereoselectiva de compuestos carbonílicos se

seleccionó una cepa de Gongronella butleri, por ser la más interesante de
ca
acuerdo a su productividad, su tolerancia a altas concentraciones de

cetonas y la ausencia de productos secundarios en la reducción de
te
cetonas. (28)
lio
b
Bi
16
I. INTRODUCCIÓN
1.9. Inmovilización de Células
ica
Los biocatalizadores inmovilizados son enzimas o células (o combinación
de ellos) confinados o localizados en cierta región definida del espacio,
m
con retención de su actividad catalítica y, si es necesario, de su viabilidad,
y que pueden ser usados de modo repetido y continuo. (29)
uí
Para que la célula este confinada en una región definida es necesario
Q
formar una fase sólida dispersa, macroscópica, de alta densidad y
catalíticamente activa, dentro de, o en contacto con, un medio reactivo
ría
líquido libre de biocatalizador. Se dice que el biocatalizador está
compartimentalizado. Las características de la fase sólida son tales que el
ie
transporte de reactivos hacia y desde el biocatalizador está gobernado por
en
difusión exclusivamente. Por la resistencia al transporte difusional se
establecen en la partícula gradientes de concentración o de pH, con lo que
el ambiente que rodea a la partícula de biocatalizador inmovilizado difiere
g
grandemente del seno de la fase líquida (29)

In
Las células libres en suspensión presentan un rápido decaimiento en su

de
actividad catalítica; sin embargo, las células inmovilizadas presentan una

estabilidad mayor, y por lo tanto la inmovilización es un requisito
necesario para poder reutilizar las células. (29)
ca
Una característica general de cualquier sistema con catalizadores

te
inmovilizados es que el transporte de sustratos y productos se produce por

mecanismos difusionales. Como se mencionó anteriormente la
lio
inmovilización permite la utilización continua del biocatalizador, dado que

este queda fácilmente retenido en el interior del reactor, mientras se
b
mantiene un flujo continuo de entrada y salida de líquido. Esto hace que

Bi
en caso de células los reactores continuos puedan operar con caudales

superiores a los correspondientes al límite del lavado que se observa
17
I. INTRODUCCIÓN
cuando se opera con células libres. En el caso de reacciones en
ica
discontinuo la inmovilización favorece la re-utilización del biocatalizador.
Otro aspecto importante es que con la inmovilización se puede aumentar
sensiblemente la concentración del biocatalizador, con respecto a un
m
proceso en el que el mismo se encuentre en suspensión. De los dos
uí
puntos anteriores se deduce que en sistemas operando en continuo, los
biocatalizadores inmovilizados permiten aumentar sensiblemente las
Q
productividades de los correspondientes bioreactores, dado que permiten
operar a mayor concentración de catalizador (por tanto, mayor
ría
concentración de sustrato), y con caudales más altos. (27)
Cuando se emplean
ie
enzimas inmovilizadas es frecuente observar un
aumento de su estabilidad y de su resistencia a la desnaturalización y
en
proteólisis cuando se encuentran inmovilizadas. En el caso de células, se
suelen reducir los efectos de contaminación accidental del cultivo, dado
g
que la población de células contaminantes que se encuentran en

In
suspensión, y en concentración mucho menor que la población de células

inmovilizadas, puede ser eliminada mucho más fácilmente del reactor. (27)
de
Los procesos biocatalizados por células enteras se pueden realizar en

diversas condiciones:
ca
 Condiciones de fermentación en medio sólido o líquido

 Con las células inmovilizadas
te
 Con las células en condiciones de no-crecimiento, denominada

lio
antiguamente resting cells conditions.

 Con las células liofilizadas
b
La metodología de células inmovilizadas es la más usada a la hora de

Bi
realizar un proceso industrial escalable pues la inmovilización permite la

separación del catalizador del medio de reacción de un modo fácil y
18
I. INTRODUCCIÓN
rápido. Los biocatalizadores deben poder obtenerse con un rendimiento
ica
razonable de inmovilización (carga de catalizador (células/g.catal)),
conducir a rendimientos y/o productividades razonables y presentar bajas
limitaciones a la transferencia de masa a nivel intraparticular (difusión) y
m
una elevada estabilidad operacional. Desde el punto de vista económico,
uí
la ventaja principal del proceso de inmovilización es el número de
reutilizaciones que se pueden hacer de las células, ya que permitirá su
Q
comercialización como catalizador. La reutilización industrial de las células
solo se lleva a cabo cuando el biocatalizador puede separarse del seno de
ría
reacción de una manera fácil y sencilla, además de mantener la actividad.
(33) En el caso de las células se necesita además que el catalizador
ie
pueda lavarse intraparticularmente a fin de minimizar los efectos de
en
toxicidad intracelular de los reactivos y/o productos. Estos aspectos
determinan la vida media de los catalizadores y dependen tanto del
método de inmovilización como de la matriz en que se lleva a cabo la
g
misma. (34)
In
Las propiedades de un biocatalizador inmovilizado se encuentran

de
definidas por las propiedades de las células y las características del

soporte. La interacción especifica entre el soporte de inmovilización y el
biocatalizador, dan lugar a un derivado inmovilizado con distintas
ca
propiedades químicas, bioquímicas, mecánicas y cinéticas. Por ello

existen diversos tipos de inmovilización de células y el método concreto a
te
elegir depende del tipo de células que queramos inmovilizar y del tipo de
lio
reacción que se vaya a llevar a cabo. (34)
Los métodos de inmovilización de biocatalizadores se pueden dividir en

b
cinco grandes grupos, en función del mecanismo es que se basan.

Bi
19
I. INTRODUCCIÓN
a. Adsorción sobre una superficie porosa.- La inmovilización se produce
ica
por interacción de tipo iónico o fuerzas de atracción débiles, sobre la
superficie del soporte.
b. Unión covalente a superficies.- La inmovilización también se realiza
m
sobre la superficie del soporte, pero la interacción entre el catalizador
uí
y el soporte es mediante enlace covalente.
c. Reticulado entre células y polímeros (CLEA).- En este grupo no
Q
existe soporte propiamente dicho. Las partículas del biocatalizador
inmovilizado se logran unir mediante interacción directa, bien por
ría
enlace covalente o bien en el caso de algunas células, mediante
procesos de floculación.
d.
ie
Atrapamiento en una matriz.- Es la formación de una estructura
en
tridimensional, en presencia del biocatalizador, que queda atrapado
de forma uniforme en su interior.
e. Sistemas con membranas (micro encapsulación, membranas
g
preformadas).- En los dos casos el biocatalizador se inmoviliza en el

In
interior de un espacio limitado por una membrana. En el primer caso

las microcápsulas se producen en presencia del biocatalizador, que
de
queda incorporado en su interior. En el segundo caso, el

biocatalizador se introduce en el interior de un sistema con
ca
membranas previamente formadas.
De todas ellas, la más utilizada es el atrapamiento en una matriz

te
macroscópica. Para que se obtengan buenas conversiones es necesario

lio
que el sustrato y los productos sean capaces de difundir a través de la

matriz macroscópica sin una gran resistencia a la transferencia de masa a
b
nivel intraparticular. Dependiendo del tipo de reactor, el soporte puede

Bi
usarse en distintas formas: esferas, láminas, fibras o cilindros

seleccionando la que resulte más conveniente para disminuir la difusión
interparticular o en la capa límite. (34)
20
I. INTRODUCCIÓN
El método de atrapamiento óptimo es aquel en el que se causa el menor
ica
trauma posible a la célula. Esto implica que en el proceso no haya un
choque térmico fuerte o cambios en la presión osmótica, en el pH, en la
fuerza iónica, etc. Las matrices más comunes empleadas son: Hidrogeles
m
(alignato, carragenano, quitosano, etc.), Termogeles (agar, agarosa,
uí
celulosa, gelatina) y Polímeros (poliacrilamida, poliuretano, alcohol). (34)
Q
1.9.1. Tipos de Inmovilizaciones:
Para obtener biocatalizadores inmovilizados que retengan actividad y sean
ría
estables es necesario aplicar un método de inmovilización adecuado, que
dependerá del tipo de actividad catalítica de interés. Existen diversos
ie
métodos para inmovilizar células, los cuales pueden ser: (29)
en
 Inmovilización por Atrapamiento empleando Termogeles
g
Esta técnica de inmovilización consiste en la formación de un gel en

In
presencia de la enzima. Las condiciones deben ser idóneas para producir

un gel con poros más pequeños que la enzima, de manera que ésta quede
de
atrapada dentro de la matriz del gel; además estos poros deben ser
suficientemente grandes para permitir la difusión y transformación del
ca
sustrato, y finalmente la liberación del producto. El atrapamiento puede ser

en geles o en fibras, que suelen ser más resistentes que los geles. En el
te
primer caso, la enzima queda atrapada en el interior de un gel, mientras

que en el segundo caso la enzima se encuentra incluida dentro de las
lio
microcavidades de una fibra sintética. El atrapamiento, de gran sencillez

desde el punto de vista experimental, requiere poca cantidad de enzima
b
para obtener derivados activos. Como ventaja adicional, la enzima no

Bi
sufre ninguna alteración en su estructura. De todas formas, el

atrapamiento requiere un control riguroso de las condiciones de
21
I. INTRODUCCIÓN
polimerización, así como la comprobación de que la naturaleza química
ica
del proceso no altera los grupos reactivos de la proteína. (32)
El agar y la agarosa son hidrocoloides que gelifican al disminuir la
m
temperatura, por lo que se conocen como Termogeles. El agar se obtiene
uí
de algas marinas de los géneros Gelidium, Gelidiella, Pterocladia,
Gracilaria y Gracilopsis, y está compuesto de agarosa (agarobiosa) y
Q
agaropectina. La primera tiene un peso molecular mayor de 100 kDa y es
la responsable de la gelificación del agar. La agaropectina por el contrario
ría
tiene un 5-8 % de sulfatos y un peso molecular ˂20 kDa. (35)
ie
El agar posee las siguientes propiedades: Es insoluble en agua fría, pero
se hincha mucho al absorber agua hasta veinte veces su peso. Se
en
disuelve con facilidad en agua hirviendo y al enfriarse se convierte en un
gel firme -el agar es el agente gelificante natural más fuerte, basta un
g
0,5% de agar en agua para la formación del gel-. Una solución de agar al
In
1,5% es clara; cuando ésta se calienta a una temperatura entre 32 - 42°C

se forma un gel resistente, que una vez formado no se funde, a menos
de
que se someta a una temperatura mayor de 85°C. Las soluciones de agar

tienen una viscosidad relativamente baja y una transición de sol a gel bien
definida que se realiza entre los 32 - 42°C, esta transición es reversible a
ca
una temperatura de 85°C. (32)

te
Según el origen del agar, este gelifica a distinta temperatura. Ello se debe
lio
a la presencia de grupos metoxilo en el C6 de la L-galactosa de forma que

cuanto mayor es el número de grupos metoxilo menor es la temperatura
b
de gelificación, al producirse esta por la formación de enlaces hidrogeno

Bi
entre cadenas. Así el agar de Gelidiella, que es el menos metoxilado,

gelifica a 42-45 ºC mientras en el extremo opuesto está el de Pterocladia
que lo hace entre 33-35 ºC. (27)
22
I. INTRODUCCIÓN
ica
 Inmovilización por adsorción en Espuma de Poliuretano
m
En la adsorción, la enzima se une a un soporte sin funcionalizar mediante
interacciones iónicas, fuerzas de Van der Waals y por puentes de
uí
hidrógeno. Consiste en poner en contacto una solución acuosa de
Q
enzimas o una suspensión de microorganismo con un adsorbente activo, y
después de un tiempo, una vez efectuada la adsorción, se lava el
ría
complejo formado para eliminar cualquier cantidad de biocatalizador que
no se haya inmovilizado. (31)
ie
Los principales factores que influyen en la adsorción, son:
en
1. el pH del medio: controla el número y la naturaleza de las cargas que
g
presenta la superficie de la proteína y del sólido;

In
2. la fuerza iónica: al aumentar la fuerza iónica se produce la desorción de

la enzima, ya que los iones inorgánicos se unen con más fuerza al soporte
de
que la proteína;
3. el diámetro de poro: debe ser aproximadamente dos veces el tamaño
del eje mayor de la enzima;
ca
4. la presencia de iones que actúen como cofactores de la enzima, ya que

pueden incrementar la carga enzimática del derivado. (31)
te
lio
En el caso particular de microorganismo pueden desarrollarse polímeros

extracelulares que favorecen la adsorción. De manera general se puede
b
decir que la adsorción es un método de inmovilización muy suave, y que

Bi
por tanto no suele afectar la actividad de las enzimas ni la viabilidad de

las células. El problema más importante que presenta es su reversibilidad,
23
I. INTRODUCCIÓN
dado que a menudo cambios en el pH, fuerza iónica o temperatura pueden
ica
afectar la desorción del soporte. La adsorción de enzimas y células se ha
estudiado sobre una gran variedad de soportes de distinta naturaleza
(tanto de carácter orgánico como inorgánico) y estructura física, y en
m
muchos casos con pre-tratamiento para favorecer la inmovilización. (36)
uí
La Espuma de Poliuretano ha sido utilizada para inmovilizar diversas
Q
células por ejemplo: bacterias como el Acetobacter aceti, Pseudomonas,
microalgas como Prototheca zopfil empleada en degradar hidrocarburos.
ría
La unión de los microorganismos al poliuretano no se hace por una
interacción puramente química como serían los enlaces de Van der Waals
ie
sino por el desarrollo de unas sustancias poliméricas extracelulares (EPS)
que crean un verdadero entramado responsable de que la biomasa siga a
en
la espuma. La generación de los EPS y muy probablemente la
composición química de los mismos depende de la materia orgánica que
g
se suministra como fuente de carbono y nitrógeno en el medio de cultivo.

In
(37)
de
ca
te
lio
b
Bi
24
I. INTRODUCCIÓN
ica
1.10. OBJETIVOS
m
1.10.1. Objetivo General
uí
Desarrollar un método de inmovilización de células que permita
mejorar los parámetros cinéticos de la reacción de reducción de la
Q
Acetofenona en condiciones sostenibles.
ría
1.10.2. Objetivos Específicos
ie
 Aislar y caracterizar un microorganismo con actividad reductasa.
en
 Realizar la curva de crecimiento de Gongronella butleri, para
g
encontrar el tiempo en el cual se encuentra en mejores condiciones

In
para realizar la reacción de reducción de la acetofenona.

de
 Inmovilizar Gongronella butleri en diferentes soportes: (Agar

Pterocladia 2,5% y Espuma de Poliuretano).
ca
 Desarrollar cinéticas de reacción para evaluar la influencia en los

te
parámetros cinéticos de la reacción.

lio
 Desarrollar métodos validados de análisis instrumental (HPLC, UV-

b
VIS) para monitorear la reacción de reducció

Bi
25
II. OBJETIVOS
ica
m
uí
Q
ría
ie
g en
In
de
ca
te
lio
b
Bi
25
II. MATERIALES Y MÉTODO
ica
m
uí
Q
ría
II. MATERIALES Y MÉTODO ie
g en
In
de
ca
te
lio
b
Bi
26
ica
2.1. Materiales y Equipos:
m
Materiales de vidrio.
uí
 Matraces Erlenmeyer de 100mL y 250mL. Marcas: Pírex, Kyntel y
LBY Boro 3.3
Q
 Fiolas de 25mL. 50 mL, 100 mL y 250mL. Marcas: Kyntel y
Fortuna.
ría
 Vasos de Precipitación graduados de 50mL, 100mL, 250 mL, 400
mL y 1L. Marcas: Pírex, Kyntel y Duran.
ie
 Viales encapsulados para cromatografía líquida de 2mL. Marca:
en
Agilent. Color: Ámbar.
 Pipetas de 10mL y 25 mL. Marcas: Pírex y Qualicolor.
 Frascos para medio de cultivo de 250mL, 500 mL y 1000mL.
g
In
Marca: Boeco.
 Tubos de ensayo de 13*100mm- Marca: PYREX
 Varillas de agitación
de
 Lunas de reloj.
 Embudos de vidrio de vástago corto 70mm de diámetro.
ca
Materiales de Plástico
te
 Tubos tipo Falcon de 15mL. Marca: Fisher Brand

lio
 Placas Petri estériles. Marca: Miniplast-ein-shener

 Probetas graduadas de 25mL, 50mL, 100mL, 250mL y 500mL.
b
 Espátulas
Bi
 Puntas para micropipeta azules amarillas

 Racks para viales
27
 Crio tubos
ica
 Porta puntas de micropipeta
 Sacabocados
m
 Gradillas para tubos
uí
Material Auxiliar.
Q
 Guantes de látex
ría
 Gafas de seguridad
 Porta objetos
 Asas de siembra metálicas
 Cinta parafilm ie
en
 Filtros para viales de PTFE 0,2µm
 Cinta para esterilización con vapor
g
 Tapones para matraces. Papel aluminio. Algodón

In
 Jeringas desechables de 1mL. Marca: Qualimaxx

 Mascarillas
de
 Bolsas para eliminación de puntas de pipeta contaminadas

 Bolsas para eliminación de residuos
ca
Instrumental de Laboratorio
te
 Balanza Analítica. Marca: Sartorius AG Germany CPA 224S

lio
 HPLC Agilent 1100 series

 Incubadora de agitación orbital JSAC 40, de temperatura y RPM
b
controlados.
Bi
 Incubadora tipo estufa (JSGI-150T)

 Autoclave JSR. Marca JSAC-40
28
 Espectrofotómetro UV-VIS. Marca: HEWLETT 8452A PACKARD
ica
DIODE ARRAY
 Cromatógrafo Líquido de Alta Resolución. MARCA: Agilent 1100
m
 Agitador de Tubos (Vortex)
 Estufa. Marca: SP
uí
 Juego de micropipetas de volumen variable:
Q
 Lab Mate+(100-1000µL)
 Pipet 4u (20-200 µL)
ría
 DragonMed(20-200 µL)
 Microlit(20-200 µL)
 Pipeta pump de 10mL.
 Centrífuga. MARCA: EBA 20 ie
en
 Columna Cromatográfica mediterránea C-18 de fase reversa
 Refrigeradoras. Marcas: INRESA Y DAEVOO
g
 pH-metro portable. MARCA: Ph-009 (II) ATC

In
 Termómetro de -10°C hasta 400°C

 Mechero Bunsen
de
2.2 Métodos.
ca
2.2.1. Estado de la colección

te
La cepa microbiana utilizada en esta tesis se encontró almacenada a 5°C

lio
en solución glicerol-agua al 30%v/v. Para ello se colocó en cada criotubo

1ml de solución glicerol-agua al 30%v/v y cubitos de medio sólido que
b
contienen microorganismo que ha crecido previamente en placas petri.

Bi
Se utilizó glicerol por ser no tóxico para las células y por contar a nivel
molecular con espacios intersticiales amplios, generando una mejor
29
residencia del ascomiceto, evitándose problemas de presionamiento
ica
entre ellos.
m
2.2.1.1 Medios de cultivo
uí
La elección del medio de cultivo con sales minerales y un balance de
Q
fuentes de carbono y nitrógeno adecuado, proporciona la posibilidad al
microorganismo de poner en marcha toda su maquinaria enzimática
ría
responsable del éxito de nuestra biotransformación. El medio de cultivo
fue recomendado por el Director del Servicio de Biotransformaciones
ie
Industriales del Parque Científico de Madrid, el cual tuvo la siguiente
composición:
en
a) Medio de Cultivo PDA para ascomicetos:
g
In
 Papa blanca…………………………….. 22 g/L

 Agar ………………………………………30g/L
de
 Dextrosa………………………………….20g/L
 Agua destilada ………………………….1L
ca
2.2.1.2 Preparación del medio sólido de cultivo

te
Pusimos a hervir rodajas de papa, previamente pesada en agua destilada

lio
durante 20 min, luego trasvasamos el líquido a un matraz y agregamos

los gramos de dextrosa propuestos. Para la preparación del medio sólido,
b
se añadió, a la composición descrita anteriormente, Agar tipo Americano

Bi
30g/L.
30
2.2.1.3. Esterilización del medio de cultivo
ica
El medio de cultivo empleado debe esterilizarse a 121°C y 1 atm de
m
presión por 20 minutos.
uí
2.2.1.4 Reacción Test catalizada por células en condiciones de no
Q
crecimiento (Resting Cells).
ría
Para evaluar la actividad reductasa del ascomiceto se seleccionó como
reacción test, la reducción de la Acetofenona a 1-Feniletanol; por ser una
reacción sencilla, que
ie
nos permite evaluar de una manera rápida y
precisa la actividad de la cepa y que puede ser analizada por
en
cromatografía líquida con detector UV, dada la absorbancia de los
electrones pi deslocalizados de los anillos bencénicos frente radiación
g
ultravioleta.
In
La concentración inicial de sustrato fue de 10mM, que es lo

de
suficientemente baja como para permitir el crecimiento del ascomiceto y

lo suficientemente alta para permitir el grado de biotransformación del
sustrato suficiente para su análisis cromatográfico.
ca
Para llevar a cabo esta reacción se dejó crecer al ascomiceto en

Erlenmeyer de 100mL con 20mL de medio de cultivo estéril, durante 7
te
días a 30°C y 200rpm. Luego se adicionó el sustrato hasta una

lio
concentración de 10mM. Después de 72 horas de reacción a las mismas

condiciones de agitación y temperatura se tomó una muestra de 3mL, se
b
centrifugó a 400rpm por 15 min, se separó la biomasa del medio líquido,

Bi
se filtró, y se analizó por cromatografía líquida, para determinar la

conversión del sustrato.
31
2.2.2. Cualificación de los equipos de Instrumentación Analítica
ica
En la siguiente tesis, se realizó la cualificación de equipos y se validó el
método de análisis, con la finalidad de tener mejor confiabilidad en
m
precisión y exactitud de los datos obtenidos.
uí
2.2.2.1 Cualificación de la Balanza Analítica
Q
Las mediciones de pesos para la siguiente investigación oscilan entre 0 a
ría
100g., es por ello, que se cualificó la balanza en este rango:
- Rango de Cualificación: 0 a 100g.

ie
en
Todas las mediciones se realizaron con agua destilada, y se tomaron los
siguientes puntos intermedios:
g
In
- Rango de Cualificación: 0 a 100g.: 0g., 25g., 50g., 75., 100g.,

con 4 repeticiones por cada medición realizada.
de
Con la recta obtenida de peso real vs peso teórico, observamos la

variación de las pendientes al repetir cada cierto tiempo el mismo método
ca
de cualificación, y así llevar un control de la exactitud y precisión de la

balanza analítica.
te
lio
2.2.2.2. Cualificación del Espectrofotómetro UV

b
Se preparó una solución madre de 0,528mM de Benzoato de Sodio.

Bi
Luego, se midió las absorbancias de diferentes concentraciones de

benzoato de sodio, esto se realizó directamente en la celda de cuarzo del
espectrofotómetro UV-visible a 254 nm. Estas diluciones se realizaron
32
agregando de manera cuantificada proporciones de Agua MiliQ (Agua
ica
Ultra pura), y se obtuvo un espectro entre las concentraciones de 0mM
(Muestra Blanco) hasta 0,528mM. Luego se evaluó su linealidad en base
m
a la repetitividad de los resultados obtenidos.
uí
2.2.2.3 Cualificación del HPLC
Q
Antes de realizar cualquier análisis en el HPLC, primero se cualificó las
ría
partes del HPLC, con el objetivo de asegurar la confiabilidad de cualquier
análisis al utilizar dicho equipo.
a) Cualificación de la Bomba del HPLC. ie

en
Se comparó el flujo real con el flujo teórico para cada uno de los 4
g
canales del equipo cromatográfico. Se pasó Agua MiliQ a través de cada

In
canal y se realizó la cualificación a los siguientes caudales nominales de:

0,5; 10, 1,5 y 2,0 mL/min hasta 4,0 mL/min.
de
Primero, se desconectó el conducto de desecho que se encuentra a la

salida del detector y se colocó un vaso para evitar caídas del eluyente
ca
sobre el detector. Luego, se enumeró y se pesó 5 tubos eppendorf para

el flujo de 0,50 mL/min, y otra cantidad similar para los flujos de 1,0; 1,5 y
te
2,0 mL/min hasta 4,0 mL/min. Se activó el funcionamiento de la bomba

lio
del equipo. Se estableció el flujo de 0,50 mL/min para el canal “A” y se

dejó pasar agua como fase móvil durante el tiempo suficiente para que la
b
presión se estabilice y que por todo el sistema circule el solvente emitido

Bi
por la bomba a través del canal “A”.
33
De manera sincronizada se controló 2 minutos y se recogió el volumen
ica
de eluyente que sale en ese tiempo. Además, se repitió esta operación 5
veces (al mismo caudal), de tal manera que se obtuvieron las 5 alícuotas
m
del caudal. Se repitió los pasos anteriores empleando los flujos de 1,0;
1,50; y 2,0 mL/min hasta 4,0 mL/min.
uí
Q
Posteriormente, se pesó los tubos eppendorf que contienen la fase móvil
recogida (agua). Se determinó volumen experimental recogido (usando la
ría
densidad del eluyente a la temperatura del laboratorio) de las 5 lecturas
para cada uno de los flujos utilizados, luego se determinó el valor
ie
promedio del volumen experimental recogido para cada caudal utilizado.
De esta manera se repitió todos los pasos para el canal “B”, “C” y “D”.
en
b) Cualificación del Sistema de Inyección
g
Para tener mayor seguridad en los resultados tanto en reproducibilidad y

In
precisión, la cualificación del sistema de inyección se dividió en dos

partes: Precisión del inyector y Magnitud del efecto memoria (efecto
de
“carry over”)
- Precisión del Inyector

ca
Se realizó tal estudio con la columna Teknokroma Mediterránea C18-

te
5µm*15*0,46, con una fase móvil: Metanol/agua(45/55 v/v), con un flujo

lio
de 1mL/min, a una longitud de onda de 254nm, con una temperatura de

horno de la columna de 30°C, para un volumen de inyección programado
b
de 10µL.
Bi
Primero, se puso en funcionamiento el equipo. Luego, se seleccionó un

flujo de 1,00mL/min y se dejó pasar fase móvil durante el tiempo suficiente
34
para que la presión se estabilice y para que circule el solvente por todo el
ica
sistema de bombeo. Posteriormente, se inyectó 10 µl de la disolución
estándar de naftaleno (0,100 mg/mL en acetonitrilo). Por último, se repitió
m
esta última operación 5 veces con esas condiciones cromatográficas y se
anotó el tiempo de retención y el área para cada una de las inyecciones
uí
de la disoluciones estándar.
Q
- Magnitud del efecto memoria (efecto “carry over”)
ría
Este efecto de carry over es ocasionado por arrastre o retención del
ie
analito analizado anteriormente. Por lo cual un mal lavado del sistema de
inyección después de un análisis, puede ocasionar falsos resultados en
en
los posteriores análisis cromatográficos.
g
Primero se programó a un flujo de 1mL/min la inyección de 10µl,

In
Posteriormente, se inyectó la disolución estándar (acetofenona) y luego

se inyectó una muestra blanco compuesto de la misma fase móvil. Se
de
observó en el cromatograma de este último si aparece señal en el tiempo

de retención de la disolución estándar.
Luego, se realizó la misma evaluación pero esta vez antes de cada
ca
inyección de la muestra blanco, se realizó un lavado programado del

sistema de inyección. Por último, se verificó si sigue presentándose señal
te
y se comparó el sistema de lavado.

lio
c) Cualificación del Detector UV-Visible

b
Bi
Se llevó a cabo la evaluación de la linealidad de detección a una longitud

de onda determinada en un rango de absorbancia. Esta evaluación se
realizó a 254nm, mediante una secuencia de tres inyecciones de cinco
35
disoluciones estándar de acetofenona (0,050; 0,150; 0,250 y 0,500 mg/mL
ica
respectivamente en metanol/agua)
m
d) Cualificación de la Columna Cromatográfica
uí
La columna cromatográfica puede presentar problemas de sangrado en
Q
su fase estacionaria, por ello se necesita cualificar el equipo. Esta
evaluación se llevó a cabo con una secuencia de 3 inyecciones de una
ría
disolución estándar que contuvo benceno (1µL/mL), tolueno (1µL/mL) y
naftaleno (1µL/mL) en acetonitrilo. Estos compuestos son similares pero
ie
tienen distinto coeficiente de extensión molar a la longitud de onda de
254nm.
en
Se seleccionó un flujo de 0.700 mL/min y se dejó pasar la fase móvil
durante el tiempo suficiente para que la presión se estabilice. Se inyectó
g
20µL de la disolución estándar. Luego se repitió esta última operación 3

In
veces con esas condiciones cromatográficas. Por último se anotó y

calculó el tiempo de retención, el área de pico, factor de capacidad (k’),
de
número de platos teóricos por metro de columna (N/m), altura de pico

teórico reducido (h) y factor de asimetría (As) del último pico (naftaleno)
para cada una de las inyecciones.
ca
te
lio
b
Bi
36
- Número de platos teóricos (N)
ica
m
uí
Q
ría
ie
Fuente: Marvin C. McMaster.2006. HPLC A Practical User´s Guide.
Figura 2.1. Picos Cromatográficos
en
N=tR2/σt2 ó N= 16tR2/Wb2 [2-1]
g
In
- Factor de capacidad (k’)

de
k’=(tR-t0)/t0 [2-2]
Dónde:
tR = tiempo de retención de la muestra
ca
t0 = tiempo muerto de la columna

te
- Altura Equivalente de Plato Teórico

lio
h = m/N [2-3]
b
Donde m es la longitud de la columna y N el número de platos

Bi
teóricos.
37
- Factor de Asimetría (As) (“tailing factor”)
ica
As = a/b [2-4]
m
Se miden los valores de a y b como se indica en la figura. Si la
uí
columna funciona bien este valor debe ser 1 o muy próximo al
Q
mismo.
ría
ie
g en
In
Fuente: Practical High-Performance Liquid Chromatography

Figura 2-2. Pico Cromatográfico
de
2.2.3. Validación y Cualificación del Método de Análisis.

ca
Se necesitó desarrollar una metodología particular de análisis para

te
determinar la relación de las concentraciones de Acetofenona y

1-Fenileltanol en el medio de reacción durante todo el proceso de
lio
biorreducción. Se emplearon los equipos cualificados previamente para la

validación de un buen método de análisis en el laboratorio de
b
investigación de esta tesis de pregrado.

Bi
2.2.3.1 Determinación de la Longitud de Onda Óptima
38
ica
Se sabe que los analitos Acetofenona y 1-Feniletanol absorben radiación
UV, debido a la presencia de sus electrones pi deslocalizados en el anillo
m
aromático de cada uno de estos. Además, se contó con un detector
ultravioleta en el HPLC. Es por ello, que primero, debido a esta
uí
absorbancia de cada uno de los analitos, se determinó la longitud de onda
Q
óptima en el espectrofotómetro UV, a la cual se realizaron posteriormente
los análisis.
ría
Para determinar la longitud de onda óptima de análisis de la Acetofenona
ie
y el 1-Feniletanol, se encontró el Punto Isosbéstico entre los dos
espectros de absorbancia de cada uno de ellos.
en
En todo el rango del espectro ultravioleta, el Punto Isosbéstico fue la
g
longitud de onda, en donde la Acetofenona y el 1-Feniletanol tuvieron la

In
misma absorbancia, a la mínima concentración posible para cada uno de

ellos.
de
Para encontrar el Punto Isosbéstico, se construyó los dos espectros de

absorbancia en un rango de longitudes de onda, a partir de dos
ca
soluciones de 0,1mM de Acetofenona y otra de 0,1mM 1-Feniletanol.

La búsqueda de la longitud de onda óptima para el análisis de la reacción,
te
se realizó con el propósito de obtener resultados de las concentraciones

lio
de los analitos de manera exacta y precisa, obteniendo un método de

análisis que reporte límites de detección y cuantificación que aporten con
b
mayor exactitud y confianza en los análisis.

Bi
39
2.2.3.2. Obtención de las Curvas de Calibración para Acetofenona y
ica
1-Feniletanol.
m
Se utilizó el método cromatográfico validado para obtener las dos curvas
de calibración en los rangos de 0 mM a 10 mM para la Acetofenona y
uí
1Feniletanol, respectivamente. Para ello primero, se seteó todas las
Q
condiciones validadas de análisis en el cromatógrafo HPLC, segundo se
prepararon diferentes concentraciones de los dos analitos en los viales de
ría
HPLC, cada uno identificado con sus concentraciones respectivas, para
luego ser analizadas en el cromatógrafo.
ie
Una vez terminado los análisis para cada concentración de los viales, se
en
reportaron las áreas, y con estos últimos se pasó a realizar las curvas de
calibración. Se halló una recta entre las áreas halladas vs. las
g
concentraciones de cada analito contenido en los viales, tanto para la

In
Acetofenona como el 1-Feniletanol. Las curvas de calibrado entre Área vs

[Analito, mM], son:
de
- Para la Acetofenona:
ca
Área1= m1.[C8H8O,mM]+b1 [2-5]

te
- Para el 1-Feniletanol:
lio
Á rea2= m2.[C8H10O,mM]+b2 [2-6]

b
Bi
40
Dónde:
ica
Área1, Área2 : Áreas halladas, que corresponden a cada vial.
m
m1, m2 : Pendiente de las curvas Área vs Concentración.
b1, b2 : Ordenadas de las curvas Área vs Concentración
uí
Q
2.2.3.3 Obtención de las Concentraciones de Acetofenona y
ría
1-Feniletanol durante la Reacción de Reducción
ie
Se realizaron reacciones de 100mL en matraces de 250 mL de capacidad,
a la concentración de 10mM de Acetofenona. De las cuales, se tomaron
en
muestras del medio de reacción con micro pipetas, a cada periodo de
tiempo expresado en horas. Se consideró el siguiente orden en la toma de
g
muestras:
In
a) Muestra Blanco: Muestra obtenida del medio de reacción, antes de

de
agregar la biomasa centrifugada de biocatalizador contenida en tubos

Falcon, y antes de agregar la cantidad medida de acetofenona. El
contenido de este matraz es el siguiente: solución buffer de fosfatos y
ca
cantidad medida de co-sustrato.

te
b) Muestra Cero: Muestra obtenida al inicio de la reacción, es decir a las

lio
cero horas de reacción, inmediatamente después de agregar la biomasa

de catalizador. El contenido de este matraz antes de tomar la muestra es
b
el siguiente: solución buffer de fosfatos, co-sustrato (Glucosa), sustrato

Bi
(Acetofenona), biomasa de biocatalizador (células libres o inmovilizadas

de Gongronella butleri).
41
c) Muestras durante el proceso de Biorreducción: Por motivos de
ica
obtener una buena gráfica de la cinética de reacción, y con ellos una
velocidad inicial más exacta y precisa de la reacción, se tomó la mayor
m
cantidad de muestras que definan bien el inicio de la reacción. Es por
ello que las tomas de muestra tuvieron la siguiente frecuencia: 0 horas, 2
uí
horas, 4 horas, 5 o 6 horas, 8 horas, 12 horas, 24 horas (1día), 48 horas
Q
(2días), 72 horas (3días), y así sucesivamente hasta obtener valores
constantes.
ría
El protocolo para trasladar las muestras en viales para su posterior
ie
análisis por cromatografía líquida en el HPLC, fue el siguiente:
en
Primero, se agitó moderadamente el matraz para homogenizar la
concentración en todo el medio de reacción antes de tomar la muestra.
g
In
Luego, se tomó la muestra con una micropipeta y se colocó en un tubo

de vidrio previamente identificado, luego se centrifugó la muestra y se
de
tomó una micropipeta la cantidad exacta de muestra del líquido

centrifugado y se trasvaso en un vial de HPLC.
ca
Posteriormente, se empleó una jeringa para succionar todo el contenido

del vial, luego se filtró la muestra usando un microfiltro, y posteriormente
te
se trasvasó este contenido a otro vial limpio e identificado. Y finalmente

lio
se prosiguió con los análisis cromatográficos a cada vial identificado. Así,

se evitó el paso de sedimentos que podrían dañar los microductos del
b
HPLC, lo cual también se refleja en la calidad de los cromatogramas.

Bi
Para el cálculo de las concentraciones totales de cada uno de los

analitos en el medio de reacción (matraz), se recurrió a las siguientes
42
ecuaciones, las cuales necesitan como dato: las áreas encontradas de
ica
los cromatogramas, pendiente y ordenada de las regresiones.
m
La concentración de acetofenona en el medio de reacción, se calcula por
medio de la siguiente ecuación:
uí
Q
(Á𝑟𝑒𝑎1 −𝑏1 )
[C8H8O, mM]= x Factor de Dilución [2-7]
𝑚1
ría
La concentración de 1-Feniletanol en el medio de Reacción, se calcula
por medio de la siguiente ecuación:
ie
en
(Á𝑟𝑒𝑎2 −𝑏2 )
[C8H8O, mM]= x Factor de Dilución [2-8]
𝑚2
g
2.2.4.-Metodología Experimental para el Proceso de

In
Biotransformación con Gongronella butleri.

de
2.2.4.1.- Asentamiento de la Colección.
El microorganismo utilizado para realizar la curva de crecimiento fue el

ca
ascomiceto Gongronella butleri y se almacenó en criotubos en una

solución glicerol -agua al 30%vv a -5°C.
te
lio
La taxonomía de esta cepa es la siguiente:

División: Ascomiceto
b
Familia: Cunninghamellaceae
Bi
Género: Gongronella
Especie: Gongronella butleri
43
2.2.4.2. Crecimiento del Ascomiceto Gongronella butleri.
ica
El proceso de replicación del ascomiceto Gongronella butleri se realizó
m
con el fin de purificar, aislar, reproducir y mantener al microorganismo
con su mejor actividad enzimática. Este proceso de replicación consistió
uí
en una secuencia de etapas que son las siguientes:
Q
a. Crecimiento del Ascomiceto en Medio Sólido
ría
Primero, esterilizó el material que se necesitó para el trabajo, así se evitó
ie
problemas de contaminación y bajos rendimientos en los ensayos.
Luego, se realizó las mediciones en peso de los componentes para el
en
medio de cultivo sólido. Y por tratarse de medio sólido se midió la
cantidad de Agar correspondiente al volumen de medio preparado.
g
In
Cada placa petri necesitó de 20mL de medio de cultivo

aproximadamente. Todo el trabajo se realizó en presencia de una llama,
de
con el fin de aprovechar la atmósfera inerte que se genera por el calor

liberado.
Realizar las mediciones en peso de los componentes para el medio de
ca
cultivo sólido.
te
En un vaso de precipitación se diluyó el medio de cultivo sólido con agua

lio
destilada hasta el volumen de medio de cultivo a preparar, la mezcla se

homogenizó con agitación magnética, luego se trasvasó el medio de
b
cultivo a un frasco para medios de cultivo y se autoclavó a 121 °C y

Bi
1 atm por 20 min. Luego se llevó el frasco de medio de cultivo a la zona

de cultivo, donde con el mechero encendido se trasvasó 20mL
aproximadamente por cada placa petri, luego se esperó hasta la
44
solidificación. Posteriormente, las placas con medio sólido se sometieron
ica
a radiación UV, con la finalidad de obtener un medio libre de
contaminación microbiana indeseable.
m
Se tomó uno de los criotubos almacenados en frio como fuente del
uí
microorganismo para la siembra. Se extrajo cubitos del ascomiceto y se
Q
sembró en la parte central de las placas petri que contienen medio de
sólido.
ría
Finalmente, el crecimiento se llevó a cabo dentro de una incubadora a
ie
condiciones de 1 atm y 30 °C por el lapso de tiempo de 7 días.
en
b. Crecimiento de Gongronella butleri en Medio Líquido
g
Primero, se desarrolló el crecimiento del ascomiceto en medio sólido.

In
Pasado los 7 días de crecimiento en medio sólido, se retiró las placas

petri de la incubadora y se seleccionó las del mejor crecimiento.
de
Segundo, se preparó medio de cultivo líquido siguiendo el mismo

procedimiento de preparación del medio PDA, se pesó los insumos para
ca
el volumen necesitado, a excepción del Agar.

te
Tercero, se trasvasó 50 mL del medio de cultivo líquido por cada matraz

lio
de 250mL. Luego se tapó las bocas de los matraces que contienen el

medio líquido con tapones de jebe y luego envolverlos en papel aluminio.
b
Cuarto, se autoclavó a 121 °C por 20 minutos.

Bi
Quinto, se seleccionó una de las placas petri que contiene al

microorganismo crecido para su posterior crecimiento en medio líquido y
45
las demás placas se aprovecharon para guardar el microorganismo en
ica
nuevos criotubos con glicerol al 30% v/v, y así obtener una nueva
colección de ascomicetos.
m
Sexto, en un lugar estéril se procedió a la siembra de los
uí
microorganismos en medio líquido. Se extrajeron cubitos de medio sólido
Q
con microorganismo de la placa petri y los introducimos en el matraz con
medio líquido de cultivo estéril.
ría
Finalmente cada matraz se identificó con un ticket, y se puso a crecer en
ie
la incubadora de agitación orbital de temperatura y velocidad de agitación
controlado. A 30 °C, 1 atm con 200 rpm.
en
2.2.4.3 Replicación del Ascomiceto Gongronella butleri
g
In
El proceso de replicación del ascomiceto se realizó con el fin de purificar,

aislar, reproducir y mantener al ascomiceto con su mejor actividad
de
enzimática. Este proceso de replicación consistió en una secuencia de

crecimientos en medio sólido en placas petri. Primero, se sembró el
ascomiceto en medio sólido, en 2 a 4 placas petri, y se siguió el
ca
procedimiento de crecimiento en medio sólido. Luego de alcanzar el total

crecimiento de ascomiceto en las placas petri dentro de la incubadora, se
te
seleccionó la placa que tuvo el mejor crecimiento uniforme radial, mejor

lio
coloración y libre de contaminación o de algún imperfecto que puede ser

observado. Posteriormente, se volvió a sembrar en 2 a 4 placas con
b
medio sólido, y como fuente del ascomiceto, se usó la placa

Bi
anteriormente seleccionada. Se cuidó que las condiciones de crecimiento

en la incubadora sean constantes. Por último, al finalizar el crecimiento
del ascomiceto en las nuevas placas petri, se obtuvo un ascomiceto listo
46
para los ensayos y pruebas correspondientes, o para un nuevo banco de
ica
ascomicetos, que luego se guardaron en frío, en criotubos con glicerol al
30%v/v.
m
2.2.4.4 Curva de Crecimiento del Ascomiceto Gongronella butleri
uí
Q
Se determinó la curva de crecimiento con la intención de encontrar el
tiempo adecuado para aprovechar su máximo contenido enzimático en
ría
un posterior proceso de reducción. Para ello se realizó el cultivo en
medio sólido y luego en medio líquido.
ie
De la incubadora con agitación orbital, que se encontraba a 30°C, 1atm y
200 rpm, se empezó a retirar 1 matraz por cada día para el análisis
en
correspondiente.
g
El contenido de cada matraz se extrajo a un tubo falcon, y luego se

In
separó por medio de una centrifuga todo el líquido sobrenadante. La

biomasa se colocó en una luna de reloj, medimos su peso inicial, luego
de
pusimos a secar en una estufa hasta que el peso de la biomasa se

vuelva constante. Secamos la biomasa alrededor de 5 horas a 120°C. Y
por último medimos el peso final.
ca
De esta manera se realizó la construcción de la curva de crecimiento del

te
microorganismo, a través de una gráfica que relaciona el peso de

lio
biomasa vs tiempo de crecimiento del ascomiceto.

b
Bi
47
ica
2.2.4.5. Preparación del Medio de Reacción
m
a. Preparación de la Solución Buffer
uí
Para la preparación de la solución amortiguadora fue requisito que el pK a
Q
del ácido débil deba tener un valor cercano al valor del pH requerido, así
se aseguró que las concentraciones del ácido y la base conjugada
ría
fueran similares.
Se tiene:
H3PO4(ac) ie
H2PO-4(ac)+H3O+(ac)Ka1= 7.5x10-3;pKa1= 2.12 [2-9]
en
H2PO-4(ac) HPO2-4(ac)+H3O+(ac)Ka2= 6.8x10-8;pKa2= 7.21 [2-10]
g
HPO-4(ac) PO3-4(ac)+H3O+(ac)Ka3= 4.8x10-12;pKa3= 12.32 [2-11]

In
Partiendo de lo anterior, en esta investigación se utilizó como medio de

de
reacción la solución buffer de fosfato. En este caso, se utilizó el ácido

débil 𝐻2 𝑃𝑂4− ya que posee un pKa2=7,21 cercano al valor del pH
requerido, igual a 6,5.
ca
Por ello, se escogió la siguiente ecuación para la preparación de la

te
solución buffer fosfato:

De acuerdo a la ecuación Henderson- Hasselbalch:
lio
H2PO-4(ac) HPO2-4(ac) + H3O+(ac) ; pKa2 [2.12]

b
Bi
log[𝑏𝑎𝑠𝑒]
𝑝𝐻 = 𝑝Ka2+ [𝑎𝑐𝑖𝑑𝑜]
[2-13]
48
log[𝐻𝑃𝑂42− ]
ica
𝑝𝐻 = 𝑝Ka2+ [𝐻2 𝑃𝑂4− ]
Se utilizó como fuente la base conjugada HPO2−

4 , sal acida de di-Sodio
m
hidrogenofosfato dodecahidratado (Na2HPO4.12H2O/ HNa2O4P.12H2O)
uí
de Peso Molecular igual a 358,14 g/mol y como fuente del ácido, la sal
ácida de Sodio dihidrogenofosfato monohidratado (NaH2PO4.H2O/
Q
H2NaO4P.H2O) con Peso Molecular igual a 137,99 g/mol.
Para un litro de solución buffer fosfato de pH=6,5; y con dato
ría
experimental de pKa2=7,21
6,5 = 7,21 + ie
𝑙𝑜𝑔[𝐻𝑃𝑂42− ]
[2-14]
en
[𝐻2 𝑃𝑂4− ]
g
[𝐻2 𝑃𝑂4− ]
In
[𝐻𝑃𝑂42− ]
= 5,13 [2-15]
Así para este sistema amortiguador de fosfatos se disolvió 2,9845

de
gramos de Na2HPO4.12H2O y 5,8975 gramos NaH2PO4.H2O en suficiente

cantidad de Agua MiliQ y se llevó la disolución a un volumen de 1 L.
ca
.
te
lio
b
Bi
49
ica
b. Preparación de la Solución Reacción
m
Se sembró el ascomiceto en placas petri con medio sólido y luego se
uí
colocaron en una incubadora a 30°C y a presión atmosférica para su
Q
crecimiento por 7 días. Luego, se preparó medio de cultivo líquido en
matraces de 250 mL, y con un Asa Henle se extrajo una cantidad de
ría
cepas jóvenes del ascomiceto de las placas petri, especialmente de los
extremos diametrales. Y luego, estos matraces se pusieron en agitación
orbital de 200rpm y a 30°C por 7 días.
ie
en
En la preparación de la solución reacción, se utilizó Acetofenona grado
HPLC, y como medio de reacción se utilizó el buffer de fosfato con
g
pH=6,5. Además se utilizó un co-sustrato de glucosa al 0,5%(p/v) con el

In
fin de regenerar la co-enzima (cofactor) del microorganismo.

de
Después de agregar en el matraz de 250mL, la cantidad de sustrato y co-

sustrato, se tomó una muestra de 1mL del medio preparado en un vial de
HPLC, y después de un análisis cromatográfico, se obtuvo el dato de
ca
muestra cero.
te
Posteriormente, teniendo la biomasa crecida del microorganismo en

lio
medio líquido, se centrifugó en tubos falcon todo el contenido de los

matraces de medio líquido con ascomicetos crecidos, con el fin de
b
quedarnos con la biomasa, libre de líquido sobrenadante y se realizó tres

Bi
lavados de la biomasa con buffer de fosfatos preparado de pH=6,5.
50
Se midió el peso inicial de la biomasa de ascomicetos, y después, esta
ica
biomasa se adicionó a los matraces con medio de reacción. Finalmente
se siguió la cinética de la reacción en agitación constante de 200 rpm en
m
un agitador orbital a temperatura controlada de 30°C.
uí
2.2.4.6 Inmovilización del Ascomiceto Gongronella butleri
Q
La Inmovilización se realizó en Agar especial de Pterocladia 2,5% y en
ría
Espuma de Poliuretano.
a) Tratamiento previo a la Inmovilización

ie
en
El ascomiceto se dejó crecer en Erlenmeyer de 250 mL con 50 mL de
medio líquido de cultivo PDA estéril. Para esto, se sacó con la ayuda de
g
un sacabocado estéril un bocado de cada cepa fresca contenida en

In
placas petri con medio sólido y se inoculó en cada Erlenmeyer de 250 mL

con 50 mL de medio líquido de cultivo PDA. Luego, cada uno de estos
de
últimos se llevó a la cámara de incubación con agitación a 30ºC y 200

rpm durante 7 días. Al finalizar el crecimiento se pasó el contendido de
estos Erlenmeyer a unos tubos Falcon y se centrifugó por 15 min a 4 000
ca
rpm para sedimentar el ascomiceto. Luego se eliminó el sobrenadante y

el ascomiceto sedimentado se lavó con agua bidestilada y purificada
te
grado miliQ, repitiendo el proceso de lavado-centrifugado, hasta eliminar

lio
el medio de cultivo que ellas puedan arrastrar. El último lavado se llevó a

cabo con tampón fosfato de potasio 50 mM y pH = 6,5. Se determinó el
b
peso húmedo de las células, quedando aptas para ser inmovilizadas.

Bi
51
ica
b) Inmovilización del Ascomiceto en Agar Pterocladia 2,5%
m
Para desarrollar la inmovilización se tomó una solución de Agar
Pterocladia 2,5% de la concentración correspondiente en tampón fosfato
uí
50 mM y pH = 6,5 y la esterilizamos en el autoclave durante 15 min a
Q
1atm de presión. A continuación se pasó la solución de Agar a un baño
termostatizado a 45ºC. Mediante un termómetro evaluamos la
ría
temperatura del Agar, cuando esta llega a equilibrarse con la del baño
añadimos el Agar en el volumen que corresponda a los tubos Falcon que
ie
albergan las células del ascomiceto previamente centrifugadas, se agitó
rápidamente esta solución con una varilla de vidrio se pasó a una placa
en
de plástico, donde se dejó que solidifique la mezcla. Una vez que la
matriz solidificó se procede a cortarlo en paralelepípedos de 1,27 x 1,27 x
g
0,31 cm. El derivado inmovilizado se pesó y se añadió a un Erlenmeyer

In
de 250 mL que contenía 100 mL de tampón fosfato potásico 50mM y

pH= 6,5; luego se añadió glucosa hasta una concentración de 0,5%
de
peso. Luego se adicionó el sustrato y se siguió la cinética de la reacción

a las mismas condiciones de agitación y temperatura. Las
concentraciones de sustrato ensayadas fueron a 10 mM. Luego se
ca
tomaron muestras de 1mL del medio de reacción a diferentes tiempos, se

extrajo los productos de reacción y se analizó usando HPLC.
te
c) Inmovilización en Espuma de Poliuretano

lio
Para llevar a cabo la inmovilización se cortó la Espuma de Poliuretano en

b
pequeños paralelepípedos de 1,0 x 1,0 x 0,7 cm3. Se pesaron 0,5 g. de

Bi
estos trocitos y se añadieron a un Erlenmeyer de 250 mL que contenía

50 mL de medio líquido de cultivo PDA y a continuación se esterilizó toda
la mezcla durante 15 min a 120 ºC y 1 atm de presión. Luego, con la
52
ayuda de un sacabocado estéril se inoculó en cada Erlenmeyer un
ica
bocado del ascomiceto contenido en placas Petri con medio sólido de
cultivo dejándose crecer estos Erlenmeyer a 30º C y 200 rpm por 7 días,
m
tiempo suficiente para que el ascomiceto colonice completamente la
Espuma de Poliuretano. Finalizando el crecimiento se filtró la Espuma y
uí
se lavó con tampón fosfato potásico 50 mM y pH=6,5 para eliminar el
Q
medio de cultivo que estas podrían arrastrar. Luego, el derivado
inmovilizado se pesó y se añadió a un Erlenmeyer de 250 mL que
ría
contenía 100 mL de tampón fosfato potásico 50mM y pH = 6,5. Luego se
adicionó el sustrato y se siguió la cinética de la reacción a 30ºC y
ie
200rpm. La concentración de sustrato ensayado fue de 10 mM. Luego se
sacó 1mL, como muestra, del medio de reacción a diferentes tiempos, se
en
extrajo los productos de reacción y se analizó en HPLC.
g
2.2.5. Estudio Cinético de Bioreducción

In
Cuando se llevan a cabo reacciones con biocatalizadores, no todas las

de
moléculas que reaccionan se encuentran disponibles para conversión

inmediata.
La reacción tiene lugar únicamente después de que los reactantes han
ca
sido transportados al lugar de reacción, por lo que los procesos de

transferencia de materia pueden ejercer una gran influencia sobre la
te
velocidad global de conversión. Debido a que la velocidad de reacción

lio
depende generalmente de la concentración de sustrato, cuando las

concentraciones del sistema varían, el análisis cinético llega a ser muy
b
complejo. Para biocatalizadores debe conocerse la concentración de

Bi
sustrato existente en cada punto del interior de la pared celular con el fin
de calcular la velocidad local de conversión. En la mayoría de los casos
53
estas concentraciones no pueden medirse aunque afortunadamente
ica
pueden calcularse utilizando la teoría de la difusión-reacción.
m
Debido a que las concentraciones varían en el interior de los
biocatalizadores, las velocidades locales de reacción también varían
uí
dependiendo de la posición. Cada célula responde a la concentración de
Q
sustrato según su posición con una velocidad de reacción determinada
por los parámetros cinéticos del biocatalizador. Esta velocidad local de
ría
reacción se denomina velocidad verdadera o velocidad intrínseca. Las
velocidades de reacción: locales y verdaderas, son difíciles de medir en
ie
biocatalizadores sin alterar las condiciones de reacción. Sin embargo, es
posible, medir la velocidad global de reacción para el catalizador entero.
en
En un sistema cerrado, la velocidad global de conversión por reacción,
ha hecho que en los sistemas heterogéneos se denomine velocidad
g
observada. Cuando los niveles de sustrato cambian lentamente durante

In
la reacción, los datos de velocidad observada pueden obtenerse

recogiendo muestras de la mezcla de reacción a diferentes tiempos y
de
analizando la variación de la concentración de sustrato.
2.2.5.1. Velocidad Inicial de Reacción Observada (Vo)

ca
Las cinéticas de muchas reacciones biológicas son bien de orden cero,

te
de primer orden o una más compleja denominada cinética Michaelis

lio
Menten. Para determinar la velocidad observada de cada

biotransformación se siguió el siguiente procedimiento: a Erlenmeyer de
b
250mL se añadieron 100 mL de tampón fosfato potásico pH=6,5. Luego

Bi
se añadió un peso determinado de células libres, el co-sustrato (glucosa),

y a continuación el sustrato a la concentración establecida (acetofenona),
llevándose a cabo la biotransformación a 30°C y 200rpm. A diferentes
54
tiempos de reacción se sacaron muestras del medio de reacción en un
ica
tubo de ensayo, se agitó en un Agitador Vortex por 10s, se centrifugó a
4 500 rpm durante 2 min. Del centrifugado se tomó 1mL en un vial; se
m
añadió a estos 0,5 mL de metanol, luego se filtró y la muestra filtrada se
trasvasó a otro vial para su posterior análisis en HPLC.
uí
Q
Para el análisis de las concentraciones del sustrato en el medio de
reacción, se empleó la curva de calibración del sustrato a diferentes
ría
concentraciones dependiendo de las áreas obtenidas en el análisis
cromatográfico.
ie
Las concentraciones (mili molar) del producto formado al cabo de un
en
tiempo (t) de reacción se determinó por medio de la siguiente relación:
g
In
(Área2 −b2 )
[P]t = x Factor de Dilución [2-16]
m2
de
Dónde:
[P]t= Concentración mili molar de producto al cabo de un tiempo t.

ca
Los datos así obtenidos se representaron en un plano XY, llevándose en

te
abscisas el tiempo de reacción (t) expresado en horas y en ordenadas la

lio
concentración mili molar del producto al cabo de t horas de reacción.

Luego, dada la tendencia de los puntos graficados y(t) aumenta
b
monótonamente desde y= 0 cuando t= 0 hasta una asíntota y = F a

Bi
valores elevados de t, con la ayuda del programa EXFIT del paquete

informático SIMFIT v5,5 ed.18, se realizó una regresión por mínimos
cuadrados ponderados, usando una serie de sumas exponenciales en
55
orden consecutivo (modelo c). Este programa ajusta y (t) a partir de una
ica
serie de sumas como se indica a continuación:
m
a) A1.exp[-k1t]+A2.exp[-k2t] + …………………..An.exp[-knt]
b) A1.exp[-k1t]+A2.exp[-k2t] +…………………..An.exp[-knt] + C
uí
c) B1.{1-exp[-k1t]}+B2.{1-exp[-k2t]} +………….Bn.{1-exp[-knt]}
Q
d) B1.{1-exp[-k1t]}+B2.{1-exp[-k2t]} +……...….Bn.{1-exp[-knt]}+ C
ría
El número(n) puede ser fijo o variable si se desean ajustar modelos en
secuencia de orden creciente. Los modelos (a y c) y (b y d) solo varían
ie
en la forma de los parámetros. A menudo solo se requieren n= 1 (como
en nuestro caso) pero, si los datos son abundantes y de alta calidad
en
tendría sentido probar n = 2 o n = 3. La función que mejor ajusta los
datos experimentales es de la forma.
g
In
y(t) = B. [1- exp (-k.t)] [3-17]
La derivada de esta función es la expresión de la velocidad observada y

de
tiene la siguiente ecuación:
dy/dt = B . k exp(-k.t) [3-18]

ca
La velocidad inicial quedará determinada cuando t tienda a cero, por lo

que la expresión anterior quedaría de la forma:
te
dy / dt = V0 = B . k [3-19]
lio
b
Dónde:
Bi
B= Máxima concentración de producto alcanzada.

K= Constante aparente de velocidad.
56
ica
2.2.5.2. Orden de reacción (n)
m
Dadas las tendencias de las cinéticas antes mencionadas, el orden de
uí
reacción se determinó experimentalmente de la siguiente manera. Se
Q
supuso una cinética de pseudo –primer orden de la forma V0 = k[S0]n. Se
realizó la reacción test con el ascomiceto a dos concentraciones de
ría
sustrato diferentes ([S1] =10mM y [S1] =5mM). Se determinó las
velocidades iniciales de ambas reacciones según:
V1 = k.[S1]n
ie [2-21]
en
V2 = k.[S2]n [2-22]
g
Del cociente de ambas expresiones tenemos:

In
(V1/V2)= ([S1]/[S2])n [2-23]

de
Tomando logaritmos y despejando el orden de reacción, n, tenemos:
n =[ln(V1/V2)]/[ln ([S1]/[S2])] [2-24]

ca
Si n=1, la suposición es correcta y la cinética de esta reacción seria de

te
pseudo-primer orden.
lio
b
Bi
57
ica
2.2.5.3. Otras variables de cinética de reacción
m
a. Conversión: La conversión porcentual del sustrato, X (%) de cada
uí
muestra al cabo de un tiempo (t), se calculó de la siguiente ecuación:
Q
[Sustrato]inicial −[Sustrato]final
xt (%) =
ría
[Sustrato]inicial
× 100 [2-25]
b. Rendimiento: El rendimiento de la reacción de pseudo- primer orden
ie
de reacción se calcula con la siguiente ecuación:
en
[Producto]Real
Yrxn (%) = [Producto] × 100 [2-26]
g
Teorico
In
c. Productividad: La productividad se encontró en base a la cantidad de

de
catalizador (biomasa), que se necesitó para obtener el producto deseado

en el tiempo que demandó la reacción, y se calcula de la siguiente
ca
manera:
[Producto,mM]final
Prxn (%) = Peso,g [2-27]
te
celulas ×Tiempo,horasrxn
lio
b
Bi
58
ica
m
uí
Q
ría
ie
g en
In
de
ca
te
lio
b
Bi
59
III RESULTADOS Y DISCUSIONES
ica
m
uí
Q
ría
III. RESULTADOS Y
DISCUSIONES ie
g en
In
de
ca
te
lio
b
Bi
59
3.1. Cualificación de los Instrumentos Analíticos
ica
En esta tesis se cualificaron equipos e instrumentos utilizados para la
determinación de los parámetros cinéticos de la reacción de reducción de
la Acetofenona; así como también se validaron los métodos de análisis. El
m
propósito de cualificar un equipo y validar un método de análisis es evitar
uí
y/o minimizar errores en las mediciones, que pueden afectar la precisión y
exactitud de los análisis. A modo de ejemplo se muestran las
Q
cualificaciones de los principales equipos y sus métodos de análisis:
ría
3.1.1. Cualificación de Balanza Analítica
Tener una balanza analítica cualificada es importante porque ayuda a
ie
confiar y obtener buenas mediciones de los pesos de las diferentes
en
sustancias utilizadas en los trabajos de investigación. En esta tesis se
cualificó la balanza Marca: Sartorious AG Germany CPA 224S, a fin de
conocer el estado del equipo y el grado de desviación de las mediciones
g
debido al uso, con la intención de tomar las medidas correctivas que nos
In
permitan tener resultados confiables.

de
La cualificación de la balanza analítica, se realizó en un rango

comprendido entre 0 y 100g. para la preparación de medios de cultivo de
microorganismos.
ca
a. Rango de Cualificación: 0 a 100g.:

te
La cualificación en este rango se realizó tomando los siguientes puntos

lio
0g., 25g., 50g., 75g., 100g., con 4 repeticiones por cada una de las
mediciones llevadas a cabo. La regresión lineal fue llevada a cabo por el
b
método de mínimos cuadrados con repeticiones, utilizando el programa

Bi
estadístico SIMFIT (Autor W. G. Bardsley, Universidad de Manchester, U.

K.) como se muestra en la siguiente figura:
60
ica
m
uí
Q
ría
Figura 3.1. Cualificación de la balanza Sartorius. Rango 0 a 100g.
ie
en
En la Figura 3.1, se observa que la regresión lineal tiene la siguiente
ecuación matemática:
g
In
Y = (0,9929 ± t.sx) X – (0,0341 ± t.sy)

de
En esta ecuación se puede observar que la pendiente de la recta es

aproximadamente uno, lo que nos indica que no existe variación
considerable entre los valores reales y los valores mostrados en la
ca
balanza (teóricos), razón por la cual podemos inferir que la balanza

Sartorius AG Germany CPA 224S se encuentra en buen estado y
te
mostrando valores fiables, sin embargo, si el valor de la pendiente fuera

lio
inferior a 0,97 los resultados no podrían ser considerados confiables.

b
Bi
61
3.1.2. Cualificación de Espectrofotómetro Ultravioleta- Visible
Los analitos que intervienen en la determinación de los parámetros
ica
cinéticos en esta tesis son: sustrato: acetofenona y producto:
1-Feniletanol; los cuales absorben en el rango ultravioleta (UV), debido a
la deslocalización de electrones que presentan ambos compuestos. En
m
ese sentido el equipo utilizado para determinar la longitud de onda a la
uí
cual se produce la máxima absorción fue el espectrofotómetro UV-VIS
Hewlett Packard Mod 8 452 A, Diode array; el cual se cualificó utilizando
Q
una solución de benzoato de sodio como patrón validador del
Espectrofotómetro UV a la longitud de onda de 254nm (Espectro UV:
ría
210nm a 310nm).
La cualificación del espectrofotómetro UV- Visible, nos ayuda a
ie
determinar de manera confiable la longitud de onda del espectro UV (nm),
en
a la cual se analizará el sustrato y producto de la reacción, y con ello
programar el detector UV del HPLC, y así finalmente, realizar el
g
seguimiento de la reacción y la cuantificación de los analitos.

In
A partir de una solución madre de benzoato de sodio 0,528 mM, se

determinó las absorbancias de diferentes diluciones con agua ultra pura
de
(miliQ).Estas diluciones se analizaron haciendo uso de la cubeta de

análisis (cuarzo). La curva de absorbancia (Lammbert-Beer) a 254nm fue:
ca
te
lio
b
Bi
62
a. Absorbancia de Benzoato de Sodio a 254nm
ica
m
uí
Q
ría
ie
en
Figura 3.2. Curva de Absorbancia de Benzoato de Sodio a 254nm para la Cualificación
Espectrofotómetro UV-Visible.
g
In
De la Figura 3.2, se observa que la relación de la absorbancia y la

concentración de benzoato de sodio tienen una tendencia lineal, la cual
de
fue ajustada por mínimos cuadrados en el software estadístico SIMFIT. Y

corresponde a la siguiente ecuación lineal:
ca
Y= (0,8252±t.sx) X-(0,02265±t.sy)
te
Dónde:
Y= Absorbancia
lio
X=Concentración, mM
b
Bi
63
3.1.3. Cualificación del Cromatógrafo de Líquidos de Alta

Performancia
ica
3.1.3.1 Cualificación de la Bomba Cuaternaria
La cualificación de la bomba consiste en la comprobación de la exactitud y
m
precisión del caudal suministrado por la bomba a través de los 4 canales del
uí
equipo cromatográfico. El procedimiento requiere utilizar la columna
estándar utilizada habitualmente en el equipo, (por ejemplo: C-8 O C-18) ya
Q
que el sistema debe estudiar su funcionamiento como un todo durante un
análisis cromatográfico. La operación consiste en hacer pasar un solvente a
ría
través de uno de los canales (en este caso agua ultra pura) con caudales
nominales de 0,50; 1,0; 1,5 y 2,0 mL/min hasta 4mL/min, con 5 repeticiones
ie
cada caudal, y realizar la medición del solvente recogido a la salida del
sistema.
en
a) Cualificación del Canal A
g
In
de
ca
te
lio
b
Figura 3.3. Cualificación del Canal A

Bi
Desviación media (d)= Σdi/n=0,0174/6= 0,0029
64
Desviación estándar (Sd)= [Σ (di-d)²/ (n-1)]^½=[6,49*10⁻⁴/(6-1)]^½
Sd= 0,0114
ica
“t” de student calculada (tcal)= [d*(n)^½]/Sd=[0,0029*(6)^½]/0,0114
m
tcal= 0,623
De tablas el valor de “t” de student tabulada al 95% (t tab) y para
uí
n=6, se tiene: Ttab=2,015
Q
Como Tcal<Ttab, entones se concluye que los valores obtenidos
de manera experimental son estadísticamente iguales a los
ría
valores teóricos expresados por el instrumento.
b) Cualificación del Canal B
ie
g en
In
de
ca
te
Figura 3.4. Cualificación del Canal B

lio

b
Desviación estándar (Sd)= [Σ(di-d)²/ (n-1)]^½=[1,506*10⁻³/(6-1)]^½

Bi
Sd= 0,0174
65
ica
tcal= 1,2388
De tablas el valor de “t” de student tabulada al 95% (ttab) y para n=6, se
tiene: Ttab=2,015
m
Como Tcal<Ttab, entones se concluye que los valores obtenidos de manera
uí
experimental son estadísticamente iguales a los valores teóricos
expresados por el instrumento.
Q
c) Cualificación del Canal C
ría
ie
g en
In
de
ca
Figura 3.5. Cualificación del Canal C

te

lio
Desviación estándar (Sd)= [Σ(di-d)²/ (n-1)]^½=[6,19*10⁻⁴/(6-1)]^½

b
Sd= 0,0111
Bi
tcal= 1,28
66
De tablas el valor de “t” de student tabulada al 95% (ttab) y para n=6, se

tiene: Ttab=2,015
ica
Como Tcal<Ttab, entonces se concluye que los valores obtenidos de
manera experimental son estadísticamente iguales a los valores teóricos
m
uí
d) Cualificación del Canal D
Q
ría
ie
g en
In
de
Figura 3.6. Cualificación del Canal D

ca
Desviación estándar (Sd)= [Σ(di-d)²/ (n-1)]^½=[6,23*10⁻⁴/(6-1)]^½

te
Sd= 0,0112
lio

b
tcal= 0,809
Bi
De las tablas el valor de “t” de student tabulada al 95%(t tab) y para n=6,
se tiene: Ttab=2,015.
67
Como Tcal<Ttab, entonces se concluye que los valores obtenidos de

manera experimental son estadísticamente iguales a los valores teóricos
ica
m
3.1.3.2. Cualificación de Sistema de Inyección
uí
La cualificación del sistema de inyección implica evaluar dos aspectos
fundamentales del sistema de inyección automático, que nos permite tener
Q
la seguridad sobre los resultados obtenidos en cuanto a su
reproducibilidad y precisión: precisión del inyector y magnitud del efecto
ría
memoria (efecto “carry over”).
a) Precisión del Inyector
ie
Se llevó a cabo la evaluación de la precisión del sistema de inyección
en
manual mediante una secuencia de cinco inyecciones de una disolución
estándar de naftaleno (0,100 mg/mL en acetonitrilo) empleando las
g
siguientes condiciones cromatográficas:

In
 Columna: Teknocroma Mediterránea Sea C18-5µm*15*0,46

 Fase móvil : Metanol/agua (45/55 v/v)
de
 Flujo de la fase móvil: 1,00 mL/min

 Longitud de onda del detector : 254nm
ca
 Volumen de inyección: 10µL

 Temperatura del horno de columna: 30°C
te
 Presión del equipo: 39bar

lio
b
Bi
68
Tabla3.1 Inyecciones de una disolución estándar de naftaleno (0,100 mg/ml

en acetonitrilo)
Tiempo retención
N° muestra Área
ica
(min)
1 4,693 2 640,500
2 4,705 2 538,800
m
3 4,703 2 630,100
4 4,707 2 612,300
uí
5 4,707 2 628,700
Q
Promedio 4,703 2 610,100
Desv. Estándar 0,005 41,105
ría
%Coeficiente de Variación 0,123 1,574
Limite Superior (95%) 4,710 2 661,130
Límite Inferior (95%) 4,696 2 559,070
ie
en
De la Tabla 3.1., se observa que las desviaciones del tiempo de retención
g
y áreas son pequeñas, esto significa que el equipo reporta datos de mayor
In
precisión y exactitud.
b. Magnitud del efecto memoria ( efecto carry over”)

de
Este parámetro nos permite determinar la contaminación producida por la

ca
inyección anterior, si no se limpia correctamente el “loop” del inyector

automático después de cada inyección.
te
Para determinar este parámetro se inyectó la disolución estándar luego se

lio
realizó un inyección en blanco (como blanco usamos la fase móvil) y se

observó si en el cromatograma aparece señal en el tiempo de retención de
b
compuesto de la disolución estándar (acetofenona). A continuación se

Bi
repitió el ensayo pero realizando la inyección con lavado, y se verificó si

hay algún cambio en la señal.
69
Efecto Carry over (Sin limpiar el sistema)
ica
Tabla 3.2. Análisis cromatográfico de solución de acetofenona
Tiempo retención
N° muestra Área
(min)
m
1 4,708 2 460,800
uí
2 4,712 2 452,100
Q
3 4,733 2 523,800
ría
Promedio 4,718 2 478,900
ie
Límite Superior (95%) 4,751 2 576,105
en
Límite Inferior (95%) 4,684 2 381,695
g
In
Tabla 3.3. Efecto carry over sin limpiar el sistema- Blanco: Fase Móvil
de
Tiempo
N° muestra retención Área %Área
(min)
ca
1 4,736 24,400 0,990

2 4,754 15,800 0,640
te
3 4,760 29,300 1,160

lio
Promedio 4,750 23,167 0,930

Desv. Estándar 0,012 6,834 0,263
b
%Coeficiente de Variación 0,263 29,498 28,322

Limite Superior (95%) 4,781 40,145 1,722
Bi
Límite Inferior (95%) 4,719 6,189 0,142
70
De la Tabla 3.2 y 3.3, se observa que después de cada análisis
ica
cromatográfico de la solución de Acetofenona, queda pequeñas partículas
del analito en el sistema de inyección, las cuales se detectan en el
cromatograma al analizar una muestra blanco que contenga la misma fase
m
móvil. Este efecto carry over, afecta la certeza de los análisis posteriores
uí
si no se realiza un buen lavado interno del sistema de inyección.
Q
ría
Efecto Carry Over (Con limpieza del sistema)
ie
Tabla 3.4. Efecto carry over con lavado del sistema- Muestra: Acetofenona
en
Tiempo retención
N° muestra Área
(min)
1 4,741 2 686,800
g
2 4,741 2 688,500
In
3 4,743 2 799,300
Promedio 4,742 2 724,870

de

Limite Superior (95%) 4,745 2 885,030
ca
Límite Inferior (95%) 4,738 2 564,710

te
lio
b
Bi
71
Tabla 3.5. Efecto carry over (utilizando inyección con lavado)
Tiempo retención
ica
N° muestra Área %Área
(min)
m
1 0 0 0
2 0 0 0
uí
3 0 0 0
Promedio - - -
Q
Desv. Estándar - - 0,000
%Coeficiente de Variación - - 0,000
Límite Superior (95%) - - 0,000
ría
Límite Inferior (95%) - - 0,000
ie
De la Tabla 3.4 y 3.5, se observa que al realizar un lavado interno del
sistema de inyección después de cada análisis cromatográfico del analito,
en
se eliminan en su totalidad cualquier resto de partículas de analito que
puedan afectar los resultados de los siguientes análisis cromatográficos.
g
In
3.1.3.3. Cualificación del detector UV-Visible

de
La cualificación del detector tiene como objetivo comprobar la linealidad de

la detección a una longitud de onda determinada (por ejemplo: 254nm)
ca
dentro de un rango de absorbancia que se considera normal (0,0-2,0D.O).

Se llevó a cabo la evaluación del detector mediante una secuencia de tres
te
inyecciones de cinco disoluciones estándar de Acetofenona (50, 150, 250,

350 y 500 mg/L respectivamente en metanol/agua).
lio
Se representó los valores de concentración de Acetofenona (mg/L) frente a

b
los valores de área de pico y se calculó la recta de regresión que pasa por
Bi
los puntos experimentales para comprobar la linealidad del detector.
72
Tabla 3.6. Cualificación del UV-Visible

Tiempo
N° disolución Acetofenona
retención Área (mV)
estándar (mg/L)
ica
(min)
1 50 4,685 1 073,0
1 50 4,688 1 085,3
m
1 50 4,685 1 113,4
2 150 4,741 3 848,2
uí
2 150 4,740 3 730,7
Q
2 150 4,745 3 746,2
3 250 4,748 5 426,4
ría
3 250 4,747 5 609,4
3 250 4,478 5 529,7
4 350 4,676 9 542,6

4 350
ie 4,677 9 316,3
en
4 350 4,678 9 449,9
5 500 4,679 12 619,1

5 500 4,680 12 624,8
g
5 500 4,676 12 831,2

In
de
ca
te
lio
b
Bi
Figura 3.7. Cualificación del UV- Visible
73
De la Tabla 3.6 y de la Figura 3.7, se obtiene un coeficiente de correlación

con una buena linealidad entre la concentración estándar de acetofenona y
el área reportada por cromatografía.
ica
3.1.3.4 Cualificación de la Columna
m
Las columnas envejecen con el tiempo por el sangrado de la fase
estacionaria, mal uso, suciedad, etc. Por ello este ensayo es vital y debería
uí
de realizarse todos los días antes de empezar a trabajar.
Q
La evaluación de la columna se llevó a cabo mediante una secuencia de
tres inyecciones de una disolución estándar que contenga una serie de
ría
compuestos similares pero con distinto valor de coeficiente de extinción
molar a la longitud de onda elegida (v.g.254nm)
ie
La disolución estándar preparada fue la siguiente: (1) benceno (1µL/mL),
en
(2) tolueno (1µL/mL) y (3) naftaleno (1µL/mL) en acetonitrilo. Se inyectan
20µL y se debe asegurar que trabaja en condiciones óptimas de limpieza
g
del mismo.
In
Al no tener la hoja del fabricante preparamos la disolución estándar

indicada anteriormente y los resultados obtenidos lo usaremos como
de
referencia del estado de la columna en evaluaciones posteriores.
Se emplearon las siguientes condiciones cromatográficas:

ca
Teknokroma Mediterránea Sea C-18-5µm*15*0,46

te
Fase Móvil: agua/acetonitrilo (35/65 v/v)

lio
Flujo de la fase móvil: 0,700 mL/min
Longitud de onda del detector: 254 nm

b
Bi
Volumen de inyección: 20µL
Temperatura del horno de columna: 40°C
74
En la Tabla3.7, se muestra el tiempo de retención, el área de pico, el

factor de capacidad (k’), el número de platos teóricos(N), el número de
platos teóricos por metro de columna (N/m), la altura de pico teórico
ica
reducido (H) y el factor de asimetría (As) del último pico (naftaleno) para
cada una de las inyecciones.
m
Tabla 3.7. Cualificación de la columna
uí
Tr N° platos
Pinchazo Área (mV) K´ N° pl.t./m H As
(min) teóricos
Q
1 6,24 10 047,2 5,06 4 240 282 666,66 0,00000354 0,83
ría
2 6,24 10 086,3 5,06 4 235 282 333,33 0,00000354 0,83
3 6,24 9 890,4 5,06 4 334 288 933,33 0,00000346 0,81
Promedio
Desv. Est.
6,24
0,00
10 007,96
103,67 ie
5,06
0,00
4 269,66
55,77
28 464,44
3 718,02
0,00000351
0,00000005
0,82
0,01
en
Lim. Sup 6,25 10 264,56 5,06 4 408,21 293 881,27 0,00000363 0,85
Lim. Inf 6,23 9 749,43 5,06 4 131,11 275 407,61 0,00000339 0,79
g
In
Los elevados valores de los platos teóricos y los valores cercanos al

uno (1) del factor de asimetría demuestran el buen funcionamiento de la
de
columna para nuestros análisis.

ca
te
lio
b
Bi
75
3.2 Validación del Método de Análisis.
ica
3.2.1. Longitud de Onda Óptima de Análisis.
En esta tesis la cuantificación de los analitos se llevaron a cabo de manera

simultánea, es decir, se aprovechó la misma muestra para determinar la
m
concentración de acetofenona y 1-Feniletanol. El inconveniente de este
uí
procedimiento consiste en que ambos analitos absorben a diferentes
longitudes de onda, razón por la cual, se procedió a determinar el punto
Q
isosbéstico de estos analitos (punto de máxima absorción de ambos
analitos juntos) a fin de resolver este inconveniente.
ría
Los espectros UV-Visible de la acetofenona y del 1-Feniletanol a bajas
ie
concentraciones (0,1mM) se superpusieron para encontrar el punto
isosbéstico para el análisis. Este estudio se desarrolló con el propósito de
en
encontrar una longitud de onda adecuada para el Análisis Cromatográfico,
ya que el Cromatógrafo de Líquidos de Alta Performance – HPLC tiene un
g
detector UV. Por lo que se usó el Espectrofotómetro UV-Visible para

In
encontrar las longitudes de onda en las cuales ambos espectros se

cruzan. Las concentraciones de las soluciones estándar de los analitos
de
fueron las siguientes:
[Acetofenona]= 0,1008 mM
ca
[1-Feniletanol]=0,0974 mM
te
lio
b
Bi
76
Tabla 3-8. Coeficientes de Extensión Molecular a 217nm
L/cm.mol
Analito
ica
Acetofenona 6 789,7
1-Feniletanol 4 461,4
m
uí
La longitud de onda adecuada es una longitud de onda en la cual los picos
cromatográficos detectados de la Acetofenona y 1-Feniletanol reportan
Q
datos que reproducen las cantidades más exactas del contenido de
Acetofenona y 1-Feniletanol en las muestras tomadas en el transcurso de
ría
las reacciones con células libres de ascomicetos. Por eso se buscó una
longitud de onda que genere una cromatografía con buena resolución para
ie
la Acetofenona y el 1-Feniletanol. A una longitud de onda igual a 217nm
se obtiene el mejor resultado como se muestra en la Tabla 3.8.
g en
3.2.2. Validación de Método de Análisis Cromatográfico
In
En esta etapa se desarrollaron una serie de pruebas del punto isosbéstico

y diferentes concentraciones de la fase móvil. Las mejores condiciones
de
cromatográficas encontradas para el análisis de la Acetofenona y del

1-Feniletanol fueron las siguientes:
ca
 Columna: Teknokroma Mediterránea Sea C18 (µm*15*0,46)

 Fase móvil
te
: Metanol/ Agua (45/55)

 Caudal fase móvil : 1,0mL/min.
lio
 Longitud de onda Detector : 217,4nm.

 Volumen de inyección : 10 µL.
b
 Temperatura termostato : 30ºC.

Bi
77
3.2.3. Curvas de Calibración para Acetofenona y 1-Feniletanol.
a. Linealidad:
ica
Una vez determinadas las condiciones adecuadas de análisis en HPLC, se
prosiguió elaborar las curvas de calibrado; para esto se tuvieron que
m
preparar diferentes concentraciones de sustrato y producto entre valores
uí
de 0 a 10mM obteniéndose los siguientes resultados como se muestran a
continuación.
Q
Tabla 3.9. Curvas de Calibración para Sustrato y Producto en HPLC
ría
Analito Curvas de Calibración Regresión
Acetofenona
ie
Área= 628,77[mM] +25,34 R2=0,999
en
1-Feniletanol
Área= 1 065,20[mM]+254,08 R2=0,999
g
En la Tabla 3.9, se muestran las ecuaciones correspondientes a las

In
curvas de calibración, con muy buena correlación lineal, que se utilizaron

para la determinación de las concentraciones de sustrato y producto en
de
HPLC.
ca
b. Repetitividad :
te
El ensayo de repetitividad sirve para determinar las variaciones de error

sistemático, precisión y exactitud de las curvas de calibrado tanto para el
lio
sustrato como para el producto. Es por ello que se tomó una muestra de
sustrato y producto (con tres repeticiones) y se calculó la desviación
b
estándar y su coeficiente de variación.

Bi
78
Tabla 3.10. Ensayo de Repetitividad para la Acetofenona (sustrato)
standard réplica 1 réplica 2 réplica 3 Área

%CV
s
ica
Mm Tr Área Tr Área Tr Área Promedio
5,376 8,880 3 394,67 8,881 3 398,213 8,881 3 400,086 3 397,65633 2,75 0,08
m
Tabla 3.11. Ensayo de Repetitividad para la 1-Feniletanol (producto)
uí
standard réplica 1 réplica 2 réplica 3 Área
Q
%CV
s
Mm Tr Área Tr Área Tr Área Promedio
ría
5,195 7,787 5 903,147 7,787 5 898,627 7,782 5 891,656 5 897,81006 5,79 0,10
ie
En la Tabla 3.10 y en la Tabla 3.11, se observa que existen una buena
en
precisión de las curvas de calibrado ya que las mediciones obtenidas en el
ensayo de repetitividad poseen un coeficiente de variación menor al 2%.
g
c. Límites de Cuantificación y Detección:

In
El límite de detección se define como la mínima cantidad de analito en una

de
muestra que puede ser detectada pero no necesariamente cuantificada. El

límite de cuantificación es la mínima cantidad de analito en una muestra
que puede ser determinada cuantitativamente con una precisión y exactitud
ca
adecuada. A continuación se muestran los límites de cuantificación y

detección obtenidos en esta tesis para la determinación de los parámetros
te
cinéticos de la reacción de reducción de la Acetofenona.

lio
b
Bi
79
Tabla 3.12. Límites de Cuantificación y Detección
Analitos Acetofenona 1- Feniletanol
ica
Límite de Cuantificación, mM. 0,79 0,60
Límite de Detección, mM. 0,26 0,20
m
Los valores mostrados en la Tabla 3.12, son importantes para la
uí
cuantificación de los analitos ya que evitan tener en los análisis falsas
señales y/o picos equivocados que no permitirían tener un adecuado
Q
seguimiento de la cinética de la reacción de reducción de la acetofenona.
ría
3.3. Proceso de Biorreducción con Gongronella butleri
3.3.1. Curva de Crecimiento ie

en
El proceso de crecimiento celular, que se produce a partir del consumo de
un determinado sustrato y que conlleva a la formación de un determinado
g
producto biológico (biomasa), es muy complejo, dado que es el resultado

In
de la interacción entre una población celular y el medio en que esta se

encuentra. La célula tiene además capacidad de adaptarse a cambios en
de
la composición del medio y a lo largo del cultivo pueden ocurrir mutaciones

o algún cambio en las características genéticas de la célula. Además cada
ca
célula individual evoluciona dentro del ciclo del crecimiento de forma que
en el medio de cultivo se encontraran células con distintas edades,
te
algunas acabadas de nacer, otras en procesos de división y otras al final

de su ciclo celular.
lio
La aproximación más comúnmente utilizada y que permite un tratamiento

b
simple, es la de considerar la población celular como un sistema no-

Bi
segregado y no-estructurado. Teniendo en cuenta esto, los datos cinéticos

de una población celular se pueden obtener básicamente utilizando dos
sistemas de reacción, el reactor continuo de tanque agitado y el reactor
80
discontinuo de tanque agitado, en este último caso el crecimiento de las

células tiene lugar dentro del reactor y al no haber una regeneración del
medio de cultivo, el crecimiento se detiene cuando se llega a algún tipo de
ica
limitación.
En un crecimiento en discontinuo las células no pueden reproducirse
m
indefinidamente, y al final de la fase exponencial la velocidad va
uí
decreciendo a medida que aparecen limitaciones, haciéndose
prácticamente nula en la denominada fase estacionaria de crecimiento,
Q
llegándose posteriormente a una fase de muerte celular, en la que
desciende el número de células.
ría
Dado que en esta tesis intentamos llevar a cabo reacciones empleando
Gongronella butleri inmovilizada, es importante la determinación del
ie
tiempo de crecimiento óptimo para la mayor producción de enzima que
en
interviene en el proceso y así la inmovilización podría realizarse con la
máxima actividad enzimática.
g
En la Tabla 3.14 se muestran los valores numéricos para la curva de

In
crecimiento del ascomiceto Gongronella butleri expresados en peso seco.

de
Tabla 3.14. Peso Seco de Gongronella butleri para curva de crecimiento.
Días Biomasa en (g)

ca
3 0,17
5 0,20
te
6 0,21
lio
7 0,23
8 0,19
b
Bi
Para observar mejor los resultados se construyó un gráfico de barras con

los tiempos de crecimiento del ascomiceto.
81
ica
m
uí
Q
ría
Figura 3.11. Curva de Crecimiento de Gongronella butleri expresado en peso seco
ie
en
En la Figura 3.11 se puede observar que Gongronella butleri alcanza la
fase estacionaria de crecimiento en medio sólido PDA a los 7 días a 28°C
g
en una incubadora, después de los cuales el microorganismo inicia la

In
muerte celular. De esta manera quedó establecido el tiempo de

crecimiento de 7 días para llevar a cabo los ensayos cinéticos para la
reducción de la Acetofenona toda vez que a este tiempo se obtiene la
de
mayor cantidad de biomasa y por ende la mayor producción de enzima

necesaria para esta Biotransformación.
ca
3.3.2. Estudio Cinético

te
Cuando se llevan a cabo reacciones con microorganismos, no todas las

moléculas del sustrato se encuentran disponibles para conversión
lio
inmediata, la reacción tiene lugar únicamente después que el sustrato ha

sido transportado al lugar de reacción, por lo que los procesos de
b
transferencia de materia pueden ejercer una gran influencia sobre la

Bi
velocidad global de conversión. Cada célula responde a la concentración
82
de sustrato según su posición con una velocidad de reacción determinada

por los parámetros cinéticos del biocatalizador.
ica
La velocidad local de reacción se denomina velocidad verdadera o
velocidad intrínseca; las cuales son difíciles de medir en microorganismos.
Sin embargo es posible, medir la velocidad global de reacción para el
m
catalizador entero. En un sistema cerrado, la velocidad de desaparición
uí
de sustrato en el seno del líquido debe ser igual a la velocidad global de
conversión por reacción, hecho que en los sistemas heterogéneos se
Q
denominan velocidad observada. Cuando los niveles de sustrato cambian
lentamente durante la reacción, los datos de velocidad observada pueden
ría
obtenerse recogiendo muestras de la mezcla de reacción a diferentes
tiempos y analizando la variación de la concentración de sustrato. A modo
ie
de ejemplo se muestra en la siguiente tabla la disminución de la
concentración inicial de sustrato Acetofenona (8,2 mM) catalizada por
en
Gongronella butleri en estado libre.
g
TABLA 3.15. Consumo de Acetofenona catalizada por Gongronella butleri en estado

In
Libre.
Tiempo ACETOFENONA Área [mM] [mM]

s %CVx10³
de
H Área1 Área2 Área3 Promedio vial matraz
0 1 743,9419 1 743,9169 1 744,0872 1 743,9820 0,0919 5,2690 2,7 8,2

1 1 492,4593 1 492,4801 1 492,4826 1 492,4740 0,0180 1,2060 2,3 7,0
ca
2 1 094,2701 1 094,2499 1 094,2390 1 094,2530 0,0157 1,4340 1,7 5,1

4 1 010,4099 1 010,4190 1 010,4221 1 010,4170 0,0063 6,2750 1,5 4,5
6 779,8800 779,8600 779,8640 779,8680 0,0106 1,3590 1,2 3,6
te
8 633,1612 633,1580 633,1458 633,1550 0,0081 1,2830 0,9 2,7

lio
12 423,5700 423,5630 423,5620 423,5650 0,0043 1,0290 0,6 1,8

18 402,6040 402,6100 402,6040 402,6060 0,0034 0,8600 0,6 1,8
24 381,6500 381,6299 381,6011 381,6470 0,0347 9,0920 0,5 1,5
b
36 381,6500 381,6299 381,6011 381,6470 0,0347 9,0920 0,5 1,5

Bi
Pendiente: 628,77; ordenada: 25,344; muestra: 1 500µL; dilución: 3
83
En la Tabla 3.15 se puede observar que las áreas del sustrato en los
cromatogramas presentan poca dispersión como lo demuestran los bajos valores
de la desviación estándar y el coeficiente de variación, lo que da solidez al valor
ica
promedio tomado para la determinación de la disminución de la concentración de
la Acetofenona en función del tiempo de reacción. Para observar mejor los
m
resultados obtenidos, en la Figura 3.12 se muestra la cinética de consumo del
sustrato Acetofenona catalizada por Gongronella butleri.
uí
Q
ría
ie
g en
In
de
Figura 3.12. Cinética de consumo de Acetofenona 8,2 mM, a 30ºC y 200 rpm
catalizada por Gongronella butleri (26 g. de peso húmedo) en estado libre.
ca
En la Figura 3.12. se puede observar que a medida que el tiempo va

te
transcurriendo la concentración de Acetofenona va disminuyendo debido

a que es consumida por el ascomiceto Gongronella butleri para la
lio
producción de 1-Feniletanol. Los datos experimentales tienen una

b
tendencia de decaimiento exponencial, razón por la cual todos los ensayos

Bi
de consumo de sustrato fueron ajustados con el programa EXFIT del

paquete estadístico SIMFIT v5,5 ed. 18 a un modelo de decaimiento
exponencial de la forma:
84
f(t)= [A.exp(-K.t)+C]
Dónde:
ica
K= Constante aparente de velocidad de consumo de sustrato. (h -1)
C= Valor asintótico cuando el tiempo decrece indefinidamente. (mM)
m
A= Gradiente de concentración entre el estado inicial y el tiempo t. (mM)
uí
La derivada de la función f(t) es la expresión de la velocidad observada de
Q
consumo de sustrato y toma la siguiente forma:
ría
df(t)/dt= A.exp(-K.t).-K
ie
La velocidad inicial de sustrato quedará determinada cuando t tienda a
en
cero; por lo que la expresión para calcular la velocidad inicial observada
de consumo de sustrato quedará establecida como:
g
df(t)/dt= V0 = -A.K
In
de
Aunque buenos resultados fueron obtenidos mediante el uso del

ascomiceto en estado libre, el siguiente paso es incrementar la estabilidad
y la eficiencia de la biorreducción, para esto es necesario inmovilizar el
ascomiceto en diferentes soportes (Espuma de Poliuretano y Agar
ca
Pterocladia 2,5%).
te
lio
b
Bi
85
TABLA 3.16. Consumo de Acetofenona catalizada por Gongronella butleri inmovilizado

en Espuma de Poliuretano.
ica
ACETOFENONA Área
Tiempo %CV [mM] [mM]
Promedi s
H x10³ vial matraz
Área1 Área2 Área3 o
m
0 2 121,4000 2 121,1998 2 121,1322 2 121,2440 0,1392 6,5620 3,1 9,3
1 1 827,6849 1 827,8211 1 827,9480 1 827,8180 0,1315 7,1940 2,8 8,4
uí
2 1 576,3198 1 576,2999 1 576,3103 1 576,3100 0,0099 0.6310 2,4 7,2
4 1 219,8998 1 220,4590 1 219,6622 1 220,0070 0,4090 3,5000 1,9 5,7
Q
6 989,4339 989,4638 989,4763 989,4580 0,2170 2,1930 1,5 4,5
8 863,6586 863,7112 863,7422 863,7040 0,0422 4,8800 1,4 4,2
ría
12 716,9012 717,0240 717,0478 716,9910 0,0786 1,9000 1,1 3,3
18 486,4088 486,4498 486,4674 486,4420 0,0300 6,1670 0,7 2,1
24
36
465,4638
444,5197
465,4854
444,5288
465,4898
444,5235
ie 465,4830
444,5240
0,0168
0,0045
3,6090
1,0280
0,7
0,6
2,1
2,0
en
Pendiente: 628,77; ordenada: 25,344; muestra: 1500µL; dilución: 3
g
cromatogramas presentan poca dispersión como lo demuestran los bajos

In
valores de la desviación estándar y el coeficiente de variación, lo que da solidez

al valor promedio tomado para la determinación de la disminución de la
de
concentración de la Acetofenona en función del tiempo de reacción. Para

observar mejor los resultados obtenidos, en la Figura 3.13 se muestra la
cinética de consumo del sustrato Acetofenona catalizada por Gongronella
ca
butleri inmovilizada en Espuma de Poliuretano.

te
lio
b
Bi
86
ica
m
uí
Q
ría
Figura 3.13. Cinética de consumo de Acetofenona 9,3 mM, a 30ºC y 200 rpm catalizada por
Gongronella butleri (26 g. de peso húmedo) inmovilizado en Espuma de Poliuretano.
ie
en
En la Figura 3.13 se puede observar que de manera similar al consumo de
Acetofenona catalizada por el Ascomiceto libre, cuando usamos Espuma de
Poliuretano, a medida que el tiempo transcurre la concentración de Acetofenona
g
va disminuyendo esto debido al buen aprovechamiento de esta por Gongronella

In
butleri para la producción de 1-Feniletanol, siendo la última concentración

muy similar a la obtenida en estado libre, esto nos indicaría que el proceso de
de
inmovilización usando como soporte la Espuma de Poliuretano no disminuye la

actividad catalítica del ascomiceto.
ca
te
lio
b
Bi
87
TABLA 3.17. Consumo de Acetofenona catalizada por Gongronella butleri

inmovilizado en Agar Pterocladia 2,5%
ica
ACETOFENONA
Tiempo Área %CV [mM] [mM]
s
h Promedio x103 vial matraz
Área1 Área2 Área3
m
0 2 121,2290 2 121,2500 2 121,2530 2 121,2440 0,0130 0,6120 3,2 9,7
uí
5 1 701,9816 1 702,1988 1 702,0116 1 702,0640 0,1176 6,9090 2,6 8,0
10 1 429,5598 1 429,6100 1 429,6212 1 429,5970 0,0326 2,2800 2,2 6,7
Q
15 1 261,9016 1 261,9480 1 261,9254 1 261,9250 0,0232 1,8300 1,9 5,9
24 1 094,2410 1 094,3030 1 094,2150 1 094,2530 0,0452 4,1300 1,7 5,1
ría
36 1 031,3098 1 031,3810 1 031,4372 1 031,3760 0,0638 6,1800 1,6 4,9
48 1 052,2990 1 052,3514 1 052,3546 1 052,3350 0,0312 1,9600 1,6 4,9
60 1 073,2697 1 073,3112
ie
1 073,3011 1 037,2940
0,0216 2,0100 1,6 5,0
en
cromatogramas presentan poca dispersión como lo demuestran los bajos
g
valores de la desviación estándar y el coeficiente de variación, lo que da

In
solidez al valor promedio tomado para la determinación de la disminución

de la concentración de la acetofenona en función del tiempo de reacción.
de
Para observar mejor los resultados obtenidos, en la Figura 3.14 se

muestra la cinética de consumo del sustrato Acetofenona catalizada por
ca
Gongronella butleri inmovilizada en Agar Pterocladia 2,5%.

te
lio
b
Bi
88
ica
m
uí
Q
ría
Figura 3.14. Cinética de consumo de Acetofenona 9,8mM, a 30°C y 200rpm
ie
catalizada por Gongronella butleri (26 g. de peso húmedo) inmovilizada en Agar
Pterocladia 2,5%
en
En la Figura 3.14 se puede observar que a medida que transcurre el
g
tiempo la concentración de Acetofenona va disminuyendo lentamente,

In
llegando a consumirse menos de la mitad del sustrato finalizada la

reacción, a diferencia de la cinética de consumo de Acetofenona
de
empleando Gongronella butleri Libre e inmovilizada en Espuma de

Poliuretano, donde la concentración de Acetofenona al finalizar la
ca
reacción es muy baja en menos tiempo (36h), lo que nos indicaría que el
Agar Pterocladia 2,5% disminuye la actividad biocatalítica del ascomiceto
te
impidiendo la máxima conversión del sustrato.

lio
b
Bi
89
Tabla 3.18. Resultados del Análisis por HPLC de la Obtención del 1-Feniletanol
en estado Libre
Tiempo 1-FENILETANOL Área %CV [mM] [mM]

s
ica
H Área1 Área2 Área3 Promedio x103 vial matraz
0 0 0 0 0 0 0 0 0
1 822,0122 822,0144 822,5334 822,1866 0,3000 6,3480 0,5 1,6
m
2 1354,7322 1 354,7425 1 354,88531 1 354,7866 0,0860 6,3400 1,0 3,1
uí
4 1851,8702 1 851,8792 1 851,8906 1 851,8800 0,0100 0,5399 1,5 4,5
6 2 171,4389 2 171,4411 2 171,43992 2 171,4400 0,0011 0,0506 1,8 5,4
Q
8 2 419,9702 2 419,9792 2 420,0106 2 419,9866 0,0210 0,8677 2,0 6,1
12 2 810,5591 2 810,5566 2 810,5643 2 810,5600 0,0039 0,1387 2,4 7,2
ría
18 3 130,1201 3 130,1211 3 130,11876 3 130,1200 0,0012 0,0383 2,7 8,1
24 3 165,6255 3165,6244 3 165,63009 3 165,6266 0,0030 0,0947 2,7 8,2
ie
36 3 130,1209 3 130,1199 3 130,11919 3 130,1200 0,0009 0,0287 2,7 8,2
en
En la Tabla 3.18 se puede observar que las áreas del producto obtenido
en los cromatogramas presentan poca dispersión como lo demuestran los
g
valores bajos en la desviación estándar y en el coeficiente de variación lo

In
que nos permite obtener un valor promedio de área confiable para la

determinación de las concentraciones de producto obtenido al transcurrir
de
el tiempo de reacción. Para observar mejor estos resultados se muestran

en forma gráfica la cinética de obtención de producto
1-Feniletanol catalizada por el ascomiceto Gongronella butleri en estado
ca
libre.
te
lio
b
Bi
90
ica
m
uí
Q
ría
ie
en
Figura 3.15: Cinética de Obtención del Producto 1-Feniletanol, a 30°C y 200rpm
catalizada por Gongronella butleri Libre (26 g. de peso húmedo)
g
In
En la Figura 3.15 se muestran los resultados obtenidos para la

biotransformación de Acetofenona usando células libres de Gongronella
de
butleri, las células de ascomiceto libres son más activas al conducir a la

máxima conversión en menos tiempo llegándose a obtener una
concentración de 8,2mM del producto final. Además se puede observar
ca
que los datos experimentales tienen una tendencia de crecimiento

exponencial, razón por la cual todos los ensayos de obtención de producto
te
fueron ajustados con el programa EXFIT del paquete estadístico SIMFIT

v5,5 ed. 18 a un modelo de crecimiento exponencial de la forma:
lio
b
y (t)= B. [ 1-exp (-K.t) ]

Bi
91
Dónde:
K= Constante aparente de velocidad de aparición de producto (h⁻¹)
ica
B= Máxima concentración de producto alcanzada. (mM)
La derivada de la función y(t) es la expresión de la velocidad observada

de aparición de producto y toma la siguiente forma:
m
uí
dy(t)/dt= B. K.exp (-K.t) ]
Q
La velocidad inicial de aparición del producto quedará determinada
cuando t tienda a cero, por lo que la expresión para calcular la velocidad
ría
inicial observada de aparición de producto queda establecida como:
ie
dy(t)/ dt = Vo = B.K
en
Tabla 3-19. Obtención del 1-Feniletanol en Soporte de Inmovilización Espuma de
Poliuretano
g

In
s
h Promedio x 103 vial matraz
0 0 0 0 0 0 0 0 0
de
1 680,1589 680,1602 680,1608 680,1600 0,0010 0,1470 0,4 1,2
2 1 141,7456 1 141,7212 1 141,7731 1 141,7466 0,0260 2,2772 0,8 2,5

ca
4 1 709,8412 1 709,8493 1 709,8644 1 709,8533 0,0145 0,8480 1,3 4,1
6 2 100,4213 2 100,3511 2 100,5075 2 100,4266 0,0780 3,7135 1,7 5,2

te
8 2 384,4802 2 384,4781 2 384,4846 2 384,4800 0,0018 0,0754 2,0 6,0
12 2 704,0381 2 704,0401 2 704,0417 2 704,0400 0,0018 0,0665 2,3 6,9

lio
18 3 059,1060 3 059,1023 3 059,1116 3 059,1066 0,0047 0,1536 2,6 7,9
24 3 023,5982 3 023,5892 3 023,6125 3 023,6000 0,0120 0,3968 2,6 7,8

b
36 3 094,6021 3 094,6022 3 094,6356 3 094,6133 0,0190 0,6139 2,6 8,0

Bi
Pendiente: 1 065,2; ordenada: 254,08; muestra: 1 500µL; dilución: 3
92
En la Tabla 3.19 se puede observar que las áreas del producto obtenido
en los cromatogramas presentan poca dispersión como lo demuestran los
valores bajos en la desviación estándar, así mismo en el coeficiente de
ica
variación, lo que nos permite obtener un valor promedio de área confiable
para la determinación de las concentraciones de producto 1-Feniletanol
m
usando como soporte Espuma de Poliuretano, obtenido a través del
tiempo de reacción. Para observar mejor estos resultados se muestran en
uí
forma gráfica la cinética de obtención de producto 1-Feniletanol catalizada
Q
por el ascomiceto Gongronella butleri Espuma de Poliuretano.
ría
ie
g en
In
de
ca
Figura 3.16: Cinética de Obtención del Producto 1-Feniletanol, a 30°C y 200rpm

catalizada por Gongronella butleri inmovilizada en Espuma de Poliuretano (26 g.
te
de peso húmedo)
lio
En la Figura 3.16 se puede observar claramente que la actividad del

b
ascomiceto inmovilizado en Espuma de Poliuretano es muy similar a las

del ascomiceto libre en estado de no crecimiento, ya que luego de 36h de
Bi
biotransformación, Acetofenona fue totalmente consumida y se alcanzó la

máxima concentración de 1-Feniletanol de 8mM, por lo que se podría decir
93
que la Espuma de poliuretano constituye un buen soporte para este

ascomiceto ya que el proceso de inmovilización no disminuye su actividad
catalítica como ocurre en el caso del Agar Pterocladia 2,5%. Esto se debe
ica
atribuir a que el ascomiceto esta adherido a la superficie externa de la
Espuma y no presenta problemas difusionales por encontrarse expuesto
m
directamente al medio de reacción como en el caso de las hifas libres en
estado de no crecimiento.
uí
Tabla 3.20. Obtención del 1-Feniletanol en Soporte de Inmovilización Agar
Q
Pterocladia 2,5%.
ría
s
h Promedio x103 vial matraz
0 0 0 0 0 0 0 0 0
10
8 93,2013
1 390,2901
893,1992
1 390,2902 ie
893,1994
1 390,2996
893,2000
1 390,2933
0,0011
0,0054
0,1276
0,3941
0,6
1,0
1,8
3,2
en
15 1 674,3458 1 674,3412 1 674,3529 1 674,3466 0,0059 0,3535 1,3 4,0
24 1 958,3982 1 958,4038 1 958,3979 1 958,4000 0,0003 0,1685 1,6 4,8

g
36 2 064,9209 2 064,9192 2 064,9203 2 064,9200 0,0006 0,0329 1,7 5,1

In
48 1 993,9003 1 993,9084 1 993,9127 1 993,9066 0,0056 0,2853 1,6 4,9

60 1 958,3925 1 958,4033 1 958,4041 1 958,4000 0,0065 0,3324 1,6 4,9
de
En la Tabla 3.20 se puede observar nuevamente que las áreas del

producto obtenido en los cromatogramas presentan poca dispersión como
ca
lo demuestran los valores bajos en la desviación estándar, así mismo en el

coeficiente de variación lo que nos permite también obtener un valor
te
promedio de área confiable para la determinación de las concentraciones

lio
de producto obtenido a través del tiempo de reacción usando como

soporte Agar Pterocladia 2,5%. Para observar mejor estos resultados se
b
muestran en forma gráfica la cinética de obtención de producto

Bi
1-Feniletanol catalizada por el ascomiceto Gongronella butleri en

Pterocladia 2,5%.
94
ica
m
uí
Q
ría
ie
Figura 3.17. Cinética de obtención del producto 1-Feniletanol, a 30ºC y 200 rpm
en
catalizada por el ascomiceto Gongronella butleri usando como soporte de
inmovilización Agar Pterocladia 2,5%.
g
In
Al observar la reducción de Acetofenona usando el ascomiceto

Gongronella butleri en estado libre nos damos cuenta que se realiza en
de
menos tiempo y a la vez se obtiene una mayor concentración del producto

1-Feniletanol, mientras que usando el Agar Pterocladia 2,5% como medio
ca
de inmovilización el tiempo de reacción es más prolongado, la obtención

del producto se da en forma lenta y la producción de 1-Feniletanol es
te
poca (se consume aproximadamente la mitad de la concentración del

sustrato) en comparación de la reacción en estado libre.
lio
b
Bi
95
3.3.3. Parámetros Cinéticos
ica
Tabla 3.21 Parámetros Cinéticos del Sustrato Acetofenona
SUSTRATO Cat A K C Vo Kespx10² n

mM g mM h⁻¹ mM mM/h h⁻¹/g.cat
m
8,20 9,65 7,93 0,19 1,78 1,50 1,96
LIBRE 1,0
uí
4,00 9,10 3,78 0,18 0,91 0,68 1,97
9,20 9,90 7,84 0,18 2,04 1,42 1,81
ESPUMA 1,1
Q
3,90 7,65 3,98 0,14 0,97 0,55 1,83
9,80 9,59 5,22 0,10 4,82 0,53 1,04
AGAR 0,9
ría
4,70 9,49 2,99 0,09 0,84 0,27 1,06
ie
En la Tabla 3.21 se evaluaron dos concentraciones iniciales diferentes de
en
Acetofenona para cada una de las reacciones de reducción manteniendo
constante la concentración del biocatalizador, se puede observar que en
g
cada uno de los experimentos realizados el orden de la reacción de

reducción de Acetofenona catalizada por Gongronella butleri tanto libre
In
como inmovilizada en Espuma de Poliuretano y Agar Pterocladia 2,5% es

prácticamente de orden uno (pseudo primer orden), la determinación de
de
los parámetros cinéticos permitieron calcular el orden de la reacción

utilizando la ecuación [3-24] lo que justificaría el ajuste realizado de los
ca
datos experimentales según el modelo de la ecuación de primer orden.

Esto nos indica que muy probablemente el paso limitante de la velocidad
te
de reacción sea la difusión de reactivos y/o productos.

lio
Asimismo se muestra el efecto de la concentración de sustrato sobre la

velocidad inicial específica de la biotransformación pudiéndose observar
b
que la velocidad inicial de reacción en cada uno de los experimentos

Bi
realizados aumenta con el incremento de la concentración de sustrato,

siendo Gongronella butleri en estado libre la que presenta mayor velocidad
inicial para esta reacción.
96
Además en cada uno de los experimentos realizados la constante

específica de velocidad kesp disminuye ligeramente con el incremento de
la concentración inicial de sustrato manteniendo cantidades similares de
ica
biocatalizador, lo que puede deberse a que el incremento de la
concentración de sustrato origine toxicidad del ascomiceto causando
m
inhibición de la enzima que cataliza el proceso de reducción.
uí
Tabla 3.22. Parámetros Cinéticos del Producto de Reacción 1-Feniletanol
Q
SUSTRATO CAT B K Vo Kespx102
mM g mM h-1 mM/h h-1/g.cat
ría
8,20 9,65 8,14 0,19 1,54 1,96
LIBRE
4,00 9,10 3,82 0,17 0,64 1,86
9,20 9,90 8,01 0,17 1,39 1,72
ie
ESPUMA
3,90 7,65 3,72 0,15 0,55 1,96
9,80 9,59 5,03 0,11 0,55 1,14
en
AGAR
4,70 9,49 2,32 0,10 0,23 1,05
g
En la Tabla 3.22 se muestra la variación de la velocidad inicial de la

In
biotransformación en función de la concentración inicial de sustrato, los

valores experimentales muestran que al tener una mayor concentración de
de
sustrato la velocidad inicial de reacción será también mayor.
Al comparar la actividad del ascomiceto en estado Libre e inmovilizado en

ca
Espuma de Poliuretano las velocidades iniciales son similares esto debido

a que el proceso de inmovilización no redujo su actividad catalítica no
te
presentando de esta manera problemas difusionales por no encontrarse

lio
expuesto directamente al medio de reacción, caso diferente ocurre en la

reacción dada en el medio de inmovilización Agar Pterocladia 2,5% que
b
como observamos tiene una velocidad inicial de reacción pequeña esto

Bi
debido a los problemas difusionales que en este medio se encuentra.
Cuando comparamos la constante específica de cada experimento se

puede demostrar que al tener una mayor concentración de sustrato este
97
se manifiesta más pequeño, actuando así de manera inversamente

proporcial, esto se puede deber a que al tener una mayor concentración
del sustrato el ascomiceto se inhibe, no pudiendo lograr su total actividad
ica
reductora.
3.3.4. Productividad, Rendimiento y Conversión de la Biotransformación
m
En las biotransformaciones, los parámetros a optimizar son, la velocidad
uí
de transformación del sustrato y el rendimiento de producto. La capacidad
biorreductora del ascomiceto Gongronella butleri Libre e inmovilizada en
Q
Agar Pterocladia 2,5% y Espuma de Poliuretano fue evaluada midiendo la
conversión de la biorreducción del sustrato Acetofenona.
ría
En la siguiente tabla se muestran los resultados obtenidos de
ie
productividad a fin de evaluar la actividad específica del biocatalizador
Gongronella butleri en estado Libre e inmovilizada en Agar Pterocladia
en
2,5% y Espuma de Poliuretano en la reacción de reducción de la
Acetofenona
g
Tabla 3.23. Productividad, Rendimiento y Conversión de la Reducción

In
Exp. SUSTRATO CAT ACETOFENONA 1-FENILETANOL Px10³

mM g X Y mM/gcat.h
de
% %
LIBRE 8,2 26,08 79 81 8,60
ESPUMA 9,3 26,35 80 80 8,40

ca
AGAR 9,7 26,30 50 48 3,04

te
En la Tabla 3.23 se puede observar que la inmovilización en Agar

lio
Pterocladia 2,5% conduce a procesos con tiempos largos de reacción y

bajas productividades, estos hechos nos llevan a pensar en la existencia
b
aquí de problemas difusionales. Por otro lado la inmovilización en Espuma

Bi
de Poliuretano conduce a mayor productividad que el Agar Pterocladia

2,5% y a tiempos más cortos de reacción, alcanzándose productividades
similares a las de las células libres en estado de no crecimiento. Estos
98
resultados cuantitativos nos sugieren que la Espuma de Poliuretano

constituye el mejor soporte para este ascomiceto ya que ejerce un efecto
protector sobre el biocatalizador y permite que el ascomiceto mantenga su
ica
actividad comportándose como si se encontrara en estado libre, ya que
como observamos el tiempo óptimo usando este soporte para la
m
biorreducción de Acetofenona es de 36h, periodo en el cual se ha
alcanzado un 80% de conversión del sustrato, demostrando ser altamente
uí
eficiente en esta biorreducción. En cambio empleando Agar Pterocladia
Q
2,5% como soporte de inmovilización se tiene un tiempo de reacción muy
elevado, lo que la hace poco interesante como soporte para este
ría
ascomiceto. Por otro lado la conversión usando este soporte es baja (50%,
72h) a pesar de la gran cantidad de biomasa. Por lo tanto este soporte no
es recomendable como sistema biocatalítico para reducción de este
sustrato.
ie
g en
In
de
ca
te
lio
b
Bi
99
IV.CONCLUSIONES
ica
m
uí
Q
ría
ie
en
IV. CONCLUSIONES
g
In
de
ca
te
lio
b
Bi
100
IV.CONCLUSIONES
IV. CONCLUSIONES
ica
Después de haber obtenido los resultados en nuestra parte experimental podemos
llegar, a nuestro juicio, a las siguientes conclusiones:
m
5.1 La realización de la cualificación de equipos e instrumentos de laboratorio,
uí
así como la validación de los métodos a emplear en los análisis permiten disminuir
considerablemente los errores en las mediciones, los cuales podrían afectar la
Q
precisión y exactitud de los resultados de los análisis para la determinación de los
parámetros cinéticos del 1-Feniletanol.
ría
5.2 El sustrato, Acetofenona, es biotransformado satisfactoriamente cuando se
ie
añade Gongronella Butleri en la fase estacionaria de su crecimiento (7 días) lo que
indica que cuando las células dejan de reproducirse son metabólicamente más
en
activas para llevar acabo la biorreducción.
g
5.3 La inmovilización del ascomiceto Gongronella Butleri utilizando Agar

In
Pterocladia 2.5% como soporte nos demuestra que la reducción de la Acetofenona

ocurre lentamente, esto se atribuye a las restricciones difusionales ocasionados
de
por la red del termogel que dificulta la exposición del Ascomiceto con el medio de
reacción.
ca
5.4 La inmovilización del Ascomiceto Gongronella Butleri utilizando Espuma de

Poliuretano como soporte resulta ser adecuada para llevar a cabo el proceso de
te
reducción de la Acetofenona, ya que dada su gran porosidad, el ascomiceto queda

lio
expuesto al medio de reacción sin presentar problemas difusionales en el interior

de la matriz.
b
Bi
5.5 La cinética del proceso de reducción de Acetofenona utilizando el

Ascomiceto Gongronella Butleri en estado libre e inmovilizado en Espuma de
Poliuretano y Agar Pterocladia 2.5% es un proceso de pseudo-primer orden, como
101
IV.CONCLUSIONES
lo demuestran los resultados de los parámetros cinéticos obtenidos, donde la

velocidad inicial de reacción está influenciada por la difusionalidad del medio de
reacción en la que se encuentra.
ica
5.6 Los procesos desarrollados en esta tesis son sostenibles, pues el derivado
obtenido empleando Agar Pterocladia 2.5% y Espuma de Poliuretano como
m
soportes de inmovilización han permitido realizar este proceso en agua y en
uí
ausencia de disolventes orgánicos contaminantes. Asimismo estos procesos se
realizan en condiciones de temperatura de ambiente y a presión atmosférica.
Q
ría
ie
g en
In
de
ca
te
lio
b
Bi
102
ica
m
uí
Q
ría
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uí
Q
ría
ie
g en
In
de
ca
te
lio
b
Bi
ABSTRACT
In the present work, the reduction capacity of ascomycetto Gongronella butleri
ica
under sustainable conditions was investigated in order to obtain an alternative
method of substitution of the traditional catalysts based on metals and boranes,
m
which generate low productivities and contamination due to the byproducts. The
uí
reductase activity of ascomycet was evaluated with the acetophenone reduction
test reaction. A Gongronella butleri strain was used in discontinuous culture with
Q
free cells and immobilized in Polyurethane Foam and Pterocladia Agar 2.5% w /
ría
v to be able to evaluate the effect of these immobilization supports on the kinetic
parameters of the acetophenone reduction and to compare the results obtained

ie
in each of the supports with the use of ascomycete in its free form. Growth of
en
ascomycet was carried out in PDA culture medium (Papa dextrose agar) and the
g
reaction took place in the stationary phase of ascomycete growth. The tests were
In
performed using high performance liquid chromatography (HPLC) equipment.
The best results were obtained when cells immobilized in Polyurethane Foam
de
were used as immobilization support, obtaining higher productivity, better
performance and conversion in less time; the reaction kinetics was of pseudo first
ca
order. Based on the obtained results we can conclude that using polyurethane
te
foam as a support for immobilization is the best alternative to achieve our

lio
reduction reaction under sustainable conditions, as it happens at room
temperature and in aqueous media.

b
Bi

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

PARA OPTAR EL TÍTULO DE

Br. ELIZABETH DEL JEHOVA CALLE MORALES

Br. ERICKA ELIZABETH SEGURA CASANOVA

Dr. MEDARDO ALBERTO QUEZADA ALVAREZ

1.3. Química Sostenible 5

1.6. Ventajas de las Biotransformaciones 10

1.7.2 Regeneración de la Coenzima 13

1.8. Gongronella butleri 16

1.9. Inmovilización de Células 17

1.9.1. Tipos de Inmovilizaciones 21

1.10.1. Objetivo General 26

1.10.2. Objetivos Específicos 26

II. MATERIALES Y MÉTODO Pág.

2.1 Materiales y Equipos 27

2.2.1. Estado de la colección 29

3.2.1.4 .Reacción test catalizada por Gongronella butleri en

2.2.2. Cualificación de los equipos de Instrumentación Analítica 32

2.2.2.3. Cualificación del HPLC 33

2.2.3. Validación y Cualificación del Método de Análisis 38

2.2.3.1 Determinación de la Longitud de Onda Óptima 39

2.2.3.2. Obtención de las Curvas de Calibración para Acetofenona

2.2.3.3 Obtención de las Concentraciones de Acetofenona

y 1-Feniletanol durante la Reacción de Reducción 41

2.2.4. Metodología Experimental para el Proceso de Biotransformación con

2.2.4.1. Asentamiento de la Colección. 43

2.2.4.2. Crecimiento del Ascomiceto Gongronella butleri 44

2.2.4.3. Replicación del Ascomiceto Gongronella butleri 46

2.2.4.4. Curva de Crecimiento del Ascomiceto Gongronella butleri 47

2.2.4.6. Inmovilización del Ascomiceto Gongronella butleri 51

III. RESULTADOS Y DISCUSIONES

3.1.1. Cualificación de Balanza Analítica 60

3.1.2. Cualificación de Espectrofotómetro Ultravioleta- Visible 62

3.1.3 Cualificación del Cromatógrafo de Líquidos de

3.1.3.1 Cualificación de la Bomba Cuaternaria 64

3.1.3.3. Cualificación del detector UV-Visible 72

3.2 Validación del Método de Análisis. 76

ascomiceto se llevó a cabo en medio de cultivo PDA (Papa dextrosa agar) y la

reacción tuvo lugar en la fase estacionaria de crecimiento del ascomiceto. Los

eficiencia (HPLC). Los mejores resultados se obtuvieron cuando se utilizó

como soporte de inmovilización es la mejor alternativa para lograr nuestra

reacción de reducción en condiciones sostenibles, pues sucede a temperatura

activos. La principal aplicación de las biotransformaciones en síntesis

orgánica está en la preparación de compuestos enantiopuros, pero también

presión atmosférica) en las cuales se llevan a cabo estos procesos

quirales, evitando condiciones de reacción extremas, que pueden conducir

Esta tecnología utiliza condiciones de reacción amigables con el ambiente,

acuosos y los subproductos son biodegradables o reutilizables. Los

química verde, de bajo impacto ambiental (6). Los microorganismos,

plantas y organismos superiores poseen la capacidad de realizar

farmacéuticos, agroquímicos, vitaminas y fragancias. (10,11)

La reducción de cetonas empleando biocatalizadores para obtener

condiciones de pH y temperaturas mucho más suaves. La ventaja de las

consiste en que aquellas son estereoselectivas y pueden realizarse a

biocatalíticos se pueden llevar a cabo en medio acuoso u orgánico/ acuoso

las líneas fundamentales en el desarrollo de la Química Sostenible.

reutilizar lo cual rebaja los costes de producción. (12)

1.2. La Química y el Desarrollo Sostenible

Básicamente el término desarrollo sostenible tiene dos implicaciones:

- El uso de recursos naturales a ritmos suficientemente bajos como para

- La generación y disipación de los recursos y emisiones a velocidades

medio natural. (7,16)