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UNIVERSIDAD RAFAEL LANDIVAR

FACULTAD DE CIENCIAS AMBIENTALES Y AGRICOLAS


FITOPATOLOGIA I
CATEDRATICO: ING. AGR. JULIO R GARCIA
CAMPUS CENTRAL

GUATEMALA
PROGRAMACIÓN DE PRÁCTICAS

PRACTICA
PRACTICA TEMA FECHA
1 EQUIPO UTILIZADO EN EL LABORATORIO DE 14/08/2012
FITOPATOLOGIA
2 TOMA DE MUESTRAS, TRANSPORTE Y 24/08/2012
ALMACENAMIENTO
3 RECONOCIMIENTO DE SINTOMAS Y SIGNOS 16/08/2012
4 ELABORACIÓN Y CONSERVACION DE MONTAJES 16/08/2012
5 PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO 23/08/2012
6 AISLAMIENTO DE HONGOS EN MEDIOS DE 28/08/2012
CULTIVO
7 IDENTIFICACION DE HONGOS VERDADEROS 04/09/2012
(REINO FUNGI)
8 IDENTIFICACION DE HONGOS ANAMÓRFICOS 06/09/2012
9 IDENTIFICACION DE ORGANISMOS SIMILARES A 11/09/2012
HONGOS (REINO CROMISTA)
10 AISLAMIENTO DE BACTERIAS FITOPATOGENAS 20/09/2012
11 IDENTIFICACION DE BACTERIAS FITOPATOGENAS 25/09/2012
12 METODOS DE EXTRACCION DE NEMATODOS 04/10/2012
FITOPARÁSITOS
13 IDENTIFICACION DE NEMATODOS FITOPARASITOS 09/10/2012
14 TRANSMISIÓN Y RECONOCIMIENTO DE SINTOMAS 25/10/2012
DE VIRUS FITOPATOGENOS
15 MONITOREO Y ELABORACION DE ESCALAS DE No se
SEVERIDAD realizará
Practica No. 1
EQUIPO UTILIZADO EN EL LABORATORIO DE FITOPATOLOGIA

Introducción

El diagnóstico fitopatológico en laboratorio es una fase importante de la fitopatología.


Basándose en paradigma etiológico de las epidemias, es importante conocer cuál es el
agente causal de la enfermedad en estudio para tener algunas bases en la toma de
decisión en el manejo. Para aislar e identificar los patógenos asociados a
enfermedades en plantas es necesario una serie de equipos y materiales que facilitan
estas prácticas. De ahí la importancia de conocerlas, saber como funcionan y como se
pueden dirigir para un correcto y certero diagnóstico de enfermedades.

Objetivo

• Demostrar el equipo básico, los materiales y reactivos que se utiliza en el


laboratorio de fitopatología.
• Enseñar el uso y funcionamiento de cada equipo, material y reactivo.

Materiales y Equipo

• Microscopio
• Estereoscopio
• Autoclave
• Centrifuga
• Incubadora
• Tamices
• Cámara de flujo laminar
• Licuadora
• Pinzas con punta fina
• Agujas de disección
• Portaobjetos
• Cubreobjetos
• Bisturí No. 22 y No. 15
• Gillettes
• Alcohol al 95% y al 70%
• Hipoclorito de sodio al 1%
• Mechero (de alcohol o gas)
• Material vegetal (hojas)
• Lactofenol azul o rojo

Observe cada equipo y material que se utiliza en el laboratorio, consulte a su


catedrático cualquier duda del funcionamiento y responda:

1. Cuál es la función del autoclave y como es su funcionamiento.


2. Para que sirve la campana de flujo laminar? Explique
3. Explique el funcionamiento de la centrifuga y proponga algún uso para realizar
diagnostico fitopatológico?
4. Cree que los materiales y reactivos que se utilizan son muy especializados o
son sencillos? Haga un cuadro con sus comentarios
5. Del listado de equipo y materiales, Cuál piensa que son indispensables para
realizar un buen diagnóstico fitopatológico?
6. Investigue el equipo utilizado en las técnicas modernas de diagnostico y haga
un cuadro comparativo incluyendo ventajas y desventajas.
Practica No. 2
TOMA DE MUESTRAS, TRANSPORTE Y ALMACENAMIENTO

Introducción.

Un aspecto importante cuando se tiene un problema con enfermedades en plantas es


saber realizar el muestreo. El muestreo de enfermedades puede realizarse de varias
maneras: aleatorio, sistemático o dirigido. La metodología de muestreo depende
mucho de cómo se distribuya la enfermedad dentro de la parcela a muestrear. Es
probable que si se tiene una enfermedad con una distribución agregada o en focos y
se realiza un muestreo aleatorio, los resultados no sean significativos lo cuál va a
provocar que se tenga que tomar mas muestra y que como consecuencia provoque
más gasto en tiempo y dinero.

Otro aspecto importante es el transporte y almacenamiento de la muestras. En climas


tropicales como el nuestro, las temperaturas tienden a elevarse en algunas zonas lo
cuál puede provocar que las muestras se deshidraten rápidamente o se acelere el
proceso de degradación de los tejidos. Si se toman muestras de suelo y raíz para
análisis nematológico se debe tener cuidado con este aspecto ya que los nematodos
no soportan altas temperaturas y esto puede causar que se arruine la muestra y por
consiguiente el análisis posterior no será certero.

Por lo anterior, la importancia de esta práctica radica en que el estudiante pueda tener
criterios en la toma de decisión en el método de muestreo a utilizar y proceda
correctamente en el transporte y almacenamiento de las muestras en el laboratorio
para su posterior análisis.

Objetivos

• Enseñar las diferentes metodologías de muestreos para enfermedades foliares


y sistémicas.
• Diseñar una metodología de muestreo nematológico.
• Demostrar al estudiante la forma correcta de almacenar y transportar las
muestras tomadas en campo.

Materiales y Equipo

• Bolsas plásticas
• Papel mayordomo
• Pinzas grandes
• Tijeras para podar
• Navajas o cuchillas
• Hieleras
• Marcadores permanentes
• Cubetas plásticas
• Pala pequeña (de jardinería)
• Barrenos para suelo
• GPS
• Lupa 10x
Desarrollo de la práctica

Para enfermedades foliares:

• Observe los cultivos e identifique sintomatologías.


• Fotografíe la sintomatología (consulte a su catedrático
catedrátic la calidad de la
fotografía).
• Identifique con el marcador la bolsa donde se colocará
colocará la muestra.
• Tome al menos 25 - 50 hojas aleatoriamente (cada hoja es una submuestra)
con el síntoma identificado.
• Si hubiera dos síntomas tome una muestra compuesta por cada síntoma.
• Coloque un pedazo de papel mayordomo húmedo (no muy mojado) dentro de
la bolsa con la muestra y proceda a cerrar la bolsa.
• Coloque la bolsa dentro de la hielera.
• Anote la localización, cultivo, I.D de muestra y sintomatología (puede usar de
referencia la fotografía).

Para enfermedades en raíz y tallos:

• Observe los cultivos


ivos e identifique los síntomas.
• Identifique con el marcador la bolsa donde se colocará la muestra.
• Tome al menos 5 plantas completas aleatoriamente (cada planta es una
submuestra) con la sintomatología.
• Coloque un poco de suelo húmedo (preferiblemente que no sea lodo) dentro de
la bolsa para mantener la humedad.
• Cierre la bolsa y colóquela en la hielera.
• Anote la localización (puede utilizar GPS), cultivo, I.D de muestra, y
sintomatología (puede usar de referencia la fotografía).

Para muestreo de suelo y raíz (nematodos):

• Observe el tamaño de las parcelas objetivo.


• Identifique si hay sintomatología en plantas y fotografíe.
• Seleccione al menos 10 puntos de muestreo (puede ser aleatorio,
sistematizado o dirigido). Entre más puntos elija,
elija más certero será sus
su
resultados.

Figura 1. (a) Muestreo al azar; (b-d)


(b Muestreo sistemático
Fuente: Coyne et al, 2007

• Proceda a tomar una muestra de suelo de aproximadamente 30 cms de


profundidad a entre la base del tallo y el punto de goteo (a la mitad), cercana a
la rizosfera, como se indica en la Figura
F 2.
Toma de muestra.
20 - 30 cm de profundidad.

Punto de goteo

Figura 2. Lugar de toma de muestra de suelo y raíz para análisis nematológico


Fuente Fotografía: Grupo Editorial Norma, S.A. (2010).

• Coloque e la submuestra en una cubeta plástica. La siguiente submuestra


deberá colocarla en la misma cubeta para revolverlas posteriormente.
• Cerca del punto puede tomar la muestra de raíz, en plantas pequeñas como
hortalizas puede arrancar una planta completa y si son arboles grandes tome
una muestra de raicillas en el punto donde saco el suelo.
• Debe haber por lo menos 10 g de raicillas por muestra, por lo tanto debe tomar
al menos 1g de raicillas por cada submuestra.
• Coloque la muestra de raíz en una bolsa plástica
plástic identificada.
• Cuando termine de recolectar el suelo proceda a revolver bien.
• Coloque 2 lb de muestra (suelo revuelto) dentro de la bolsa que contiene la
muestra de raicillas correspondiente a cada muestra.
• Coloque las muestras en la hielera.
• Anote la localización
alización (puede utilizar GPS), cultivo, I.D de muestra, fecha de
muestreo y sintomatología (puede usar de referencia la fotografía).

Proceda a llevar todas las muestras tomadas e identificadas al laboratorio y guarde en


la refrigeradora.

Conteste las siguientes preguntas:

1. Por qué se coloca un pedazo de papel mayordomo humedecido en la bolsa con


las muestras?
2. Por qué se utiliza una hielera para transportar las muestras?
3. Cómo almacenaría las muestras sino pudiera analizarlas de inmediato?
4. Cuál serían algunos criterios en la selección de un sistema de muestreo
5. Investigue algunas metodologías de determinación del tamaño de muestra o
número de muestras
6. Según su criterio, cuál sería el tiempo máximo de almacenaje en condiciones
óptimas antes de que la muestra
mues se arruine

Bibliografía

Coyne, D; Nicol, J; Claudius, B. (2007). Nematología práctica: Una guía de campo y


laboratorio. SP-IPM
IPM Secretariat, International Institute of Tropical Agriculture
(IITA), cotonou, Benin. 82p
Grupo Editorial Norma S.A. (2010). La planta y sus partes. Disponible en:
http://www.eleducador.com/ecu/contenido/contenido_preview.aspx?conID=367
5&catID=359

Harmon, C; Tolin, S; Arevalo, M; Diaz, J; Palmieri, M. (2008). Advance plant diagnostic


training. Proyecto IPDN – CRSP Centroamérica y el Caribe.
Practica No.3
RECONOCIMIENTO DE SINTOMAS Y SIGNOS

Introducción

Luego de realizar correctamente el muestreo y llevarlo al laboratorio se puede


proceder al análisis de las muestras recolectadas. Para el diagnóstico de
enfermedades un aspecto importante es identificar los síntomas que se presentan,
estos pueden dar mucha pauta adonde dirigirse para el análisis. Por ejemplo una
marchitez o una clorosis puede dirigir el análisis a la base del tallo o raíz en busca de
Fusarium spp, Ralstonia solanacearum o nematodos, dependiendo del hospedero.
Algunos mosaicos, moteados, enanismos o enrollamiento de hojas puede deberse a
una infección por virus. Las manchas foliares pueden asociarse con el tipo de
hospedero para tener mas o menos una idea de cual organismo es el que esta
afectando.

Por eso la importancia de que el estudiante caracterice y reconozca los síntomas y


signos de diferentes enfermedades radica en que a través de estos la identificación de
los patógenos pueda realizarse. En caso no hubiera signos, se pueden inducir a través
de técnicas clásicas como cámaras húmedas, medios Agar, o flujos bacterianos.

Objetivos

• Caracterizar sintomatologías de diferentes enfermedades.


• Reconocer los signos que se presentan en algunas enfermedades.

Materiales y Equipo

• Estereoscopio
• Pinzas con punta fina
• Pinzas grandes
• Cartulina blanca
• Material vegetal enfermo

Procedimiento:

• Prepare el equipo y los materiales


• Observe la sintomatología del material enfermo
• Descríbala y fotografíe
• Proceda a observar bajo estereoscopio
• Identifique los signos
• Descríbalos y fotografíe

Conteste lo siguiente:

1. Con sus palabras escriba un concepto de enfermedad


2. Con sus palabras escriba un concepto de síntoma y signo de una enfermedad
3. Investigue la sintomatología de las siguientes enfermedades: Sphaceloma
fawceti en aguacate, Plasmodiophora brassicae en brócoli, Fusarium
oxysporum arveja china, TSWV en tomate, ALC en cocotero.
Bibliografía

Agrios, G. (2005). Plant Pathology. 5th edition. ELSEVIER Academic Press. Florida,
USA. 922p.
Practica No.4
ELABORACIÓN Y CONSERVACION DE MONTAJES

Introducción

Dentro de las técnicas clásicas de diagnóstico, la identificación de patógenos en base


a morfología (sobre todo hongos y nematodos) es la más utilizada como un
diagnóstico rápido pudiendo determinar a nivel de género. Para poder lograr esto es
necesario obtener buenos montajes, es decir, que los resultados de la identificación
son directamente proporcionales a la calidad del montaje que se elabore. También es
muy necesario realizar colecciones de referencia con montajes permanentes con
información que permita realizar una base de datos.

Entre las diferentes técnicas de elaboración de montajes esta el raspado que consiste
en tomar directamente las estructuras (comúnmente hongos) del material vegetal que
se pueden observar en el tejido afectado. Por otro lado están los cortes de tejidos, esto
permite tener un panorama histológico de infección y desarrollo del patógeno, así
como también observar las estructuras importantes de identificación. Las estructuras
del raspado o el corte se colocan directamente en una solución que permite que la
muestra este hidratada y fijada. Para montajes temporales se pude usar agua
destilada, este permite observar el montaje e identificarlo en el momento. Para
montajes permanentes se puede usar lactofenol o gelatina glicerada, estos permitirán
fijar y conservar la muestra.

Objetivos

• Aprender la metodología para elaborar y conservar los montajes de agentes


causales de enfermedades en plantas.

Materiales y Equipo

• Estereoscopio
• Microscopio
• Agujas de disección
• Pinzas con punta fina
• Cartulina blanca
• Portaobjetos
• Cubreobjetos
• Lactofenol azul y rojo
• Agua destilada
• Gelatina glicerada
• Pintauñas transparente
• Material vegetal enfermo (preferiblemente hongos)

Desarrollo de la práctica

• Identifique la sintomatología del material y fotografíe


• Observe en el estereoscopio e identifique si hay signos del patógeno y
fotografíe.
Raspados:

• Coloque una gota de lactofenol o agua destilada en un portaobjetos.


• Con ayuda de la aguja de disección tome las estructuras observadas del
patógeno y llévelas hacia la gota de solución en el portaobjetos
• Colocar cubre objetos sin causar burbujas de aire, como se indica en la Figura
3.

Figura 3. Diagrama de colocación del cubreobjetos. Se debe colocar a 45° para evitar
la formación de burbujas de aire.

• Observe al microscopio y fotografíe

Cortes:

• Realice cortes transversales de los tejidos afectados lo más delgado posible


con ayuda de un Gillette (consulte al catedrático el grosor del corte) bajo el
estereoscopio.
• Cuando tenga el corte colóquelo sobre un portaobjetos.
• Coloque encima un cubreobjetos y presione un extremo del mismo sin destruir
el tejido del corte.
• Donde quedo levantado agregue Lactofenol o agua destilada hasta que se
cubra todo el montaje.
• Observe al microscopio y fotografíe.

Conservación:

• Puede utilizar una porción pequeña de gelatina glicerada encima de un


portaobjetos.
• Con ayuda de un encendedor calentar debajo del portaobjetos hasta que la
gelatina se derrita.
• Realice el corte o raspado y coloque en la gelatina derretida.
• Ponga el cubre objetos.
• Observe en microscopio y fotografíe.
• Cuando el montaje este listo y deseado, se sella con ayuda del pintauñas en
los extremos del cubreobjetos.
• Para conservación se puede utilizar también Lactofenol y para montajes con
nematodos soluciones de formaldehido.
• Cuando el montaje este sellado por completo se procede a colocar una
etiqueta para su identificación con los siguientes datos:

Organismo (nombre científico)


Cultivo (hospedero)
Fecha de elaboración del montaje
Localización (preferiblemente coordenadas)
Figura 4. Diagrama de un montaje permanente debidamente identificado.
Fuente: Agudelo, 2009

Conteste lo siguiente:

1. Escriba cuál son según su criterio, las características de un buen montaje


2. Investigue porqué se utiliza Lactofenol o gelatina glicerada para un montaje
permanente.
3. Investigue una metodología de tinción para observar montajes en microscopio
electrónico de barrido

Bibliografía

Agrios, G. (2005). Plant Pathology. 5th edition. ELSEVIER Academic Press. Florida,
USA. 922p.

Agudelo, P. (2009). Curso de identificación de nematodos fitoparásitos. URL, Clemson


University and APS Office of International Programs. Guatemala.
Practica No.5
PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO

Introducción

Una de las metodologías para diagnóstico fitopatológico muy útil es la elaboración de


cultivos in vitro de los agentes patogénicos que afectan a las plantas (comúnmente
usados en hongos y bacterias). La elaboración de estos medios de cultivo no requiere
mayor ciencia ni especialidad, únicamente se debe seguir las recetas cumpliendo con
cada reactivo. Los medios pueden ser sólidos o líquidos, específicos de algún grupo
de patógenos y pueden servir para caracterizar bioquímicamente los patógenos.

Cada reactivo que se agrega al medio tiene una finalidad, puede ser nutricional,
inductora al desarrollo de cuerpos fructíferos, inhibidora y en otros casos indicadora
para los patógenos o microorganismos aislados. Es importante conocer al menos los
medios de cultivo más comunes para diagnóstico fitopatológico.

Objetivos

• Conocer la metodología de elaboración de medios de cultivo Agar que se


utilizan en diagnostico fitopatológico.
• Dar al estudiante las recetas de algunos medios de cultivo Agar que más se
usan en laboratorio.

Materiales y Equipo

• Autoclave • Extracto de levadura


• Erlenmeyer 250 ml • Dextrosa (Glucosa)
• Beakers de 1000 ml y 500 ml • Carbonato de calcio
• Plancha de calentamiento con • Extracto de carne (Difco)
agitador • Peptona
• Agitador magnético • NaCl
• Agua destilada • Azul Bromotimol (solución al 1%)
• Jugo de vegetales (V8) • Agar
• Papas • Cajas de petri estériles
• Dextrosa • Tubos de ensayo con gradilla
• Peptona Proteosa No.3 • Algodón
• K2HPO4 • Pipetas de 5 ml
• MgSO4 . 7H2O • Glicerol

Desarrollo de la práctica

Agar Nutritivo (AN):

Para un 1L de medio:
Extracto de carne 3 g
Peptona 5g
Agar 15 g

• Mezclar todos los ingredientes en 1,000 ml de agua destilada y dejar a punto


de ebullición con constante agitación.
• Ajustar a pH 6.8 – 7.2
• Autoclave a 121°C a 1atm (14.7 P.S.I) de presión p or 15 – 20 minutos.
• Deje enfriar a 55 - 50°C
• Vierta en las cajas de petri
• Selle las cajas e identifique con un marcador el tipo de medio.

Papa Dextrosa Agar (PDA):

Para un 1L de medio:
Papa (sólida) 250 g
Dextrosa 20 g
Agar 20 g

• Cocinar los 250g de papa en 500ml de agua por 1 hora.


• Agregue en otro recipiente 500ml de agua y mezcle el Agar.
• Agregue la infusión de papa en el recipiente con el agar (con ayuda de una
gasa doblada, cuele la papa).
• Agregue la dextrosa y lleve a punto de ebullición con constante agitación.
• Autoclave a 121°C a 1atm (14.7 P.S.I) de presión p or 15 – 20 minutos.
• Deje enfriar a 55 - 50°C
• Vierta en las cajas de petri
• Selle las cajas e identifique con un marcador el tipo de medio.

Medio V8 agar (V8A):

Para un 1L de medio:
Jugos de vegetales V8 200 ml
CaCO3 3g
Agar 20 g

• Coloque en un recipiente 500 ml de agua destilada


• Agregue el jugo, el CaCO3 y el agar
• Ajuste a 1 L con agua destilada
• Dejar a punto de ebullición con constante agitación.
• Autoclave a 121°C a 1atm (14.7 P.S.I) de presión p or 15 – 20 minutos.
• Deje enfriar a 55 - 50°C
• Vierta en las cajas de petri. Mientras vierte el medio debe agitarlo
constantemente para que este no se precipite al fondo del recipiente.
• Selle las cajas e identifique con un marcador el tipo de medio.

King’s B agar (KB):

Para un 1L de medio:
Peptona Proteosa No. 3 20 g
K2HPO4 1.5 g
MgSO4 . 7H2O 1.5 g
Glicerol 10 ml
Agar 15 g

• Mezclar todos los ingredientes en 1,000 ml de agua destilada y dejar a punto


de ebullición con constante agitación.
• Ajustar a pH 6.8 – 7.2
• Autoclave a 121°C a 1atm (14.7 P.S.I) de presión p or 15 – 20 minutos.
• Deje enfriar a 55 - 50°C
• Vierta en las cajas de petri
• Selle las cajas e identifique con un marcador el tipo de medio.
Extracto de Levadura-Dextrosa-Carbonato de Calcio Agar (YDC):

Para un 1L de medio:
Extracto de levadura 10 g
Dextrosa (Glucosa) 20 g
CaCO3 20 g
Agar 15 g

• Mezclar todos los ingredientes en 1,000 ml de agua destilada y dejar a punto


de ebullición con constante agitación.
• Ajustar a pH 7.2
• Autoclave a 121°C a 1atm (14.7 P.S.I) de presión p or 15 – 20 minutos.
• Deje enfriar a 55 - 50°C
• Vierta en las cajas de petri (tiene que agitar constantemente cuando se vierta
sino el CaCO3 se precipita al fondo del recipiente y el medio no queda blanco)
• Selle las cajas e identifique con un marcador el tipo de medio.

Medio Hugh and Leifson (O – F):

Para un 1L de medio:
Peptona 2g
NaCl 5g
K2HPO4 0.3 g
Azul Bromotimol (sol. 1%) 3 ml
Dextrosa (Glucosa) 10 g
Agar 3g

• Mezclar todos los ingredientes en 1,000 ml de agua destilada y dejar a punto


de ebullición con constante agitación.
• Ajustar a pH 7.1 (Debe tener una coloración verde-azul)
• Con ayuda de una pipeta coloque 5 ml de medio en tubos de ensayo.
• Tape los tubos con algodón.
• Autoclave a 121°C a 1atm (14.7 P.S.I) de presión p or 15 – 20 minutos.
• Deje enfriar y que solidifique el medio.
• No debe de tocar el algodón ya que sirve de filtro para evitar la contaminación
del medio.

Conteste lo siguiente:

1. Si se quisiera hacer los mismos medios pero en forma líquida, que haría?
2. Por qué se debe sellar las cajas petri conteniendo el medio sólido?
3. Investigue la receta para la elaboración y el uso del medio D1M, TZCA, CMA,
Agar Sabouraud.
4. Que agregaría a los medios si quisiera evitar el crecimiento de hongos
contaminantes? y de bacterias contaminantes?
5. Escriba ventajas y desventajas del uso de medio de cultivos para diagnóstico.
Bibliografía

Gonzales, M. (2003). Cultivo in vitro de ojo de gallo. Hoja técnica No. 44. CATIE.
Manejo Integrado de Plagas y Agroecología (Costa Rica) No. 67 p 91-93.

USAC. (2003). Caracterización de bacterias fitopatógenas. Manual de laboratorio de


Introducción a la Fitopatología. Facultad de Agronomía, Subarea de Protección de
Plantas. 13p.
Practica No. 6
AISLAMIENTO DE HONGOS EN MEDIOS DE CULTIVO

Introducción

Los hongos verdaderos son organismos que afectan diversos cultivos y son muy
variables en cuanto a su bioecología. Un hongo verdadero se puede aislar en medio
de cultivo fácilmente si este no es un parasito obligado como las royas o como las
cenicillas. En algunos casos se utilizan medios de cultivos especiales y específicos,
pero son muy costosos y el procedimiento es complicado, para efectos de diagnóstico
no es práctico.

Un hongo se puede aislar de cualquier órgano y cualquier tejido de la planta que este
afectado por este, el procedimiento es sencillo y se debe tener mucha asepsia al
momento de realizar el aislamiento. Después de aislado se purifica y se procede a
identificar el organismo. Los medios más utilizados son el PDA y el V8A, por ser los
más nutritivos que pueden inducir a una alta esporulación de los hongos en especial el
medio V8A.

Objetivo

• Aprender la metodología para realizar siembras de tejido afectado por


enfermedades fungosas en medios de cultivo para aislamiento y determinación
de hongos.

Materiales y Equipo

• Medio PDA
• Medio V8A
• Alcohol al 95% y al 70%
• Hipoclorito de sodio al 1%
• Cajas petri pequeñas
• Vidrios de reloj
• Agua estéril
• Papel absorbente estéril
• Tijeras
• Pinzas
• Mechero
• Incubadoras
• Beaker 250ml
• Marcadores permanentes punta fina
• Material vegetal enfermo (preferiblemente hojas afectadas con hongos)

Desarrollo de la práctica:

• Tome el material vegetal y caracterice sintomatología


• Corte explantes del material enfermo para aislar el hongo, como se muestra en
la figura 5. El explante debe tener tejido enfermo y tejido sano.
Figura 5. Diagrama del corte de tejido afectado y sano en un explante.

• Colocar al menos 15 explantes de la muestra en una caja petri pequeña y


proceder a lo siguiente, flameando con alcohol al 95% y un mechero las pinzas
en cada paso:

o Agregar agua estéril para limpiarlos


o Deseche el agua en un beaker
o Agregar alcohol al 70% por 1 minuto
o Desechar alcohol
o Agregar Hipoclorito de sodio al 1% por 2 minutos
o Desechar Hipoclorito
o Agregar agua estéril para lavar
l el hipoclorito
o Realizar 2 veces el lavado
o Colocar los explantes sobre un papel absorbente estéril y cubrirlos con
otro pedazo de papel

• Deje que se seque para evitar el crecimiento de bacterias en el medio.


• Cuando estén bien secos, coloque 4 a 5 explantes
explantes por cada caja de petri con
medio de cultivo.

Figura 6. Diagrama de colocación de explantes en el medio de cultivo

• Selle la caja de petri e identifíquela con el tipo de medio, I.D muestra, cultivo y
fecha
• Coloque las cajas con los explantes sembrados en una incubadora a 27°C y
observe a las 48 hrs.
Purificación:

• Cuando se obtenga micelio en crecimiento de los explantes, debe seleccionar


los más limpios (sin bacteria).
• Cortar un cuadro de medio de cultivo que contenga un tipo de micelio y
colóquelo al medio de otra caja de petri con medio de cultivo como se indica en
la figura 6.

Figura 7. Diagrama del aislamiento de micelio para purificación

• El micelio crecerá en el medio con más pureza.


• Observar las diferencias de la caja con explantes y las cajas purificadas con el
hongo.

Conteste lo siguiente:

1. Por qué los explantes deben tener tejido sano al momento de cultivarlos?
2. Por qué es importante que antes de pasar los explantes, después de
desinfectar, al medio de cultivo deben estar secos? Explique la causa
3. Investigue la metodología para elaborar cultivos monospóricos de hongos
4. Investigue la metodología para conservar los cultivos de hongos purificados
5. Elabore un diagrama de flujo con el procedimiento de aislamiento y purificación
de hongos en medio de cultivo.

Bibliografía

Agrios, G. (2005). Plant Pathology. 5th edition. ELSEVIER Academic Press. Florida,
USA. 922p.

Harmon, C; Tolin, S; Arevalo, M; Diaz, J; Palmieri, M. (2008). Advance plant diagnostic


training. Proyecto IPDN – CRSP Centroamérica y el Caribe.
Practica No. 7
IDENTIFICACION DE HONGOS VERDADEROS (REINO FUNGI)

Introducción

Los hongos verdaderos (reino fungi) son organismos que se pueden encontrar en
cualquier cultivo causando enfermedades, en su mayoría el Phylum Ascomycota. Este
es el phylum más extenso en cuanto a agentes causales de enfermedades fungosas
en plantas. Dentro de este grupo de hongos verdaderos también se encuentra el
Phylum Basidiomycota con enfermedades como royas y carbones, además de también
encontrar los hongos macro como los champiñones, anacates, ostra, etc. El Phylum
Zygomycota y Chytridiomycota son los agentes fitopatógenos en menor proporción
dentro del grupo de hongos verdaderos. El phylum Zygomycota en su mayoría se
encuentra en el ambiente y son contaminantes, representan problemas en Post-
cosecha. Dentro del phylum Chytridiomycota el género que resalta es Olpidium spp
que es vector de virus en cultivo de melón.

Las nuevas clasificaciones actualmente se están realizando en base a características


moleculares, pero siempre tomando en cuenta la morfología. Es importante conocer
cada estructura los organismos para poder al menos determinar a que grupo de
hongos verdaderos pertenece un agente fitopatógeno para tomar una decisión de
control y una de las formas más practicas de hacerlo es identificando características
morfológicas.

Objetivos

• Conocer las características morfológicas claves para la identificación de


hongos verdaderos.

• Determinar algunos géneros de hongos verdaderos agentes causales de


enfermedades.

Materiales y Equipo

• Estereoscopio
• Microscopio
• Pinzas
• Aguja de disección
• Portaobjetos
• Cubreobjetos
• Lactofenol azul o rojo
• Agua destilada
• Material vegetal infectado con hongos verdaderos

Desarrollo de la práctica:

• Tome el material vegetal y caracterice sintomatología (fotografíe)


• Proceda a realizar un buen montaje procurando que se pueda apreciar todas
las estructuras de los hongos para su identificación (preferiblemente que sea
corte).
• Determine a través de las estructuras si es Ascomycota o Basidiomycota
(consulte a su catedrático).
• Si es Ascomycota, observe y establezca la siguiente información:
o Cuerpo fructífero (Apotecio, cleistotecio, pseudotecio, peritecio)
o Tipo de Asca (unitunicada o bitunicada)
o Forma y coloración de la ascospora
o Con paráfisis o sin paráfisis
o Esta en tejido estromático
o Uniloculado o multiloculado

• Fotografíe todo lo observado


• Utilice la clave de identificación de géneros proporcionada por el catedrático

Conteste lo siguiente:

1. Investigue la división taxonómica del Reino Fungi actualizada.


2. Haga un listado de hongos de importancia agrícola presentes en Guatemala
del Phylum Ascomycota, Basidiomycota, Zigomycota y Chytridiomycota
3. Elabore un cuadro con diferencias morfológicas entre estos Phylum
4. Investigue la cantidad de especies descritas para el Phylum Ascomycota y
Phylum Basidiomycota.

Bibliografia

Agrios, G. (2005). Plant Pathology. 5th edition. ELSEVIER Academic Press. Florida,
USA. 922p.

Cummins, G; Hiratsuka, Y. (2003). Illustrated Genera of Rust Fungi. 3rd. Edition. APS
Press. St Paul, Minnesota. 225p.

Hanlin, R; Tortolero, O. (1990). Illustrated Genera of Ascomycetes. APS Press. St


Paul, Minnesota. 279p

Williams, J. (2006). Simplified Identification Key for Plant Pathogenic Fungi. Extension
Plant Pathologist. University of Georgia. 11p
Practica No. 8
IDENTIFICACION DE HONGOS ANAMÓRFICOS

Introducción

Los hongos anamórficos anteriormente eran conocidos como Deuteromycetos, ahora


están ubicados como un grupo aparte lateral al reino fungi. También son llamados
hongos mitospóricos o imperfectos, y estos no son más que la fase asexual de
algunos hongos Ascomycetos (en su mayoría) o Basidiomycetos. Estos hongos son
los más comunes encontrarlos como agentes patógenos de enfermedades en plantas,
algunos géneros son de gran importancia económica como Fusarium spp o
Colletotrichum spp. Tienen gran capacidad infectiva y de diseminación por su facilidad
de reproducción ya que no forman esporas sexuales sino que esporas sin combinación
genética llamadas conidias. Son capaces de reproducirse através de micelio, tal es el
caso de Rhizoctonia solani o Sclerotium rolfsii.

Los hongos anamórficos se dividen en 3 grupos: los que producen conidios en


conidióforos libres (hyphomycetes), los que producen conidias en conidiomas
(coelomycetes) y los que no producen conidias (agonomycetes). Estos hongos son
muy fáciles de aislar y cultivar en medio agar.

Objetivos

• Conocer las características morfológicas claves para la identificación de


hongos anamórficos.
• Determinar algunos géneros de hongos anamórficos, agentes causales de
enfermedades.

Materiales y Equipo

• Estereoscopio
• Microscopio
• Pinzas
• Aguja de disección
• Portaobjetos
• Cubreobjetos
• Lactofenol azul o rojo
• Agua destilada
• Material vegetal infectado con hongos anamórficos

Desarrollo de la práctica:

• Tome el material vegetal y caracterice sintomatología (fotografíe)


• Proceda a realizar un buen montaje procurando que se pueda apreciar todas
las estructuras de los hongos para su identificación.
• Observe y establezca la siguiente información:

o Forma conidios o no
o Donde forma los conidios (conidióforos libre, acérvulos, picnidios)
o Micelio septado o cenocítico
o Forma, agrupación y coloración de las conidias
o Forma del conidióforo
o Lugar de formación de las conidias
• Fotografíe todo lo observado
• Utilice la clave de identificación de géneros proporcionada por el catedrático

Conteste lo siguiente:

1. Investigue cuál es la fase sexual de estos hongos fitopatógenos comunes:


Fusarium, Colletotrichum, Sphaceloma, Diplocarpon, Rhizoctonia, Oidium,
Leptostromella, Phyllosticta, Lasiodiplodia, Cercospora, Monilia, Sclerotium,
Trichoderma, Phomopsis, Ascochyta, Spilocaea, Cylindrocladium, Septoria,
Botrytis
2. Elija 3 cultivos e investigue que géneros de hongos anamórficos lo afectan,
busque en internet fotografías de estructuras morfológicas de cada hongo.

Bibliografía

Agrios, G. (2005). Plant Pathology. 5th edition. ELSEVIER Academic Press. Florida,
USA. 922p.

Barnett, H; Hunter, B; (1999). Illustrated Genera of Imperfect Fungi. 4th Edition. APS
Press. St Paul, Minnesota. 218p

Williams, J. (2006). Simplified Identification Key for Plant Pathogenic Fungi. Extension
Plant Pathologist. University of Georgia. 11p
Practica No. 9
IDENTIFICACION DE ORGANISMOS SIMILARES A HONGOS (REINO CROMISTA)

Introducción

Los hongos cromistas son organismos parecidos a los hongos, anteriormente estaban
ubicados dentro de los Phycomycetes ahora son parte del Phylum Oomycota y se
caracterizan por tener micelio cenocítico, formar esporangios y zoosporas flageladas
en su fase asexual, y oosporas en su fase sexual. Son hongos con gran importancia
en la agricultura ya que dentro de este grupo se puede encontrar Phytophthora spp
que es un organismo que puede causar muchas perdidas económicas en diferentes
cultivos y que en altas severidades puede haber perdida total de rendimiento.

Estos hongos tienen fácil dispersión y sobrevivencia. Son acuaticos y se pueden


encontrar en suelos cultivables. Es importante la identificación de estos organismos
como agentes causales de enfermedades ya que en el mercado hay productos que
tienen especifidad a los mismos y hay otros que requieren un manejo puntual en
ciertos factores del patosistema para evitar el desarrollo y la dispersión de la
enfermedad.

Objetivos

• Conocer las características morfológicas claves para la identificación de


cromistas.
• Determinar algunos géneros de cromistas, agentes causales de enfermedades
en plantas.

Materiales y Equipo

• Estereoscopio
• Microscopio
• Pinzas
• Aguja de disección
• Portaobjetos
• Cubreobjetos
• Lactofenol azul o rojo
• Agua destilada
• Material vegetal infectado con hongos cromistas

Desarrollo de la práctica:

• Tome el material vegetal y caracterice sintomatología (fotografíe)


• Proceda a realizar un buen montaje procurando que se pueda apreciar todas
las estructuras de los hongos para su identificación.
• Observe y establezca la siguiente información:

o Forma del esporangio


o Forma y ramificación del esporangióforo
o Los esporangios son papilados o no
o Hospedero
o Forma de oospora (si hubiera)

• Fotografíe todo lo observado


• Utilice la clave de identificación de géneros proporcionada por el catedrático
Conteste lo siguiente:

1. Diferencie morfológicamente el reino fungi, hongos anamórficos y el reino


cromista.
2. Elija 3 cultivos diferentes y liste los hongos cromistas que afectan a estos.
3. Investigue por qué se dice que estos organismos están bioquímicamente
asociados con plantas

Bibliografia.

Agrios, G. (2005). Plant Pathology. 5th edition. ELSEVIER Academic Press. Florida,
USA. 922p.

Harmon, C; Tolin, S; Arevalo, M; Diaz, J; Palmieri, M. (2008). Advance plant diagnostic


training. Proyecto IPDN – CRSP Centroamérica y el Caribe.

Mycologue Publications. (2002). The Fifth Kingdom. Disponible:


http://www.mycolog.com/fifthtoc.html

Schmitthenner, A & Bhat, R. (1994). Useful Methods for Studying Phytophthora in the
Laboratory. OARDC Special Circular 143. Department of Plant Pathology. The
Ohio State University.
Practica No. 10
AISLAMIENTO DE BACTERIAS FITOPATOGENAS

Introducción

Otros organismos que afectan comúnmente a los cultivos son las bacterias
fitopatógenas. Se puede encontrar diferentes géneros de bacterias, provocando
distintas sintomatologías e infectando diversos órganos de la planta. Estos organismos
pueden causar muchas perdidas en los cultivos y su manejo es complicado. Una forma
de identificación de bacterias es através del aislamiento, purificación y caracterización
en medios de cultivo.

Es importante caracterizar los síntomas que causan las bacterias para poder dirigir el
diagnostico a estas. El aislamiento es sencillo pero se debe tener mucha asepsia en el
proceso ya que en el ambiente se encuentran gran variedad de bacterias
contaminantes y en los tejidos vegetales se pueden encontrar las bacterias endofíticas
que pueden causar confusión al momento del aislamiento. Hay ciertos métodos de
aislamiento para algunos géneros de bacteria en especifico, por ejemplo con Ralstonia
solanacearum se puede realizar el método de flujo bacteriano o con Pectobacterium
spp una inoculación en chile pimiento o papa. Los medios de cultivo más utilizados
para el aislamiento y purificación es el medio Agar Nutritivo (AN) o el medio 523,
posteriormente se utilizan otros medios diferenciales para caracterizar las bacterias.

Objetivo

• Conocer la metodología para el aislamiento de bacterias fitopatógenas en


medios de cultivo Agar.

Materiales y Equipo

• Medio AN
• Alcohol al 95% y al 70%
• Hipoclorito de sodio al 1%
• Agua estéril
• Cajas petri pequeñas
• Vidrios de reloj
• Varilla de vidrio
• Beakers de 100ml y 250 ml
• Tijeras
• Pinzas
• Asa
• Mechero
• Incubadoras
• Chile pimiento (fruto)
• Marcadores permanentes punta fina
• Material vegetal enfermo con bacteriosis
Desarrollo de la práctica:

Para hojas y tallos:

Figura 8. Diagrama de aislamiento de bacterias fitopatógenas


Fuente: SAFRINET, 2000.

• Observe y caracterice la sintomatología en hojas (fotografíe)


• Corte al menos 10 explantes con el síntoma.
• Coloque los explantes en una caja petri pequeña
• Proceda a desinfectar los explantes como se explica a continuación, flameando
las pinzas con alcohol al 95% y un mechero en cada paso:
• Agregue agua estéril para limpiar los explantes
• Deseche el agua en un beaker
• Agregue alcohol al 70% por un minuto
• Deseche el alcohol
• Agregue hipoclorito de sodio al 1% por 2 minutos
• Deseche el hipoclorito
• Lave dos veces con agua estéril para eliminar el hipoclorito (asegúrese que
este bien lavado)
• Coloque los explantes en un vidrio de reloj estéril y agrégueles una gota de
agua estéril.
• Flamee una varilla de agitación y enfríe con agua estéril.
• Proceda a macerar el tejido para que las bacterias pasen a la gota de agua
estéril.
• Con un asa, extraiga un poco del macerado y proceda a estriar al medio de
cultivo AN como se muestra en la figura 8 y 9.
Figura 9. Diagrama de purificación de las colonias.
Fuente: SAFRINET, 2000.

Para marchitez bacteriana o Moko (Ralstonia solanacearum):

• Después de caracterizar la sintomatología y fotografiar,


• Coloque en un beaker o un tubo de ensayo agua estéril
• Sumerja un poco en el agua el material infectado
• Observe como del tejido sale una especie de flujo color blanco,
• Deje que se precipite el flujo,
• Con un asa proceda a tomar una muestra del flujo bacteriano y estríe en el
medio de cultivo.

Figura 10. Diagrama del metodo de flujo bacteriano para aislamiento de Ralstonia
solanacearum. Fuente: SAFRINET, 2000.
Para enterobacterias fitopatogénicas (Pectobacterium):

• Caracterice la sintomatología y fotografíe.


• Tome un chile pimiento y esterilice la superficie del chile con alcohol al 70%.
• Flamee una aguja de disección y enfríela pinchando una sección del chile
pimiento.
• Pinche el material degradado con la bacteria de la muestra para que quede en
la aguja
• Pinche el chile pimiento con la bacteria. Puede repetir haciendo 3 pinchazos
por muestra (solo pinche una vez cada agujero).
• Identifique cada pinchazo. El pinchazo para enfriar la aguja será el control.
• Puede utilizar palillos de madera para pinchar también, a diferencia que estos
los debe dejar insertados.
• Coloque el chile pimiento en cámara húmeda en una incubadora a 30°C.
• Observe el chile pimiento a las 24 y 48 hrs.
• Del tejido degradado, con ayuda de un asa, tome un poco de muestra y
proceda a estriar directo al medio de cultivo AN.
• Coloque las cajas en incubadora a 25 – 30°C.
• Luego de aislar la bacteria en el medio AN observe cada 24 hrs el crecimiento
y seleccione las colonias obtenidas.
• Con un asa tome una colonia y pásela a otra caja petri con medio AN y estríe.
• De esta manera se purifica el medio con una sola colonia de bacteria para
posteriormente pasar a caracterizar.
• Haga 3 cajas mínimo por cada estriado.

Conteste lo siguiente:

1. Investigue la metodología de diluciones para purificación de las colonias


2. Investigue que otros medios se pueden utilizar para aislar bacterias de tejido
vegetal enfermo

Bibliografía

SAFRINET. (2000). Introduction to Practical Phytobacteriology. 1st. Edition. The Swiss


Agency for Development and Cooperation. Johannesburg. 83p.

Schaad, N; Jones, J; Chun W. (2001). Laboratory Guide for Identification of Plant


Pathogenic Bacteria. 3rd. Edition. APS Press. St Paul, Minnesota. 373p.
Practica No. 11
IDENTIFICACION DE BACTERIAS FITOPATOGENAS

Introducción

Luego de aislar las bacterias y purificar las colonias se procede a la identificación de


las mismas, esto se realiza através de una caracterización bioquímica con medios de
cultivo diferenciales. Estos procedimientos son sencillos de realizar si ya se tiene la
técnica. Cada medio de cultivo es una prueba que se le realiza a una colonia de
bacterias y esta prueba puede ser positiva o negativa dependiendo de la reacción ante
el medio, por ejemplo con Pseudomonas spp el medio KB toma una coloración verde
por la flourescencia de la bacteria, esta prueba se considera positiva. La identificación
se realiza de esta manera ya que las bacterias son procariotes muy pequeños y son
organismos muy similares en cuanto a morfología (las bacterias fitopatógenas tienen
forma de bacilos) variando únicamente en la posición de los flagelos.

Es de mucha importancia la identificación correcta de las bacterias ya que esto dará la


pauta para tomar una decisión en el principio de control, y este principio estará
influenciado por el estudio epidemiológico que se le dé. Es importante, después de la
identificación de la bacteria, conocer la biología de la misma para que se pueda
integrar en el análisis del Patosistema y poder tener claro hacia donde dirigir el
manejo.

Objetivos

• Caracterizar bioquímicamente algunas bacterias fitopatógenas agentes


causales de enfermedades.
• Determinar algunos géneros de bacterias fitopatógenas en base a la
caracterización realizada.

Materiales y Equipo

• Medio AN
• Medio KB
• Medio YDC
• Medio (O – F)
• KOH al 3%
• Cristal violeta
• Solución Lugol
• Alcohol al 95%
• Safranina al 1%
• Agua estéril
• Pipetas
• Aceite mineral
• H2O2
• Medios de cultivo con colonias de bacterias fitopatógenas

Desarrollo de la practica:

• De los medios con aislamientos de bacterias proceda a escoger una colonia y


determine la forma (circular, fusiforme e irregular), consistencia (mucoide,
fluida, arrugada y micelial), elevación (umbonada, convexa, domo, levantada y
plana), coloración y velocidad de crecimiento.
• Evite seleccionar aquellas colonias que crecen en menos de 24 hrs,
comúnmente estas son saprófitas o secundarias (con excepciones).
• Comúnmente una bacteria fitopatógena posee forma de domo, circular y lisa. Si
la colonia es irregular, filamentosa, plana o arrugada no la elija.
• Luego de caracterizar la colonia proceda a determinar el tipo de gram de la
bacteria:

Por tinción:

• Distribuya una asada de la bacteria proporcionada sobre un portaobjetos, fije la


bacteria pasándola sobre una llama (evite quemar la bacteria)
• Añada una gota de la solución de cristal violeta dejándola durante 30 seg
• Lave con agua el portaobjeto eliminando el colorante y adicione una gota de la
solución de Lugol durante 30 seg
• Lave con agua y aplique alcohol al 95% hasta que no salga más colorante
• Adicione una gota de safranina al 1% durante 30 seg
• Lave con agua y seque. Observe al microscopio usando los aumentos 10x, 40x
y finalmente el lente de inmersión 100x (use aceite). Las bacterias Gram (+) se
observaran de color azul y las Gram (-) de color rojo.

KOH:

• Coloque en un portaobjetos una gota de la solución de KOH al 3%.


• Tome una asada de la bacteria elegida y revuélvala con la gota.
• Revuelva bien y empiece a observar la consistencia de la solución.
• Al estirar el asa hacia arriba si se forma una liga mocosa la bacteria es Gram(-)
si no se forma es Gram (+).
Figura 11. Prueba de gram con KOH al 3%. Notese la liga mucosa, en esta prueba la
bacteria es Gram (-). Fuente: SAFRINET, 2000.

• Posterior de saber el tipo de Gram de la bacteria, proceda a estriar en los


medios de cultivo KB y YDC. Al menos 3 cajas por tipo de colonia elegida.
• Deje en la incubadora a 25 – 30°C y observe
• En medio KB si la colonia tiene fluorescencia la prueba es positiva
• En medio YDC si la colonia tiene coloración amarilla (con excepción de X.
campestris pv manihotis) la prueba es positiva.

Luego inocular en el medio (O – F) de la siguiente manera:

• Tome dos tubos con el medio.


• Tome una pinza o un asa y flamee
• Enfríe en el medio donde están las bacterias para ser caracterizadas.
• Tome una asada de una colonia de bacteria y sin tocar las paredes del tubo
pinche el medio unos 2 cm (solo pinche una vez, no varias). Inocule dos tubos.
• Con la pipeta estéril tome un poco de aceite mineral y con cuidado de no tocar
las paredes del tubo ni el medio inoculado agregue aceite a solo un tubo.
• Identifíquelos y déjelos en la incubadora a 25 – 30°C y observe.
• Si el tubo sin aceite cambia de color amarillo y el tubo con aceite no cambia de
color la bacteria es aeróbica.
• Si el tubo con aceite cambio de color amarillo y el tubo sin aceite no cambia, la
bacteria es estricta anaeróbica.
• Si los dos tubos cambian de color la bacteria es anaeróbica facultativa.
• Se considera positiva la prueba cuando es estricta anaeróbica o facultativa.

Posteriormente siga la siguiente clave rápida para determinar algunos géneros


comunes de bacterias:

1 Gram (+)…………………………………………………..………..……………….. 2
1’ Gram (-)………………………………………………..……….…………..……….. 3

2 Colonia micelial…………………………………..…….…………… Streptomyces


2’ Colonia mucoide………………………………..……………Coryneform, Bacillus,
Clostridium

3 Anaeróbica (O – F positivo)…………….………………………………..… Erwinia


3’ Aeróbica (O – F negativo)...……………………….………….……………………. 4
4 Flourescencia en medio KB…………………….…….…………… Pseudomonas
4’ Sin flourescencia en medio KB…………………………………………………… 5

5 Colonia amarilla en YDC……………………………….………….. Xanthomonas


5’ Sin color amarilla en YDC……………..……..….…. Agrobacterium, Acidovorax,
Burkholderia, Ralstonia

Investigue lo siguiente:

1. Otras técnicas rápidas de diagnóstico para bacterias fitopatógenas.


2. Por qué Ralstonia, Acidovorax y Burkholderia anteriormente eran consideradas
Pseudomonas
3. Usos de Bacillus spp en la agricultura
4. La etimología del nombre Xanthomonas
5. Elija 3 cultivos y liste las bacterias fitopatógenas que afectan a este
describiendo sintomatología.

Bibliografía

SAFRINET. (2000). Introduction to Practical Phytobacteriology. 1st. Edition. The Swiss


Agency for Development and Cooperation. Johannesburg. 83p.

Schaad, N; Jones, J; Chun W. (2001). Laboratory Guide for Identification of Plant


Pathogenic Bacteria. 3rd. Edition. APS Press. St Paul, Minnesota. 373p.

USAC. (2003). Caracterización de bacterias fitopatógenas. Manual de laboratorio de


Introducción a la Fitopatología. Facultad de Agronomía, Subarea de Protección
de Plantas. 13p.
Practica No. 12
METODOS DE EXTRACCION DE NEMATODOS FITOPARÁSITOS

Introducción

Los nematodos fitoparásitos son organismos microscópicos que viven en suelo y


pueden afectar principalmente raíces de plantas. Existen nematodos con habito
ectoparasiticos que viven y se alimentan fuera de la raíz, los nematodos endoparásitos
son nematodos que ingresan a los tejidos de la raíz y se alimentan de ella por dentro.
Si los nematodos endoparásitos se mueven atraves de la raíz son migratorios y si
penetran a la raíz y se alimentan de ella en un solo sitio son sedentarios. Hay otro tipo
de nematodos con habito mas especializado que se pueden encontrar en la literatura
como semi-endoparásitos (mitad del cuerpo fuero y otra dentro), tal es el caso de
Rotylenchulus reniformis o Tylenchulus semipenetrans.

Existen muchas metodologías de extracción de nematodos y estas se pueden utilizar


dependiendo del hábito y tamaño de cada uno. La extracción es sencilla y cada
metodología varía en cuanto a precisión. La metodología esta influenciada
dependiendo de lo que busque, por ejemplo si se busca identificar una metodología de
extracción rápida se puede utilizar, pero si se busca conteo se necesita ser más
preciso en el procedimiento de extracción.

Objetivos

• Aprender las diferentes metodologías para extracción de nematodos en suelo


(ectoparásitos) y en tejido vegetal afectado (endoparásitos).

Materiales y Equipo

• Embudo de Baermann • Embudos


• Tamices (20, 80, 150, 200, 350, • Papel absorbente
400, 500 Mesh) • Cloro (comercial)
• Beakers diferente volumen • Caolín
• Licuadora o procesador de • Solución azucarada (1:1)
alimentos • Formaldehido
• Erlenmeyers diferente volumen • Bolsas plásticas Ziploc
• Centrifuga • Bisturí #15
• Estereoscopio • Material vegetal afectado por
• Microscopio nematodos
• Pizetas • Raíces con agallas o quistes
• Cubetas plásticas • Muestras de suelo (diversas)
• Palanganas

Desarrollo de la practica:

Método del embudo de Baermann (suelo o raíces):

• Arme el embudo de Baermann colocando una pinza al final de la manguera de


hule.
• Proceda a agregar agua sin llenar por completo el embudo.
• Suelte la pinza rápidamente y vuelva a ponerla, esto es para que no queden
burbujas de aire en la manguera.
• Tome 50 – 100 cc de suelo en un beaker.
• Rápidamente voltee el beaker sobre la maya con papel absorbente del embudo
de Baermann dejando el suelo sobre el papel.
• Agregue agua con una pizeta en los bordes del embudo hasta que la muestra
de suelo quede bien sumergida en el agua.
• No rebalse el agua por los bordes y cuide que el papel no se salga tampoco de
los mismos.
• Déjelo reposar de 1 a 5 días, los nematodos que están en el suelo bajaran
hasta donde esta la manguera llena de agua.
• Tiene que cuidar que el nivel de agua se mantenga siempre en el mismo.
• Posteriormente libere la pinza y extraiga de la manguera unos 10 cc de
solución conteniendo los nematodos.
• Realice el mismo procedimiento con 10 a 25g de material vegetal

Figura12. Diagrama del embudo de Baermann para extracción de nematodos.


Fuente: Agudelo, 2009.

Método Tamizado (suelo):

• En un beaker coloque 100 cc de suelo.


• Llene a la mitad con agua, una cubeta plástica
• Coloque el suelo en la cubeta y deshaga los grumos con las manos.
• Revuelva bien hasta que quede sin grumos.
• Haga una torre de tamices dejando el mayor Mesh hasta abajo (500 Mesh) y el
de menor hasta arriba (80 o 20 Mesh) en este orden (en paréntesis están
opcionales si no hubieran): 500, 325 (400), 200 (150), 80 (20) Mesh.
• Agregue el contenido de la cubeta a la torre de los tamices. Debe agregar el
contenido despacio ya que por la cantidad de suelo se saturarán y se llenarán
de agua, no debe rebalsar por los extremos de los tamices.
• Si se llenan de agua muévalos para que pase el agua.
• No agregue el suelo que queda al fondo de la cubeta.
• Posteriormente agregue más agua del chorro lentamente para ir lavando los
tamices.
• Dependiendo del tamaño de los nematodos, estos irán quedando atrapados en
los tamices. Para recolectar una mayor cantidad y diversidad de nematodos
puede recuperar de los últimos dos tamices (500 y 325)
• Recolecte de estos últimos tamices con ayuda de una pizeta.

Método Tamizado-Centrifugado-Flotación en azúcar (suelo):

• Repita los pasos del método tamizado y recupere los nematodos de los últimos
dos tamices en tubos de centrifuga (puede distribuir la muestra en varios
tubos).
• Agregue a los tubos una pequeña porción de caolín (1g/50ml).
• Agite bien y proceda a centrifugar por 4 a 5 minutos.
• Con la ayuda del caolín los nematodos quedaran atrapados con el suelo al
fondo del tubo de la centrifuga.
• Descarte el sobrenadante y llene los tubos con una solución azucarada (1:1).
• Agite bien y centrifugue por 1 minuto (los nematodos no deben pasar mucho
tiempo en la solución azucarada ya que pueden plasmolizarse).
• Recupere el sobrenadante en un tamiz 500 mesh y lave con abundante agua
para eliminar la solución azucarada.
• Recupere los nematodos del tamiz en un recipiente.

Extracción de material vegetal (raíces):

• Lave las raíces para eliminar el suelo adherido.


• Pese de 10 a 25g de raicillas.
• Colóquelas en una licuadora o procesador de alimentos.
• Agregue un poco de agua y proceda a macerar los tejidos.
• Los nematodos dentro de la raíz saldrán por la maceración.
• Puede utilizar posteriormente el método de tamizado, tamizado-centrifugado
con flotación en azúcar ó el embudo de Baermann.

Método de disección (nematodos agalladores o de quiste):

• Tome la muestra de raíz con los signos y fotografíe


• Observe la raíz en el estereoscopio y fotografíe
• Con ayuda de un bisturí #15 haga un corte de las agallas y extraiga las
hembras infladas (tienen forma de pera) de Meloidogyne o extraiga los quistes
directamente de la raíz.
• Elabore un montaje con formaldehido de las hembras de Meloidogyne y de los
quistes y observe en el microscopio. Fotografíe.

Método de Incubación:

• Tomé las raíces, píquelas y pese 25g


• Colóquelas dentro de una bolsa plástica.
• Agregue agua tratando de no saturar la muestra.
• Cierre la bolsa pero no por completo y déjela a temperatura ambiente por 2 a 7
días.
• Recupere el agua que queda en la bolsa (puede utilizar tamices de 150 y 500
! recupera en 500).
• Si no tuviera bolsa puede utilizar un beaker o erlenmeyer, lo importante es no
saturar la muestra con agua y no cerrar por completo la bolsa para que los
nematodos tengan oxigeno.
Extracción de nematodos foliares:

• Tome la muestra y caracterice el daño. Fotografíe


• En una caja petri coloque la hoja y agregue agua hasta que quede sumergida.
• Observe en el estereoscopio y comente.
• Puede ayudar a apresurar la salida de los nematodos si realiza un pequeño
corte en la hoja.

Extracción de huevecillos de raices:

• Tome una muestra de raíz y colóquela en un frasco de 1L con tapadera.


• Agregue solución de cloro comercial al 10% hasta que las raíces queden
sumergidas.
• Agite por 4 minutos.
• Coloque el tamiz 200 mesh sobre uno 500 mesh y proceda a agregar la
solución en los tamices.
• Lave abundantemente con agua por 30s asegúrese que se lave la mayor
cantidad de cloro posible.
• Recupere los huevecillos del tamiz 500 mesh y colóquelo en una probeta para
su conteo posterior.
• Si la muestra esta muy turbia puede realizar centrifugación sin caolín y con
flotación en azúcar.

Conteste lo siguiente:

1. Cuáles son los criterios para elegir el método de extracción.


2. Explique porque los nematodos se plasmolizan al estar mucho tiempo en la
solución de azúcar.
3. Elabore un cuadro con ventajas y desventajas de cada método de extracción.

Bibliografía

Agudelo, P. (2009). Curso de identificación de nematodos fitoparásitos. URL, Clemson


University and APS office of international programs. Guatemala.

Coyne, D; Nicol, J; Claudius, B. (2007). Nematología práctica: Una guía de campo y


laboratorio. SP-IPM Secretariat, International Institute of Tropical Agriculture
(IITA), cotonou, Benin. 82p
Practica No. 13
IDENTIFICACION DE NEMATODOS FITOPARASITOS

Introducción

Luego de una exitosa extracción de nematodos en suelo o en material vegetal se


puede proceder a la identificación. La identificación de nematodos fitoparásitos se
puede realizar en base a morfología y morfometría como una técnica clásica. Se
necesita ser muy observador y tener muy afinada la vista para reconocer estructuras
anatómicas de los nematodos que son clave al momento de la identificación.
Utilizando este método clásico de diagnostico en nemátodos únicamente se podrá
determinar géneros, en algunos casos si es posible determinar especies pero es
complicado y no hay mucho material disponible para especies en base a caracteres
morfológicos.

Los nematodos a pesar de lo pequeño que son, pueden causar muchos problemas en
diferentes cultivos. Estos se pueden encontrar en todos los suelos donde se cultiva y
llegan a provocar síntomas característicos como clorosis, falta de desarrollo, daños en
raíz y perdidas en rendimiento. Algunos nematodos están en constante interacción con
patógenos en suelo.

Objetivos.

• Observar las diferentes características anatómicas y morfológicas de


nematodos fitoparásitos para la identificación.
• Identificar algunos géneros de nematodos fitoparásitos extraídos de suelo y
material vegetal afectado

Materiales y Equipo

• Estereoscopio
• Microscopio
• Cajas petri pequeñas
• Agua destilada
• Solución de Formalina Glicerina (Formalina (40% formaldehido) 10ml +
Glicerina 1ml + agua destilada 89ml)
• Material para pescar nematodos
• Soluciones con nematodos
• Portaobjetos
• Cubreobjetos
• Bisturí #15
• Gillettes
• Aceite de inmersión

Desarrollo de la práctica:

• Tome un recipiente que contenga solución con nematodos


• Agítelo y coloque un poco en una caja de petri pequeña (puede usar vidrio de
reloj)
• Observe en el estereoscopio e identifique los nematodos
• Coloque una gota de solución de formaldehido o agua destilada sobre un
portaobjetos
• Proceda a pescar los nematodos como se indica en la figura 13 y colóquelos
en la gota de solución de formalina glicerina o agua
Figura 13. Diagrama del proceso de pesca de neamatodos.

• Coloque el cubre objetos y observe en el microscopio


• Identifique la anatomía del nematodo y fotografíe, puede usar 10x, 40x y 100x
(aceite de inmersión)
• Siga la siguiente clave para identificación del género:

1 Estilete ausente…………………………………………………Nematodos no parasíticos


1’ Estilete presente: La mayoría son parásitos en plantas………………………………..2

2 Esófago de 2 partes (forma de botella), bulbo medio


ausente……………………………………………….…………………….………………...3
2’ Esófago de 3 partes, metacorpus diferenciado con
estomatoestilete………………………………………………..……….…….………….…5
3 Odontoestilete largo, recto; cuerpo largo, delgado; nematodos muy
largos………………………………………………………………….………………………4
3’ Onquioestilete corto, curveado; cuerpo corto………..… Trichodorus, Paratrichodorus

4 Estilete con aletas o kias, anillo guía cerca de la base………………….……Xiphinema


4’ Estilete sin aletas o kias, anillo guía cerca del ápice…………………….….Longidorus

5 Metacorpus mas grande que ¾ del ancho de cuerpo; DEGO en


metacorpus………………………………………………….………………………..………6
5’ Metacourpus menos de ¾ del ancho de cuerpo; DEGO en
procorpus…………………………………………………………………………………….7

6 Cola de la hembra redondeada, machos sin bursa………………..………Aphelenchus


6’ Cola de la hembra conoide con mucron, machos sin bursa……..……Aphelenchoides

7 Procorpus separado del metacorpus…………………………………………..………….8


7’ Procorpus fusionado con metacorpus…………………………………………..……….21

8 Hembra vermiforme……………………………………………………………..…………..9
8’ Hembra hinchada……………………………………………………………....…………19
.
9 Estilete muy largo; región cefálica diferenciada redondeada…………..…………….10
9’ Estilete moderadamente largo a corto…………………………………..………………11

10 Cola redondeada………………………………………………………..……Benololaimus
10’ Cola con punta………………………………………………………….……Dolichodorus

11 Estilete débil (no muy marcado)…………………………………………..…………….12


11’ Estilete fuerte (bien marcado)……………………………………………..……………13

12 Cola subacutada con punta; vulva en el tercio posterior…………….……Ditylenchus


12’ Cola filiforme, mas de 6x el ancho de cuerpo a la altura del
ano……………………………………………………………………….………Tylenchus

13 Vulva a la mitad del cuerpo…………………………………………..Tylenchorhynchus


13’ Vulva en la parte posterior del cuerpo………………………………………………….14

14 Estilete fuerte (bien marcado); 2 ovarios; cola de la


hembra mas pequeña que el ancho del cuerpo a la altura del
ano………………………………………………………………………………….………….15
14’ Estilete relativamente fuerte; cabeza achatada……………………………….……..18

15 Con escutelos…………………………………………………………………….………16
15’ Con fásmidos………………………………………………………..…………..……….17

16 Escutelos anteriores y posteriores a la vulva…………………….………Hoplolaimus


16’ Escutelos ambos en la región anal……………………………….………Scutellonema

17 Traslape ventral; DEGO > ¼ del largo del estilete……………..…….Helicotylenchus


17’ Traslape dorsal; DEGO< ¼ del largo del estilete………………………Rotylenchulus

18 Un ovario; vulva en la parte posterior………………………………..….…Pratylenchus


18’ Dos ovarios; vulva a la mitad de cuerpo………….………………..………Radopholus
19 Cuerpo blanco, no forma quiste, huevos depositados
en matriz gelatinosa; comúnmente con forma de pera……………..……Meloidogyne
19’ Cuerpo café, forma quiste, huevos dentro del quiste retenidos…………………….20

20 Quiste redondo…………………………………………………..………………Globodera
20’ Quiste con forma de limón……………………………………..……………..Heterodera

21 Envuelto con otra cutícula……………………………………….……..Hemicycliophora


21’ Sin envoltura…………………………………………………..………………………….22

22 Parte posterior hinchada de la hembra, poro excretor en parte


posterior………………………………………………………………..……….Tylenchulus
22’ Parte posterior no hinchada………………………………………………….………….23

23 Cuerpo corto, delgado; segmentación aparente………………………...…………….24


23’ Hembras pequeñas, delgadas, vulva en la parte
posterior, no se observa estilete en otros estadios……………………..Paratylenchus

24 Anulaciones cuticulares redondeadas………………………………….Mesocriconema


24’ Anulaciones cuticulares aserradas………………………………...…………Criconema

Bibliografía.

Agudelo, P. (2009). Curso de identificación de nematodos fitoparásitos. URL, Clemson


University and APS office of international programs. Guatemala.

Mai, W; Mullin, P; Lyon, H; Loeffler, K. (1996). Plant Parasitic Nematodes a Pictorial


Key to Genera. 5th Edition. Cornell University Press. Ithaca, New York. 277p.

Siddiqi, M. (2000). Tylenchida parasites of plants and insects. 2nd Edition. CABI
Publishing. London, UK. 813p.

UNL Nematology Lab. (1977). Interactive Diagnostic Key to Plant Parasitic, Freeliving
and Predaceous Nematodes. Disponible:
http://nematode.unl.edu/key/nemakey.htm
Practica No. 14
TRANSMISIÓN Y RECONOCIMIENTO DE SINTOMAS DE VIRUS
FITOPATOGENOS

Introducción

Los virus fitopatógenos son entidades subcelulares que provocan ciertas distorsiones
en la fisiología de las plantas. La sintomatología que provocan estas entidades son
características, por ejemplo, mosaicos, deformaciones en hojas, enanismos, clorosis,
necrosis, entre otros. Los virus pueden trasmitirse atraves de organismos vectores
entre estos, en su mayoría insectos. También pueden transmitirse atraves de injertos,
por semillas y por polen.

Es importante el reconocimiento de los síntomas para poder dirigir el diagnostico a


estas entidades. La identificación en laboratorio no es sencilla, existen varios métodos
entre ellos la utilización de plantas indicadoras, observación de cuerpos de inclusión,
pruebas serológicas y PCR que es la mas certera. El manejo de estas entidades es
difícil y debe ir dirigido hacia el mecanismo de transmisión.

Objetivo

• Demostrar algunas formas de transmisión de algunos virus fitopatógenos,


através de la inoculación de plantas.
• Reconocer los síntomas característicos de virosis en plantas.

Materiales y equipo:

• Plantas de 30-40 DDS de Capsicum annum, Nicotiana tabacum, Chenopodium


quinoa, Phaseolus vulgaris
• Solución tampón (buffer) fosfato, pH 7.0
• Mortero con pistilo
• Algodón
• Carborundum No. 600 (SiC)
• Agua destilada
• Hojas meristemáticas con sintomatología de virosis

Desarrollo de la práctica:

• Tome el material infectado por virosis y fotografíe la sintomatología


• Coloque unas hojas en el mortero y proceda a macerar con el pistilo
• Agregue 2ml de solución tampón fosfato y siga macerando
• Tome una de las plantas indicadoras y espolvoree carborundum No. 600 sobre
una hoja (no desperdicie)
• Con un algodón impregne un poco de la solución del mortero (inoculo) y frote
sobre la hoja con carborundum para inocular
• Lave con agua destilada y coloque en cámara humeda por 24hrs
• Observe a los días que pasa con las plantas y discuta
• Haga este procedimiento con cada planta indicadora.

Conteste lo siguiente:

1. Investigue una descripción corta y la sintomatología de las siguientes


entidades: Citrus tristeza virus (CTV),Tomato spotted wilt virus (TSWV),Citrus
exocortis viroid (ceVd), Avocado sunblotch viroid (ASBVd), Bean common
mosaic virus (BCMV), Chinesse virus of tomato (VCdT), Squash curly leaf virus
(SCLV),Cucumber mosaic virus satellite RNA.
2. Investigue algunos vectores de virus que no sean insectos, mencione algunos
ejemplos (nombre científico del vector y el virus que transmite)
3. Haga un cuadro comparativo mencionando ventajas y desventajas de los
métodos para identificación de virus fitopatógenos.

Bibliografia

Harmon, C; Tolin, S; Arévalo, M; Diaz, J; Palmieri, M. (2008). Advance plant diagnostic


training. Proyecto IPDN – CRSP Centroamérica y el Caribe.

Valenzuela, V; Redondo, E; Bujanos, R. (2003). Detección de virus por serología y


plantas indicadoras en el tubérculo-semilla y plantas de cultivo de meristemos
en papa (Solanum tuberosum L.) var. Alfa. Revista Mexicana de Fitopatología,
Julio-Diciembre, año/vol.21, numero 002. Sociedad Mexicana de Fitopatología,
A.C. Ciudad Obregón, México. 176-180p.
Practica No. 15
MONITOREO Y ELABORACION DE ESCALAS DE SEVERIDAD

Introducción

El diagnostico de enfermedades es parte importante en la fitopatología y sobre todo en


criterios para manejo y control de enfermedades. Todo esto dentro del contexto de un
paradigma etiológico de las enfermedades o epidemias. Pero no se debe concentrar
todo los criterios únicamente en el organismo patógeno sino que se debe comprender
todos los subsistemas que están en interacción dentro del Patosistema en estudio. Ver
y comprender el manejo desde la población de plantas sanas es lo principal dentro del
paradigma epidemiológico. Para un estudio epidemiológico es importante el
componente de cambio de función en la población de plantas u hospederos y una
forma de medir ese cambio es através de la incidencia y severidad de una enfermedad
o daño.

Para determinar la incidencia de una enfermedad se cuenta el número de plantas


afectadas y se divide dentro del número total en estudio. Para determinar la severidad
de una enfermedad o daño, es más complejo ya que se debe de pasar una variable
cualitativa a forma cuantitativa (que pude ser muy subjetivo) y eso se realiza através
de escalas de severidad. Es importante tener bien definidas las escalas para realizar
los monitoreos y sobre todo entrenar el ojo ya que están en función del criterio de
quien toma los datos.

Objetivo

• Aprender la elaboración de escalas de intensidad de daño y validarlas para su


utilización en los monitoreos de enfermedades.

Materiales y Equipo

• Bolsas plásticas
• Marcadores
• Libreta de notas
• Lápiz
• Regla
• Cartulina blanca
• Cultivo afectado con enfermedad foliar

Desarrollo de la práctica:

En campo:

• Observe la parcela afectada con la enfermedad, caracterice los síntomas y


como se distribuye esta en el cultivo. Fotografíe.
• Realice un muestreo de hojas con la enfermedad aleatoriamente, tome al
menos 50 hojas.
• Guarde e identifique la bolsa con la muestra de hojas y lleve al laboratorio.

En laboratorio:

• Tome las hojas con el daño y colóquelas hojas sobre la cartulina blanca.
• Fotografíe cada hoja por separado (si hay 50 hojas tiene que tomar 50 fotos).
• No debe perder el orden con el que fotografío las hojas ya que se procederá a
tomar datos y cada dato debe corresponder correctamente a cada fotografía.
• Con ayuda de una regla mida el área total de cada hoja.
• Ahora mida el área de daño de cada hoja (No se olvide que cada dato debe
corresponder a cada fotografía).
• Con ayuda del programa 2Log v2.0 genere los intervalos de las escalas de
severidad.
• Coloque los intervalos (la escala) y una fotografía representando el valor del
área afectada.
• Con la escala elaborada proceda validarla en grupos de trabajo (consulte al
catedrático).

Conteste lo siguiente:

1. Investigue la formula o el método para determinar el porcentaje de severidad


con los valores obtenidos de la escala.
2. Cuál es la diferencia entre precisión y error.
3. En la elaboración de escalas de severidad se dice que el proceso debe ser
reproducible y repetitivo. Cual es la diferencia en estos dos terminos.
4. Investigue y mencione el principio de Weber-Fechner de la óptica aplicado al
monitoreo de severidad de enfermedades con escalas.

Bibliografía

Mora, G. (2010). Epidemiología Vegetal. Material exclusivo de curso libre de


Postgrado. COLPOS y URL.