Universidad Austral de Chile

Facultad de Ciencias
Instituto de Bioquimica
BIOQ200

GLICOGENÓLISIS EN CORTES DE HÍGADO

Nombres: Abigail Vasquez F – Melissa Torres Z.

Fecha: Martes 10 de Julio, 2018.

OBJETIVOS
Estudiar la glicogenólisis in vitro mediante la incubación de cortes de hígado de rata en una
solución salina (tampón PBS) a través de una determinación semi-cuantitativa del glicógeno
hepático por medio de la extracción de este con ácido Tricloroacetico (TCA) visualizando su
coloración (caoba) en presencia de yodo y a su vez determinaremos cuantitativamente la
presencia de glucosa entregada al medio después de distintos tiempos de incubación a 37°C.

RESULTADOS

Preparación previa:
Se agregó 0,5 ml de solución de PBS a 3 tubos que contenían 164 mg de corte de hígado. El tubo 1
no se incubó, considerándolo como tiempo cero (t0); el tubo 2, se incubó 15 minutos (t15) y el tubo
3, se incubó 30 minutos (t30), ambos en un baño de 37ºC.
Al tubo 1, inmediatamente después de mezclar el corte de hígado con la solución de PBS, se
extrajo toda la solución y colocó en un tubo eppendorf y dejó en hielo hasta que finalicen los
tiempos de los demás tubos. Inmediatamente después, se extrajo el glicógeno del corte.

I) Determinación semi-cuantitativa del glicógeno hepático:

Se tomó el trozo de tejido del tubo 1, añadió 5 ml de TCA al 5% y se colocó en el homogeneizador.

Luego se centrifugó 7 min a 3500 rpm conservando el sobrenadante en un tubo de ensayo
rotulado como S1. Para tubos 2 y 3, posterior a la incubación, se realiza la misma operación
(rotulando S2 y S3, respectivamente).
Finalmente, para la medición de absorbancia a 540 nm, se realiza una reacción colorimétrica.
Tomamos 1 ml de cada sobrenadante (S1, S2, S3) y se agregó 1 ml de TCA 5%. Simultáneamente se
preparó un BLANCO con 2 ml de TCA 5% y un PATRON con 1 ml de ácido TCA 5% más 1 ml de
solución de glicógeno (0.25 mg/ml). Se añadió 3 ml de la solución de yodo a cada tubo, agitó
cuidadosamente e inició la lectura. El resumen de los resultados obtenidos y calculados se
presenta en la tabla 1.
Tabla 1. Resumen de valores obtenidos en la determinación de glicógeno.

Corte Peso Tiempo de Absorbancia Concentració Glicógeno Glicógeno

de incubación a 540 nm n glicógeno en corte en 100 mg
tejido (min.) (mg/mL) de hígado de tejido
(mg) (mg) (mg)

1 164 0 0,078 0.214 1.07 0.652

2 164 15 0.196 0.538 2.69 1.640

3 164 30 0.142 0.329 1.65 1.000

Patrón - - 0.091 0.250 - -

Tabla 1. Tabla de valores obtenidos en la determinación semi-cuantitativa del glicógeno

hepático. La concentración de glicógeno fue calculada a partir de los datos de absorbancia
obtenidos y la concentración del patrón (0,25mg/ml). Considerando que los tubos tienen 5 ml de
solución, es posible calcular la cantidad en mg. de glicógeno en el corte. Y, finalmente, teniendo en
cuenta el peso de cada corte, se obtiene los mg de glicógeno por cada mg de corte de tejido.

Ejemplo de cálculos
Para cada cálculo se utilizó como ejemplo los valores del corte 1 resumidos en Tabla 1.

➢ Concentración de glicógeno
𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑒𝑠𝑡á𝑛𝑑𝑎𝑟
= 𝑓𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 𝐾
𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖𝑜𝑛 𝑒𝑠𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑟
0.091
= 0.364 𝑚𝑔/𝑚𝑙
0.25 𝑚𝑔/𝑚𝑙

𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑐𝑜𝑟𝑡𝑒 1
Concentración corte 1:
𝐹𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 𝐾

0.078 𝑚𝑔
𝑚𝑔 = 0.214 ⁄𝑚𝑙
0.364 ⁄𝑚𝑙
 ➢ Ejemplo de cálculo de mg de glicógeno en corte de hígado

Masaglicógeno =𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖𝑜𝑛 𝐺𝑙𝑖𝑐ó𝑔𝑒𝑛𝑜 × 5 𝑚𝑙

𝑚𝑔
= 0.214 ⁄𝑚𝑙 × 5 𝑚𝑙
= 1.07 𝑚𝑔

➢ Ejemplo de cálculo de mg de glicógeno en 100 mg de tejido

𝑀𝑎𝑠𝑎𝐺𝑙𝑖𝑐ó𝑔𝑒𝑛𝑜
× 100 𝑚𝑔𝑡𝑒𝑗𝑖𝑑𝑜
𝑀𝑎𝑠𝑎 𝑇𝑒𝑗𝑖𝑑𝑜

1.07 𝑚𝑔
× 100 𝑚𝑔𝑡𝑒𝑗𝑖𝑑𝑜 = 0.652 𝑚𝑔
164𝑚𝑔𝑡𝑒𝑗𝑖𝑑𝑜

II) Determinación cuantitativa de la glucosa entregada al medio de incubación por el hígado

(método GOD-PAP)
Se tomó los 3 tubos con solución de PBS (t0, t15, t30) mantenidos en hielo y se centrifugó a 10.000
rpm por 5 min. Luego, se transfirió 10 μl de cada tubo a 3 tubos rotulados respectivamente.
Paralelamente, se preparó un blanco (10 μl de solución PBS) y un patrón de glucosa (300mg/dl). Se
agregó a cada tubo, 1 ml de solución reactiva e se incubó a 37ºC por 5 min.
Finalmente, se dejó enfriar a temperatura ambiente (5 min) y leyó absorbancia a 505 nm.
El resumen de los resultados obtenidos y calculados se presenta en la tabla 2.

Tabla 2. Resumen de valores obtenidos por la determinación de glucosa.

Corte Peso de Tiempo de Absorbancia Glucosa en Glucosa µmol
tejido incubación a 505 nm los 10µL total glucosa en
(mg) (min.) (µmol/mL) formada 100mg
(µmol) tejido

1 164 0 0,553 0,0343 0,0172 0,0105

2 164 15 1,196 0,0741 0,0371 0,0226

3 164 30 1,642 0,1017 0,0509 0.0310

Patrón - - 0.968 16,67 - -

Tabla 2. Tabla de valores obtenidos en la determinación cuantitativa de glucosa por el método

GOD- PAP. El método utilizado en donde por la acción de las enzimas glucosa oxidasa y
peroxidasa, es posible medir la absorbancia del producto de las reacciones. Este compuesto
coloreado, 4-(p-benzoquinonamonoimino)-fenazona tiene su máxima absorbancia a 505nm
(absorbe en cantidad proporcional a la cantidad de glucosa presente en la muestra). Los cálculos
fueron realizados de la misma manera que para la determinación de glicógeno.
Ejemplos de cálculos:

Para cada cálculo se utilizó como ejemplo los valores del corte 1 resumidos en Tabla 1.

➢ Cálculo de concentración de glucosa en los 10 µL de solución patrón (PM glucosa = 180

g/mol):
1𝑚𝑜𝑙 1000000𝜇𝑚𝑜𝑙 300𝑚𝑔 1𝑔
∙ ∙ ∙ = 16,6 𝜇𝑚𝑜𝑙/𝑚𝐿
180𝑔 1𝑚𝑜𝑙 100𝑚𝐿 1000𝑚𝑔

➢ Ejemplo de cálculo de concentración de glucosa en los 10 µL :

𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎𝐸𝑠𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑟 × 𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖𝑜𝑛𝐸𝑠𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑟 = 𝐹𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 𝐾
µmol⁄ µmol⁄
0.968 × 16.67 𝑚𝑙 = 16,14 𝑚𝑙
0.553
𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖𝑜𝑛𝑐𝑜𝑟𝑡𝑒 1 =
µmol⁄
16.14 𝑚𝑙
µmol⁄
𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖𝑜𝑛𝑐𝑜𝑟𝑡𝑒 1 = 0.0343 𝑚𝑙

➢ Ejemplo de cálculo de glucosa total formada (en base a los 0,5 mL PBS agregados del primer
tratamiento):
µmol⁄
0.0343 𝑚𝑙 × 0,5 𝑚𝑙 = 0,0172 𝜇𝑚𝑜𝑙

➢ Ejemplo de cálculo de glucosa por cada 100mg de tejido:

𝜇𝑚𝑜𝑙𝐺𝑙𝑖𝑐ó𝑔𝑒𝑛𝑜
× 100 𝑚𝑔𝑡𝑒𝑗𝑖𝑑𝑜
𝑀𝑎𝑠𝑎𝑡𝑒𝑗𝑖𝑑𝑜
0.0172𝜇𝑚𝑜𝑙
× 100𝑚𝑔 𝑡𝑒𝑗𝑖𝑑𝑜 = 0.0105𝜇𝑚𝑜𝑙
164 𝑚𝑔𝑡𝑒𝑗𝑖𝑑𝑜

A partir de los datos calculados y resumidos en la Tabla 2. se confeccionó el siguiente gráfico.

Gráfico 1: cantidades de glicógeno por 100 mg de tejido versus cantidades de glucosa liberada al
medio por 100 mg de tejido versus tiempo.
Concentracion de glicogeno y glucosa en cortes en
higado de rata sin ayuno

µmoles de glucosa en 100 mg de tejido

mg de glicogeno en 100mg de tejido

1,8 0,035
1,6 0,03
1,4
0,025
1,2
1 0,02
0,8 0,015 Glicógeno
0,6
0,01 Glucosa
0,4
0,2 0,005
0 0
0 5 10 15 20 25 30 35
Tiempo de incubación(min)

Grafico1. Niveles de concentración de glucosa y glicógeno en cortes de hígado de rata sin ayuno.
Se graficó mg de glucógeno/100mg de tejido y µmoles de glucosa/100mg de tejido (Eje Y) versus el
tiempo de incubación (Eje X).
DISCUSIÓN

La glucogenólisis consiste en la degradación de glicógeno a glucosa mediante la acción de la

enzima fosfoglucomutasa, que cataliza la trasferencia de un grupo funcional desde una posición a
otra de la misma molécula, y de la enzima glucosa-6-fosfatasa, la cual hidroliza a glucosa-6-fosfato,
liberando finalmente glucosa y fosfato inorgánico. Esta ruta metabólica puede estudiarse in vitro
al incubar cortes de hígado, como se realizó en el práctico, en una solución salina. Producto de
esto, debiésemos observar una disminución de la concentración de glucógeno en el tejido y un
aumento en la concentración de glucosa en el medio de incubación (tampón PBS). Es decir,
debimos obtener el siguiente gráfico de ejemplo.

Grafico 2. Concentraciones de glucosa versus concentraciones de glucógeno.

Concentracion de glicogeno y glucosa

1,8 0,035
mg de glicogeno

1,6 0,03

µmoles de glucosa
1,4
0,025
1,2
1 0,02
0,8 0,015 Glicógeno
0,6 Glucosa
0,01
0,4
0,2 0,005

0 0
0 5 10 15 20 25 30 35
Tiempo de incubación(min)

Sin embargo, si observamos el Grafico 1. obtenido experimentalmente podemos notar que la

gráfica de la concentración de glucógeno aumenta y luego decae, resultado que no debió
obtenerse ya que como se ejemplifico en el Grafico 2. debimos obtener una pendiente negativa.
Creemos que puede deberse a un error en la homogenización del tejido lo que pudo provocar una
degradación de glucógeno diferente en cada tejido, que además tenían el mismo peso en mg. No
obstante, si se observa una disminución de la concentración de glucógeno al final de la grafica, por
lo que igual logramos ver que a medida que avanza el tiempo de incubación la concentración de
glucógeno disminuye ya que se degrada finalmente a glucosa en el medio de incubación.

Por otro lado, con respecto a la grafica de la concentración de glucosa obtuvimos una pendiente
ascendente, la cual concuerda con la pendiente ejemplificada en el Grafico 2. lo que nos indica
que a medida que el glucógeno del tejido se fue degradando a glucosa, está fue aumentando en su
concentración en el medio a mayor tiempo de incubación.
REFERENCIAS

Bioquímica Ilustrada Harper – Robert K. Murray – 29va Edición