GUÍA DE TRABAJO PRÁCTICO - Código FGL 029

EXPERIMENTAL Versión 02
Talleres y Laboratorios de Docencia ITM Fecha 08-10-2018

1. IDENTIFICACIÓN DE LA GUÍA

Nombre de la guía: Electroforesis de ADN en gel de agarosa

Código de la guía (No.): 009
Taller(es) o Laboratorio(s) aplicable(s): Ingeniería Biomédica H-204
Tiempo de trabajo práctico estimado: 2 Horas
Asignatura(s) aplicable(s): Bioquímica Medica II
Ingeniería Biomédica / Ciencias Exactas y
Programa(s) Académico(s) / Facultad(es):
aplicadas

COMPETENCIAS CONTENIDO TEMÁTICO INDICADOR DE LOGRO

Comprender e implementar la
Técnicas de Biología Molecular:
Separación de ácidos nucleicos técnica de electroforesis en
mediante técnica de electroforesis gel de agarosa para el análisis
 Electroforesis
de ácidos nucleicos.

2. FUNDAMENTO TEÓRICO

2.1 Aspectos teóricos

La electroforesis es una técnica donde los solutos son separados en un campo eléctrico. Ya que las proteínas
y los ácidos nucleicos (ADN y ARN) son moléculas cargadas eléctricamente, al ser expuestas a un campo
migran a una velocidad dependiente de la sumatoria de carga neta y el tamaño, a través de una matriz
polimérica preparada y sumergida en una solución de iones (Buffer de corrido).
Una vez generado el campo eléctrico, simultáneamente las moléculas cargadas positivamente migrarán hacia
el polo negativo (Cátodo), mientras que las moléculas con carga positiva se desplazarán hacia el ánodo.

Fundamento
La electroforesis como método de separación tuvo su avance más significativo gracias a los estudios realizado
por el Doctor Arne Tiselius en 1937; este investigador Sueco recibió el premio Nobel de Química en 1948,
utilizando como modelo el estudio de proteínas sanguíneas. En términos prácticos el movimiento de una
molécula cargada, o Velocidad de migración (v), en la electroforesis depende del equilibrio entre dos fuerzas
opuestas, la atracción hacia el polo opuesto (Fuerza electrostática) y la resistencia al movimiento ejercida por
el entramado molecular de la matriz (Fricción).
Durante la electroforesis la velocidad de migración (v) del ADN o cualquier molécula cargada depende de la
fortaleza del campo eléctrico aplicado (E; unidad de voltios por distancia), la carga neta del ADN (z), y el
coeficiente de fricción (f). La fuerza electroestática Ez, que conduce la molécula cargada a través de un
electrodo con carga opuesta, se opone a la resistencia viscosa, que se origina por la fricción entre la molécula

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y el medio. El coeficiente de fricción f depende tanto de la masa de la molécula, como de su forma de la

molécula, así como de la viscosidad (η) del medio. Para una esfera de radio r:

Corrimiento electroforético
Las separaciones electroforéticas se realizan en soportes solidos (Celulosa, Agarosa, Poliacrilamida, entre
otros), actuando como como un colador molecular (tamiz) que permite la separación de las moléculas por
tamaño. Las moléculas que son pequeñas comparadas con el tamaño de los poros en el gel, se mueven más
rápidamente, mientras que las moléculas más grandes se mueven más lentamente debido a la dificulta para
pasar a través de los poros del gel. En la figura 5 se muestra la estructura molecular de la Agarosa.

Figura 5. Estructura molecular de la Agarosa. A Formación del tamiz molecular. B Enlace covalente formado
entre dos monómeros que conforman la Agarosa. C Microfotografía electrónica de un gel de Agarosa. D
Representación esquemática del tamiz molecular formado por la Agarosa.

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Los geles de agarosa y poliacrilamida pueden ser vertidos en una gran variedad de formas y tamaño de poro.
Los cambios en estos parámetros dependen principalmente del tamaño de los fragmentos a ser separados, sin
embargo, los geles de poliacrilamida son más efectivos para separar fragmentos pequeños aumentando la
resolución del corrido, por lo que se pueden separar moléculas de ADN que difieren en tan solo un par de
nucleótidos. Aunque los geles de poliacrilamida tienen esta ventaja, son más tediosos de preparar pues se
necesita la polimerización de dos moléculas diferentes (Acrilamida y Bis-Acrilamida), y más complejos de
manipular pues presentan una alta neurotoxicidad. Los geles de Agarosa por su parte tienen menos poder de
resolución en comparación con la poliacrilamida, pero tienen un alto rango de separación y no presenta
neurotoxicidad.

Voltaje

A bajos voltajes, la tasa de migración de fragmentos lineares de ADN es proporcional al voltaje aplicado. Sin
embargo, a medida que aumenta la intensidad del campo eléctrico, la movilidad de fragmentos de alto peso
molecular incrementa diferencialmente. Así, el rango efectivo para la separación en geles de agarosa disminuye
a medida que el voltaje aumenta. Para obtener una máxima resolución de fragmentos de ADN con un tamaño
mayor a 2Kb, los geles de agarosa no deberían correr a más de 5-8 V/cm (100 – 130 voltios)

Buffers electroforéticos

Durante la electroforesis los iones de los buffers son electrolizados, lo cual genera la migración de los protones
hacia el ánodo, e hidroxilos hacia al cátodo. El extremo catódico de la cámara de electroforesis se vuelve básico,
y el extremo del ánodo es ácido.

La movilidad electroforética del ADN es afectada por la composición y la concentración iónica del buffer
electroforético. En ausencia de iones la conductividad eléctrica es mínima y el ADN migra lentamente. En Buffer
de alta concentración iónica, la conductancia eléctrica es muy eficiente y se genera una alta temperatura que
funde el gel y desnaturaliza el ADN, por lo que la concentración de iones debe estar controlada.

Existe una variedad de diferentes Buffers disponibles para la electroforesis de ADN nativo de doble cadena.
Estos contienen Tris acetato y EDTA (pH 8.0; TAE), Trisborato (TBE), o Tris-fosfato (TPE) a concentraciones
de 50 mM aproximadamente (pH 7.5-7.8). Para fragmentos de bajo peso molecular, el TAE, tiene la capacidad
más baja de amortiguación entre los tres Buffers y se agota si la electroforesis se lleva a cabo por largos
periodos. Tanto el TBE como el TPE son más costosos que el TAE y tiene mayor capacidad de
amortiguamiento. Fragmentos lineares de doble cadena de ADN migran aproximadamente el 10% más rápido
en un Buffer TAE que en TBE o TPE; el poder de resolución de TAE es un poco mejor que el de TBE o TPE
para ADNs de alto peso molecular, siendo el Buffer de mejor resolución para ADN de mamíferos (3). Debido a
que el pH de esos búferes es básico, el fosfato del DNA con carga negativa migrara al ánodo.

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Buffer de carga

Los Buffers de carga se mezclan con la muestra antes de ser cargados en los pozos del gel. Estos Buffers
tienen tres funciones: Incrementan la densidad de la muestra, ayuda a que el ADN deposite bien en el fondo
del pozo, le da color a la muestra y permite hacerle el seguimiento durante el corrido para evitar que se salga
del gel.

Escalera alélica de ADN control (Marcador de peso)

Se recomienda siempre correr la muestra con una escalera estándar o marcador de peso para determinar el
tamaño de los fragmentos (Bandas) que se obtienen en cada pozo muestra, principalmente cuando se ha
realizado un ensayo de PCR (Reacción en cadena de la polimerasa) o RFLP (Patrones polimórficos de cortes
de restricción).

Visualización del ADN en geles de Agarosa.

Los fragmentos de ADN que son separados en geles mediante electroforesis no son perceptibles a menos que
el ADN se marcado. Un método sensitivo es exponer el ADN a una tinción con compuestos intercalantes
(Bromuro de Etidio, SYBR GREEN), los cuales se incorporan entre las bases nitrogenadas del ADN. Dado que
estos compuestos fluorescen bajo luz ultravioleta cuando está unido al ADN, es posible determinar la posición
del ADN en un gel después de corrido electroforético. La cantidad del complejo ADN-SYBR es mayor que del
complejo ADN-Bromuro de Etidio y fluoresce >1000 veces más, aumentando la posibilidad de observar
(aumento de la sensibilidad) las bandas de ADN en un gel.

2.2 Indicaciones sobre el manejo de los equipos e instrumentos más relevantes

Cámara de electroforesis

1. Prepare el gel de agarosa como se indica más adelante.

2. Inunde la cámara con el buffer de corrido una solidificado el gel
3. Sirva el marcador de peso y las muestras
4. Coloque la tapa de seguridad sobre la cámara de electroforesis
5. Conecte los cables de la tapa (Supersafe) a los electrodos de la fuente de poder

Precaución: No abra la tapa ni toque el gel o el buffer durante el corrido para evitar una descarga eléctrica. En
este mismo sentido, apague la fuente de poder y desconéctela antes de abrir la cámara de electroforesis

1. Al finalizar el corrido, saque el gel y deposite el buffer en el frasco de descarte.

2. Limpie la cámara con abundante agua y séquela con toallas desechables.

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Tapa de seguridad
Conectores a la
fuente de poder

Bandeja para
ensayo en UVT

Cámara de Buffer

Empaque de
presión (2)

Peine de 1 mm

Figura 1. Componentes cámara electroforética Owl B1A

Fuente de poder

Encienda el equipo.

1. Utilice el indicador de voltaje hasta colocar 120v . Posteriormente utilice el cronómetro para
programar dicho corrido durante 60 minutos.
2. Conecte la cámara electroforética a los electrodos manteniendo el código de colores Rojo y negro para
la polaridad.

3. Oprima la tecla para iniciar o parar el procedimiento.

4. Apague y desconecte el equipo una vez termine la electroforesis

Botón de
encendido
Conectores de
los electrodos

Controles de
voltaje y tiempo
Figura 2. Componentes Fuente de poder

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Vortex

 Seleccionar el modo de agitación (Continua o toque).

 Colocar las soluciones en la parte superior para agitar.
 Limpiar con un paño húmedo al terminar la práctica.

Figura 3. Descripción del Vortex

Transiluminador UV

1. Abrir la tapa con filtro UV

2. Colocar el gel una vez terminado el corrido
3. Cerrar la tapa con filtro UV
4. Conectar el Transiluminador
5. Encender el equipo
6. Colocar la opción de mayor intensidad
7. Observa o fotografiar el gel
8. Analizar los resultados obtenidos
9. Apagar el equipo y desconectarlo
10. Abrir la tapa para descartar el gel en bolsa roja
11. Limpiar el equipo con jabón y alcohol antiséptico

Tapa traslucida
Fuente UV con filtro UV

Selector de Encendido
intensidad

Figura 4. Descripción del transiluminador

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3. OBJETIVO(S)

Comprender el fundamento para la separación y análisis de ácidos nucleicos mediante electroforesis en gel de
agarosa.

4. RECURSOS REQUERIDOS

Para esta práctica se utilizarán las muestras de la práctica de purificación de ácidos nucleicos (ver guía):
AW1, AW2 y ADN purificado. Adicionalmente si incluirán amplificados de ADN (GAPDH) realizados en la
práctica de PCR.

Equipos e Instrumentos

 Fuente de poder 20-150V

 Cámara electroforética horizontal y accesorios
 Transiluminador con fuente de luz ultravioleta
 Placa de calentamiento con agitador magnético
 Balanza Analítica
 Vortex
 Horno microondas
 Micropipetas
 Pipeteadores

Materiales y reactivos

- Materiales
 Caja Therazaki
 Espátula
 Puntas plásticas para micropipeta
 Parafilm
 Erlenmeyer 100/200 ml
 Beaker 50 ml
 Probeta 1-100ml
 Pipetas volumétricas
 Frascos capacidad 1L
 Microtubos de 1.5 ml

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- Reactivos

 Agua destilada
 Ácido etilen de amino tetracético dihidratado (EDTA.H2O)
 Ácido acético
 Tris Base
 SYBR GREEN I 1µl (Agente intercalante)
 Dimetilsulfoxido anhidro (DMSO)- 99µl
 Agarosa- 1g
 Solución de trabajo Buffer TAE 0.5X- 50ml
 ADN o producto de PCR- 10µl
 Buffer de carga 6X Green GoTaq
 Marcador de peso GeneRuler 100 bp Plus para ADN

5. PROCEDIMIENTO O METODOLOGÍA PARA EL DESARROLLO

Organización del molde y preparación del gel de Agarosa

1. Retirar la tapa Super-Safe que contiene los conectores para los cables de los electrodos.
2. Colocar la bandeja en la cámara electroforética en la posición para servir el gel como se muestra en
la Figura 6, asegurándose que los empaques de presión naranja queden contra la pared de la cámara
y en posición perpendicular a los electrodos.
3. Preparar 50 ml de agarosa al 2%, pesando 1 g de agarosa
4. Adicionarla a un Erlenmeyer y aforar con Buffer TBE 0.5X hasta completar un volumen de 50 ml.
5. Calentar en el microondas durante 30 segundos. Repetir este ciclo 3 o 4 veces hasta disolver
completamente y evitando la formación de burbujas.

La solución de agarosa puede sobrecalentarse y hervir violentamente si se deja por

mucho tiempo en microondas

6. Enfriar el gel de agarosa a 60ºC antes de servir en la bandeja Figura 6, numeral 3.

7. Mientras que se enfría la agarosa, colocar el peine de 1 mm en la bandeja como se muestra en la
Figura 6, numeral 2.
8. Solidificar el gel a temperatura ambiente durante 30-45 minutos para que se formen los pozos y el
resto de la matriz molecular.

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Figura 6. Organización del molde de la cámara y preparación del gel

Organización de la cámara para el corrido electroforético

1. Una vez se haya solidificado la agarosa (formación de la matriz), se deberá mover la bandeja de la
cámara para cambiar a posición de corrido como se muestra en la Figura 7, asegurándose que los
empaques de presión queden en posición paralela a los electrodos.
2. Retirar cuidadosamente el peine de una forma firme y rápida, y levantando lentamente hacia arriba
de la bandeja de gel para evitar daños a los pozos.
3. Llenar la cámara electroforética con TAE 0.5X hasta sobrepasar la matriz de agarosa.

Figura 7. Posición de la bandeja para correr el gel.

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Siembra de Muestras

1. En una caja de Therazaki o en papel Parfilm, agregar 10µL de la muestra de ADN extraída o del
amplificado de PCR
2. Adicionar 2µL de Buffer de carga 6x
3. Agregar 0.5µL de la Solución Stock SYBR GREEN I (1:100)
4. Mezclar las tres soluciones aspirando repetidas veces. Evite la formación de burbujas tocando la base
de la caja Therazaki o el papel Parafilm.
5. Sembrar 10µL de la mezcla en el pozo del gel

Nota: Para la preparación del Marcador de Peso, mezcle 2.5 µL de marcador con 0.5µL de buffer de
carga 6x y 0.5µL de solución stock SYBR GREEN I (1:100). Sembrar 3.0 µL de esta mezcla siempre
en el primer pozo del gel para tener la referencia de tamaño.

Tabla 1. Mezcla de muestras en placa Therazaky.

Reactivo 1 2 3 4 5

Buffer de Carga 0.5 µl 2 µl 2 µl 2 µl 2 µl

6x
SYBR GREEN 0.5 µl 0.5 µl 0.5 µl 0.5 µl 0.5 µl
I
Marcador de 2.5 µl ------- ------- ------- -----
peso --- --- --- -----

Muestra de ---------- 10 µl 10 µl 10 µl 10 µl
ADN
Volumen final 3.0 µl 10.0 µl 10.0 10.0 10.0
µl µl µl

Nota: Los volúmenes de muestra pueden modificarse dependiendo de la situación. Debe conservarse la
relación muestra/Buffer de carga 6X, teniendo en cuenta que la concentración final del Buffer en la muestra
debe ser de 1X.

6. En el primer carril sembrar los 3.0µl la mezcla de Marcador-Buffer de carga- SYBR GREEN I,
ubicando cuidadosamente la punta en medio del pozo sin romperlo, como se muestra en la figura 8.
7. En los siguientes carriles sembrar los 10.0 µl de la mezcla ADN/Amplificado- Buffer de carga- SYBR
GREEN I, teniendo las mismas precauciones.

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Figura 8. Siembra del marcador y las muestras en el gel.

Condiciones finales para el corrido electroforético

1. Coloque la tapa Super-Safe deslizándola sobre la cámara, esta tapa lleva los conectores a la fuente
de poder y debe estar conectada a los cables de alimentación que tienen los electrodos tipo barra.
Conecte el otro extremo de la fuente de alimentación y lleve a una toma eléctrica adecuada,
completando el circuito.
Nota: Tenga la precaución de no mover bruscamente la cámara porque puede ocasionar la salida de
las muestras o la contaminación cruzada entre pozos.
2. Conectar la fuente de poder
3. Encender la fuente de poder
4. Colocar el corrido a 120v, a un tiempo estimado de 60 minutos.
Nota: Monitoree cuidadosamente el gel para evitar que la muestra o el marcado de peso se salgan y
se depositen en otros pozos.
5. Una vez oprimida la tecla Run verifique la aparición de burbujas en cátodo y el ánodo de la
cámara. Este es un indicativo del flujo de cargas a través del gel y el buffer.
6. Cuando el gel haya terminado de correr y el azul de bromofenol en el buffer de carga haya migrado
hasta el final del gel, apagar la fuente de poder y desconectarla.

Visualización del ADN o los amplificados

1. Deslizar la tapa para acceder al gel y remover cuidadosamente la bandeja que lo contiene.
Colocar la bandeja porta-geles sobre el transiluminador UV sin necesidad de remover el gel
2. Levantar la tapa ámbar del transiluminador y colocar la bandeja con el gel en el área de la luz UV
3. Encender el transiluminador y programarlo a una intensidad media o alta.
4. Observar la formación de bandas discretas, y en caso de que se formen completamente indicar el
tamaño de cada una de acuerdo a la correspondencia con el carril del marcador de peso
molecular.

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Composición de buffers utilizados en la Electroforesis

Buffer Solución Stock/Litro

Tris Base
Buffer TaE (Tris-Ácido ácetico-EDTA) Ácido acético
5x
EDTA 0.5 M

Azul de bromofenol al 0.25%

Buffer de carga Xylencianol FF al 0.25%
Sucrosa en H2O al 40% (p/v)
Se realiza una solución 1:100 a partir del
reactivo original 10.000X para preparar un
volumen de 100 µL:
Solución Stock SYBR Green I
1 µL de SYBR GREEN I (Lonza)
+ 99 µL de DMSO al 100%
(anhidro)
Tabla 1. Buffers para electroforesis

El SYBR Green I se usa como reemplazo del colorante altamente mutagénico bromuro de etidio,
porque es fácil de trabajar y disminuyen los problemas de eliminación (BEt).. Sin embargo,
cualquier molécula capaz de unirse al ADN con alta afinidad es un posible mutagénico,
incluyendo el SYBR.

6. PARÁMETROS PARA ELABORACIÓN DEL INFORME

6.1. ¿Qué diferencias existen entre una electroforesis en gel y una capilar? ¿Mencione ventajas y desventajas
de cada una? ¿Utilidad?

6.2. Realice un comparativo entre la electroforesis y la cromatografía de capa fina a nivel de la metodología y
la utilidad.

6.3. En la práctica anterior, usted extrajo ADN a partir de una línea celular humana. Consulte cual es el tamaño
del ADN humano, y compare su peso frente al marcador molecular. ¿Qué puede concluir? ¿Esperaría más de
una banda en el caso del material extraído? Explique su respuesta.

Nota: El marcador de Peso Molecular de ADN presenta una escalera alélica con incrementos
de 100pb.

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6.4. Describa el resultado obtenido a partir del bandeo que se formó en el gel de agarosa tanto para el ADN
extraído como para el amplificado de PCR. Anexe una foto al informe y explique qué relación tiene los
resultados frente al tamaño esperado, y frente a la calidad del ADN extraído y amplificado. Explique si se
formó una banda discreta, o si por el contrario se formó una banda con un extremo degradado o
manchoso explique qué posibles cambios en la siguiente lista de factores podría estar interfiriendo en un
adecuado proceso:

 La concentración y el tipo de agarosa de acuerdo al tamaño de la muestra de ADN

 El voltaje aplicado
 El buffer usado para electroforesis
 Calidad de las muestras o la extracción

6.5 En esta práctica se usó como Buffer electroforético TAE 5X solución madre y TAE 0.5X como Buffer de
trabajo, realice los cálculos respectivos si se quisiera trabajar a partir de una solución madre TAE 10X y
la respectiva dilución para una solución de trabajo TAE 1X.

6.6 Explique qué beneficios trae usar Buffer Tris acetato y EDTA (TAE), Tris-borato (TBE), o Tris-fosfato
(TPE) como buffers electroforéticos y cuáles son las diferencias en utilidad de estos Buffers.

6.7 Explique por qué es necesario usar un Buffer de carga en la electroforesis y cuál es la finalidad de cada
uno de sus componentes.
.
6.8 Dibuje un gel con su respectivo marcador de peso molecular, luego de que hiciera la digestión de una
muestra con la enzima EcoRI. El amplificado digerido tenía una longitud de 738 pares de base, con punto
de corte en la posición 100 y 200.

6.9 Cuál es la secuencia de reconocimiento de la enzima EcoRI. ¿Corta una sola de las cadenas? ¿Cuál es
el enlace que digiere? ¿Qué tipo de reacción química efectúa? ¿Qué diferencia hay entre endonucleasa y
exonucleasa?

6.10 ¿Cuál es la utilidad de la técnica RFLP y como relaciona con la electroforesis?

6.11. A cuál grupo químico pertenece la Agarosa y cuál es el enlace que permite su polimerización.

6.12. ¿Es plausible el uso de este tipo de polímeros en la entrega controlada de fármacos? Explique su
respuesta.

6.13. ¿Cuáles son las diferencias a nivel molecular entre la poliacrilamida y la Agarosa? ¿Con base en
estas diferencias qué relación hay entre la estructura molecular del tamiz y la resolución de un
corrido electroforético?

6.14. ¿Qué diferencia metodológica hay entre la electroforesis de ADN y de Proteínas?

6.15. ¿Cuáles son los pasos de un Westernblot y para qué sirve?

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6.16. ¿Cuáles son los sistemas de marcaje utilizados para la detección del analito en el Westernblot?

6.17. ¿Cómo se asegura la especificidad de la detección en el Westernblot?

6.18. ¿Qué diferencia hay entre Westernblot, Southernblot y Northernblot?

6.19. ¿Si deseara detectar una molécula específica de ADN después de un corrido electroforético como lo
haría? Menciones los pasos que realizaría, el tipo de marcaje y la interpretación del resultado.

7. DISPOSICIÓN DE RESIDUOS

Para la presente práctica se manipularán muestras de ADN purificado y amplificados de ADN, reactivos
químicos que incluyen sales, ácidos y bases para lo cual se utilizarán todos los elementos de protección
personal detallados en esta guía más adelante. La tinción de ácidos nucleicos se realizará con el reactivo Sybr
Green I (no tóxico y no mutagénico) será manipulado según las instrucciones del fabricante.

Todo el material plástico contaminado con restos biológicos y los restos de sangre, células o tejidos serán
descartados en bolsa roja rotulada con el símbolo de riesgo biológico para su disposición final con la empresa
encargada de la recolección de residuos biológicos en el ITM. Para el caso del material plástico contaminado
con químicos serán descartados en bolsa roja rotulada con el símbolo de riesgo químico para su disposición
final con la empresa encargada de la recolección de residuos químicos. Los restos de químicos serán
descartados en contenedor de plástico con tapa rotulado según el tipo de químico (orgánicos, inorgánicos,
ácidos y bases o sales), componentes y concentración para su entrega final con la empresa encargada de la
recolección de residuos químicos en el ITM.

8. BIBLIOGRAFÍA

Alberts B, Jhonson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P. 2002. Molecular Biology of the cell. Cuarta
edición. Garland Science. New York.

Berg MJ, Tymoczko LJ, Stryer L. 2002. Biochemestry. Quinta edición, W. H. Freeman and Company. New
York.

Gerald Karp. Biología celular y molecular: Conceptos y experimentos. Editorial Mcgraw Hill. Geofrey M
Cooper. The Cell a molecular approach. Editorial Sinauer Associates.

McKee, Trudy; McKee, James R; Palacios Martínez, Juan Roberto. Bioquímica: la base molecular de la vida
(4a ed). 2009.

Karp, Gerald. Biología Celular y Molecular. Quinta edición. Edit: Mc Graw Hill. 2009.

Mary K. Campbell, Shawn O. Farrell. Bioquímica. Sexta edición. 2010

Lodish. Biología Celular y Molecular. Tercera edición. Edit: Panamericana. 2003

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Fabian M Cortés Mancera – Esneyder Arias

Elaborado por:
Johanna Carolina Arroyave
Revisado por: Diana Alexandra Orrego Metaute
Versión: 02
Fecha: 14/11/2017

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