LAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGI SEL

FRAKSIONASI DAN ANALISA KOMPONEN SELULER

Nama : Febby Nurdiya Ningsih

NIM : 125090100111016
Kelompok :4
Asisten PJ : Galuh Wening Permata Sari
Tanggal : 9 Oktober 2013

LABORATORIUM FISIOLOGI TUMBUHAN DAN MIKROTEKNIK

JURUSAN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS BRAWIJAYA
MALANG
 FRACTIONATION AND CELLULAR COMPONENT ANALYZE
Febby Nurdiya Ningsih
Biology Department, Faculty Of Matemathic And Natural Science, Brawijaya University

ABSTRACT

Fractionation of cell is a method to study about cell and it’s body of cell.The aim
of this practice is separating subcelluler component by centrifugation.Practical uses of
materials namely red beans, tetrazolium, sucrose, iodine and the tools used are
sentrifuge, polypropilene tube, glass objects, water bath, sentrifugator, net, mortar and
microscopes. The centrifugation method used, iodine test, and the tetrazolium test.
Homogenation include, filtration, centrifugation 1000 rpm in 5 minutes, 2000 rpm in 10
minutes and 4000 rpm in 20 minutes. Iodine test is used to know existence of the starch
in the cell while the tetrazolium used to know the mitochondria within cells. The tetrazolium
test results show negative response. But in iodine test result that amilum was existence.
Failure in tetrazolium test cause of wrong technique and trouble in sentrifugator.

Keyword: centrifugation, fractinonation, iodin, result, tetrazolium, Amilum, mitochodrial

 FRACTIONATION AND CELLULAR COMPONENT ANALYZE
Fakhisa, E., Febby, N., Ivakhul, A., Noviana D.L., Priska, Ristianadewi., Zulfah
Biology Department, Faculty Of Matemathic And Natural Science, Brawijaya University

ABSTRACT

Fractionation of cell is a method to observe and study about cell and it’s body
of cell. The aim of this practice is separating subcelluler component by centrifugation.
Centrifugation is one separation technique based on the size and density. Practical uses
of materials namely read beans, tetrazolium, sucrose, iodine and the tools used are
sentrifus, muslin tube, glass objects, water bath, sentrifus, mortar, test tubes and
microscopes. The centrifugation method used, iodine test, and test the tetrazolium.
Homogenation include, filtration, centrifugation and 1000 rpm in 5 minutes, 2000 rpm in
10 minutes and 4000 rpm in 20 minutes. Iodine test is used to know the starch in the cell
while the tetrazolium used to know the mitochondria within cells. Based on the result,
iodine test give a positive result to sample p-2 and p-3, but unfortunately tetrazolium test
result give a negative result.This Failure happen because of wrong technique.

Keyword: centrifugation, fractinonation, iodin, tetrazolium, Amilum, mitochodrial

BAB 1
PENDAHULUAN

1.1. Dasar Teori

 Sel memiliki berbagai macam komponen. Sel sendiri berdasarkan komponennya
dibagi menjadi sel prokariotik dan sel eukariotik. Pada hewan dan tumbuhan, tersusun atas
sel eukariotik. Sel eukariotik sendiri terdiri atas beberapa komponen seluler, yang
diantaranya adalah nucleus, mitokondria, apparatus golgi, dan sebagainya. Untuk
mengetahui keberadaan komponen-komponen sel, terkadang kita perlu melakukan suatu
metode tertentu untuk mengamati dan menganalisis komponen seluler tersebut. Dalam
mengamati dan menganalisis komponen seluler, ada beberapa metode yang salah satunya
adalah metode fraksinasi.

Gambar 1. Diagram alir dari salah satu contoh proses fraksinasi

(Oxford University, 2002)
Fraksinasi sel merupakan suatu kombinasi metode untuk memisahkan organel-
organel sel dan komponen-komponen sel yang lainnya. Terdapat dua fase fraksinasi sel,
yakni homogenisasi dan isolasi. Pada tahap awal, pra-homogenisasi, membrane sel atau
dinding sel perlu dirusak terlebih dahulu untuk mempermudah proses homogenisasi
(Johnson et al., 2002)
Homogenisasi merupakan proses pemisahan organel dari selnya dengan cara
merusak dan membuka sel. Kerusakan pada sel ini terjadi karena pemberian suatu zat kimia,
enzim atau karena gelombang suara. Namun beberapa peneliti juga terkadang
menghomogenisasi sel dengan cara memaksa sel melalui suatu celah berukuran lebih kecil
dengan tekanan yang amat tinggi sehingga sel menjadi rusak (LTAING, 2005).
 Sedangkan fase isolasi merupakan pemisahan organel sel berdasarkan ukurannya.
Fase ini dapat dilakukan dengan berbagai macam cara, baik dengan cara kimiawi maupun
fisika, seperti sedimentasi gravitasi atau pengendapan, penyaringan sederhana dan
sentrifugasi. Namun kebanyakan cara yang digunakan adalah sentrifugasi (Heidcamp,
2013).
Sentrifugasi merupakan cara untuk mempercepat proses pemisahan komponen
berdasarkan pada ukuran dan densitas tiap komponen dengan memanfaatkan kecepatan
rotasi. Jadi, sampel yang telah dihomogenisasi dimasukkan ke dalam suatu alat yang dapat
berputar dengan kecepatan tertentu dengan bantuan sebuah rotor. Proses ini membutuhkan
waktu yang lebih singkat daripada proses sedimentasi biasa. Proses sentrifugasi
memanfaatkan gaya gravitasi bumi dan kecepatan. Ada dua jenis sentrifugasi, yakni
differential centrifugation dan ultracentrifugation. Namun pada umumnya yang digunakan
adalah differential centrifugation (Gallik, 2011).
Differential centrifugation memisahkan komponen seluler berdasarkan laju
sedimentasi dan berdasarkan pada ukuran dan bentuk tiap komponen. Pada differential
centrifugation, tiap-tiap stepnya menghasilkan produk berupa pellet, yang merupakan
komponen seluler dengan ukuran dan densitas tertentu yang mengendap lebih dahulu.
Sedangkan cairan jenuh diatas pellet adalah supernatant, yang merupakan campuran
komponen yang memiliki ukuran dan densitas lebih kecil daripada pellet. Pellet bisa menjadi
hasil isolasi yang dibutuhkan. Jika pellet yang didapat belum sesuai dengan kebutuhan,
maka supernatant yang ada disentrifugasi kembali dengan kecepatan yang berbeda dari
sebelumnya. Organel yang biasanya berhasil terisolasi dalam proses ini adalah mitokondria,
nukleus, kloroplas, dll (Alberts et al., 2009).

Gambar 2. Metode Differential centrifugation

(Alberts et al, 2009)

Metode fraksinasi sering kali digunakan dalam analisis-analisis mikrobiologi yang

dibutuhkan dalam bidang pangan, industri, maupun medis. Metode ini dikenal sebagai
metode yang akurat dan rinci dalam menunjukkan proses biokimia dan data kuantitatif dari
suatu mikroorganisme, termasuk data perkembangan suatu virus (Fisher et al., 1966).

1.2. Tujuan
 Praktikum dengan topik berjudul “Fraksionasi dan Analisa Komponen Seluler”
dilakukan dengan tujuan memisahkan komponen seluler tumbuhan berdasarkan ukurannya
dengan sentrifugasi.

BAB II
METODE

2.1. Alat dan Bahan

Dalam praktikum ini, alat dan bahan yang digunakan adalah tabung sentrifus
(tabung polipropilene), kain kasa, objek + cover gelas, water bath, sentrifus, mortal dan
 alu, tabung reaksi, mikroskop cahaya, biji kacang merah (Paseolus vulgaris)
tetrazolium chloride 0,05%, sukrosa-bufer solution dan iodin.

2.2. Prosedur
Dalam praktikum ini, terdapat beberapa tahapan kerja yakni homogenasi, filtrasi,
sentrifugasi, pengamatan komponen sel hasil fraksinasi menggunakan mikroskop dan
pengamatan komponen sel hasil fraksinasi menggunakan tetrazolium. Pada tahap
awal, yakni homogenasi, dengan cara menggerus 5 butir kacang merah dengan mortar
dan alu. Setelah itu ditambah dengan sucrose-buffer solution sebanyak 10 ml. Hasil
homogenasi tersebut dinamakan homogenat.
Setelah dihomogenasi, homogenat tersebut difiltrasi dengan kain kasa sebanyak
1 lapis. Hasil filtrasi tersebut berupa cairan dan disebut filtrat, sedangkan substan yang
tertahan di kain kasa adalah residu.
Setelah difiltrasi, filtrat yang dihasilkan dituang ke dalam tabung polipropilen
kemudian ditambah lagi dengan sucrose-buffer solution hingga 5 ml. kemudian
ditimbang terlebih dahulu dengan neraca digital. setelah ditimbang dan diketahui
massanya, disentrifugasi dengan kecepatan rendah (1000 rpm) selama 5 menit.
Setrifugasi ini menghasilkan padatan di dasar tabung sentrifus yang dinamakan pellet
p-1, dan menghasilkan cairan jenuh diatas pellet, yakni supernatan s-1. Supernatan s-
1 dipipet dengan perlahan dan dipindahkan ke tabung sentrifus yang baru. sedangkan
p-1 dibuang. Lalu s-1 yang sudah dipindahkan ke tabung polipropilen baru ditimbang
dengan neraca digital lalu di tambahi dengan sucrose-buffer solution lagi hingga
volume totalnya 10 ml. setelah itu kembali disentrifus dengan kecepatan yang lebih
tinggi dari sebelumnya (2000 rpm) selama 10 menit. Hasil sentrifus kedua ini adalah
pellet p-2 dan supernatant s-2.
s-2 dan p-2 dipisahkan dengan cara memipet s-2 dan memindahkannya ke tabung
polipropilen baru. s-2 ditimbang kembali dengan neraca digital dan ditambahi sucrose-
buffer solution hingga volume totalnya mencapai 10 ml. Setelah itu disentrifus kembali
dengan kecepatan 4000 rpm selama 20’. p-2 diambil sedikit sampel yang kemudian di
oleskan (smear) di atas kaca objek. setelah itu ditetesi dengan iodin dan ditutup dengan
cover glass. Preparat tersebut diamati di mikroskop perbesaran 100x kemudian
ditingkatkan menjadi 400x.
Setelah s-2 selesai disentrifus selama 20 menit, didapatkan supernatant 3 dan
pellet 3. Supernatan 3 dipisahkan dari pellet 3. Kemudian pellet 3 di diambil sedikit dan
dioleskan di atas kaca objek. Setelah itu ditetesi dengan iodin dan ditutup dengan cover
glass. Preparat tersebut kemudian diamati dengan mikroskop perbesaran 100x dan
400x.
Masing-masing sisa dari pellet 2 dan pellet 3, diambil sampel sebanyak 1 ml dan
dimasukkan ke dalam tabung A (untuk p-2) dan tabung B (untuk p-3). Masing-masing
dari tabung, ditambahi dengan tetrazolium chloride dengan perlahan melalui sisi
dinding (tidak perlu dikocok). Kedua tabung tersebut kemudian diinkubasi selama 30
menit pada suhu 37-40 0C. setelah diinkubasi, diamati perubahan apa yang terjadi
kemudian dicatat dalam buku pengamatan.
 BAB III
HASIL DAN PEMBAHASAN

3.1. Analisa Prosedur

Dalam praktikum ini, terdapat berbagai macam alat dan bahan yang
digunakan. Masing-masing alat dan bahan memiliki fungsi tersendiri. Tabung
polipropilen memiliki fungsi sebagai wadah untuk menampung filtrate maupun
supernatant yang akan disentrifus. Tabung ini digunakan karena bahannya yang tidak
mudah pecah dan tidak mudah leleh ketika berada dalam suhu panas. Mengingat pada
saat proses sentrifus, terjadi rotasi yang amat cepat dan menghasilkan panas pada
sentrifus biasa, sehingga dibutuhkan jenis tabung yang sesuai dengan kondisi pada
saat sentrifus berlangsung (Physorg. 2008)
Kain kasa memiliki fungsi yakni untuk menyaring homogenate sehingga
filtratnya terpisah dari residu. Objek dan cover glass merupakan seperangkat alat untuk
membuat preparat dari sampel pellet agar dapat diamati dengan mikroskop. Waterbath
berfungsi untuk menginkubasi sampel dengan suhu yang terkontrol. Inkubasi dilakukan
untuk mempercepat reaksi. Sentrifugator merupakan alat penting yang berfungsi untuk
memisahkan organel-organel atau substansi sesuai dengan ukuran dan densitasnya.
Mortal dan alu digunakan untuk membantu proses homogenasi bahan agar bentuknya
menjadi lebih sederhana dan halus sehingga mudah untuk diambil filtratnya. Untuk
mengamati dan membuktikan keberadaan suatu organel, digunakan pula mikroskop
cahaya. Dengan menggunakan mikroskop, maka organel-organel yang menjadi target
pengamatan dapat diamati keberadaannya.
Pada praktikum ini, bahan utam yang digunakan adalah kacang merah
(Phaseolus vulgaris). Selain bahan utama, terdapat juga bahan-bahan pendukung
seperti larutan tetrazolium chloride 0,05%, sucrose-buffer solution dan larutan Iodin.
Alasan mengapa kacang merah digunakan dalam praktikum ini adalah karena uji yang
pernah dilakukan sebelumnya, kacang merah memiliki tingkat keberhasilan paling
tinggi dibandingkan dengan bahan lain. Maksudnya, penemuan organelnya paling
mudah daripada yang lainnya. Selain itu, di dalam kacang mengandung banyak
mitokondria dibadingkan dengan bagian tanaman lainnya. Pada uji ini iodin berperan
sebagai indikator keberadaan amilum. Hal tersebut dikarenakan suatu substan akan
menunjukkan keberadaan amilum ketika direaksikan dengan iodin, yang ditandai
dengan munculnya warna ungu tua hingga hitam. Sedangkan sucrose-buffer solution
berguna untuk menjaga kondisi fisiologis organel agar tetap bertahan seperti semula
meskipun melalui berbagai macam proses, seperti sentrifugasi.
Tetrazolium chloride berfungsin sebagai indikator reaksi redox. Sehingga
tetrazolium sering digunakan untuk indikasi ada tidaknya proses respirasi seluler yang
berlangsung. Tidak hanya respirasi, tetrazolium chloride juga digunakan untuk
mengetahui ada tidaknya proses metabolime (Berridge, 2005)
Ada banyak perlakuan yang dilakukan dalam praktikum kali ini. Perlakuan
pertama adalah penggerusan pada kacang merah. Penggerusan dilakukan dengan
maksud untuk memecah sel dan merusak dinding sel. Setelah digerus, hasil gerusan
ditambah dengan sucrose-buffer solution yang bertujuan untuk menjaga kondisi
fisiologis sel dan organel-organelnya. Kemudian dilakukan penyaringan yang fungsinya
 untuk memisahkan residu dan filtrat. Filtrat dipindahkan ke tabung polipropilen baru dan
ditimbang dengan neraca digtal. Penimbangan ini bertujuan untuk mengetahu massa
dari filtrate yang didapatkan. Setelah ditimbang, disentrifus selamat 5 menit dengan
kecepatan 1000 rpm. Setrifugasi berfungsi untuk memisahakan organel-organel
berdasarkan ukuran dan densitasnya. Setelah selesai disentrifus, kemudian antara
supernatant dan pellet dipisahkan. Supernatan yang telah dipisahakan kemudian diberi
perlakuan yang sama, mulai dari penambahan sucrose-buffer solution sampai
pemisahan pellet dan supernatant baru. Langkah tersebut terus dilakukan hingga
dihasilkan supernatant 3 dan pellet 3. Tiap sentrifugasi, kecepatan dan waktunya
dinaikkan dua kali lipat dari sebelumnya. Fungsi sentrifus dengan kecepatan
bertingkatnya adalah agar tiap organel tertentu dapat terpisah-pisah sesuai dengan
koefisien sedimentasinya. Pada pellet 2 dan pellet 3, diambil sampel untuk dijadikan
preparat. Pada preparat tersebut ditetesi iodin sebagai indikator keberadaan amilum.
Sehingga pada saat diamati di mikroskop, butir-butir amilumnya akan nampak karena
bereaksi dengan iodin.
Selain untuk preparat, masing-masing dari pellet 2 dan 3 diambil sampel
sebanyal 1 ml untuk diuji dengan larutan Tetrazolium chloride. Pada saat uji ini, sampel
yang sudah diberi tetrazolium chloride perlu diinkubasi dengan suhu 37 0C. Suhu
tersebut merupakan suhu optimum pada sel atau organel-organel, dimana belum
terjadi lisis. Inkubasi dilakukan dengan tujuan untuk mempercepat reaksi tetrazolium
chloride (…)

3.2. Analisa Hasil

3.2.1. Uji Iodin
Pada uji Iodin, dengan melakukan pengamatan pada preparat pellet 2 (p-2)
ditemukan butir-butir amilum yang berbentuk oval berwarna kehitaman. Bulatan-
bulatan hitam ini terjadi karena amilum tersebut beraksi positif dengan iodin sehingga
memunculkan warna gelap. Butir-butir amilum dapat dilihat pada gambar berikut

Gambar 1. Foto pengamatan butir amilum pada sampel p-2

 Berdasarkan pada foto pengamatan tersebut, selain amilum terdapat
segerumbulan substan berwana kuning, yang merupakan debris atau kotoran sisa
penggerusan (pecahan dinding sel)
Pada pellet 3, yang merupakan hasil sentrifugasi terakhir ternyata masih
ditemukan butir-butir amilum. Berikut adalah gambar pengamatan pada sampel p-3 :

Gambar 2. Foto Pengamatan butir amilum pada sampel p-3

Uji iodin merupakan uji yang dilakukan untuk mendeteksi keberadaan

amilum. reaksi antara keduanya dapat menghasilkan warna biru kehitaman atau
bahkan hitam. hal tersebut dikarenakan unit-unit glukosa dalam amilum membentuk
rantai heliks karena adanya ikatan dengan konfigurasi pada tiap unit glukosa
(Poedjiadi, 1994).
Jika dibandingkan ukuran amilum yang ditemukan pada p-2 dan pada p-3,
lebih besar amilum yang ada di p-2. Amilum yang ditemukan pada p-3 hanya berupa
serpihan yan lebih kecil daripada amilum di p-2. Hal ini mengacu pada saat sentrifugasi
terjadi proses sedimentasi berdasarkan ukuran dan densitas substan, sehingga amilum
yang masih ditemukan di pellet 3 dikarenakan ukurannya yang lebih kecil, sehingga
ikut tersedimentasi di p-3 yang merupakan hasil sentrifugasi terakhir.
Ada beberapa faktor yang mempengaruhi keberadaan amilum di pellet 3
yang seharusnya sudah tidak ada amilum, yang diantaranya faktor kesalahan teknis.
Pada saat proses sentrifugasi berlangsung, alat sentrifus sempat eror sehingga proses
sentrifugasi terhenti dan mengulang dari awal lagi. Sehingga kesalahan ini
mengakibatkan sentrifugasinya tidak optimum. Ada faktor lain, yakni pada saat
pemisahan pellet 3 dengan supernatant 3, masih terdapat supernatant yang tersisa dan
bercampur dengan pellet 3. Selain itu juga, pada saat pengambilan sampel, yang
tersedot oleh pipet adalah bagian yang banyak supernatannya.
3.2.2. Uji Tetrazolium
Berdasarkan uji tetrazolium chloride pada sampel p-2 dan p-3, menunjukkan
hasil yang negatif. Dimana tidak ditemukan cincin merah yang merupakan indikator
keberadaan aktivitas respirasi oleh mitokondria. Kegagalan ini kemungkin disebabkan
oleh trouble yang terjadi selama proses sentrifugasi. Proses sentrifugasi sempat
terhenti karena terjadi trouble pada sentrifugator. Selain itu juga karena teknik
pemisahan supernatant dan pellet yang salah, serta teknik pengambilan sampel untuk
preparat.
Jika terdapat mitokondria, akan muncul cincin berwarna merah muda. Cincin
yang menandakan keberadaan mitokondria tersebut merupakan hasil reaksi dari
tetrazolium dan NAD, yang hanya diproduksi di mitokondria. Tetrazolium tereduksi oleh
NAD. NADH merupakan komponen kritis yang sering dihasilkan dari respirasi seluler
(Badran, 2013).
Diharapkan pada pelaksanaan praktikum ini dikemudian hari, untuk
memerhatikan kondisi alat dan juga lebih berhati-hati dalam melakukan teknik
pemisahan dan pemindahan supernatant dengan pellet agar tidak kembali bercampur.
Jika hal-hal tersebut terjadi, sangat memungkin kan bahwa kegagalan seperti pada
praktikum kali ini akan terulang kembali.
JAWABAN PERTANYAAN

1. Homogenasi untuk pemisahan sel dari jaringan penyusunnya serat pelepasan organel
dari selnya
2. Sentrifugasi untuk pemisahan organel sel berdasarkan ukurannya dilakukan dengan
beberapa tahap berdsarkan kebutuhannya
3. Perbedaan masa jenis, komponen dengan masa jenis lebih besar akan mengendap
lebih cepat daripada partikel yang lebih kecil.
4. Sebab jika dilakukan hanya satu kali sentrufugasi dengan keceptan maksimal maka
organel yang memiliki berat jenis besar hingga kecil akan bercampur menjadi satu.
Sehingga hal tersebut menyulitkan untuk idenktifikasi.
5. Karena biji tempat terjadinya regenerasi sel yang terdapat pada jaringan
meristem dan biji juga mengandung amilum.