Universidad de las Américas

Facultad de Ciencias de la Salud

Carrera de Medicina

Extracción de DNA de sangre periférica usando método de salino

Laboratorio de Biología Molecular

Práctica No 002

Integrantes Número de Matrícula

Alcívar Gabriel 724813
Fernández Melany 725927
Samaniego Nathali
Tapia Zammyrha 724105
Unger Jaidy 724975
Fecha de entrega: 04/04/2019

A. OBJETIVOS:
 Obtener ADN de buena calidad y cantidad a partir de sangre periférica humana.

B. RESULTADOS:

I. Lisis de glóbulos rojos

Figuras 1-2-3: Materiales para la extracción de sangre, muestra de sangre en tubo EDTA e
incubación con el tampón de lisis celular, respectivamente.
 II. Lisis de núcleos y precipitación de proteínas

Figuras 4-5: Muestra con la solución de lisis de núcleos donde se aprecia una pequeña
(mínima) sedimentación en la parte inferior y su posterior centrifugado.

III. Precipitación de DNA y Rehidratación del pellet

Figuras 6-7: Muestra con etanol luego del centrifugado y lavado con etanol (izquierda).
Muestra rehidratada (izquierda). No se puede apreciar el ADN condensado debido a su
transparencia.

Se obtuvo una cantidad de ADN de 0,947 Q de ADN y 18,44μg/μL al medir en el

espectrofotómetro.

C. DISCUSIÓN

La extracción salina es un método de purificación que utiliza la solubilidad reducida de

ciertas moléculas en una solución de muy alta fuerza iónica. Los aminoácidos cargados y
polares requieren que las moléculas de agua los rodeen para permanecer disueltos. A cierta
fuerza iónica, las moléculas de agua ya no son capaces de soportar las cargas tanto de los
iones como de las proteínas. El resultado es la precipitación del soluto menos soluble, como
las proteínas (MindTouch, 2018). El método de extracción salina es una técnica de
extracción de ADN simple y no tóxica, introducida por Miller, que aísla un ADN de alta
calidad de la sangre total. En el método estándar se necesita NaCl saturado para que las
proteínas se precipiten fuera de la solución (Mohammad, 2018). Se estima que de una
muestra de sangre humano de 200L se obtienen 3-10g (Alejos, Aragón, & Cornejo).

En la extracción realizada en el laboratorio, se obtuvieron 18,94ng/L. Sin embargo, este

valor solamente representa el 1% de la solución total, ya que se tenían 100L. El valor real
de ADN, por cálculos, sería: 1894 ng/100L. Transformando los nanogramos a
microgramos, lo extraído sería solamente 1,89g de ADN de una muestra que originalmente
contaba con 300L de sangre. Este valor se encuentra por debajo de lo esperado de una
muestra de 200L. Una de las posibles explicaciones para haber obtenido tan baja cantidad
recae en la inexperiencia del equipo de trabajo en la extracción de ADN por este método,
ya que no habían realizado este tipo de procedimientos anteriormente. Dicha inexperiencia
abarca equivocaciones en el pipeteo, el vaciamiento de sobrenadantes, la adición de las
cantidades exactas de los reactivos, entre otras.

D. CUESTIONARIO:

1. ¿Por qué el buffer de lisis celular deja intactos los núcleos de las células?

Los detergentes son una clase de moléculas cuyas propiedades únicas permiten la
manipulación de interacciones hidrofóbico-hidrófilas entre moléculas de muestras
biológicas. Las concentraciones moderadas comprometen la integridad de las membranas
celulares, facilitando así la lisis de las células y la extracción de proteínas solubles, a
menudo en forma nativa. Utilizando ciertas condiciones de amortiguación, varios
detergentes penetran efectivamente entre las capas de la membrana a concentraciones
suficientes para formar micelas mezcladas con fosfolípidos aislados y proteínas de la
membrana. Los componentes de la membrana celular, el número de agregados, la
temperatura y la naturaleza de la membrana y del detergente determinan qué membrana
va a ser lisada. (ThermoFisher Scientific).

La solución buffer de lisis de células de sangre es utilizada para el aislamiento de ADN y

ARN, el tampón está diseñado para la lisis preferencial de los glóbulos rojos de la sangre
humana entera, produciendo glóbulos blancos intactos (sin glóbulos rojos) para otras
aplicaciones. Este buffer no está destinado a ser utilizado con sangre completa de ninguna
otra especie (Novachem del Ecuador).
 2. ¿Qué principio opera cuando usted agrega la solución de precipitación de
proteínas? ¿Qué pasaria
́ si se agregara una solución menos concentrada? (Una
décima parte de la que utilizó).

La desnaturalización de las proteínas es el efecto neto de las alteraciones en las

propiedades biológicas, químicas y físicas de la proteína mediante una ligera alteración de
su estructura (Eckersall, 2008). Las proteínas son generalmente solubles en sales diluidas;
este fenómeno se conoce como salting-in. Sin embargo, cuando la concentración de sal
aumenta, la solubilidad disminuye, y con ciertas sales las proteínas se vuelven insolubles
(salting-out). La concentración debe ser muy alta para precipitar las proteínas; por lo tanto,
se utilizan sales muy solubles (serie Hofmeister). Además, algunas proteínas no se
precipitan incluso en presencia de una concentración extremadamente alta de sales,
especialmente las proteínas de baja masa molecular. Cuando se requiere la precipitación
completa de proteínas, el enfoque más fácil es usar una solución saturada de sulfato de
amonio. La funcionalidad de la proteína se recupera completamente al resolverse en
tampones fisiológicos apropiados (Righetti & Boschetti, 2013).

Tal como se ha explicado en el párrafo anterior, al agregar una solución menos concentrada
de precipitación de proteínas, la cantidad de estas que precipitarían disminuiría
considerablemente o, por el contrario, no precipitarían del todo.

3. ¿Qué sucede cuando se agrega el Isopropanol? ¿Qué pasaria

́ si agrega el
mismo volumen de etanol? ¿Qué pasaria
́ si agrega 2,5 volúmenes de etanol?

El ADN precipita más rápido al agregar el isopropanol debido a que es menos soluble en
él. Sin embargo, éste solo se utiliza cuando hay un mayor volumen de muestra y baja
concentración de ADN. Con el etanol se necesita que el ADN esté en mayor concentración
y la muestra en menor volumen (New England Biolabs, 2017). Si se agregara el mismo
volumen de etanol, debido al volumen de la muestra, la cantidad sería insuficiente. Debido
a esto, el protocolo estándar para una muestra de gran volumen es añadir 2-2,5 veces el
volumen de la muestra en etanol para que la precipitación ocurra sin problemas, o bien,
isopropanol en un volumen de 0,7-1 veces el de la muestra (New England Biolabs, 2017)

E. CONCLUSIONES
 La extracción de ADN por salting-out es un método sensible a errores humanos.
 La cantidad de ADN obtenida es mínima en comparación a la muestra y los reactivos
empleados.
  Es difícil observar el ADN, aún cuando se encuentra condensado en una solución de
etanol.

F. BIBLIOGRAFÍA

Alejos, L., Aragón, M., & Cornejo, A. (s.f.). Extracción y purificación de ADN. Herramientas
moleculares aplicadas. Recuperado de
http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones2/libros/710/extraccion.pdf

Eckersall, D. (2008). Proteins, Proteomics, and the Dysproteinemias. En J. Janeko, J.

Harvey, & M. Bruss, Clinical Biochemistry of Domestic Animals. Estados Unidos:
Academic Press. Recuperado de https://www.sciencedirect.com/topics/immunology-
and-microbiology/protein-denaturation

MindTouch. (2018). Salting Out. Chemistry LibreTexts. Recuperado de

https://chem.libretexts.org/Bookshelves/Physical_and_Theoretical_Chemistry_Text
book_Maps/Supplemental_Modules_(Physical_and_Theoretical_Chemistry)/Therm
odynamics/Real_(Non-Ideal)_Systems/Salting_Out

Mohammad, A. (2018). Evaluation of a modified salt-out method for DNA extraction from
whole blood lymphocytes: A simple and economical method for gene polymorphism.
Pharmaceutical and Biomedica Research, 4(2), 28-32.

New England Biolabs. (2017). DNA Precipitation: Ethanol vs. Isopropanol. BiteSizeBio.
Recuperado de https://bitesizebio.com/2839/dna-precipitation-ethanol-vs-
isopropanol/

Novachem del Ecuador. (s.f.). Solución buffer (lisis celulas sangre roja). Novachem del
Ecuador. Recuperado de http://www.novachem.com.ec/producto/solucion-buffer-
lisis-celulas-sangre-roja/

Righetti, G., & Boschetti, E. (2013). Low Abundance Proteom Discovery. Estados Unidos:
Elsevier. Recuperado de https://www.sciencedirect.com/topics/chemistry/protein-
precipitation.

ThermoFisher Scientific. (s.f.). Detergents for Cell Lysis and Protein Extraction.
ThermoFisher Scientific/ Recuperado de
https://www.thermofisher.com/ec/en/home/life-science/protein-biology/protein-
biology-learning-center/protein-biology-resource-library/pierce-protein-
methods/detergents-cell-lysis-protein-extraction.html