Total Dietary Fiber

AOAC Method 2009.01

I. PREPARASI SAMPEL

- Siapkan sampel, dan hilangkan lemak menggunakan metode AOAC 985.29 jika kandungan
lemak dalam sampel yaitu ≥10%.

- Untuk sampel dengan kandungan air yang tinggi (>25%) lakukan freeze dry.

- Haluskan sampel sebanyak ±50 g pada penggiling melalui saringan 0.5 mm. Transfer semua
bahan ke tabung plasti bermulut lebar, segel dan homogenkan dengan cara digoyangkan.
Simpan pada desiccant .

II. DIGESTION ENZIM PADA SAMPEL (AOAC 2009.01)

Blank

Setiap pengujian, jalankan dua blank bersamaan dengan sampel untuk mengukur kontribusi
dari reagen terhadap residu.

Sampel

 Timbang duplo
- sebanyak 1.000 ± 0.005 g sampel secara akurat ke dalam 250 ml Fisherbrand® soda
glass, dengan mulut botol yg lebar.

 Penambahan Enzim
- Basahi sampel dengan 1.0 ml etanol
- Tambahkan 40 ml campuran pancreatic α-amylase/AMG ke masing-masing botol
- Tutup masing-masing botol
- Transfer botol ke wadah Grant OLS 200 shaking incubation bath (atau sejenisnya)
(Gambar 1) dan amankan botol ditempatnya dengan pegas pada kerangka shaker.
Alternatif lainnya menggunakan Mixdrive 15® submersible magnetic stirrer with 7 × 30
mm stirrer bars (Gambar 2).
 Gambar 1. Grant® OLS 200 shaking incubation bath at 37 oC

Gambar 2. 2mag Mixdrive 15® submersible magnetic stirrer in a custom made water
bath. Diperbolehkan mengaduk 15 sampel dengan kontrol kecepatan (170
rpm) dan 37OC.

 Inkubasi dengan pancreatic α-amylase/AMG

Inkubasi larutan pada 37oC dan 150 rpm dalam gerakan orbital menggunakan penangas
air penggetar atau pada 2mag Mixdrive 15® submersible magnetic stirrer (untuk
memastikan suspensi terbentuk maksimal) untuk lebih tepatnya selama 16 jam (misal
dari pukul 17.00 sampai 9.00 pagi.

 Adjustment pH mendekati 8.0 (pH 7.9 – 8.4), Inaktivasi enzim α-amylase and AMG
Setelah 16 jam, pindahkan semua botol sampel dari penangas air penggetar dan segera
tambahkan 3.0 ml larutan buffer tris 0.75 M untuk mengakhiri reaksi (Pada waktu yang
 bersamaan, jika hanya tersedia 1 , naikkan suhu inkubasi sampai 60oC dalam keadaan
siap untuk langkah inkubasi protease. Kendurkan tutup botol sampel dan segera
masukkan botol ke dalam penangas air (tanpa shaking) pada suhu 95oC sampai 100oC
serta inkubasi selama 20 menit dengan sesekali dikocok menggunakan tangan. Gunakan
termometer untuk memastikan suhu akhir jika isi botol (>90oC).

 Pendinginan
Pindahkan semua botol sampel dari penangas air (gunakan sarung tangan yang
memadai) dan dinginkan hingga mendekati suhu 60oC.

 Treatment Protease
Tambahkan 0.1 ml larutan protease dengan positive displacement dispenser (larutan
kental). Inkubasi pada 60oC selama 30 menit.

 Adjustment pH
Tambahkan 4.0 ml asam asetat 2 M ke masing-masing botol dan campurkan. Ini
memberikan pH akhir mendekati 4.3

 Standar Internal
Tambahkan 1.0 ml larutan standar internal D-Sorbitol (100 mg/mL) ke masing-masing
botol dan pastikan tercampur dengan baik.

PENENTUAN HMWDF (IDF plus SDFP)

a. Pengendapan SDFP
Panaskan sampel hingga mencapai suhu 60oC dan tambahkan 192 ml (diukur pada suhu
ruang) Etanol 95% (atau IMS) panaskan hingga mencapai suhu 60 oC. Aduk rata dan
biarkan endapan terbentuk pada suhu kamar selama 60 menit.

b. Pengaturan Filtrasi
Tera krusibel yang mengandung Celite1 hingga mendekati 0.1 mg. Basahi dan
redistribusi tempat Celite di wadah menggunakan 15 ml Etanol 78% (v/v dari botol
pencuci. Apilkasikan penyedot ke wadah (Gambar 3).
Catatan : 1Note: Gooch, fritted disk, Pyrex® 50 mL, pore size coarse, ASTM 40-60 µm,
Corning® No. 32940-50C or equivalent
 Gambar 3. Labu Buchner, cawan (a), karet lengan (b), pengatur jenis vakum untuk
penyaringan (c), botol sampel dan batangkaca berkaret (d)

c. Filtrasi
Saring endapan (hasil step a) menggunakan vakum dan cawan. Gunakan botol pencuci
dengan Etanol 78%, transfer secara kuantitatif semua partikel yang tersisa ke cawan.
Simpan filtrate dan pencucian dan lanjutkan ke langkah penentuan SDFS [I (a)]

d. Pencucian
Cuci residu secara berurutan dengan 2 bagian 15 ml dari Etanol 78% (v/v), 95% (v/v)
Etanol dan aseton menggunakan vakum

e. Pengeringan Cawan
Keringkan residu semalaman di dalam oven pada suhu Containing residue overnight in
105oC.

f. Pendinginan cawan di desikator

Masukkan cawan ke dalam desikator selama ± 1 jam. Timbang berat cawan yang
mengandung residu serat pangan dan Celite yang mendekati 0.1 mg. Untuk
memperoleh jumlah residu, tera penimbangan wadah yaitu dengan menimbang cawan
kering beserta celite.
g. Penentuan Protein dan Abu
i. Residu dari cawan pertama dianalisa untuk protein dan residu pada cawan kedua
dari sampel duplo dianalisa untuk kadar abu. Lakukan analisa protein
menggunakan Kjeldahl atau metode pembakaran (Peringatan : celite yang
diuapkan dari sampel dapat menyumbat saluranunit transfer). Gunakan faktor
6.25 untuk menghitung mg protein.

ii. Untuk analisa abu, bakar residu pada cawan kedua selama 5 jam pada 525 oC.
Kemudian dinginkan di dalam desikator dan timbang hingga perbedaannya
paling tidak 0.1 mg dari penimbangan sebelumnya.

h. Penentuan HMWDF
Kurangi abu dan protein dari berat residu rata-rata dan lanjutkan ke langkah [J] untuk
menghitung HMWDF

i. Penentuan SDFS
Catatan : Deionisasi yang tepat adalah bagian penting untuk mendapatkan data
kromatografi berkualitas pada SDFS
Untuk mengetahui tentang bentuk puncak garam dalam kromatogram SDFS, larutkan 10
mg NaCl dalam 9 ml air deionisasi dan tambahkan 1 ml standar internal 100 mg/mL
standar internal HPLC D-Sorbitol dan lanjutkan ke langkah [I(b)] pada “Transfer 2 ml
larutan tersebut…”. Kromatogram HPLC larutan ini seharusnya menunjukkan tidak ada
puncak pada rentang waktu yang sesuai dengan karbohidrat DP3 atau lebih besar.
a. Filtrasi recovery dan konsentrasi
- Sisihkan filtrate dari salah satu sampel duplo [G(c)] untuk digunakan jika terjadi
tumpahan atau jika data duplo SDFS diinginkan.
- Pindahkan satu setengah filtrat [G(c)] dari sampel duplo lain ke dalam 500 ml
labu evaporator dan uapkan hingga kering dibawah vakum pada suhu 60oC.

b. Deionisasi sampel
- Tambahkan 5 ml air deionisasi ke labu evaporator dan aduk labu selama 2
menit untuk melarutkan sampel.
- Transfer larutan ke wadah polypropylene 20 ml yang dapat ditutup.
- Transfer 2 ml larutan tersebut ke bagian atas kolom sekali pakai Bio-Rad yang
masing-masing mengandung 4g yang disiapkan dan dicampur yaitu Amberlite
FPA 53 (OH-) dan Ambersep 200 (H+) (Gambar 4).
 Gambar 4. Deionisasi sampel dengan mixed bed resin (~4 g Amberlite® FPA53
(OH-) dan ~4 g Ambersep® 200 (H+) pada Bio-Rad, Econo-Pac
Disposable Chromatography Columns connected to a Gilson Miniplus®
Evolution pump.

- Elusi kolom pada laju alir 1.0 ml/menit ke dalam botol Duran®. Ketika sampel
sudah memasuki resin, tambahkan 2 m air destilat ke resin dan biarkan meresap.

- Tambahkan ±20 ml air deionisasi melalui bagian atas kolom dan terus
mengelusi dengan laju alir 1.0 ml/menit. Pindahlan eluat ke labu bagian bawah
rotary evaporator dan uapkan hingga mongering dibawah wakum 60oC.

- Tambahkan 2 ml air deionisasi ke labu dan ulangi sambil diaduk dengan

memutar-mutar labu selama 2 menit.

-Gunakan pipet Pasteur, transfer larutan ke wadah polypropylene

c. Preparasi sampel untuk analisa HPLC

- Transfer larutan ke syringe 10 ml dan saring melalui saringan 0.45 µm
- Gunakan syringe kaca HPLC 100 µL untuk mengisi loop injector 50 µL pada
HPLC.
- Lakukan langkah tersebut secara duplo.

- Kondisi pengukuran diantaranya :

Kolom : Waters Sugar-Pak (6.5 × 300 mm)
Pelarut/Fase Gerak : Air destilat mengandung Na2Ca-EDTA (50 mg/L)
Laju Alir : 0.5 ml/menit
 Suhu : 90oC

d. Penentuan response factor D-glucose

Since D-glucose provides an LC refractive index (RI) response equivalents to the
response factor for the non-digestible oligosaccharides that make up SDFS the LC
is calibrated using D-glucose and the response factor is used for determining the
mass of SDFS. Use a 100 µL LC syringe to fill a 50 µL injection loop for each
standard D-sorbitol/D-glucose solution. Inject in triplicate.
Obtain the values for the peak areas of D-Glucose and internal standard from the
3 chromatograms. The reciprocal of the slope obtained by comparing the ratio of
peak area of D-glucose/peak area of D-Sorbitol internal standard (y-axis) to the
ratio of the mass of D-glucose/mass of D-sorbitol (x-axis) is the “response
factor)”. Determine the average response factor (typically 0.97 for D-sorbitol.
- Karena D-glukosa memberikan respons ekuivalen indeks bias LC (RI) yang setara
dengan faktor respons untuk oligosakarida yang tidak dapat dicerna yang
membentuk SDFS, HPLC dikalibrasi menggunakan D-glukosa dan faktor respons
digunakan untuk menentukan massa SDFS.

- Gunakan jarum suntik 100 μL LC untuk mengisi loop injeksi 50 μL untuk setiap
larutan standar D-sorbitol / D-glukosa. Inject sebanyak 3 kali ulangan.

- Dapatkan nilai untuk area puncak D-Glukosa dan standar internal dari 3
kromatogram. Kebalikan dari lereng diperoleh dengan membandingkan rasio
luas puncak D-glukosa / luas puncak standar internal D-Sorbitol (sumbu y)
dengan rasio massa D-glukosa / massa D-sorbitol (x- sumbu) adalah "faktor
respons)".

- Tentukan faktor respons rata-rata (biasanya 0,97 untuk D-sorbito)

Response factor (Rf) = (PA-IS) / (PA-Glu) × (Wt-Glu / Wt-IS)

Keterangan :
PA-IS = Puncak Area internal standar (D-sorbitol)
PA-Glu = Puncak area D-glucose
 Wt-Glu= massa standar D-glucose
Wt-IS = massa standar D-sorbitol

e. Penentuan puncak area SDFS (PA-SDFS) dan internal standar (PA-IS) pada
kromatogram ekstrak sampel
Inject ekstrak sampel [I(c)] pada HPLCC Catat area semua puncak DP lebih besar
dari titik demarkasi DP2/Dp3 sebagai PA-SDFS. Catat area puncak standar
internal sebagai (PA-IS)

j. Perhitungan untuk HMWDF, IDF AND SDFP :

Penentuan Blank (B) (mg) :
𝑩𝑹𝟏+𝑩𝑹𝟐
= − 𝑷𝑩 − 𝑷𝑨
𝟐

Keterangan :
BR1 and BR2 = massa residu (mg) masing-masing untuk penentuan blank secara duplo
PB and PA = massa protein dan abu (mg) yang ditentukan pada residu blank pertamba
dan kedua
 HMWDF, IDF or SDFP (mg/100 g) :

𝑹𝟏+𝑹𝟐
−𝑷𝑩−𝑷𝑨−𝑩
𝟐
= 𝑴𝟏+𝑴𝟐 × 𝟏𝟎𝟎
𝟐

Where :
R1 = massa residu 1 dari M1 (mg)
R2 = massa residu 2 dari M2 (mg)
M1 = test portion mass 1 (g)
M2 = test portion mass 2 (g)
PA = massa abu dari R1 (mg)
PB = massa abu dari R2 (mg)

HMWDF (%) = HMWDF (mg/100g)/1000

k. Perhitungan SDFS :

SDFS (mg/00 g) = Rf × (Wt-IS, mg) × (PA-SDFS)/(PAIS) × 100/M

Where :
Rf = response factor

Wt-IS = berat standar internal yang terkandung dalam 1 ml larutan standar internal
yang dipipet ke dalam campuran sampel (100 mg)

PA-SDFS =puncak area internal standar (D-sorbitol)

M = massa bagian uji (M1 atau M2) dalam gram sampel yang filtratnya dipekatkan
dan dianalisis dengan HPLC

l. Perhitungan TDF :
Integrated TDF (%) = HMWDF (%) + SDFS (%)