PRIMERAMENTE LEA EL ARTICULO Y

REALICE UN CUADRO SINOPTICO PARA

CADA TIPO DE TINCIÒN.
http://www.microinmuno mayores que lo que son realmente, de
.qb.fcen.uba.ar/Seminario manera que las medidas de las células que

Tinciones.htm han sido fijadas o teñidas no pueden

realizarse con mucha precisión.
[Consultado el 8 de sep
2017]
La mayoría de los colorantes son
compuestos orgánicos que tienen alguna
MONDALIDAD VANCUVER
afinidad específica por los materiales
celulares. Muchos colorantes utilizados con
Técnicas de tinción.
frecuencia son moléculas cargadas
Fundamentos positivamente (cationes) y se combinan con
intensidad con los constituyentes celulares
El tamaño de la mayoría de las células
cargados negativamente, tales como los
bacterianas es tal que resultan difíciles de
ácidos nucleicos y los polisacáridos ácidos.
ver con el microscopio óptico. La principal
Ejemplos de colorantes catiónicos son el
dificultad es la falta de contraste entre la
azul de metileno, el cristal violeta y la
célula y el medio que la rodea, y el medio
safranina. Otros colorantes son moléculas
más simple de aumentar el contraste es la
cargadas negativameute (aniones) y se
utilización de colorantes. Estos pueden
combinan con los constituyentes celulares
emplearse para distinguir entre tipos
cargados positivamente, tales como muchas
diferentes de células o para revelar la
proteínas. Esos colorantes incluyen la
presencia de determinados constituyentes
eosina, la fucsina ácida y el rojo Congo.
celulares, tales como flagelos, esporas,
Otro grupo de colorantes son sustancias
cápsulas, paredes celulares, centros de
liposolubles; los colorantes de este grupo se
actividad respiratoria, etc.
combinan con los materiales lipídicos de la
célula, usándose a menudo para revelar la
Las células generalmente son tratadas para
localización de las gotículas o depósítos de
coagular el protoplasma antes de teñirlas,
grasa. Un ejemplo de colorante liposoluble
proceso llamado fijación. Para bacterias, la
es el negro Sudán.
fijación por el calor es lo más corriente,
aunque también puede fijarse con
Algunos colorantes teñirán mejor sólo
sustancias químicas como formaldehido,
después de que la célula haya sido tratada
ácidos y alcoholes. Después de la fijación, si
con otra sustancia química, que no es un
se añade el colorante, no se producen
colorante por sí mismo. Esta sustancia se
ulteriores cambios estruturales en el
denomina mordiente; un mordiente habitual
protoplasma. La fijación se realiza
es el ácido tánìco. El mordiente se combina
habitualmente en células que han sido
con un constituyente celular y lo altera de
fijadas sobre un portaobjetos, tratando
tal modo que ahora sí podrá atacar el
después éste con el agente fijador, y
colorante.
siguiendo inmediatamente el proceso de
tinción. La fijación produce habitualmente el
Si se desea simplemente incrementar el
encogimiento de las células; la tinción, por
contraste de las células para la microscopía,
el contrario, hace que las células aparezcan
son suficientes los procedimientos simples
de tinción. El azul de metileno es un buen Sobre un portaobjetos de vidrio, limpio y
colorante simple que actúa sobre todas las seco, se coloca una gota del material que se
células bacterianas rápidamente y que no va a teñir (si es líquido) o se hace rodar el
produce un color tan intenso que oscurezca hisopo con que se tomó la muestra. Una vez
los detalles celulares. Es especialmente útil que el hisopo ha tocado la superficie del
para detectar la presencia de bacterias en portaobjetos, que no está estéril, ya no
muestras naturales, puesto que la mayor puede ser empleado para inocular los
parte del material no celular no se tiñe. medios de cultivo. Puede usarse una aguja
estéril para transferir una pequeña cantidad
La tinción negativa es el reverso del de un cultivo bacteriano a la superficie del
procedimiento de tinción usual: las células portaobjetos. Este material es suspendido
se dejan sin teñir, pero se colorea en en una gota de agua o solución salina
cambio el medio que las rodea. Lo que se previamente colocada sobre el portaobjetos.
ve, por tanto, es el perfil de las células. La Cuando se trata de colonias muy pequeñas
sustancia utilizada para la tinción negativa que pueden perderse en una gota de líquido
es un material opaco que no tiene afinidad se emplea una varilla delgada de madera
por los constituyentes celulares y que estéril con la cual se toca la colonia
simplemente rodea las células, tal como la obteniéndose así una fracción apreciable del
tinta china (que es una suspensión de desarrollo. El material se frota directamente
particulas de carbono coloidal) o la nigrosina sobre el portaobjetos, donde puede
(un colorante negro insoluble en agua). La visualizarse con facilidad. El material
tinción negativa es un modo satisfactorio de colocado en el portaobjetos se deja secar al
aumentar el contraste de las células en la aire o bien se pasa varias veces por la zona
microscopia óptica, pero su máxima utilidad azul de la llama de un mechero de Bunsen
está en revelar la presencia de cápsulas hasta que el vidrio esté tan caliente que
alrededor de las células bacterianas. moleste al tacto pero no queme.

Los métodos de tinción son de gran utilidad,

pero deben usarse siempre con precaución,
ya que pueden conducir a errores. Las
Examen de muestras al
moléculas de colorante forman en ocasiones
microscopio
precipitados o agregados que parecen
estructuras celulares auténticas, pero que
Según la manipulación que efectuemos
son formaciones completamente artificiales
sobre la muestra a observar y según los
inducidas por el mismo colorante. Tales
colorantes que empleemos durante el
estructuras se denominan artefactos, y
proceso, podemos hablar de diferentes
deben tomarse muchas precauciones para
modalidades de tinción.
tener la seguridad de que no nos estamos
equivocando al creer que un artefacto es Examen microscópico directo de las
una estructura realmente existente. muestras clínicas Sin Tinción

Preparación de un frotis
 No se que todas las estructuras celulares se tiñen
utiliza con la misma tonalidad (Tinta china, Azul
ningún Metileno de Loeffler, Azul de lactofenol).
tipo de
colorante El Hidróxido de potasio al 10% (solución de
. KOH) permite ver elementos de hongos ya
que el KOH digiere parcialmente los
Es el componentes proteicos, por ejemplo de la
montaje directo húmedo o examen en célula huésped, pero no actúa sobre los
fresco: las muestras se extienden polisacáridos de las paredes celulares de los
directamente sobre la superficie de un hongos.
portaobjetos para su observación. El
material que es demasiado espeso para La tinta china o Nigrosina permite observar
permitir la diferenciación de sus elementos células levaduriformes capsuladas
puede diluirse con igual volumen de solución (C r y p t o c o c
salina fisiológica estéril. Se deposita c u s ), sobre todo en LCR. Los
suavemente un cubreobjetos sobre la polisacáridos capsulares rechazan la tinta
superficie del material. china y la cápsula aparece como un halo
claro alrededor de los microorganismos.
Este tipo de preparación se emplea para Azul de metileno de Loeffler puede
detectar trofozoítos móviles de parásitos agregarse a las preparaciones en fresco de
intestinales como heces para observar la presencia de
G i a r d i a , leucocitos.
E n t a m o e b a ,
huevos y quistes de otros parásitos, larvas y En la imagen:
gusanos adultos, C r y p t o c o c
T r i c h o m o n c u s
a s , hifas de hongos, etc n e o f o r m a n
s en una tinción con tinta china.
En la imagen:
C a n d i d a sp en un Examen microscópico de las
examen en fresco.
muestras clínicas muy modificadas
Tinción
Examen microscópico de las Diferen
muestras clínicas levemente cial
modific
adas Se
Tinción utilizan
Simple
varios
colorante
Se utiliza
s
un solo
combinad
colorante
os. Las estructuras celulares se diferencian
, por lo
en función de los diferentes colorantes que etílico/acetona. Escurrir y cubrir con
fijan de acuerdo con su propia constitución Safranina (color de contraste) durante 20
química. seg. Lavar y secar.

Los ejemplos clásicos sería la tinción de Esta tinción se denominada así por el
GRAM o la de Ziehl-Neelsen bacteriólogo danés Christian Gram, quien la
desarrolló en 1844. Sobre la base de su
En la imagen: BGN y levaduras en una reacción a la tinción de Gram, las bacterias
tinción GRAM pueden dividirse en dos grupos,
grampositivas y gramnegativas (en este
caso, los términos positivo y negativo no
tiene nada que ver con carga eléctrico, sino
microfotografía: Daniel Val
simplemente designan dos grupos
morfologicos distintos de bacterias).

Examen de muestras al Las bacterias gram-positivas y gram-

microscopio: la tinción negativas tiñen de forma distinta debido a

las diferencias constitutivas en la
GRAM
estructura de sus paredes celulares. La
pared de la célula bacteriana sirve para dar
La tinción de Gram es uno de los métodos
su tamaño y forma al organismo así como
de tinción más importantes en el laboratorio
para prevenir la lisis osmótica. El material
bacteriológico y con el que el estudiante
de la pared celular bacteriana que confiere
debe estar perfectamente familiarizado. Su
rigidez es el peptidoglicano. La pared de la
utilidad práctica es indiscutible y en el
célula gram-positiva es gruesa y consiste en
trabajo microscópico de rutina del
varias capas interconectandas de
Laboratorio de Microbiología las referencias
peptidoglicano así como algo de ácido
a la morfología celular bacteriana (cocos,
teicoico. Generalmente, 80%-90% de la
bacilos, positivos, negativos, etc) se
pared de la célula gram-positiva es
basan
peptidoglicano. La pared de la célula gram-
justament
negativa, por otro lado, contiene una capa
e en la
mucho más delgada, únicamente de
tinción de
peptidoglicano y está rodeada por una
GRAM
membrana exterior compuesta de

Descripta fosfolípidos, lipopolisacáridos, y

en forma lipoproteínas. Sólo 10% - 20% de la pared

breve, la de la célula gram-negativa es

peptidoglicano.
secuencia
de la tinción es la siguiente: el Frotis fijado
Debido a su importancia en taxonomía
con calor se tiñe 1 min con Violeta Cristal,
bacteriana y a que indica diferencias
se lava con agua, se cubre con solución
fundamentales de la pared celular de las
Yodada durante 1 min y se lava de nuevo
distintas bacterias, describiremos aquí con
con agua, decolorar con mezcla alcohol
algún detalle la tinción de Gram y las de la célula (y también puede dañar la
interpretaciones que actualmente se hacen membrana citoplásmica a la que se une
sobre el porqué de su funcionamiento. peptidoglicano). La delgada capa de
peptidoglicano es incapaz de retener el de
Las células fijadas al calor sobre un complejo cristal violeta-yodo y la célula se
portaobjetos se tiñen, primero con una decolora. Las células grampositivas, a causa
solución de cristal violeta (otros colorantes de sus paredes celulares más espesas
básicos no son tan efectivos) y son lavadas (tienen más peptidoglicano y menos lípido),
después para quitar el exceso de colorante. no son permeables al disolvente ya que éste
En este estado, todas las células, tanto las deshidrata la pared celular y cierra los
grampositivas como las gramnegativas, poros, disminuyendo así el espacio entre las
están teñidas de azul. moléculas y provocando que el de complejo
cristal violeta-yodo quede atrapado dentro
El portaobjetos se cubre entonces con una de la pared celular. Después de la
solución de yodo-yoduro potásico. El decoloración las células grampositivas son
ingrediente activo es aquí el I2 ; el KI todavía azules, pero las gramnegativas son
simplemente hace soluble el I2 en agua. incoloras.
El I2 entra en las células y forma un
complejo insoluble en agua con el cristal Para poner de manifiesto las células
violeta. De nuevo tanto las células gramnegativas se utiliza una coloración de
grampositivas como las gramnegativas se contraste. Habitualmente es un colorante de
encuentra color rojo, como la safranina o la fucsina
n en la básica. Después de la coloración de
misma contraste las células gramnegativas son
situación. rojas, mientras que las grampositivas
permanecen azules.
Se lleva a
cabo Deben destacarse algunos aspectos
después cruciales de la tinción de Gram:
la
decoloraci 1) El tratamiento con cristal violeta debe
ón, usando una mezcla de alcohol-acetona, preceder al tratamiento con yodo. El yodo
sustancias en las que es soluble el complejo por sí solo tiene poca afinidad con las
I2 -cristal violeta. Algunos organismos células.
(grampositivos) no se decoloran, mientras
que otros (gramnegativos) lo hacen. La 2) La decoloración debe realizarse con poca
diferencia esencial entre esos dos tipos de agua para evitar que pierdan la tinción las
células está por tanto en su resistencia a la células grampositivas. EI proceso de
decoloración; esta resistencia se debe decoloración debe ser corto y es esencial un
probablemente al hecho de que en el caso cálculo preciso del tiempo para obtener
de bacterias gram-negativas, la mezcla de resultados satisfactorios.
alcohol/acetona es un solvente lipídico y
disuelve la membrana exterior de la pared
3) Cultivos más viejo de 24 horas pueden aminoácidos que las gram-negativas; el
perder su habilidad de retener el complejo contenido graso es mucho más elevado en
cristal violeta - yodo. las gram-negativas que en las gram-
positivas. Este hecho se ha propuesto como
El carácter de grampositivo no es siempre explicación del mecanismo de la reacción al
un fenómeno del todo o nada. Algunos gram (ver las dos imágenes juntas).
organismos son más grampositivos que
otros y algunos son gram-variables, es
Bacteria Gram Bacteria Gram
decir, unas veces grampositivos y otras
Positiva Negativa
gramnegativos.

Morfología
ultramicroscópica de
las bacterias:
estructuras internas
Pared celular
Tiene una capa delgada
Debajo de las sustancias extracelulares, de peptidoglicano
como son las cápsulas y cubiertas (mureina) unida a una
Tiene una capa gruesa
mucilaginosas, y en la periferia de una membrana exterior por
de peptidoglicano
delicada membrana que está en inmediato lipoproteínas. La
(mureina) y dos clases
contacto con el citoplasma, se encuentra la membrana exterior está
de ácidos teicoicos. Ácido
pared celular, que es una estructura rígida hecha de proteína,
Lipoteicoico que está en
que da forma a la célula. Las paredes fosfolípido y
la superficie, empotrado
celulares pueden destruirse o romperse en lipopolisacárido. En el
en la capa de
condiciones especiales. lipopolisacárido, la
peptidoglicano y unido a
porción de lípido está
la membrana
Constituyentes importantes de la pared embebida en el
citoplásmica. Y ácido
celular son los aminoácidos, aminoazúcares, fosfolípido y el antígeno
teicoico de la pared que
azúcares y grasas. Estas sustancias O polisacárido está en la
está en la superficie y se
(proteínas, Hidratos de carbono, grasas) superficie. El lípido se
une sólo a la capa de
están enlazadas formando el polímero llama Lípido A y es
peptidoglicano. El ácido
complejo que forma la pared celular. tóxico, pero el
Teicoico es el
lipopolisacárido entero
responsable del
Entre los constituyentes de la pared celular se llama Endotoxina. La
determinante antigénico
de las bacterias Gram-positivas y Gram- pared de la célula tiene
del organismo.
negativas existen importantes diferencias. poros llamado Porines
Por ejemplo, las paredes de las bacterias para el transporte de
gram-positivas contienen menos substancias de peso
 A de diámetro, que forman una masa densa
molecular bajo. Entre la
y compacta en todo el citoplasma. Estas
membrana citoplásmica
partículas de RNA-proteína se denominan
y la pared celular hay un
ribosomas, y son el equivalente en las
espacio periplásmico con
bacterias de los microsomas, o partículas
enzimas hidrolíticas,
que se encuentran en las células animales y
enzimas inactivadoras
vegetales.
de antibióticos y
proteínas de transporte.
Estructuras Citoplasmáticas

También existen diferencias en la Nucleoide (cuerpo cromatínico)

composición de la pared entre las células de
las diversas especies. Las células bacterianas no contienen el
núcleo característico de las células de las
Membrana Citoplásmica plantas y animales superiores. Sin embargo,
(citoplasmática o protoplasmática) contienen en el citoplasma "cuerpos" que se
consideran como una estructura nuclear, el
Inmediatamente debajo de la pared celular, ADN de la célula bacteriana se encuentra
existe una membrana fina, o envoltura, que confinado en este espacio, es único y
se denomina membrana citoplásmica o circular, doble hélice sin proteínas. Como no
protoplásmica y está formada por una se trata de un núcleo discreto, se ha
bicapa de fosfolípido integral y proteínas sugerido que se dé a estas estructuras las
periféricas empotradas. La membrana denominaciones de cuerpo cromatínico,
citoplásmica tiene una significación nucleoides, equivalentes nucleares, y aun
funcional de suma importancia. Se trata de cromosomas bacterianos. Se demuestra con
una membrana semipermeable, selectiva, el método de tinción de Feulgen, específico
que controla el paso de los elementos para el DNA, y por microscopia electrónica,
nutritivos dentro de la célula y la salida de porque la sustancia nuclear es menos densa
los productos de desecho. Tiene enzimas que el citoplasma cincundante.
respiratorias y durante la división celular el
cromosoma se une a la membrana de la Ribosomas
célula en el sitio llamado Mesosoma.
Tienen estrecha relación con la síntesis de
Citoplasma proteínas (30S y 50S para formar un
complejo 70S).
El material celular contenido dentro de la
membrana citoplásmica puede dividirse en Plásmidos
tres partes, región citoplásmica, de
apariencia granular, la cual es rica en RNA, Lazos extracromosómicos de ADN, algún
región nuclear o cromatínica, que es rica en código para la resistencia a drogas, toxinas
DNA, y la parte líquida que mantiene y otros factores.
disueltos los elementos nutritivos. El RNA,
combinado con proteínas, forma partículas o Endosporas
corpúsculos macromoleculares, de unos 200
Algunas bacterias pueden transformarse en Cocos
pequeños ovoides o esferas, que son formas
celulares muy resistentes, denominadas Micrococos, aparecen aislados y dispersos
esporas, o endosporas, porque se producen tras la división celular. Diplococos, aparecen
intracelularmente. Todos los organismos de por pares. Estreptococoss, tienden a unirse
los géneros Bacillus y formando cadenas. Estafilococos, aparecen
C l o s t r i d i u en grupos irregulares, a veces de gran
m se caracterizan, en parte, por su tamaño
propiedad de producir esporas. También
tienen esta propiedad otros géneros de
bacterias verdaderas, pero sólo en casos
aislados. Las bacterias capaces de esporular
pueden crecer y reproducirse en forma de
células vegetativas durante muchas fo División a lo

generaciones. Sin embargo, en cierto r largo del mismo

División a lo
período del desarrollo del cultivo en medio m plano,
largo de 3 planos
nutritivo apropiado, se produce, dentro del a formando Divisió

citoplasma, la síntesis de nuevo es cadenas cortas n a lo

protoplasma destinado a transformarse en fé largo

espora. ric de 2
2
a: planos
coco 4 - 20
se diferen irregul
s en regular
lla tes: armen
junt cadena mente:
Tinción GRAM: Morfología m
os: s:
Tétrad
Sarcin
te:

Bacteriana a
Dipl Estrept
as
as
Estafil

C ococos
ococ ococos
oc
Ya hemos visto que la tinción de GRAM os
o
aporta dos ideas básicas para la deficinión
"taxonómica" de las bacterias: el color que
adquieren tras la tinción y la forma que Bacilos
presentan las células bacterianas.
grandes variaciones morfológicas:
En lo relativo a la coloración, ya hemos fusiformes, estreptobacilos, cocobacilos
explicado anteriormente que hablamos de
microorganismos Gram-positivos cuando
aparecen teñidos de color azul-violeta y de
Gram negativos cuando se visualizan de
color rojo-rosado.

Formas básicas en que se puede visualizar

la morfología bacteriana en una tinción Forma Dos Cadenas de Empalizada
GRAM: de vara: bacilos bacilos: s, Bacilos
 se juntos: Estreptobac lado con p n e u m o n i a
llaman Diplobacil ilos lado o en e ,
Bacilos os figuras en S t r e p t o c o
X, V o Y c c u s grupo B

Espirales (Treponemas, Borrelias ...)

Si la espiral es flexible y
Forma espiral rígida Tetradas: forma típica de
ondulada se llama:
se llama: Espirilo M i c r o c o c c
Espiroqueta
u s s p

Utilizamos el término Pleomorfismo para

referirnos a la adopción de diferentes
formas en una misma especie.

Tinción GRAM: Bacterias Bacilos Gram-positivos

Gram-Positivas

Gruesos: forma típica de

C l o s t r i d i u
Cocos Gram-positivos m s p , como C .
p e r f r i n g e n
s , C .
Racimos: forma típica de
s e p t i c u m
S t a p h y l o c
o c c u s s p , como
S . a u r e u s

Finos: forma típica de

L i s t e r i a
s p
Cadenas: forma típica de
S t r e p t o c o
c c u s s p , como
S .
 c t e r s p aparecen con
morfología de diplococos.

A c i n e t o b a
c t e r puede ser pleomórfico, y
a veces aparece como coco Gram-positivo.
Ramificados: forma típica de
A c t i n o m y c
e t e s y
N o c a r d i a , como
A .
i s r a e l i i

Cocobacilos: forma usual de

A c i n e t o b a
c t e r s p , que puede
ser Gram-positivo o Gram-negativo, y, a
menudo, Gram-variable.

gráficos obtenidos de:

http://www.uphs.upenn.edu/bugdrug/antibiot
ic_manual/gram.htm

Tinción GRAM: Bacterias Bacilos Gram-negativos

Gram-Negativas
Bacilos finos: forma usual de
enterobacteriaceae, como E .
Cocos Gram-negativos C o l i

Diplococos: forma usual de

N e i s e r i a
s p , como N .
m e n i n g i t i
d i s
Cocobacilos: forma usual de
También H a e m o p h i l
M o r a x e l l a u s s p , como H .
s p y i n f l u e n z a e
A c i n e t o b a
 los fluorocromos auramina y rodamina.
Estos colorantes se fijan a las bacterias, que
aparecen de color amarillo o naranja
brillante contra un fondo verdoso. El
permanganato de potasio, empleado como
contraste, evita la fluorescencia inespecífica.
Curvados: forma usual de Todos los microorganismos ácido-alcohol
V i b r i o s p , resistentes, incluyendo los esporozoarios
como V .
c h o l e r a e , y parásitos, se tiñen con estos colorantes.
C a m p y l o b a
c t e r s p , como Un aspecto importante de la coloración
C . j e j u n i
rodamina-auramiria es que luego los frotis
pueden ser reteñidos con la coloración de
Ziehl-Neelsen o Kinyoun directamente sobre
la tinción con el fluorocromo, si se elimina
antes el aceite de inmersión. De esta forma,
los resultados positivos pueden ser
confirmados con las coloraciones
Forma de aguja fina: forma usual de tradicionales, que además permiten la
F u s o b a c t e diferenciación morfológica.

r i u m s p
NARANJA DE ACRIDINA

El fluorocromo naranja de acridina se une al

ácido nucleico ya sea en su forma nativa o
desnaturalizada. En algunas preparaciones
de naranja de acridina, el color de la
fluorescencia puede variar, dependiendo del
pH y de la concentración. El naranja de
gráficos obytenidos de:
acridina ha sido empleado como colorante
http://www.uphs.upenn.edu/bugdrug/antibiot
vital, que da una fluorescencia verde si el
ic_manual/gram.htm
microorganismo está vivo y roja si está
muerto. De todos modos, como el colorante
se intercala en el ácido nucleico, el germen
Otras tinciones de uso viable se inactivará poco tiempo después de
habitual la tinción.

El uso de naranja de acridina para detectar

la presencia de bacterias en los
RODAMINA-AURAMINA hemocultivos ha sido ampliamente
aceptado. De hecho, una gran cantidad de
Los ácidos micólicos de las paredes celulares estudios han demostrado que la tinción de
de las micobacterias poseen afinidad para hemocultivos con naranja de acridina es tan
sensible como el subcultivo ciego para la El frotis se tiñe durante unos 5 min con
detección inicial de hemocultivos positivos. Carbolfucsina aplicando calor suave. Lavar
con agua. Decolorar con alcohol etílico 95%
ZIEHL-NEELSEN (BAAR) con un 3% de ClH concentrado. Lavar y
teñir durante 30-60 seg con Azul de
Las paredes celulares de ciertos parásitos y Metileno (color de contraste). Lavar y secar
bacterias contienen ácidos grasos (ácidos
micólicos) de cadena larga (50 a 90 átomos BLANCO DE CALCOFLÚOR
de carbono) que les confieren la propiedad
de resistir la decoloracíón con alcohol-ácido, Las paredes celulares de los hongos fijan el
después de la tinción con colorantes colorante blanco de calcoflúor aumentando
básicos. Por esto se denominan ácido- considerablemente su visibilidad en los
alcohol resistentes. Las micobacterias como tejidos y otras muestras. Según fue descrito
M . por Hageage y Harrington, este colorante se
t u b e r c u l o emplea en lugar de KOH al 10% para el
s i s y M . examen inicial de los materiales clínicos.
m a r i n u m y los También se emplea para aumentar la
parásitos coccídeos como visualización de los elementos morfológicos
C r y p t o s p o de los cultivos puros de los hongos. En
r i d i u m se caracterizan algunos laboratoríos ha suplantado al azul
por sus propiedades de ácido-alcohol de lactofenol en muchas aplicaciones. Los
resistencia. La coloración clásica de Ziehl- organismos fluorescen con luz blanco-
Neelsen requiere calentamiento para que el azulada o verde manzana, según la fuente
colorante atraviese la pared bacteriana que luminosa que se utilice.
contiene ceras.

Se ha desarrollado una coloración de ácido-

TINCIÓN DE ESPORAS
alcohol resistencia modificada que diferencia
las especies de
(WIRTZ-CONKLIN)
N o c a r d i a
(bacterias ramificadas filamentosas cuyas Algunos géneros bacterianos,
paredes celulares contienen ácidos-grasos
entre los que destacan Clostridium y Bacillus,
de unos 50 átomos de carbono), de los
producen en su interior formas de resistencia
actinomiceos (muy semejantes pero no
ácido-alcohol resistentes). denominadas endosporas. Se producen
N o c a r d i a cuando las condiciones ambientales son
s p p son decoloradas por la mezcla desfavorables (agotamiento de los nutrientes,
ácido-alcohol estándar pero no por un
temperaturas extremas, radiaciones,
tratamiento más suave con ácido sulfúrico
compuestos tóxicos, etc.) formándose una
0,5 a 1%. Estos microorganismos se
denominan ácido-alcohol resistentes espora por cada forma vegetativa. Al finalizar
parciales o débiles. el proceso de esporogénesis, la célula
vegetativa se lisa y libera la espora al
exterior. Cuando el ambiente es favorable, la Las endosporas, tras la primera
espora germina generando una nueva forma tinción, no perderán el colorante en el lavado
vegetativa. La capacidad de germinar perdura con agua, y sí lo harán las formas vegetativas,
durante años. Algunas de las bacterias que quedarán teñidas con el segundo
productoras de endosporas son patógenas colorante.
para el hombre, por lo que su estudio y
observación son de enorme interés.

OBJETIVOS

1. Observar las endosporas y su disposición en las formas vegetativas.

2. Comparar las distintas morfologías y disposiciones que adoptan las endosporas en las
especies empleadas.

MATERIAL NECESARIO

- Portaobjetos con frotis bacterianos previamente preparados.

- Colorantes:
a) Solución de verde malaquita (5%)
b) Solución de safranina (0,5%)
- Pinzas de madera
- Mechero Bunsen o de alcohol
- Microscopio y aceite de inmersión

FUNDAMENTO
Las endosporas poseen unas
cubiertas exclusivas que las hacen resistentes
a los factores ambientales adversos. Además,
estas cubiertas hacen que las esporas
aparezcan en el microscopio óptico como
estructuras refringentes y de difícil tinción.
La tinción específica de esporas
requiere dos colorantes:
1.- Verde malaquita: capaz de
teñir las esporas en caliente.
2.- Safranina: colorante de
contraste que tiñe las formas vegetativas.
 REALIZACIÓN
Se emplearán cultivos en fase
estacionaria para dar lugar a que las bacterias
produzcan las esporas. Esta tinción es
delicada en su realización y para poder
obtener unos resultados satisfactorios hay que
seguir cuidadosamente las instrucciones.
1. Preparar los frotis
bacterianos indicados.
2. Teñir con verde malaquita.
Con unas pinzas de madera colocar la
muestra encima de la llama del mechero de
forma que el colorante humee durante 5 min.
Nota: evitar que la muestra
hierva. Añadir más colorante si éste se
evapora; es importante que la muestra no se
seque.
3. Lavar con abundante agua el
exceso de colorante.
4. Teñir con safranina 1 min.
5. Lavar con abundante agua el
exceso de colorante.
6. Secar la preparación.
7. Observar la preparación al
microscopio. Anotar la disposición y la
morfología de las tres especies del género
Bacillus.
Tinción de esporas

INTERPRETACIÓN DE LOS
RESULTADOS
La posición y la morfología de la
endospora en el interior de la bacteria
constituyen un carácter taxonómico útil para
diferenciar especies dentro de un mismo
género.
 Las tres bacterias
empleadas en esta práctica

Localización y morfología de las esporas en Bacillus

difieren en la disposición y
morfología de las endosporas. B.
sphaericus posee una endospora
esférica con localización
terminal y deformante de la
célula vegetativa, por lo que
suele ser denominada "en palillo
de tambor". B. thuringiensis
tiene localizada la endospora
elipsoidal en el centro de la
célula vegetativa, lo que provoca
un abombamiento característico
denominado "en huso". B. subtilis
forma una espora cilíndrica
subterminal no deformante.

Bibliografía:

http://www.danival.org/not
asmicro/tincion/_madre_tinc
ion.html