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ANTIBIOGRAMA: método in vitro que permite estudiar el comportamiento de las bacterias antes
concentraciones conocidas del agente antibiótico.
CALDO: medio de cultivo liquido con componentes orgánicos indefinidos (peptona, extractos de
órganos y tejidos, etc.).
CULTIVO PURO: población de células bacterianas provenientes de una única célula. Permite estudiar
las características propias del microorganismo.
CULTIVO MIXTO: es aquel en el cual dos o más especies se desarrollan simultáneamente en el medio
de cultivo.
JARRAS GAS-PAK: sistema utilizado para el cultivo de bacterias anaerobias, en este se crea un
ambiente anaerofilico o de microaerofilia.
MEDIO DE CULTIVO: medio que suministra a las bacterias los elementos necesarios para su
multiplicación.
MEDIO FLUIDO: medios semisólidos con un contenido de agar igual o superior al 1%.
MEDIO SELECTIVO: es aquel que solo permite el crecimiento de un biotipo o unos pocos biotipos
entre los que se presentan en el inoculo.
MEDIO DIFERENCIAL: es aquel que permite la distinción entre tipos celulares próximos y
relativamente parecidos.
MEDIO GENERAL: es aquel que soporta el crecimiento de una amplia variedad de microorganismos
sin exigencias nutricionales especiales.
RESIEMBRA: cuando en el cultivo mixto, nos interesa estudiar un solo tipo de colonia, se procede a
extraer una pequeña porción con un asa de platino estéril procediendo a sembrarla en un medio de
cultivo idóneo, para de esta manera obtener un cultivo puro.
TINCION COMPUESTA: en este tipo de tinción se utilizan más de una sustancia tintorial. Los
colorantes se aplican a la preparación, separados o juntos, formando parte de una solución. En
consecuencia, se puede determinar algunas características propias de diversos órganos que
permiten diferenciarlo de los demás, por lo que también reciben el nombre de coloraciones
diferenciales. Un ejemplo de estas son la coloración de Gram y la coloración de Ziehl-Neelsen.
Tamaño
Disposición y forma
Cocos:
Un plano:
2 cocos: DIPLOCOCOS
4 – 20 cocos: ESTREPTOCOCOS
Dos planos:
MICROCOCOS
Tres planos:
SARCINA
Varios planos:
ESTAFILOCOCOS
Espirales o espiroquetas:
COLORACIÓN DE GRAM
Esta coloración fue empleada por primera vez por el danés “Hans Christian Gram” en el año 1884,
de ahí su nombre.
La mayor parte de las bacterias se tiñen al principio con el cristal violeta y yodo, que forman
complejos insolubles dentro de la pared bacteriana. Las bacterias que poseen capas gruesas de
peptidoglucano en sus paredes celulares, y en consecuencia retienen la tinción después del
tratamiento con acetona y adquieren una tonalidad morada, se definen como “Grampositivas”. Los
microorganismos que tienen capas más delgadas de peptidoglucano, pierden con rapidez el
complejo por la acción de la acetona y por lo tanto se tiñen con el reactivo de tinción rosa
“Safranina” y se conocen como “Gramnegativas”.
Fundamento técnico:
Utilidad:
Su principal utilidad es que permite dividir las bacterias en dos grandes grupos:
1. Grampositivos: retienen el colorante primario “Cristal violeta”, por lo tanto se tiñen de color
violeta o violeta azulado.
El espectro que abarca la coloración de Gram incluye la mayoría de las bacterias, algunos hongos y
parásitos tales como Trichomonas spp., larvas de Strongyloides stercoralis y quistes de protozoarios.
Las excepciones incluyen:
También puede ser utilizada para diferenciar células epiteliales e inflamatorias, definiendo el estado
de infección y la calidad de la muestra.
Técnica:
1. Realizar un extendido del material para estudio, y permitir que se seque al aire.
3. Colocar el extendido en una rejilla para teñirlo y cubrir la superficie con solución de cristal
violeta.
5. Cubrir con la solución de Yodo para Gram por 1min. y lavar nuevamente con agua.
6. Cubrir con unas pocas gotas del decolorante alcohol acetona, 10 segundos o menos.
9. Ubicar el extendido en posición vertical para que se escurra el exceso de agua y seque.
Blastoconidias gemantes
Bacillus
Bacilos Listeria Enterobacteriaceae
Corynebacterium Pseudomonas
Clostridium
Grampositivas Gramnegativas
Capa gruesa de peptidoglucano en Capa fina de peptidoglucano.
forma de estratos.
Unidos al peptidoglucano: ácidos Membrana externa (fosfolípidos,
teicoicos y lipoteicoicos. lipopolisacarido y proteínas).
La coloración de Ziehl – Neelsen se emplea para teñir los Bacilos Acido – Alcohol Resistentes (BAAR),
estas bacterias tienen la propiedad de captar en su pared la fucsina fenicada (de color fucsia) y
retenerla aun con la acción de decolorantes, como la mezcla de ácido y alcohol. Esta característica
se debe al alto contenido en lípidos, particularmente a los ácidos micólicos, que poseen en la pared
celular. Así, utilizando una técnica adecuada es posible identificar al bacilo de la tuberculosis en la
muestra del enfermo como un bastoncito rojo – fucsia, sobre una coloración de fondo que facilita
su visualización.
Esta propiedad no es específica del bacilo de la tuberculosis, sino que la tienen todos los bacilos del
género Mycobacterium, aun las micobacterias ambientales y otros pocos microorganismos.
La coloración de Ziehl – Neelsen es la técnica más apropiada para ser utilizada en todos los
laboratorios de los países de América Latina. Es la recomendada por la Organización Mundial de la
Salud (OMS) y la Unión Internacional Contra la Tuberculosis y Enfermedades Respiratorias (UICTER),
por ser la que asegura resultados reproducibles con un entrenamiento sencillo y la más económica.
Fundamento:
¡La selección de la partícula más purulenta de la muestra es uno de los pasos más importantes para
aumentar la probabilidad de identificar los casos de tuberculosis mediante la baciloscopia!
Coloración:
8. Cubrir la totalidad de la superficie del extendido con fucsina básica fenicada recién filtrada.
Dispensar el colorante con suavidad, sin salpicar y sin tocar con el gotero o el embudo el
extendido
9. Con la llama de un hisopo embebido en alcohol calentar suavemente por debajo del
extendido, con movimientos de vaivén, hasta que se observe que se desprenden los
primeros vapores blancos. No calentar con mechero.
10. En el término de aproximadamente 5 minutos calentar 3 veces hasta la emisión de vapores,
esto es suficiente para que la fucsina penetre adecuadamente en el bacilo y se fije a sus
lípidos. No hervir la fucsina, esto puede alterar la morfología de las células bacterianas.
11. Con una pinza, levantar cuidadosamente la lámina portaobjetos desde el extremo más
cercano al operador. Enjuagar con abundante agua a baja presión, con un frasco o grifo.
Lavar muy suave y cuidadosamente la superficie eliminando totalmente la solución de
fucsina. Girar el extendido y lavar también la parte posterior.
Decoloración:
12. Cubrir la totalidad del extendido con solución decolorante y dejar actuar por 3 minutos.
13. Enjuagar con abundante agua a baja presión.
14. Eliminar el exceso de agua inclinando el portaobjetos.
Contar el número de campos que ha leído y el número de BAAR que ha identificado. Se puede utilizar
una cuadricula de 10 cuadrados x 10 cuadrados, que representa los 100 campos microscópicos,
como ayuda para registrar la cuenta.
5 3 4 0 2 3 2 4 1 0
Para calcular el promedio de BAAR encontrados por campo, sumar el total de BAAR contados y
dividir ese total por el número de campos observados. Cuando los bacilos se presentan agrupados,
una estimación aproximada del número de bacilos presentes en el cumulo es suficiente para calcular
este promedio.
Ejemplo:
Si se observan de 1 – 10 bacilos por campo hasta llegar a 50 campos, se cuenta hasta ahí.
Si se observan más de 10 bacilos por campo, solo cuento hasta llegar a 20 campos.
Si no observo ninguno bacilo por campo debo seguir leyendo hasta los 100 campos.
Los campos leídos en la BK deben ser “Campos microscópicos útiles”. Se considera campo
microscópico útil a aquel en el cual se observan células bronquiales (leucocitos, células ciliadas) o
fibras mucosas, que aparecen teñidas de azul. Por lo tanto, un campo microscópico se puede
considerar útil si cumple la siguiente norma:
Los campos sin elementos no deben ser considerados para contar el total de campos observados,
A MENOS que CONTENGAN BAAR.
¿Qué procedimiento se debe seguir frente al hallazgo de menos de 5 BAAR en 100 campos
observados?:
La gravedad de la enfermedad
Infectividad del paciente
Evaluación del paciente bajo tratamiento
COLORACIONES SIMPLES
Son aquellas en la que los microorganismos se tiñen con un solo colorante y sin empleo de
mordientes. Lac bacterias se teñirán en relación a la sustancia colorante empleada.
Las tinciones simples se utilizan cuando se desea teñir rápidamente un microorganismo, utilizando
fundamentalmente para observar su morfología.
Cristal violeta
Azul de metileno
Safranina
Para el cultivo in vitro de los microorganismos es necesario la preparación de medios especiales, con
el fin de que sean utilizados como nutrientes. Estas sustancias nutritivas en su conjunto son llamadas
“Medios del cultivo”. Estas son sustancias o mezclas de sustancias naturales o artificiales que
proporcionan a los microorganismos los principios nutritivos necesarios para su desarrollo y
reproducción.
Entre los principales componentes de los medios de cultivo, se encuentran: agar, peptona, extracto
de carne, extracto de levadura, sangre, plasma, suero, bilis, carbohidratos, etc.
Además, deben reunir ciertas condiciones, sin las cuales no es posible obtener resultados confiables
en el laboratorio, entre ellas:
Para que un medio de cultivo resulte eficaz, sus componentes deben responder a las exigencias
nutricionales de las especies que se pretenden cultivar. Debido a que existen diferencias en los
elementos constitutivos de cada género o especie, así como en sus actividades metabólicas y los
mecanismos para obtener los nutrientes, se comprenderá que no haya un medio de cultivo
estándar que posibilite el desarrollo de todas las especies, existiendo por lo tanto una amplia
variedad.
Conservar indefinidamente las distintas especies bacterianas, ya sea por repiques sucesivos
o liofilización. Con la ventaja de disponer en un momento determinado algunas de ellas, ya
sea para estudio – investigación, preparación de antígenos, de vacunas (por ejemplo:
Haemophylus influenzae), antitoxinas (por ejemplo: Clostridium tetani), entre otros.
Según su composición:
Agar en malayo significa jalea. Es una sustancia mucilaginosa que se obtiene de algas pertenecientes
al grupo Agarofitas que comprende los géneros: Gellidium, Pteraloida, Gracilaria y Acanthopeltis.
Las paredes de la planta posee una capa interna de celulosa y otra más externa de sustancias
pécticas. Para la producción de agar se extraen las capas pécticas ricas en agarosa y agaropectina,
para ser procesadas industrialmente, siendo comercializado en forma deshidratada.
Bioquímicamente se trata de un éster sulfúrico de una molécula lineal galactano que es insoluble
en agua fría pero soluble en agua caliente. Una solución de 1,5% de Agar, forma un gel firme entre
32 – 39°C, que no se funde por debajo de 85°C.
SEMISOLIDOS: estos medios contienen un porcentaje de Agar menos que el empleado para
los medios solidos (<1%), lo que facilita una mayor migración de sustancias y la movilidad
de los gérmenes. Ejemplos: Medio Cary-Blair, Agar semisólido para motilidad.
Crecimiento atípico:
Medio de cultivo erróneo defectuosamente preparado
Medio de cultivo deshidratado vencido
El medio de cultivo ha sido almacenado durante un tiempo excesivo, envejeciendo
o deteriorándose
Condiciones de cultivo no relacionadas con las normas establecidas
Residuos de sustancias extrañas, ya sea en los recipientes de preparación o de
cultivo, en el agua o en el material de ensayo
Para el aislamiento de cultivos puros en el medio de cultivo, se requiere realizar una adecuada
siembra (Inocular de manera aséptica la cepa bacteriana u otro microorganismo en el medio de
cultivo preciso). Esta depende de las características fisiológicas del microorganismo que se quiere
aislar, por ejemplo, requerimientos de oxígeno.
Instrumentos de siembra:
Los instrumentos de siembra son los objetos empleados para tomar el volumen o fracción de la
muestra y sembrarla en el medio de cultivo.
Aguja bacteriológica:
Consiste en un fino alambre recto, de platino o nicrón, que tiene aproximadamente una longitud de
7cm, el cual se encuentra insertado por uno de sus extremos a un cabo metálico, el cual sirve para
que el manipulador pueda tomar en su mano este instrumento de siembra.
Tanto el platino como el nicrón tienen la propiedad de calentarse rápidamente y ponerse al rojo
vivo, cuando son expuestos directamente a la llama de un mechero y de enfriarse a los pocos
segundos, después de haber sido retiradas de esa fuente de calor. Esta característica se aprovecha
en el trabajo diario del laboratorio, para esterilizar en pocos segundos este instrumento en cada
ocasión en que se requiere su uso.
Es similar en todos los aspectos a la aguja, con la diferencia de que el extremo terminal del alambre
de platino o nicrón, en lugar de ser recto, forma un pequeño círculo en el extremo, con un diámetro
de 4 a 5mm. El método de esterilización es igual al empleado por la aguja.
Espátula de Drigalski:
Puede ser metálica o de vidrio fusible. Al igual que la aguja y el asa, cuando son metálicas, consisten
en un alambre de platino o de nicrón insertado a un cabo metálico, pero con la particularidad de
que el extremo terminal tiene la forma de un triángulo. Se esteriliza a la llama del mechero igual
que la aguja y el asa.
Pipeta:
Las pipetas utilizadas como instrumentos de siembra, deben ser previamente esterilizadas en
autoclave y estar provistas de un bulbo de caucho por su parte posterior, similar a las empleadas en
los goteros. Las más utilizadas en el trabajo diario son las de “Pasteur”.
Consiste en un fino aplicador, generalmente de madera, con una pequeña mota de algodón
adherida a uno de sus extremos. Los hisopos, una vez confeccionados, deben ser colocados en el
interior de tubos de ensayo de tamaño apropiado, taponeados y re-tapados antes de proceder a su
esterilización en autoclave. Cuando se emplean para tomar las muestras, casi siembre se utilizan a
continuación para realizar la siembre en el medio de cultivo.
Métodos de siembra:
El método de siembra a emplear dependerá de los objetivos que se pretendan alcanzar con el
cultivo, ya que en ocasiones se requiere que el desarrollo del microorganismo se produzca de forma
masiva, mientras que en otras resulta indispensable que las colonias queden aisladas o que las
manifestaciones del metabolismo tengan lugar con tensiones reducidas o privadas de oxígeno, los
métodos de siembra más empleados son los siguientes:
Siempre que se utilicen instrumentos de siembre de platino o nicrón, deben ser calentados en la
llama del mechero hasta el rojo vivo, antes y después de realizar la siembra, con el objetivo de
destruir a los microorganismos contaminantes de la superficie del instrumento.
Con independencia del tipo de medio y el método de siembra a emplear, esta debe realizarse en las
proximidades de la llama del mechero ya que el calor emanado reduce el número de
microorganismos presentes en sus inmediaciones, lo cual es utilizado como un recurso a favor del
proceder aséptico.
Este método de siembra se realiza sobre la superficie de los medios de cultivo solidos distribuidos
en placas de Petri o en tubos de ensayo solidificados en forma de cuña (Slam).
Ejemplos;
Para esta técnica se emplea un asa bacteriología que tiene 4mm de diámetro. Su mayor aplicación
es para el urocultivo, un método cuantitativo en el cual se deben contar las colonias aisladas. El asa
calibrada puede contener 0,001ml de orina, por lo tanto, el número de colonias se multiplicara 1000
veces.
Por ejemplo;
Cuando se desea realizar una siembra masiva se puede utilizar la espátula de Drigalski. En
este caso la gota de muestra liquida se esparce con la espátula por toda la superficie del medio de
cultivo solido imprimiendo un movimiento en espiral. La siembra masiva también se puede realizar
con un hisopo grueso embebido de un cultivo líquido, procediendo a su deslizamiento sobre toda la
superficie de una placa de agar.
En general, el crecimiento se manifiesta por turbidez, la cual podrá opacar todo el cultivo o darle un
aspecto granuloso o nebuloso.
Como la bacteria se encuentra impedida de desplazarse por la solidez del medio, al multiplicarse en
un punto específico, sus descendientes que alcanzan magnitudes millonarias en menos de 24 horas,
ocasionan agregados bacterianos, que dan lugar a estructuras visibles de diferentes formas,
aspectos y colores, denominadas colonias bacterianas, cuyos caracteres serán típicos para cada
género o especie.
Agar – Agar purificado, de tipo americano, que cumple las especificaciones USP/NE XX y APHA
especialmente indicado para la preparación de medios de cultivo. Las soluciones al 1,5% dan geles
suficientemente consistentes para poder hacer estrías en superficie.
Agar Sangre
Composición:
Fundamento:
El agar sangre aporta muchos factores de enriquecimiento. Se usa también para ver la capacidad
hemolítica de los microorganismos patógenos (que es un factor de virulencia).
Resultados:
Los Streptococcus spp. β-hemolíticos presentan colonias translucidas y opacas, grises, pequeñas y
mucoides con una zona de aclaramiento alrededor.
Las colonias de neumococos se observan placas, lisas, translucidas, grisáceas y algunas mucoides,
rodeadas por una pequeña zona verdosa (α-hemolisis).
Las colonias de Staphylococcus spp. tienen una apariencia opaca, de color blanco o amarillo y
rodeadas de una zona transparente (β-hemolisis).
Agar chocolate
El agar chocolate se obtiene agregando sangre de carnero a una base de agar enriquecido que se
encuentre a una temperatura lo suficientemente alta (alrededor de 80°C) como para lisar los
hematíes y liberar el factor V y Factor X.
Composición:
Hoy en día la mayoría de los laboratorios compran el agar chocolate y otros medios bacteriológicos
que ya vienen preparados y liofilazados para reconstituir. El “Agar chocolate” preparado
comercialmente contiene:
Utilidad:
El ligero calentamiento durante el agregado de la sangre a la base de agar fundido cuando se prepara
el agar chocolate produce lisis de los eritrocitos, liberando los factores X y V necesarios para la
recuperación y crecimiento de las especies de Haemophilus.
Sin embargo, también es un excelente medio para la recuperación de otros microorganismos con
requerimientos especiales de cultivo, como Neisseria meningitis o Neisseria gonorrheae, a partir de
muestras que no están habitualmente contaminadas con otros microorganismos, como LCR o
liquido articular.
Composición:
Peptona
Almidón soluble
Cloruro sódico
Suplemento GC
Hemoglobina
Fundamento:
El medio de Thayer – Martin es el que hasta el momento se ha demostrado más eficaz para el
aislamiento de neisserias patógenas.
Además de una buena base nutritiva constituida por el medio basal, incorpora factores de
crecimiento indispensables en el suplemento GC y la hemoglobina indispensable para el buen
desarrollo de estos microorganismos. La selectividad del medio se consigue gracias a la
incorporación de antibióticos como son Vancomicina, Nistatina y Colistina:
En los hombres:
Por lo general, para el diagnóstico de la gonorrea en las mujeres se precisa un crecimiento positivo
de diplococos Gramnegativos intracelulares, de morfología característica y reacción positiva de
oxidasa. En cambio, en el hombre suele ser suficiente la demostración de gonococos intracelulares
en los exudados uretrales, y solo cuando sea posible se cultivara para demostración bioquímica.
La muestra se inocula en el medio con un asa bacteriológica y se incuba a 35°C, en una atmosfera
húmeda y enriquecida con un 10% de CO2.
Composición:
Resultados:
Los fermentadores débiles, incluidos Klebsiella, Enterobacter, Serratia y Hafnia producen colonias
purpuras.
Los no fermentadores de la lactosa, que incluyen Proteus, Salmonella y Shigella, producen colonias
transparentes.
Composición:
Fundamento:
Utilidad:
Sirve como un indicador visual del pH, distinguiéndose así las bacterias Gramnegativas que pueden
fermentar la lactosa de las que no.
Los fermentadores lentos o débiles de la lactosa, como Citrobacter, Providencia, Serratia y Hafnia
producen un color rosa pálido o pueden aparecer sin color después de 24 horas.
Las especies de Proteus, Salmonella y Shigella, con raras excepciones, producen colonias
transparentes.
Composición:
Extracto de carne
Citrato de sodio
Mezcla de peptonas
Tiosulfato de sodio
Lactosa
Citrato férrico
Rojo neutro
Verde brillante
Agar base
Fundamento:
Las sales biliares y el verde brillante actúan como inhibidores de bacilos Grampositivos, de
la mayoría de bacilos coli y del Swarming en Proteus spp. mientras que permite el
crecimiento de Salmonella y Shigella.
El tiosulfato de sodio y el citrato férrico permiten la detección de la producción de H2S.
La lactosa proporciona la fuente de carbohidratos.
El rojo neutro y el verde brillante actúan como indicadores de pH.
Agar como agente solidificante.
Resultados:
Las colonias fermentadoras de lactosa se ven de color rosado (pH acido), las no fermentadoras son
incoloras (pH básico).
Las colonias de Salmonella spp. y Proteus spp. son incoloras con centro negro por
producción de H2S.
Las colonias de Shigella spp. son incoloras sin precipitados negros.
Composición:
Extracto de carne
Peptona
Lactosa
L-cistina
Azul de bromotimol
Agar base
Escherichia coli colonias amarillas, opacas, las cepas no fermentadoras dan colonias de
color azul.
Klebsiella sp. colonias muy mucosas de color variable, desde amarillo a blanco azulado.
Proteus sp. colonias translucidas azules, más pequeñas que las de E. coli
Staphylococcus aureus colonias convexas, amarillas.
Pseudomonas aeruginosa colonias planas, rugosas, de color verde a verde azulado y
borde irregular.
El Agar TCBS está especialmente recomendado para el aislamiento selectivo de Vibrios que provocan
afecciones coléricas, diarreas disentéricas y el examen de alimentos sospechosos de portadores de
los mismos.
Composición:
Peptona de caseína
Peptona de carne
Extracto de levadura
Citrato sódico
Tiosulfato sódico
Bilis bovina
Clorato sódico
Sacarosa
Cloruro de sodio
Citrato férrico
Azul de timol
Fundamento:
El Agar TCBS actualmente está aceptado de forma universal como el mejor para el aislamiento
diferencial de vibriones enteropatógenos, consiguiendo una fuerte inhibición de toda la flora
acompañante. Su formulación permite un abundante crecimiento de Vibrio cholerae y Vibrio
parahaemolyticus. También crecen en el Vibrio alginolyticus y los Vibrios NAG.
Las enterobacterias quedan fuertemente reprimidas por las elevadas concentraciones de citrato,
tiosulfato, bilis y cloruro sódico. Aunque pueden aparecer algunas colonias entéricas, su tamaño y
aspecto es fácilmente discernible de los vibrios.
Normalmente, de este medio, se seleccionan las colonias y se identifican con las pruebas primarias
(Oxidasa, reacciones en Agar Kligler, Voges-Proskauer y antibiograma) antes de pasar a la
seroidentificación y fagotipado.
Debido a su alta selectividad el medio admite inóculos masivos del material patológico.
Resultados:
El Agar Xilosa – Lisina – Desoxicolato es un medio diferencial, ligeramente selectivo, muy adecuado
para la detección de enterobacterias patógenas exigentes, sobre todo del genero Shigella.
La baja cantidad de Desoxicolato hace que la flora Grampositiva sea inhibida, pero en cambio
permite el crecimiento de Shigella con mayor facilidad que otros medios más selectivos.
Este Agar fue diseñado para detectar shigellae en heces después de enriquecimiento en caldo para
Gramnegativos.
Composición:
Xilosa
L-lisina
Lactosa
Sacarosa
Cloruro sódico
Extracto de levadura
Rojo fenol
Desoxicolato sódico
Tiosulfato sódico
Citrato férrico amónico
Agar base
Fundamento:
La fermentación de la Xilosa, Lactosa o Sacarosa provoca una acidificación del medio que se
manifiesta por un viraje del indicador a color amarillo alrededor de la colonia. Este color se va
debilitando, llegando a desaparecer a las 24 horas, por lo cual es recomendable la lectura entre las
18 – 24 horas.
La producción de H2S a partir del tiosulfato se detecta fácilmente por el ennegrecimiento de las
colonias en las que se deposita sulfuro de hidrogeno.
Resultados:
Todas las reacciones permiten una buena diferenciación de Shigella que no fermenta la xilosa y por
lo tanto dan una reacción de fermentación negativa.
Los miembros del gen ero Salmonella si pueden fermentar la xilosa, pero la agotan rápidamente y
la alcalinización del medio debido a la descarboxilación de la lisina enmascaran la reacción pudiendo
Con los restantes géneros de enterobacterias no ocurre este fenómeno debido a que el acumulo de
ácido por fermentación de lactosa y sacarosa es tan grande que impide la reversión del pH por
descarboxilación e incluso el depósito de precipitados de H2S, durante las primeras 24 horas.
Se trata de un medio altamente selectivo debido a su alta concentración salina lo que inhibe el
desarrollo de otros microorganismos (excepto los enterococos). Los Staphylococcus coagulasa
positivo hidrolizan el manitol acidificando el medio, las colonias aparecen rodeadas de una zona
amarilla brillante. Los Staphylococcus coagulasa negativos, presenten colonias rodeadas de una
zona roja o purpura.
Composición:
Manitol (1%)
NaCl al 7,5%
Indicador: “Rojo fenol”
Peptonas
Vancomicina
Trimetoprima
Polimixina B
Cefalotina
Anfotericina B
5% de oxigeno
10% de CO2
85% de nitrógeno
La morfología de las colonias de especies de Campylobacter en medios solidos varía desde planas,
grises, de forma irregular que puede ser secas o húmedas, a colonias redondas y convexas,
brillantes, de bordes enteros.
Utilidad:
Agar de Kligler
Fundamento:
El Agar de Kligler es un medio diferencial que reúne las características del agar
de dos azucares de Rusell y del medio de acetato de plomo para la detección de
H2S. En este medio se puede detectar la fermentación de la lactosa y la
producción de H2S, lo cual permite un diagnostico presuntivo de la mayor parte
de los géneros de la familia Enterobacteriaceae.
El Agar de Kligler se utiliza en tubos inclinados con una corta cuña y fondo abundante, que se
inoculan tanto en la superficie como en profundidad. El inoculo debe ser abundante y obtenido de
un medio sólido, ya que si se parte de caldo las lecturas pueden retrasarse hasta 2 – 3 días, cuando
lo normal es una incubación de 18 horas a 37°C.
Se recomienda utilizar tubos con tapones que permitan el acceso del aire por ejemplo: algodón,
celulosa o cap-o-test o bien si son cierres roscados dejarlos flojos (medio abiertos) ya que de otro
modo puede dificultarse la reoxidación del indicador.
Cuando la producción de H2S es muy abundante puede dificultarse la lectura, por lo que se
recomienda hacer lecturas tempranas.
Composición:
Peptona de gelatina
Extracto de levadura
Glucosa
Lisina
Citrato de hierro y amonio
Tiosulfato de sodio
Purpura de bromocresol
Agar base
Fundamento:
En este medio de cultivo, la peptona y el extracto de levadura aportan los nutrientes para el
desarrollo bacteriano. La glucosa es el hidrato de carbono fermentable y la lisina es el sustrato
utilizado para detectar la presencia de las enzimas descarboxilasas y desaminasa. El citrato de hierro
y amonio, y el tiosulfato de sodio, son los indicadores de la producción de ácido sulfhídrico. El
purpura de bromocresol, es el indicador de pH, el cual es de color amarillo a pH igual o menor a 5,2
y de color violeta a pH igual o mayor a 6,8.
Por descarboxilación de la lisina, se produce la amina cadaverina, que alcaliniza el medio y esto
produce un viraje del indicador al color violeta. La descarboxilación de la lisina, tiene lugar en medio
acido, por lo que es necesario que la glucosa sea previamente fermentada.
Los microorganismos que no producen lisina descarboxilasa, pero que son fermentadores de la
glucosa, producen un viraje de la totalidad del medio de cultivo a amarillo, pero a las 24 horas de
incubación se observa el pico de color violeta debido al consumo de las peptonas y el fondo amarillo.
La producción de sulfuro de hidrogeno (H2S), se visualiza por el ennegrecimiento del medio debido
a la formación de sulfuro de hierro.
Siembra:
Se siembra por punción profunda con aguja de inoculación, y se incuba en aerobiosis durante 24
horas a 37°C.
Interpretación:
A B C
A B C D
Caldo Selenito
Composición:
Peptona
Lactosa
Fosfato potásico
Selenito sódico
pH aproximado 7,0
Es un medio clásico para el enriquecimiento de patógenos intestinales, sobre todo los miembros del
genero Salmonella, a partir de muestras muy contaminadas con otras bacterias, como heces, orina,
aguas fecales, etc.
Composición:
Peptona de carne
Peptona de caseína
Sales biliares
Carbonato cálcico
Tiosulfato sódico
Verde brillante
Solución Yodo – yodurada
Novobiocina
La técnica usual de empleo es añadir una cantidad de muestra al caldo, en la proporción 1:10 y
después de homogeneizarlo, se incuba a 37°C durante un periodo no superior a las 48 horas, ya que
pasado este tiempo el medio pierde selectividad y la flora reprimida puede producir
sobrecrecimiento.
Luego de este periodo con un asa se toman alícuotas y se realizan siembras por agotamiento sobre
la superficie de medios selectivos, como el Agar S-S o el X.L.D.
La infusión de cerebro y corazón es un medio de cultivo clásico muy utilizado en microbiología clínica
para el cultivo de organismos patógenos, ya que mantiene muy bien las características de
antigenicidad, virulencia y toxicidad, y además está perfectamente adaptado para la adición de
sangre.
Composición:
Extracto de corazón
Extracto de cerebro
Proteosa peptona
Dextrosa
Cloruro sódico
Fosfato disódico
utilidad:
Sobre este medio se obtienen excelentes resultados en el cultivo de estreptococos que requieren
sangre para su crecimiento, meningococos e incluso hongos patógenos.
En este medio crecen bien todo tipo de bacterias aerobias o anaerobias, permite el desarrollo de
una amplia variedad de microorganismos, incluidos los nutricionalmente exigentes. Además, se
observa que las bacterias estrictamente aerobias crecen en la parte superior, mientras que las
anaerobias facultativas o anaerobias estrictas crecen en las profundidades del medio. Sirve para el
aislamiento tanto de anaerobios estrictos y facultativos como de microorganismos microaerofilicos.
La elevada viscosidad del medio de cultivo thioglicolato impide la penetración rápida de oxígeno.
Fundamento:
Resultados:
A) El oxígeno penetra solo una corta distancia en el tubo, de modo que los aerobios estrictos
solo crecen en la superficie.
B) Los anaerobios estrictos, como son sensibles al oxígeno, solo crecen en las profundidades.
C) Los aerobios facultativos, son capaces de crecer tanto en presencia como en ausencia de
oxígeno y crecen en todo el medio.
D) Los microaerófilos, crecen apartándose en la zona entre el oxígeno y ausencia de oxígeno.
E) Los anaerobios aerotolerantes crecen por todo el tubo, no obstante el crecimiento no es
mejor cerca de la superficie porque estos organismos solo son fermentadores.
El medio de transporte de Amies es una modificación al de Cary-Blair, que a su vez lo es del de Stuart.
En la formulación de Amies la solución salina está más equilibrada y además se ha suprimido el azul
de metileno ya que se había observado que podía resultar toxico para ciertos microorganismos.
Aunque originalmente Amies incluyo el carbón en el medio para poder usar hisopos limpios, muchos
clínicos prefieren aun el sistema clásico del hisopo impregnado de carbón y utilizar la base de
transporte sin él.
Basándose en la formulación de Stuart, Cary y Blair diseñaron este medio de cultivo para el
transporte de muestras fecales a los laboratorios. La principal modificación consistió en la supresión
del glicerofosfato por un tampón de fosfatos, que privaba a los microorganismos de toda fuente
energética y evitaba así el sobrecrecimiento de los gérmenes menos exigentes durante el
transporte. Además, suprimieron el azul de metileno que en algunos casos se había mostrado toxico
para ciertos biotipos y subieron el pH a 8,4 ya que facilita la viabilidad de las bacterias fecales.
Cuando las muestras son fecales se recomienda el uso de hisopos normales, sin preparación
especial, pero si el muestreo se realiza en tracto respiratorio, el mantenimiento de la viabilidad se
mejora utilizando hisopos impregnados de carbón.
Este medio está recomendado para el transporte o estacionamiento de las muestras tanto fecales
como de otros orígenes, actuando selectivamente en favor de los bacilos Gramnegativos, gracias a
su contenido en desoxicolato y citrato. Por este motivo puede ser utilizado como sustrato de
preenriquecimiento de enterobacterias patógenas, ya que inhibe el sobrecrecimiento de la flora
Grampositiva acompañante.
Prueba de la Catalasa
Técnica:
Con un palillo de madera estéril recoger el centro de una colonia pura del agar y colocarla sobre un
portaobjetos limpio, luego agregarle 2 o 3 gotas de H2O2.
Interpretación:
A. Catalasa negativo
B. Catalasa positivo
Utilidad:
Permite diferenciar entre los cocos Grampositivos, Staphylococcus spp. (Positivo) de Streptococcus
spp. (Negativo)
Prueba de la Coagulasa
Técnica:
Debido a que hay microorganismos que tienen dos tipos de coagulasa; libre y unida, existen dos
técnicas, en tubo y portaobjetos.
Para la prueba en tubo, esta debe ser leída a las 4 horas de incubación, luego de las 4 horas la lectura
puede arrojar falsos negativos porque puede ocurrir fibrinólisis.
1. Prueba en portaobjetos:
a) Colocar una gota de agua destilada sobre un
portaobjetos
b) Agregar una gota de suspensión bacteriana y
homogeneizar
c) Agregar una gota de plasma
d) Se observa una reacción positiva (grumos blanquecinos) en 5 a 20 segundos.
2. Prueba en tubo:
a) En un tubo de vidrio agregar 0.5ml de plasma + __
b) Tomar una asada de una colonia y mezclar suavemente
c) Incubar a 37°C por 4 horas (observar cada 30 minutos)
d) Inclinar suavemente él tuvo para ver si hay coagulo
Utilidad:
Se basa en la presencia de la enzima termoestable DNAsa que es capaz de clivar los enlaces
fosfodiester internos de la molecula de DNA. Se utiliza un medio solido que contiene verde de
metilo, el cual se combina con DNA altamente polimerizado. Cuando la combinacion ocurre, por
accion de la enzima DNAsa, se produce una decoloracion del medio.
Interpretacion:
Utilidad:
Permite diferenciar Staphylococcus aureus, la unica especie dentro del genero Staphylococcus que
posee DNAsa, de las otras especies.
Esta prueba es especialmente util cuando algunas cepas de S. aureus producen reacciones de
coagulasa equivocas o debiles en tubo y en realidad algunos aislamientos raros pueden ser
coagulasa negativos. En estas circunstancias puede ser de utilidad llevar a cabo este prueba.
Tecnica:
Se siembra una asada de una colonia pura en un placa de Agar Müeller-Hinton con un hisopo
embebido con la suspension de la cepa a estudiar. Luego se aplica el disco de novobiocina (5ug) y
se incuba a 35°C por 18 – 24 horas.
Interpretacion:
Tecnica:
Se realiza una siembra masiva de una colonia pura en una placa de Agar Sangre y se coloca el disco
de bacitracina en el centro, incubar en CO2 a 35°C por 18 – 24 horas.
Prueba de la Urea
Mide la capacidad que tienen algunas bacterias para producir Ureasa, una enzima que hidroliza la
urea originando amonio lo que producirá un incremento del pH que puede detectarse con el
indicador de pH “Rojo Fenol”.
Interpretación:
Proteus: positivo
Klebsiella: positivo
Escherichia: negativo
Providencia: negativo
Salmonella: negativo
Este medio indica la capacidad de las bacterias de metabolizar el citrato. Contiene citrato como
única fuente de carbono, fosfato de amonio como única fuente de fosfato y “Azul de bromotimol”
como indicador de pH.
Interpretación:
Salmonella: positivo
Klebsiella: positivo
Enterobacter: positivo
Citrobacter: positivo
Serratia: positivo
Proteus: positivo
Escherichia coli: negativo
Prueba de la fenilalanina
Interpretación:
Proteus: positivo
Providencia: negativo
Otras Enterobacteriaceae: negativo
Interpretación:
Pseudomonas: positivo
Moraxella: positivo
Neisseria: positivo
Plesiomonas shigelloides: positivo
Enterobacteriaceae: negativos
Acinetobacter: negativo
Técnica:
Estriar un cuadrante de una placa de agar sangre en varias direcciones con una asada de la
colonia pura en estudio.
Colocar un disco de Optoquina o taxo P en el centro del área estriada.
Incubar 18 – 24 horas a 35°C.
Interpretación:
NOTA: la prueba del taxo P debe realizarse en Agar Sangre, ya que los Streptococcus requieren
sangre para crecer. NO es un antibiograma, es un prueba de IDENTIFICACIÓN.
Controlar la capacidad de las células bacterianas de producir lisis en presencia de sales biliares, en
un tiempo y con una temperatura específicas.
Utilidad:
Se utiliza específicamente para diferenciar entre Streptococcus pneumoniae soluble en bilis, de otras
especies de Streptococcus alfa-hemolíticos no solubles en bilis.
Interpretación:
Fundamento técnico:
La esculetina reacciona con una sal de hierro para formar un complejo castaño oscuro o negro. El
citrato de hierro se incorpora al medio de esculina con bilis en una concentración del 0,05% como
indicador de la hidrolisis de la esculina y de la formación de esculetina resultante.
Interpretación:
Utilidad:
Esta prueba es especialmente útil en el cultivo de exudados vaginales de mujeres embarazadas para
diferenciar Streptococcus agalactiae negativo (un patógeno importante en recién nacidos) de
Enterococcus positivo.
Se basa en la capacidad de los Enterococcus de crecer a una concentración de NaCL de 6,5%. Se trata
de un medio líquido que además contiene glucosa y un indicador de pH “Purpura de bromocresol”.
Interpretación:
Se considera positiva la presencia de turbidez, con o sin acidificación del medio, que se observa
como un viraje de color purpura a amarillo.
El medio contiene triptófano, y la liberación de indol por acción de la enzima se detecta por la
aparición de un anillo de color rojo después de agregar una solución del revelador “Kovac o Erlich”.
Interpretación:
Utilidad:
Interpretación:
Bacterias móviles:
Enterobacter
Proteus
Vibrio
Plesiomonas shigelloides
Entre otros.
Enterobacter
Proteus mirabilis
Yersinia enterocolitica
Medir la capacidad enzimática de un organismo para descarboxilar un aminoácido para formar una
amina, con la consiguiente alcalinidad. Las pruebas de las descarboxilasas se emplean
fundamentalmente para determinar grupos bacterianos entre las Enterobacteriaceae.
La L-arginina sufre la descarboxilación para dar agmatina, una molécula más grande que la
putrescina, que no puede ser considerada el producto final en el catabolismo de la arginina
por las bacterias vivas. La acción catalítica de la enzima agmatinasa desdobla la agmatina en
putrescina y urea. Si se encuentra la enzima ureasa, la urea es también catabolizada en
amoniaco.
El indicador “Pupura de bromocresol” produce los mismos cambios para cualquier aminoácido,
prueba positiva (color purpura) y prueba negativa (color amarillo).
Interpretación:
Lisina-descarboxilasa:
Salmonella: positivo
Citrobacter: negativo
Enterobacter: negativo
Ornitina-descarboxilasa:
Enterobacter: positivo
Proteus mirabilis: positivo
Klebsiella: negativo
Proteus vulgaris: negativo
Arginina-deshidrolasa:
Es una prueba cualitativa de la producción de ácido (determinación del pH), algunos organismos
producen más ácidos que otros.
Fundamento técnico:
La prueba de RM (Rojo de Metilo) se basa en el empleo de un indicador del pH, rojo de metilo, para
determinar la concentración de iones hidrogeno (pH) presente cuando un organismo fermenta la
glucosa.
Interpretación:
Reacción de Voges-Proskauer
Fundamento técnico:
Utilidad:
La reacción de Voges-Proskauer para la acetoína se usa sobre todo para separar a la E. coli de los
grupos Klebsiella y Enterobacter, aun cuando otros miembros de las Enterobacteriaceae son capaces
de producir una reacción de VP positiva.
Reactivos reveladores:
El primer reactivo agregado es una alícuota incubada del catalizador alfa-naftol, actúa como
intensificador de color, lo que aumenta la sensibilidad de la reacción sin pérdida de su especificidad.
El segundo reactivo es KOH al 40% (o NaOH al 40%), que cuando se agrega al medio VP, contribuye
a la absorción de CO2. No debe exceder un volumen exacto de 0,2ml. El KOH reaccionara con la
peptona dando un color rosado salmón.
Interpretación:
VP positivo VP negativo
Color rojo rosado en la superficie del Color amarillo en la superficie del medio,
medio, y permanece 10min. o el anillo rojo rosado desaparece en
10min.
VP negativo VP positivo