UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLARREAL

FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES Y MATEMÁTICA

Escuela Profesional de biología

REPORTE N°: 3

CURSO: Bioquímica I

TEMA: Centrifugación

INTEGRANTES:

CÓDIGO APELLIDOS Y NOMBRES CORREO ELECTRÓNICO

2016004294 Cabrejos Rueda, Sandra sandra160797@hotmail.com

2016003849 Bolivar Quispe Sara sarabolivarquispe@hotmail.com

2016010346 Enriquez Marin, Alison. Enriquezmarin1218@gmail.com

DOCENTE:

Blgo. Erick Mercado

Semestre 2019 – I
 INTRODUCCIÓN

La centrifugación y la ultracentrifugación son métodos por los cuales se acelera la

sedimentación de una sustancia aplicándole una fuerza centrífuga. Este proceso permite
separar materiales de distintas densidades por medio de la utilización de centrifugas o
ultracentrífugas.

Las centrifugas son instrumentos de laboratorio que permiten someter distintas

sustancias a fuerzas que producen la sedimentación. El componente más importante en
la centrifuga es el rotor, que es el dispositivo que gira y en el cual se colocan los tubos
de ensayo con las sustancias a trabajar.

Existen distintos tipos de centrifugas según su velocidad las principales son: Centrifugas
corrientes (8000-10 000 rpm), Súper-centrífuga (10 000-20 000 rpm), Ultracentrífugas
(Hasta 100 000 rpm).

El tipo de centrifugación que usaremos en la siguiente práctica es la centrifugación

diferencial, aplicada comúnmente para el fraccionamiento celular. Esta técnica consiste
principalmente en realizar una serie de centrifugaciones empezando a velocidades bajas
e ir quitando en cada centrifugación el sobrenadante para seguir centrifugándolo a
mayor velocidad.

Esta centrifugación nos permite separar los componentes subcelulares por densidad para
su posterior identificación. Además, se logrará calcular el coeficiente de sedimentación
determinado por el cociente entre la velocidad de sedimentación y la aceleración
aplicada.
MUESTRA(S) UTILIZADA(S):

 Hojas de espinaca fresca  Solución amortiguadora de Tris-

NaCl con Tritón X-100 al 2%
 Centrífuga
 Pipetas
 Tubos falcon
 Probeta
 Gasa

 Solución amortiguadora de Tris-

NaCl con urea 6M

METODOLOGÍA

1. Aislamiento de la Fracción de Cloroplastos

Se pesó 1 g de hojas de espinaca y se cortó en trozos evitando tomar las nervaduras

gruesas. Luego se colocó en el mortero 10 ml de la solución amortiguadora (ya sea Tris
NaCl-Urea o Tris NaCl-Tritón) junto con los trozos de espinaca y se procedió a
machacar hasta obtener una mezcla homogénea. Se filtró la mezcla por varias capas de
gasa en un tubo de centrifuga. Se centrifugaron los tubos a 200g (convertidos a rpm en
los resultados) por un minuto colocando siempre un tubo con agua de contrapeso. Una
vez centrifugada la solución, se retiró el sobrenadante y se colocó en otro tubo falcon.
Ya retirado el sobrenadante, se volvió a centrifugar a 1300g (convertidos a rpm en los
resultados) por cinco minutos. Se midió las distancias del pellet (A) y del sobrenadante
(B). Se anotó los datos ya que estos se utilizarán para hallar el coeficiente de
sedimentación. Se extrajo el sobrenadante con ayuda de una pipeta Pasteur dejando solo
el pellet para añadirle 10 ml de la solución amortiguadora fría de Tris-NaCl con la que
se trabajó inicialmente para luego agitar dicha solución en el tubo falcon. Finalmente
colocar una gota en la lámina portaobjetos, observar al microscopio y anotar los
resultados.

Fotografía 1, 2 y 3 – Se observa el proceso de trituración de la espinaca y el proceso de filtración

por varias capas de gasa de la solución obtenida en el mortero (1 g de espinaca añadido con 10 ml
de la solución amortiguadora de Tris-NaCl con urea o Tris-NaCl con tritón).
Fotografía 4 – Se realizó la Fotografía 5 – Decantación del
primera centrifugación de nuestra sobrenadante a otro tubo falcon
mezcla a 200 g por 1 minuto. para centrifugarlo a 1300g por 5
minutos.

Fotografía 6 – Solución de
espinaca con Tris-NaCl con tritón (a
la derecha) y tubo falcon con agua
que sirve de contrapeso.

Fotografía 7 – Sobrenadante y
pellet después de la segunda
centrifugación, de la solución de
espinaca con Tris-NaCl con urea.

Fotografía 8 – Solución de 10 ml de Tris-

NaCl (con urea o tritón, dependiendo de la
muestra) en una probeta siendo añadida al
pellet de la segunda y última centrifugación
para agitarlo, homogeneizarlo y observar al
microscopio.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN

I. Determinación de las velocidades de centrifugación requeridas para el

aislamiento de cloroplastos.

Radio del rotor RPM para 200 g RPM para 1300 g

9 1409.849 3594.42

𝑹𝑪𝑭
Fórmula: 𝒓𝒑𝒎 = √𝟏.𝟏𝟏𝟖 ×𝟏𝟎−𝟓 × 𝒓

Reemplazando:

200
 𝑟𝑝𝑚 = √1.118 × 10−5 × 9 = 1409.849781

1300
 𝑟𝑝𝑚 = √ = 3594.425773
1.118 × 10−5 × 9

II. Aislamiento de la Fracción de Cloroplastos

Anote las observaciones de los tubos de centrifuga en las dos preparaciones

Tris-NaCl-Tritón-X-100
Tris-NaCl-Úrea (Hipotónico)
(Hipertónico)

Antes de centrifugar: Antes de centrifugar:

V= 6 ml V= 7 ml
Después de centrifugar (distancias Después de centrifugar (distancias
medidas): medidas):
A= 0.4 cm A= 0.5 cm
B= 4.5 cm B= 6 cm

Donde:

A= distancia en cm desde el extremo inferior del tubo de centrifuga al tope de pellet

B= distancia en cm entre el nivel superior de la muestra centrifugada y el nivel superior

del pellet
III. Observación Microscópica de la Fracción de cloroplastos

Fotografía 9 - Aumento 100X (Solución Fotografía 10 - Aumento 100X (Solución

hipotónica: Tris-NaCl-Úrea) hipertónica: Tris-NaCl-Tritón-X-100)

Fotografía 11 - Aumento 400X (Solución Fotografía 12 - Aumento 400X (Solución

hipertónica: Tris-NaCl-Urea) hipertónica: Tris-NaCl-Tritón-X-100)
Examine los cloroplastos. Mencione el efecto de la úrea y el tritón-X-100 sobre los
cloroplastos. Discuta sus resultados.

El tritón X-100 es un detergente no iónico que altera la estructura de la membrana si es

usado extensamente, ya que en menor exposición no produce efectos graves en la
estructura del tejido. Por lo que comparados con los detergentes aniónicos y catiónicos
el Tritón X-100 es un detergente calificado como “suave” por no producir generalmente
cambios conformacionales drásticos ni efectos desnaturalizantes en las proteínas.
(García de Gurtubay y García, 1979).

Estos detergentes rompen las interacciones lípido-lípido y lípido-proteína que

conforman la bicapa lipídica produciéndose un rompimiento en la membrana.

La urea es utilizada para desnaturalizar proteínas, alguna de las cuales salen de la

membrana de los cloroplastos.

Mediante las observaciones en el microscopio a un aumento de 100X y 400X se puede

comprobar que efectivamente, la urea es una solución hipotónica (es decir, que la
concentración es menor en el medio externo que en el medio interno de la célula) ya que
atraviesa por difusión simple la membrana de los cloroplastos, y por ende ingresa agua
a las células provocando que éstas se hinchen y aumenten su volumen. Este fenómeno
en una célula vegetal es también conocido como turgencia.

En la solución hipertónica de Tritón-X-100, observamos una clara deformación de los

cloroplastos surgiendo el fenómeno de plasmólisis que se produce cuando las
condiciones del medio celular son hipertónicas, es decir, que tienen una concentración
mayor que la que existe en el interior celular ocasionando que la célula se deshidrate, se
arruge y deforme. Esto es debido a que el Tritón X-100 puede disolver proteínas en el
caso de los cloroplastos son afectadas las porinas de la membrana externa y luego
afectando la vacuola y a toda la célula en general. (Lodish. 2004)

IV. Determinación del coeficiente de sedimentación

1. Determine el coeficiente de sedimentación para los cloroplastos que inicialmente

estaban en la parte superior de la suspensión y luego de la centrifugación se
movieron al tope de “pellet”. Para determinar S, calcule las distancias X 1 y X2.

Tris-NaCl-Urea Tris-NaCl-Tritón-X-100

X1= radio del rotor – A 9 – 0.4 = 8.6 9 – 0.5= 8.5

X2= radio del rotor – B 9 – 4.5 = 4.5 9 – 6= 3

 2. Anotar para los valores de rpm y (t2-t1) (en segundos). Calcule S usando la
ecuación:

210 log(𝑋1/𝑋2)
S=
(𝑟𝑝𝑚)2 (𝑡2 −𝑡 1 )

t1: Tiempo de la primera centrífuga = 1m = 60s

t2: Tiempo de la segunda centrífuga= 5m = 300s
Para la primera centrífuga: t2-t1 =60s
Para la segunda centrífuga: t2-t1= 240s

S Tris-NaCl-Úrea Tris-NaCl-Tritón-X-100

rpm2 para 1300 g 190500.9012 x 10-13 = 306318.5977 x 10-13 =

(12919896.64) 190501 S 306319 S

CONCLUSIÓN

La sustancia amortiguadora Tritón-X-100, es un detergente iónico que altera la

estructura de la membranas celulares y causa también una deformación de los
cloroplastos por ser una sustancia altamente hipertónica.

Mientas que la urea al ser una sustancia muy usada en la desnaturalización de las
proteínas, hace que la célula se encuentre en un medio hipotónico en el cual se
desarrolla una difusión provocando el hinchamiento de la célula.

CUESTIONARIO

1. Indique que tipo de rotores de centrifuga hay y en qué se diferencian.

a) Rotores basculantes

Rotores basculantes para sedimentación con fuerzas centrífugas pequeñas de hasta

aproximadamente 6000 x g.

Ventajas: Puede obtenerse un mayor rendimiento ya que es posible llenar el tubo de

ensayo de la centrífuga completamente, y la sedimentación se lleva a cabo en el
centro de la parte inferior del tubo de ensayo, lo cual permite una fácil separación de
las fases.

b) Rotores de tambor

Los rotores de tambor son rotores especializados para velocidades de rotación altas
o – para ser precisos – para las fuerzas centrífugas altas; los recipientes
(generalmente viales de reacción) se ubican en cartuchos y se colocan verticalmente
en el rotor. El método de sedimentación es similar a los rotores basculantes.

Ventajas: En comparación con los rotores basculantes, los rotores de tambor

consiguen velocidades de rotación mayores y, por lo tanto, mayores fuerzas
centrífugas.

c) Rotores de ángulo fijo

Los rotores de ángulo fijo se utilizan para la sedimentación con fuerzas centrífugas
altas de hasta de 60 000 x g y más que por lo general se necesitan en los laboratorios
de investigación.

Ventajas: Los rotores fijos permiten menores tiempos de sedimentación en

comparación con los basculantes ya que pueden lograrse mayores velocidades de
rotación y mayores fuerzas centrífugas. La distancia de sedimentación es también
generalmente más corta que con rotores basculantes, lo que también tiene una
influencia positiva sobre la sedimentación. La capacidad de la cámara del rotor se
puede utilizar mejor que con rotores basculantes.

BIBLIOGRAFÍA

 García de Gurtubay y García, J. (1979). Efectos del detergente no iónico

Tritón X-100 sobre las membranas mitocondriales (Tesis de doctorado).
Universidad Computense de Madrid, Madrid, España.
 Lodish y col., 2004,”Biología Celular y Molecular” (5ta ed.), Editorial
Medica Panamericana, Buenos Aires.


WEB-GRAFÍA

 https://www.sigma-zentrifugen.de/es/productos/rotores/tipos-de-rotores/
(Consultado el 24 de mayo del 2019).