LAS BACTERIAS ACÉTICAS

M. Carmen Polo y Angel A. Sánchez-Luengo

Instituto de Fermentaciones Industriales (CSIC)
c/Juan de la Cierva, 3. 28006 Madrid
1. Introducción
El vinagre ha sido utilizado por el hombre desde tiempos remotos, obteniéndolo de forma
empírica de cualquier sustrato que contuviera alcohol, pero sin que se sospechara que fueran
unos microorganismos los responsables del proceso de acetifi-cación. Desde los primeros
estudios biológicos del velo que oca-sionalmente se forma en las bebidas alcohólicas de baja
gra-duación, llevados a cabo por Persoon en 1822 (1), hasta los más recientes, encaminados a la
búsqueda de cepas más resis-tentes a elevados contenidos de ácido acético o a temperaturas
altas, o a la utilización de células inmovilizadas sobre soportes adecuados, se ha recorrido un
largo camino. Son numerosos los investigadores que han estudiado estos micoorganismos tanto
desde el punto de vista taxonómico como el de su capacidad de mutación, propiedades
bioquímicas, aislamiento y purificación de sus enzimas, etc. En este capítulo, se hace una
revisión de las distintas posiciones taxonómicas que han ocupado estas bacterias a lo largo de la
historia, de su capacidad de mutación discutida por algunos autores, y de ciertos aspectos de su
metabolismo. Se dan algunos medios adecuados de cultivo para su aisla-miento y se indica la
forma de realizar las pruebas fisiológicas para su caracterización siguiendo la 9.2 edición del
Manual de Bergey.
2. Nomenclatura de las bacterias acéticas
El primer estudio biológico de los velos que ocasionalmente se forman en las bebidas
alcohólicas de baja graduación, como hemos dicho anteriormente, fue realizado por Persoon en
1822, quien propuso para estos microorganismos el nombre de Mycoderma. Pasteur que en
1868 hizo el primer estudio sistemático sobre la fermentación acética, reconoció que la «madre
del vinagre» era una masa de organismos vivos que producían la fermentación acética y que ésta
no era posible si no estaba presente el Mycoderma aceti.
Más tarde se propusieron los nombres de Termobacterium, Bacterium, Bodas, Acetobacterium,
etc. La designacion gené-rica de Acetobacter, utilizada hoy día universalmente, fue sugerida por
Beijerinck en 1900 (1). Más tarde Asai en 1935 (1) propuso dos nombres genéricos para dividir
las bacterias acéticas: Acetobacter y Gluconobacter gen. nov. perteneciendo a este último sólo
las bacterias que tenían cierta capacidad para oxidar el etanol y cuya acumulación de ácido
glucónico era muy elevada. También han sido propuestas diferentes familias para albergar al
género Acetobacter. En la 7.' edición del Manual de Bergey (2), los géneros Acetobacter y
Glucono-bacter se incluyen en la familia Pseudomonadaceae, pero a raíz del descubrimiento de
Leifson sobre la flagelación (Acetobacter, cuando tiene flagelos son siempre peritricos),
Acetobacter fue excluido de esta familia, especificándose en la 8' edición del Bergey (3) que la
familia Pseudomonadaceae sólo incluye el. género Gluconobacter mientras que Acetobacter
queda como un género de filiación incierta.
En la 9na edición el Bergey (4) aparece de nuevo la familia Acetobacteriaceas con dos géneros:
Acetobacter que tiene la capacidad de oxidar el lactato o el acético a CO2 y si son móviles tiene
flagelos peritricos, y Gluconobacter que no oxida el lactato o el acético a CO2, y si son móviles
tiene flagelos polares.
3. Clasificaciones propuestas
La clasificación taxonómica tradicional de los microorganismos se ha visto sometida
continuamente a reordenaciones y cambios debido a que se basaba fundamentalmente en
criterios morfológicos y fisiológicos.
El primer taxonomista de este grupo de bacterias fue el científico francés Louis Pasteur (siglo
XVIII); estudiando el método de Orleáns para la producción de vinagre demostró que, tras una
primera oxidación en la que el etanol se transformaba a ácido acético, éste podía sufrir una
segunda oxidación transformándose en dióxido de carbono y agua. Este resultado llevó a
Pasteur a formular la implicación de estos microorganismos en el proceso, confirmando la
existencia de Mycodema aceti que había sido descrita por Persoon en 182263, ya que el proceso
de fermentación no es posible si no está presente el Mycoderma aceti.
Más tarde propusieron los nombres de Termobacterium, Bacterium, Bacilus, Acatobacterium,
etc. Posteriormente, en 1894, Hansen observó que la microbiota que transforma el alcohol en
ácido acético, no es pura, sino que está formada por varias especies que reaccionaron con el
yodo, en concreto, distinguió cuatro especies: Bacterium aceti, Bacterium pasteurianum,
Bacterium kutzingianum y Bacterium xilynum64. Pero no fue hasta 1900 cuando Beijerinck
propuso el género Acetobacter, utilizado hoy día universalmente para estos microorganismos,
tras realizar una clasificación basándose en los hábitats donde se encuentran las bacterias y en
su capacidad de fijar nitrógeno inorgánico.
El primero en proponer una clasificación basada en criterios bioquímicos y fisiológicos para
este género fue Vissert Hooft (1925). Secuencialmente, Asai (1934-1935) realizó la propuesta
de una clasificación de las bacterias acéticas en dos géneros: Acetobacter y Gluconobacter gen.
nov. La diferencia entre estos dos géneros se basa fundamentalmente en características
fisiológicas, aunque también existen diferencias citológicas, pues Acetobacter tiene la capacidad
de oxidar el etanol a ácido acético y, posteriormente, puede completar la oxidación del ácido
acético a agua y dióxido de carbono y, además, pueden tener flagelos peritricos, mientras que el
género Gluconobacter no puede realizar la oxidación del ácido acético y pueden presentar
flagelos polares.
Fue Frateur (1950) quien formuló una clasificación basada principalmente en criterios
bioquímicos: la producción de catalasa, oxidación de acetato y lactato a carbonato, formación de
compuestos cetónicos, producción de ácido glucónico y capacidad de crecer en un medio con
alcohol y sales de amonio como única fuente nitrogenada (medio Hoyer). Básicamente este
criterio de clasificación ha dividido el género Acetobacter en cuatro grupos: Peroxydans,
Oxydans, Mesoxydans y Suboxydans, el nombre de cada grupo indica su mayor o menor
capacidad para realizar la oxidación del etanol a ácido acético.
Leifson (1954) agrupó estas bacterias acéticas según si tenían flagelos perítricos y si eran
capaces de oxidar etanol en el género Acetobacter, y si tenían flagelos polares y eran incapaces
de llevar a cabo la completa oxidación en el género Gluconobacter.
Las claves taxonómicas de las bacterias han sido históricamente recogidas en el Manual de
Bacteriología Sistemática de Bergey. En su novena edición67, algunas técnicas moleculares han
sido incluidas como la composición de ácidos grasos, electroforesis de proteínas solubles, % del
contenido de G+C, e hibridación ADN-ADN. Los géneros Gluconobacter y Acetobacter han
sido incluidos en la familia de las Acetobacteraceae. El género Acetobacter estaba compuesto
por cuatro especies: A. aceti, A. pasteurianus, A. liquefaciens y A. hansenii. El género
Gluconobacter sólo consistía en G. oxydans.
4. Metabolismo de las bacterias acéticas
Los aspectos bioquímicos de las bacterias acéticas no han sido tan extensamente estudiados
como, por ejemplo, los de las levaduras de cervecería, los de las bacterias lácticas o los de la
exhaustivamente estudiada Escherichia coli. No obstante, existen numerosos trabajos sobre el
metabolismo de estas bacterias.
A continuación, se hace una revisión de algunos de los aspectos del metabolismo de las
bacterias acéticas, basado fundamentalmente en los trabajos realizados por los grupos japoneses
del Departamento de Química Agrícola de la Uni-versidad de Yamaguchi y del Departamento
de Cervecería de la Universidad de Agricultura de Tokio.
En primer lugar, conviene destacar que el metabolismo de las bacterias es respiratorio, es decir,
el oxígeno es el aceptor final de electrones; son aerobios estrictos, siendo para ellos el oxígeno
molecular un nutriente esencial.
4.1. Metabolismo del etanol
La oxidación del etanol por Acetobacter se realiza en dos etapas, como ya puso de manifiesto
Hennenberg en 1897 para Acetobacter industrian. En la primera etapa se oxida el etanol a
acetaldehido y en la segunda el acetaldehido a ácido acético.
El esquema de oxidación del etanol por Acetobacter pro-puesto por Nakayama (18) que
confirma esta hipótesis, se muestra en la figura 1.

El etanol es oxidado a acetaldehido por E, y los electrones resultantes son aceptados por el
grupo hierro-hemo del cito-cromo 553 del enzima. El acetaldehido así formado, continúa
oxidándose vía E2 o E3. Por la primera vía, los electrones liberados del acetaldehido se
transfieren al hemo unido a E1, eso es, al citrocromo 553, y por la segunda reducen el NADP.
El NADH2 producido por E3 evita que la oxidación del acético continúe a través del ciclo de
los ácidos tricarboxilicos. El pH óptimo de E, y E2 también favorece la acumulación de ácetico
por especies de Acetobacter.
Cuando una suspensión de células se somete a ultrasonido y se centrifuga a 6.000 g durante 60
minutos, se separan dos fracciones, el sedimento y el sobrenadante. Al sobrenadante se le llama
«extracto crudo» y la suspensión del sedimento en un tampón recibe el nombre de «fracción de
sedimento». Si el extracto crudo se somete a centrifugación a 100.000 g durante 60 minutos, se
obtienen de nuevo dos fracciones, el sedimento o «fracción particulada» y el sobrenadante o
«fracción solu-ble». Nakayama (19) demuestra que los dos tipos de deshi-drogenaras están
localizados tanto en la fracción soluble como en la particulada.
La alcohol deshidrogenasa de la fracción soluble está ligada a NAD y según algunos autores a
NADP, opinión con la que no está de acuerdo Nakayama.
La alcohol deshidrogenasa particulada, considerada como uno de los principales enzimas para la
producción de ácido acético, está ligada al citocromo 553, de ahí su nombre de «alcohol-
citocromo 553 reductasa». Este enzima es activo a pH ácido, siendo su pH óptimo alrededor de
4.
Hay al menos dos aldehido deshidrogenasas solubles, uno ligado a NADP y el otro a NAD. Al
parecer, el metabolismo del acetaldehido en células no viables parece estar catalizado por
enzimas ligados a NAD y no a NADP. Hay además un aldehido deshidrogenasa coenzima y
independiente localizado en las dos fracciones, soluble y particulada, pero que se da
principalmente en la particulada.
Murakoa (20) apoya la propuesta de Shinagawa (21) de que las alcohol y aldehido
deshidrogenasa están localizadas en la superficie externa de la membrana citoplasmática, en
contacto con el medio de cultivo donde el ácido acético se acumula rápidamente.
La actividad relativa de los enzimas alcohol y aldehido deshidrogenasas particuladas ha sido
determinada por Divies (22). Midiendo la radioactividad del etanol marcado y el oxigeno
consumido ha comprobado que la ADH se inhibe cuando aumenta el acetaldehido, pero a su vez
la acetaldehido deshidrogenasa se activa cuando la concentración de acetalde-hido es mayor de
8 milimoles/litro, desapareciendo el acetal-dehido acumulado y desinhibiéndose la alcohol
deshidrogenasa. Cuando el medio se empobrece en oxígeno, el acetaldehido se acumula en el
medio de cultivo y su oxidación se inhibe junto con la del etanol.
El ácido acético también inhibe la alcohol deshidrogenasa y la aldehido deshidrogenasa. Su
poder inhibidor es mucho más importante en los extractos que en las células enteras. También
afecta de forma diferente a las formas proliferantes que a las no proliferantes actuando como un
inhibidor más potente en estas últimas.
La actividad de la alcohol deshidrogenasa particulada es 300 veces mayor que la de la fracción
soluble (23); ésto unido a que el pH óptimo de la primera es 4 y el de la segunda
aproximadamente 8, apoya el criterio de que la «particulada» es la que tiene realmente
importancia en el proceso de la acetificación.
La alcohol y aldehido deshidrogenasa se inducen por el etanol, es decir, son más activas cuando
las células se cultivan sobre etanol que cuando lo hacen sobre lactato o sobre glucosa siendo
más induciblei los enzimas particulados que los solubles.
Las bacterias acéticas del género Acetobacter son capaces de oxidar el ácido acético a CO2 +
H2O a través del ciclo de Krebs o por el ciclo glioxílico. Divies (22) ha demostrado con
Acetobacter rances que, en un medio de cultivo a base de extracto de levadura y etanol, el 60%
del carbono de las células proviene del etanol. En las primeras horas del cultivo se asimila el
acetato, después se oxida. El etanol inhibe la síntesis de los enzimas que intervienen en la
oxidación del acetato; cuando todo el etanol del medio se transforma en ácido acético aumenta
por tanto la capacidad de oxidar el acetato.
4.2. Metabolismo de los hidratos de carbono
La oxidación del etanol caracteriza a las bacterias acéticas pero también muchos carbohidratos y
alcoholes primarios y secundarios pueden servir como fuentes de energía, acumu-lándose
temporal o definitivamente productos orgánicos par-cialmente oxidados.
Los azúcares son oxidados a CO2 exclusivamente a través de la vía de las pentosas fosfato; la
ruta de Entner-Doudoroff común en los aerobios quimioheterótrofos, no opera en este grupo.
También es inusual en estas bacterias el metabolismo del pirúvico, ya que mientras que en la
mayoría de los aerobios el pirúvico es oxidado a acetil-Co A y CO2, las bacterias acéticas lo
descarboxilan no oxidativamente a acetaldehido. El acetaldehido es el primer intermediario en
la degradación del etanol, como hemos visto antes; hay, por tanto, una con-vergencia metabólica
en este punto entre la oxidación de los sustratos metabolizados a través del pirúvico y la
oxidación del etanol (Fig. 2).
En el Departamento de Química Agrícola de la Universidad de Yamaguchi de Japón, han
trabajado sobre el estudio de las rutas metabólicas de los carbohidratos en Acetobcter y
Gluconobacter, y la caracterización de los enzimas responsables de la formación de los ácidos
glucónicos y 2 y 5 cetoglucóni-cos, (24, 25). Dividen estos enzimas en dos grupos, en base a sus
propiedades catalíticas y fisiológicas y a su localización en los microorganismos. Un grupo
NADP dependiente cetoglu-conato reductasa está presente en la fracción soluble de las
bacterias, el otro grupo es el de las deshidrogenasas particula-res estrechamente ligadas a los
componentes de la membrana celular.
Sugieren estos autores que la gluconato deshidrogenasa particulada tiene como función producir
cetogluconatos como reserva extracelular de fuente de carbono, mientras que las NADP
reductasas ligadas tiene otro papel: el de suministrar a las células una fuente de energía.
Aseguran que el metabolismo del cetogluconato es único e intrínseco en las bacterias acéticas,
por lo que la presencia de 2 cetogluconato reductasa y 5 ceto-gluconato reductasa es una clave
útil para la clasificación de las bacterias acéticas.
4.3 Formación de acetoína.

El primero en revelar la formación de acetoína por parte de las bacterias acéticas fue Kitasato
en 1929, usando piruvato como sustrato.

El pirofosfato de tiamina (ThPP) favorece la producción de CO2 y la síntesis de acetoína a partir

de piruvato. Cuando adicionamos acetaldehído al piruvato en condiciones anaerobias, se
incrementa la formación de acetoína pero no la producción de CO2, lo que apoya la teoría de
que la acetoína se forma por reacción entre el acetaldehído y el aldehído ThPP.

2 Piruvato + 2 ThPP 2 Aldehido  ThPP + 2 CO

Aldehido - ThPP  CH-CHO + ThPP

Aldehido + ThPP + CH-CHO  Acetoína + ThPP

La producción de acetoína en presencia de etanol se incrementa por la adición de piruvato y

lactato. Es mayor la formación de acetoína cuando se añade al medio glicerina, succinato,
malato, fumarato o oxalacetato en presencia de etanol que cuando el etanol no está presente.
Al parecer estas fuentes carbonadas podrían ser metabolizadas a piruvato y éste a su vez
reaccionaría con acetaldehído formado a partir del etanol, para dar acetoína. La adición de
acetato, acetaldehído, gluconato, citrato y α-cetoglutarato, no incrementan la producción de
acetoína.
Bibliografía
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