Biologia quimica

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La biolog�a qu�mica es una disciplina cient�fica que abarca los campos de la
qu�mica y la biolog�a . La disciplina implica la aplicaci�n de t�cnicas qu�micas,
an�lisis y, a menudo, peque�as mol�culas producidas a trav�s de la qu�mica
sint�tica , para el estudio y la manipulaci�n de sistemas biol�gicos. A diferencia
de la bioqu�mica , que implica el estudio de la qu�mica de las biomol�culas y la
regulaci�n de las v�as bioqu�micas dentro y entre las c�lulas, la biolog�a qu�mica
se ocupa de la qu�mica aplicada a la biolog�a (s�ntesis de biomol�culas, simulaci�n
de sistemas biol�gicos, etc.).

Contenido
1 Introducci�n
2 sistemas de inter�s
2.1 Prote�mica
2.1.1 T�cnicas de enriquecimiento
2.1.2 Etiquetas de afinidad
2.1.3 Sondas enzim�ticas
2.2 Glicobiolog�a
2.3 Qu�mica combinatoria
2.4 Detecci�n molecular
2.5 Empleo de biolog�a
2.6 Plegamiento y agregaci�n de prote�nas como causa de enfermedad
2.7 S�ntesis qu�mica de p�ptidos
2.8 Dise�o de prote�nas por evoluci�n dirigida
2.9 Reacciones biocompatibles de cicloadici�n por clic en biolog�a qu�mica
2.9.1 Reacciones bioortogonales
2.9.2 Dise�o de reactivos bioortogonales y reporteros qu�micos bioortogonales.
2.9.3 Uso en sistemas biol�gicos
2.9.4 Direcciones futuras
2.10 Descubrimiento de biomol�culas a trav�s de la metagen�mica.
2.11 Fosforilaci�n de prote�nas
2.12 Enfoques qu�micos para la biolog�a de c�lulas madre
2.13 Fluorescencia para evaluar la ubicaci�n y funci�n de las prote�nas.
2.13.1 Fluor�foros y t�cnicas para etiquetar prote�nas
2.13.2 Din�mica de prote�nas
3 Ver tambi�n
4 referencias
5 Lectura adicional
5.1 Revistas
Introducci�n
Algunas formas de biolog�a qu�mica intentan responder preguntas biol�gicas
sondeando directamente los sistemas vivos a nivel qu�mico. A diferencia de la
investigaci�n que utiliza bioqu�mica , gen�tica o biolog�a molecular , donde la
mutag�nesis puede proporcionar una nueva versi�n del organismo, c�lula o
biomol�cula de inter�s, los sistemas de sondas de biolog�a qu�mica in vitro e in
vivo con mol�culas peque�as que han sido dise�adas para un espec�fico prop�sito o
identificado sobre la base de un an�lisis bioqu�mico o basado en c�lulas (ver
gen�tica qu�mica ).

La biolog�a qu�mica es una de varias ciencias interdisciplinarias que tienden a

diferir de los campos reduccionistas m�s antiguos y cuyos objetivos son lograr una
descripci�n del holismo cient�fico . La biolog�a qu�mica tiene ra�ces cient�ficas,
hist�ricas y filos�ficas en qu�mica m�dica , qu�mica supramolecular , qu�mica
bioorg�nica , farmacolog�a , gen�tica , bioqu�mica e ingenier�a metab�lica .

Sistemas de inter�s
Prote�mica
Art�culo principal: Prote�mica
La prote�mica investiga el proteoma , el conjunto de prote�nas expresadas en un
momento dado en condiciones definidas. Como disciplina, la prote�mica ha superado
la identificaci�n r�pida de prote�nas y se ha convertido en un ensayo biol�gico
para el an�lisis cuantitativo de muestras de prote�nas complejas al comparar los
cambios de prote�nas en sistemas perturbados de manera diferente. [1] Los objetivos
actuales en prote�mica incluyen determinar secuencias de prote�nas , abundancia y
cualquier modificaci�n postraduccional . Tambi�n son interesantes las interacciones
prote�na-prote�na , la distribuci�n celular de prote�nas y la comprensi�n de la
actividad proteica. Otro aspecto importante de la prote�mica es el avance de la
tecnolog�a para lograr estos objetivos.

Los niveles de prote�na, modificaciones, ubicaciones e interacciones son

propiedades complejas y din�micas. Con esta complejidad en mente, los experimentos
deben dise�arse cuidadosamente para responder preguntas espec�ficas, especialmente
frente a la gran cantidad de datos que generan estos an�lisis. La informaci�n m�s
valiosa proviene de prote�nas que se expresan de manera diferente en un sistema en
estudio. Estas prote�nas se pueden comparar entre s� utilizando prote�mica
cuantitativa , que permite que una prote�na se marque con una etiqueta de masa. Las
tecnolog�as prote�micas deben ser sensibles y robustas; por estas razones, el
espectr�metro de masasha sido el caballo de batalla del an�lisis de prote�nas. La
alta precisi�n de la espectrometr�a de masas puede distinguir entre especies
estrechamente relacionadas y las especies de inter�s pueden aislarse y fragmentarse
dentro del instrumento. Sus aplicaciones al an�lisis de prote�nas solo fueron
posibles a fines de la d�cada de 1980 con el desarrollo de la ionizaci�n de
prote�nas y p�ptidos con una fragmentaci�n m�nima. Estos avances fueron ESI y MALDI
. Las tecnolog�as de espectrometr�a de masas son modulares y se pueden elegir u
optimizar seg�n el sistema de inter�s.

Los bi�logos qu�micos est�n preparados para impactar la prote�mica a trav�s del
desarrollo de t�cnicas, sondas y ensayos con qu�mica sint�tica para la
caracterizaci�n de muestras de prote�nas de alta complejidad. Estos enfoques
incluyen el desarrollo de estrategias de enriquecimiento, etiquetas de afinidad
qu�mica y sondas.

T�cnicas de enriquecimiento
Las muestras para Prote�mica contienen una mir�ada de secuencias de p�ptidos, la
secuencia de inter�s puede estar altamente representada o de baja abundancia. Sin
embargo, para un an�lisis exitoso de la EM, el p�ptido debe enriquecerse dentro de
la muestra. La reducci�n de la complejidad de la muestra se logra mediante el
enriquecimiento selectivo utilizando t�cnicas de cromatograf�a de afinidad . Esto
implica apuntar a un p�ptido con una caracter�stica distintiva como una etiqueta de
biotina o una modificaci�n postraduccional . [2] Se han desarrollado m�todos que
incluyen el uso de anticuerpos, lectinas para capturar glucoprote�nas, iones
met�licos inmovilizadospara capturar p�ptidos fosforilados y sustratos de enzimas
suicidas para capturar enzimas espec�ficas. Aqu�, los bi�logos qu�micos pueden
desarrollar reactivos para interactuar con sustratos, espec�fica y estrechamente,
para perfilar un grupo funcional objetivo en una escala de proteoma. El desarrollo
de nuevas estrategias de enriquecimiento es necesario en �reas como sitios de
fosforilaci�n no ser / thr / tyr y otras modificaciones postraduccionales. Otros
m�todos de descomplejamiento de muestras se basan en separaciones cromatogr�ficas
aguas arriba .

Etiquetas de afinidad
La s�ntesis qu�mica de las etiquetas de afinidad ha sido crucial para la maduraci�n
de la prote�mica cuantitativa. iTRAQ , las etiquetas de masa en t�ndem (TMT) y la
etiqueta de afinidad codificada por is�topos (ICAT) son etiquetas de masa de
prote�nas que consisten en un grupo de uni�n covalente, un conector codificado en
masa (isob�rico o isot�pico) y un asa para el aislamiento. Varias etiquetas de masa
se unen a diferentes prote�nas como una especie de huella de tal manera que al
analizar c�lulas de diferentes perturbaciones, los niveles de cada prote�na se
pueden comparar relativamente despu�s del enriquecimiento por el mango introducido.
Otros m�todos incluyen SILAC y etiquetado de is�topos pesados. Estos m�todos se han
adaptado para identificar prote�nas complejadoras marcando una prote�na de cebo,
derrib�ndola y analizando las prote�nas que ha complejado. [3] Otro m�todo crea una
etiqueta interna al introducir nuevos amino�cidos que est�n codificados
gen�ticamente en organismos procariotas y eucariotas. Estas modificaciones crean un
nuevo nivel de control y pueden facilitar la fotocrosslinking para explorar
interacciones prote�na-prote�na. [4] Adem�s, los amino�cidos que contienen ceto,
acetileno, azida, tio�ster, boronato y deshidroalanina se pueden usar para
introducir selectivamente etiquetas y nuevos grupos funcionales qu�micos en las
prote�nas. [5]

Sondas enzim�ticas
Para investigar la actividad enzim�tica en oposici�n a la prote�na total, se han
desarrollado reactivos basados ??en la actividad para marcar la forma
enzim�ticamente activa de las prote�nas (ver Prote�mica basada en la actividad ).
Por ejemplo, los inhibidores de serina hidrolasa y ciste�na proteasa se han
convertido en inhibidores suicidas . [6] Esta estrategia mejora la capacidad de
analizar selectivamente los componentes de baja abundancia a trav�s de la
focalizaci�n directa. Las estructuras que imitan estos inhibidores podr�an
introducirse con modificaciones que ayudar�n al an�lisis prote�mico, como un
identificador o etiqueta de masa. [7] La actividad de la enzima tambi�n se puede
controlar a trav�s del sustrato convertido. [8]Esta estrategia se basa en el uso de
conjugados de sustrato sint�ticos que contienen restos sobre los que act�an enzimas
espec�ficas. Los conjugados del producto son capturados por un reactivo de afinidad
y analizados. La concentraci�n medida del producto conjugado permite la
determinaci�n de la velocidad de la enzima. Se pueden visualizar otros factores
como la temperatura, la concentraci�n de enzimas y la concentraci�n de sustrato.
[9]La identificaci�n de sustratos enzim�ticos (de los cuales puede haber cientos o
miles, muchos de los cuales se desconocen) es un problema de dificultad
significativa en prote�mica y es vital para la comprensi�n de las v�as de
transducci�n de se�ales en las c�lulas; Las t�cnicas para etiquetar sustratos
celulares de enzimas es un �rea que los bi�logos qu�micos pueden abordar. Un m�todo
que se ha desarrollado utiliza quinasas "sensibles a los an�logos" para etiquetar
sustratos utilizando un an�logo ATP no natural, lo que facilita la visualizaci�n y
la identificaci�n a trav�s de un asa �nica. [10]

Glicobiolog�a
Si bien el ADN , el ARN y las prote�nas est�n codificados a nivel gen�tico, existe
un sistema separado de mol�culas traficadas en la c�lula que no est�n codificadas
directamente a ning�n nivel directo: az�cares. Por lo tanto, la glicobiolog�a es un
�rea de investigaci�n densa para los bi�logos qu�micos. Por ejemplo, las c�lulas
vivas se pueden suministrar con variantes sint�ticas de az�cares naturales para
probar la funci�n de los az�cares in vivo. Carolyn Bertozzi , anteriormente en la
Universidad de California, Berkeley , ha desarrollado un m�todo para reaccionar
espec�ficamente en el sitio de las mol�culas de la superficie de las c�lulas que
han sido marcadas con az�cares sint�ticos.

Qu�mica combinatoria
Los bi�logos qu�micos utilizaron la s�ntesis automatizada de muchos compuestos
diversos para experimentar con los efectos de las mol�culas peque�as en los
procesos biol�gicos. M�s espec�ficamente, observan cambios en el comportamiento de
las prote�nas cuando peque�as mol�culas se unen a ellas. Tales experimentos
supuestamente pueden conducir al descubrimiento de mol�culas peque�as con
propiedades antibi�ticas o quimioterap�uticas. Estos enfoques de qu�mica
combinatoria son id�nticos a los empleados en la disciplina de farmacolog�a.
Detecci�n molecular
Los bi�logos qu�micos tambi�n est�n interesados ??en desarrollar nuevas
herramientas basadas en biomol�culas y mol�culas peque�as para estudiar procesos
biol�gicos, a menudo mediante t�cnicas de imagen molecular. [11] El campo de la
detecci�n molecular fue popularizado por el trabajo de Roger Tsien en el desarrollo
de compuestos fluorescentes con detecci�n de calcio, y por ser pionero en el uso de
GFP , por lo que recibi� el Premio Nobel de Qu�mica 2008. [12] Hoy, los
investigadores contin�an utilizando principios qu�micos b�sicos para desarrollar
nuevos compuestos para el estudio de metabolitos y procesos biol�gicos.

Empleo de biolog�a
Muchos programas de investigaci�n tambi�n se centran en emplear biomol�culas
naturales para realizar tareas biol�gicas o para apoyar un nuevo m�todo o material
qu�mico. A este respecto, los investigadores han demostrado que el ADN puede servir
como plantilla para la qu�mica sint�tica, las prote�nas de autoensamblaje pueden
servir como un andamiaje estructural para nuevos materiales y el ARN puede
evolucionar in vitro para producir una nueva funci�n catal�tica. Adem�s, las
mol�culas peque�as sint�ticas heterobifuncionales (de dos lados) como los
dimerizadores o PROTAC re�nen dos prote�nas dentro de las c�lulas, lo que puede
inducir sint�ticamente nuevas funciones biol�gicas importantes como la degradaci�n
de prote�nas espec�ficas. [13]

Plegamiento y agregaci�n de prote�nas como causa de enfermedad

Una forma com�n de agregaci�n son los husos largos y ordenados llamados fibrillas
amiloides que est�n implicados en la enfermedad de Alzheimer y que se ha demostrado
que consisten en regiones de hoja beta reticuladas perpendiculares a la columna
vertebral del polip�ptido. [14] Otra forma de agregaci�n ocurre con las prote�nas
pri�nicas , las glucoprote�nas encontradas con la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob y
la encefalopat�a espongiforme bovina . En ambas estructuras, la agregaci�n ocurre a
trav�s de interacciones hidrof�bicas y el agua debe excluirse de la superficie de
uni�n antes de que pueda ocurrir la agregaci�n. [15] Se puede ver una pel�cula de
este proceso en "Chemical and Engineering News". [diecis�is]Las enfermedades
asociadas con prote�nas mal plegadas son potencialmente mortales y extremadamente
debilitantes, lo que las convierte en un objetivo importante para la investigaci�n
en biolog�a qu�mica.

A trav�s del proceso de transcripci�n y traducci�n , el ADN codifica secuencias

espec�ficas de amino�cidos . Los polip�ptidos resultantes se pliegan en estructuras
secundarias, terciarias y cuaternarias m�s complejas para formar prote�nas. Basado
tanto en la secuencia como en la estructura, a una prote�na particular se le
confiere su funci�n celular. Sin embargo, a veces el proceso de plegado falla
debido a mutaciones en el c�digo gen�tico y, por lo tanto, a la secuencia de
amino�cidos o debido a cambios en el entorno celular (por ejemplo, pH, temperatura,
potencial de reducci�n, etc.). El plegamiento incorrecto ocurre con mayor
frecuencia en individuos de edad avanzada o en c�lulas expuestas a un alto grado de
estr�s oxidativo, pero una fracci�n de todas las prote�nas se pliegan
incorrectamente en alg�n momento incluso en las c�lulas m�s saludables.

Normalmente, cuando una prote�na no se pliega correctamente, las chaperonas

moleculares en la c�lula pueden alentar el replegamiento a su forma activa. Cuando
el replegamiento no es una opci�n, la c�lula tambi�n puede enfocarse en la prote�na
para la degradaci�n en sus amino�cidos componentes a trav�s de mecanismos
proteol�ticos , lisosomales o autof�gicos . Sin embargo, bajo ciertas condiciones o
con ciertas mutaciones, las c�lulas ya no pueden hacer frente a las prote�nas mal
plegadas y se produce un estado de enfermedad. O la prote�na tiene una p�rdida de
funci�n, como en la fibrosis qu�stica , en la que pierde actividad o no puede
alcanzar su objetivo, o la prote�na tiene una ganancia de funci�n, como con la
enfermedad de Alzheimer, en el que la prote�na comienza a agregarse haciendo que se
vuelva insoluble y no funcional.

El plegamiento de prote�nas se ha estudiado previamente utilizando enfoques

computacionales y ensayos biol�gicos in vivo en organismos modelo como Drosophila
melanogaster y C. elegans . Los modelos computacionales utilizan un proceso de novo
para calcular las posibles estructuras de prote�nas en funci�n de los par�metros de
entrada, como la secuencia de amino�cidos, los efectos del disolvente y las
mutaciones. Este m�todo tiene la desventaja de que el entorno celular se ha
simplificado dr�sticamente, lo que limita los factores que influyen en el
plegamiento y la estabilidad. Por otro lado, los ensayos biol�gicos pueden ser
bastante complicados de realizar in vivo con un alto rendimientocomo la eficiencia
y siempre queda la cuesti�n de qu� tan bien los sistemas de organismos inferiores
se aproximan a los sistemas humanos.

Dobson y col. Proponga combinar estos dos enfoques de manera que los modelos
computacionales basados ??en los estudios de organismos puedan comenzar a predecir
qu� factores conducir�n al plegamiento de prote�nas. [17] Ya se han realizado
varios experimentos basados ??en esta estrategia. En experimentos con Drosophila ,
se evaluaron diferentes mutaciones de p�ptidos beta amiloides en funci�n de las
tasas de supervivencia de las moscas, as� como de su capacidad m�vil. Los
resultados del estudio muestran que cuanto m�s se agrega una prote�na, m�s
perjudicial es la disfunci�n neurol�gica. [17] [18] [19] Otros estudios que usan
transtiretina , un componente del l�quido cefalorraqu�deoque se une al p�ptido beta
amiloide que disuade la agregaci�n pero que puede agregarse especialmente cuando
est� mutado, indica que las prote�nas propensas a la agregaci�n pueden no agregarse
donde se secretan y m�s bien se depositan en �rganos o tejidos espec�ficos en
funci�n de cada mutaci�n. [20] Kelly y col. han demostrado que cuanto m�s estable,
tanto cin�tica como termodin�micamente, una prote�na mal plegada es m�s probable
que la c�lula la secrete del ret�culo endopl�smico en lugar de apuntar a la
prote�na para la degradaci�n. [21] Adem�s, cuanto m�s estr�s sienta una c�lula por
las prote�nas mal plegadas, m�s probable es que las nuevas prote�nas se plieguen de
manera incorrecta. [22]Estos experimentos, as� como otros, han comenzado a
dilucidar las causas intr�nsecas y extr�nsecas del plegamiento err�neo, as� como la
forma en que la c�lula reconoce si las prote�nas se han plegado correctamente.

A medida que se obtiene m�s informaci�n sobre c�mo la c�lula hace frente a las
prote�nas mal plegadas, comienzan a surgir nuevas estrategias terap�uticas. Un
camino obvio ser�a la prevenci�n del plegamiento incorrecto. Sin embargo, si no se
puede evitar el plegamiento de prote�nas, quiz�s se puedan reforzar los mecanismos
naturales de degradaci�n de la c�lula para tratar mejor las prote�nas antes de que
comiencen a agregarse. [23] Antes de que estas ideas se puedan realizar, se
necesitan muchos m�s experimentos para comprender la maquinaria de plegado y
degradaci�n, as� como los factores que conducen al plegamiento incorrecto. Se puede
encontrar m�s informaci�n sobre el plegamiento de prote�nas y c�mo se relaciona con
la enfermedad en el libro recientemente publicado por Dobson, Kelly y Rameriz-
Alvarado titulado Principios y terapias actuales y emergentes sobre enfermedades de
plegamiento de prote�nas. [24]

S�ntesis qu�mica de p�ptidos

Art�culo principal: s�ntesis de p�ptidos
En contraste con la pr�ctica biotecnol�gica tradicional de obtener p�ptidos o
prote�nas mediante el aislamiento de hu�spedes celulares mediante la producci�n de
prote�nas celulares , los avances en las t�cnicas qu�micas para la s�ntesis y
ligadura de p�ptidos han permitido la s�ntesis total de algunos p�ptidos y
prote�nas. La s�ntesis qu�mica de prote�nas es una herramienta valiosa en biolog�a
qu�mica, ya que permite la introducci�n de amino�cidos no naturales, as� como la
incorporaci�n espec�fica de residuos de " modificaciones postraduccionales " como
la fosforilaci�n, la glicosilaci�n, la acetilaci�n e incluso la ubiquitinaci�n..
Estas capacidades son valiosas para los bi�logos qu�micos, ya que los amino�cidos
no naturales pueden usarse para sondear y alterar la funcionalidad de las
prote�nas, mientras que las modificaciones postraduccionales son ampliamente
conocidas por regular la estructura y actividad de las prote�nas. Aunque se han
desarrollado t�cnicas estrictamente biol�gicas para lograr estos fines, la s�ntesis
qu�mica de p�ptidos a menudo tiene una barrera t�cnica y pr�ctica m�s baja para
obtener peque�as cantidades de la prote�na deseada. Dada la importancia ampliamente
reconocida de las prote�nas como catalizadores celulares y elementos de
reconocimiento, la capacidad de controlar con precisi�n la composici�n y la
conectividad de los polip�ptidos es una herramienta valiosa en la comunidad de
biolog�a qu�mica y es un �rea de investigaci�n activa.

Mientras que los qu�micos han estado haciendo p�ptidos m�s de 100 a�os, [25] la
capacidad de sintetizar de manera eficiente y r�pidamente p�ptidos cortos la
mayor�a de edad con el desarrollo de Bruce Merrifield 's s�ntesis de p�ptidos en
fase s�lida (SPPS). Antes del desarrollo de SPPS, el concepto de s�ntesis de
pol�meros paso a paso sobre un soporte insoluble carec�a de precedentes qu�micos.
[26]El uso de un soporte polim�rico insoluble unido covalentemente simplific�
enormemente el proceso de s�ntesis de p�ptidos al reducir la purificaci�n a un
simple procedimiento de "filtraci�n y lavado" y facilit� un auge en el campo de la
qu�mica de p�ptidos. El desarrollo y la "optimizaci�n" de SPPS tom� la s�ntesis de
p�ptidos de manos de la comunidad especializada en s�ntesis de p�ptidos y la puso
en manos de la comunidad m�s amplia de qu�mica, bioqu�mica y ahora biolog�a
qu�mica. SPPS sigue siendo el m�todo de elecci�n para la s�ntesis lineal de
polip�ptidos de hasta 50 residuos de longitud [26]y se ha implementado en
sintetizadores de p�ptidos automatizados disponibles comercialmente. Una
deficiencia inherente en cualquier procedimiento que requiera reacciones de
acoplamiento repetidas es la acumulaci�n de productos secundarios resultantes de
acoplamientos incompletos y reacciones secundarias. Esto coloca el l�mite superior
para la s�ntesis de longitudes de polip�ptidos lineales en alrededor de 50
amino�cidos, mientras que la prote�na "promedio" consiste en 250 amino�cidos. [25]
Claramente, hab�a una necesidad de desarrollar m�todos "no lineales" para permitir
el acceso sint�tico a la prote�na promedio.

Aunque las deficiencias de SPPS lineales se reconocieron poco despu�s de su

creaci�n, tard� hasta principios de la d�cada de 1990 para desarrollar una
metodolog�a efectiva para ligar peque�os fragmentos de p�ptidos hechos por SPPS, en
cadenas de polip�ptidos del tama�o de prote�nas (para una revisi�n reciente de
estrategias de ligadura de p�ptidos, ver revisi�n de Dawson et al. [27] ). El m�s
antiguo y mejor desarrollado de estos m�todos se denomina ligadura qu�mica nativa .
La ligadura qu�mica nativa se dio a conocer en un art�culo de 1994 del laboratorio
de Stephen BH Kent . [28]La ligadura qu�mica nativa implica el acoplamiento de un
tio�ster C-terminal y un residuo de ciste�na N-terminal, lo que finalmente resulta
en la formaci�n de un enlace amida "nativo". Otros refinamientos en la ligadura
qu�mica nativa han permitido el acoplamiento cin�ticamente controlado de m�ltiples
fragmentos de p�ptidos, permitiendo el acceso a p�ptidos de tama�o moderado, como
un d�mero de proteasa del VIH [29] y lisozima humana. [30] Incluso con los �xitos y
las caracter�sticas atractivas de la ligadura qu�mica nativa, todav�a hay algunos
inconvenientes en la utilizaci�n de esta t�cnica. Algunos de estos inconvenientes
incluyen la instalaci�n y preservaci�n de un tio�ster C-terminal reactivo, el
requisito de un residuo de ciste�na N-terminal (que es el segundo amino�cido menos
com�n en las prote�nas), [31] y el requisito de un residuo C-terminal est�ricamente
libre.

Otras estrategias que se han usado para la ligadura de fragmentos de p�ptidos

usando la qu�mica de transferencia de acilo introducida por primera vez con la
ligadura qu�mica nativa incluyen la ligadura de prote�nas expresadas, [32] t�cnicas
de sulfuraci�n / desulfuraci�n, [33] y el uso de auxiliares de tiol removibles.
[34]
La ligadura de prote�nas expresada permite la instalaci�n biotecnol�gica de un
tio�ster C-terminal usando inte�nabioqu�mica, permitiendo as� el ap�ndice de un
p�ptido N-terminal sint�tico a la porci�n C-terminal producida recombinantemente.
Esta t�cnica permite el acceso a prote�nas mucho m�s grandes, ya que solo la
porci�n N-terminal de la prote�na resultante tiene que sintetizarse qu�micamente.
Tanto las t�cnicas de sulfuraci�n / desulfuraci�n como el uso de auxiliares de tiol
extra�bles implican la instalaci�n de un resto de tiol sint�tico para llevar a cabo
la qu�mica de ligadura qu�mica nativa est�ndar, seguido de la eliminaci�n del
auxiliar / tiol. Estas t�cnicas ayudan a superar el requisito de una ciste�na N-
terminal necesaria para la ligadura qu�mica nativa est�ndar, aunque los requisitos
est�ricos para el residuo C-terminal todav�a son limitantes.

Una categor�a final de estrategias de ligadura de p�ptidos incluye aquellos m�todos

que no se basan en la qu�mica del tipo de ligadura qu�mica nativa. Los m�todos que
entran en esta categor�a incluyen la ligadura de Staudinger sin trazas, [35]
cicloadiciones dipolares de azida-alquino, [36] y ligaduras de imina. [37]

Los principales contribuyentes en este campo incluyen a Stephen BH Kent, Philip E.

Dawson y Tom W. Muir, as� como a muchos otros involucrados en el desarrollo de
metodolog�as y aplicaciones de estas estrategias a problemas biol�gicos.

Dise�o de prote�nas por evoluci�n dirigida

Art�culo principal: Evoluci�n dirigida
Uno de los objetivos principales de la ingenier�a de prote�nas es el dise�o de
nuevos p�ptidos o prote�nas con una estructura y actividad qu�mica deseadas. Debido
a que nuestro conocimiento de la relaci�n entre la secuencia primaria, la
estructura y la funci�n de las prote�nas es limitado, el dise�o racional de nuevas
prote�nas con actividad enzim�tica es extremadamente desafiante. La evoluci�n
dirigida, ciclos repetidos de diversificaci�n gen�tica seguidos de un proceso de
selecci�n o selecci�n, pueden usarse para imitar la evoluci�n darwiniana en el
laboratorio para dise�ar nuevas prote�nas con una actividad deseada. [38]

Existen varios m�todos para crear grandes bibliotecas de variantes de secuencia.

Entre los m�s utilizados est�n sometiendo ADN a la radiaci�n UV o mut�genos
qu�micos , PCR propensa a errores , codones degenerados , o recombinaci�n . [39]
[40] Una vez que se crea una gran biblioteca de variantes, se utilizan t�cnicas de
selecci�n o selecci�n para encontrar mutantes con un atributo deseado. Las t�cnicas
comunes de selecci�n / selecci�n incluyen clasificaci�n celular activada por
fluorescencia (FACS), [41] presentaci�n de ARNm , [42] presentaci�n de fagos o
compartimentaci�n in vitro .[43] Una vez que se encuentran variantes �tiles, su
secuencia de ADN se amplifica y se somete a rondas adicionales de diversificaci�n y
selecci�n. Como solo se seleccionan prote�nas con la actividad deseada, m�ltiples
rondas de evoluci�n dirigida conducen a prote�nas con rasgos beneficiosos de
acumulaci�n.

Hay dos estrategias generales para elegir la secuencia de partida para un

experimento de evoluci�n dirigida: dise�o de novo y redise�o. En un experimento de
dise�o de prote�nas, se elige una secuencia inicial al azar y se somete a m�ltiples
rondas de evoluci�n dirigida. Por ejemplo, esto se ha empleado con �xito para crear
una familia de prote�nas de uni�n a ATP con un nuevo patr�n de plegado que no se
encuentra en la naturaleza. [44] Las secuencias aleatorias tambi�n pueden estar
sesgadas hacia pliegues espec�ficos especificando las caracter�sticas (como polar
frente a no polar) pero no la identidad espec�fica de cada amino�cido en una
secuencia. Entre otras cosas, esta estrategia se ha utilizado para dise�ar con
�xito prote�nas de haz de cuatro h�lices . [45] [46]Debido a que a menudo se piensa
que se requiere una estructura bien definida para la actividad, sesgar una prote�na
dise�ada para adoptar una estructura plegada espec�fica probablemente aumente la
frecuencia de variantes deseables en las bibliotecas construidas.
En un experimento de redise�o de prote�nas, una secuencia existente sirve como
punto de partida para la evoluci�n dirigida. De esta manera, las prote�nas viejas
se pueden redise�ar para aumentar la actividad o nuevas funciones. El redise�o de
prote�nas se ha utilizado para la simplificaci�n de prote�nas, la creaci�n de
nuevas estructuras cuaternarias y el redise�o topol�gico de una corismato mutasa .
[39] [47] [48] Para desarrollar enzimas con nuevas actividades, uno puede
aprovechar las enzimas promiscuas o las enzimas con reacciones secundarias
significativas. En este sentido, la evoluci�n dirigida se ha utilizado en la ?-
humuleno sintasa, una enzima que crea m�s de 50 sesquiterpenos diferentes , para
crear enzimas que sintetizan selectivamente productos individuales. [49]Del mismo
modo, se pueden seleccionar funciones completamente nuevas de los andamios de
prote�nas existentes. En un ejemplo de esto, se cre� una ARN ligasa a partir de un
andamio de dedo de zinc despu�s de 17 rondas de evoluci�n dirigida. Esta nueva
enzima cataliza una reacci�n qu�mica que no se sabe que es catalizada por ninguna
enzima natural. [50]

Los m�todos computacionales , cuando se combinan con enfoques experimentales,

pueden ayudar significativamente tanto al dise�o como al redise�o de nuevas
prote�nas a trav�s de la evoluci�n dirigida. La computaci�n se ha utilizado para
dise�ar prote�nas con pliegues antinaturales, como una bobina enrollada derecha .
[51] Estos enfoques computacionales tambi�n podr�an usarse para redise�ar prote�nas
para unir selectivamente mol�culas diana espec�ficas. Al identificar las secuencias
principales utilizando m�todos computacionales, la aparici�n de prote�nas
funcionales en las bibliotecas se puede aumentar dram�ticamente antes de cualquier
experimento de evoluci�n dirigida en el laboratorio.

Manfred T. Reetz , Frances Arnold , Donald Hilvert y Jack W. Szostak son

investigadores importantes en este campo.

Reacciones biocompatibles de cicloadici�n de clic en biolog�a qu�mica

Los avances recientes en tecnolog�a han permitido a los cient�ficos ver
subestructuras de c�lulas a niveles de detalles sin precedentes. Lamentablemente,
estas im�genes "a�reas" ofrecen poca informaci�n sobre la mec�nica del sistema
biol�gico en cuesti�n. Para ser completamente efectivos, los sistemas de im�genes
precisos requieren una t�cnica complementaria que aclare mejor la maquinaria de una
c�lula. Al conectar dispositivos de seguimiento (sondas �pticas) a biomol�culas in
vivo , se puede aprender mucho m�s sobre el metabolismo celular , el transporte
molecular , las interacciones c�lula-c�lula y muchos otros procesos [52]

Reacciones bioortogonales
El etiquetado exitoso de una mol�cula de inter�s requiere la funcionalizaci�n
espec�fica de esa mol�cula para reaccionar quimioespec�ficamente con una sonda
�ptica. Para que un experimento de etiquetado se considere robusto, esa
funcionalizaci�n debe perturbar m�nimamente el sistema. [53] Desafortunadamente,
estos requisitos a menudo pueden ser extremadamente dif�ciles de cumplir. Muchas de
las reacciones normalmente disponibles para los qu�micos org�nicos en el
laboratorio no est�n disponibles en los sistemas vivos. Las reacciones sensibles al
agua y redox no se llevar�an a cabo, los reactivos propensos al ataque nucleof�lico
no ofrecer�an quimioespecificidad, y cualquier reacci�n con grandes barreras
cin�ticas no encontrar�a suficiente energ�a en el ambiente de calor relativamente
bajo de una c�lula viva. As�, los qu�micos han desarrollado recientemente un panel
de qu�mica bioortogonalque proceden quimioespec�ficamente, a pesar del entorno de
materiales reactivos que distraen in vivo .

Dise�o de reactivos bioortogonales y reporteros qu�micos bioortogonales

El acoplamiento de una sonda �ptica a una mol�cula de inter�s debe ocurrir dentro
de un marco de tiempo razonablemente corto; por lo tanto, la cin�tica de la
reacci�n de acoplamiento deber�a ser altamente favorable. La qu�mica de clics es
muy adecuada para llenar este nicho, ya que las reacciones de clics son, por
definici�n, r�pidas, espont�neas, selectivas y de alto rendimiento. [54]
Desafortunadamente, la "reacci�n de clic" m�s famosa, una cicloadici�n [3 + 2]
entre una azida y un alquino ac�clico , est� catalizada por cobre, lo que plantea
un grave problema para su uso in vivo debido a la toxicidad del cobre. [55]

El problema de la toxicidad del cobre puede aliviarse utilizando ligandos quelantes

de cobre, lo que permite el etiquetado catalizado por cobre de la superficie de las
c�lulas vivas. [56]

Para evitar la necesidad de un catalizador, el laboratorio de la Dra. Carolyn

Bertozzi introdujo una cepa inherente en la especie alquino mediante el uso de un
alquino c�clico. En particular, el ciclooctino reacciona con azido-mol�culas con un
vigor distintivo. [57] Una mayor optimizaci�n de la reacci�n condujo al uso de
ciclooctinos difluorados (DIFO), que aumentaron el rendimiento y la velocidad de
reacci�n. [58] Otros compa�eros de acoplamiento descubiertos por laboratorios
separados que son an�logos a los ciclooctinos incluyen transcicloocteno , [59]
norborneno , [60] y una mol�cula funcionalizada con ciclobuteno. [61]

Uso en sistemas biol�gicos

Como se mencion� anteriormente, el uso de reacciones bioortogonales para etiquetar
biomol�culas requiere que la mitad del par reactivo "clic" est� instalado en la
mol�cula objetivo, mientras que el otro est� conectado a una sonda �ptica. Cuando
la sonda se agrega a un sistema biol�gico, se conjuga selectivamente con la
mol�cula objetivo.

El m�todo m�s com�n para instalar la reactividad bioortogonal en una biomol�cula

objetivo es a trav�s del etiquetado metab�lico. Las c�lulas se sumergen en un medio
donde el acceso a los nutrientes est� limitado a an�logos modificados
sint�ticamente de combustibles est�ndar como los az�cares. Como consecuencia, estas
biomol�culas alteradas se incorporan a las c�lulas de la misma manera que sus
hermanos de tipo salvaje. La sonda �ptica se incorpora al sistema para obtener
im�genes del destino de las biomol�culas alteradas. Otros m�todos de
funcionalizaci�n incluyen enzim�ticamente la inserci�n de azidas en prote�nas ,
[62] y la s�ntesis de fosfol�pidos conjugados a cyclooctynes. [63]

Direcciones futuras
A medida que estas reacciones bioortogonales se optimicen a�n m�s, probablemente se
usar�n para interacciones cada vez m�s complejas que involucran m�ltiples clases
diferentes de biomol�culas. Las interacciones m�s complejas tienen un margen de
error m�s peque�o, por lo que una mayor eficiencia de reacci�n es primordial para
el �xito continuo en el sondeo �ptico de maquinaria celular. Adem�s, al minimizar
las reacciones secundarias, el dise�o experimental de un sistema de vida
m�nimamente perturbado est� m�s cerca de realizarse.

Descubrimiento de biomol�culas a trav�s de la metagen�mica

Art�culo principal: Metagen�mica.
Los avances en las tecnolog�as modernas de secuenciaci�n a fines de la d�cada de
1990 permitieron a los cient�ficos investigar el ADN de las comunidades de
organismos en sus entornos naturales, llamado "eDNA", sin cultivar especies
individuales en el laboratorio. Este enfoque metagen�mico permiti� a los
cient�ficos estudiar una amplia selecci�n de organismos que anteriormente no se
caracterizaban debido en parte a una condici�n de crecimiento incompetente. Estas
fuentes de eDNA incluyen, entre otras, suelos , oc�ano, subsuelo , aguas termales ,
respiraderos hidrotermales , casquetes polares , h�bitats hipersalinos y ambientes
de pH extremo. [64] De las muchas aplicaciones de metagen�mica, bi�logos qu�micos y
microbi�logos comoJo Handelsman , Jon Clardy y Robert M. Goodman , pioneros de la
metagen�mica, exploraron enfoques metagen�micos hacia el descubrimiento de
mol�culas biol�gicamente activas como los antibi�ticos . [sesenta y cinco]
Resumen de los m�todos metagen�micos
Resumen de los m�todos metagen�micos
Se han utilizado estrategias de detecci�n funcionales u homol�gicas para
identificar genes que producen peque�as mol�culas bioactivas. Los estudios
metagen�micos funcionales est�n dise�ados para buscar fenotipos espec�ficos que
est�n asociados con mol�culas con caracter�sticas espec�ficas. Los estudios
metagen�micos de homolog�a, por otro lado, est�n dise�ados para examinar genes para
identificar secuencias conservadas que se asociaron previamente con la expresi�n de
mol�culas biol�gicamente activas. [66]

Los estudios metagen�micos funcionales permiten a los cient�ficos descubrir nuevos

genes que codifican mol�culas biol�gicamente activas. Estos ensayos incluyen
ensayos de superposici�n de agar superior donde los antibi�ticos generan zonas de
inhibici�n del crecimiento contra los microbios de prueba, y ensayos de pH que
pueden detectar cambios de pH debido a mol�culas reci�n sintetizadas utilizando un
indicador de pH en una placa de agar . [67] La detecci�n de expresi�n g�nica
inducida por sustrato (SIGEX), un m�todo para detectar la expresi�n de genes
inducidos por compuestos qu�micos, tambi�n se ha utilizado para buscar genes con
funciones espec�ficas. [67] Esto condujo al descubrimiento y aislamiento de varias
prote�nas nuevas y mol�culas peque�as. Por ejemplo, el grupo Schipper identific�
tres AHL lactonasas derivadas de ADNc que inhibenFormaci�n de biopel�culas de
Pseudomonas aeruginosa mediante ensayos metagen�micos funcionales. [68] Sin
embargo, estos m�todos de detecci�n funcional requieren un buen dise�o de sondas
que detecten las mol�culas que se sintetizan y dependen de la capacidad de expresar
metagenomas en el sistema del organismo hu�sped. [67]

En contraste, los estudios metagen�micos de homolog�a condujeron a un

descubrimiento m�s r�pido de genes que tienen secuencias hom�logas como los genes
previamente conocidos que son responsables de la bios�ntesis de mol�culas
biol�gicamente activas. Tan pronto como se secuencian los genes, los cient�ficos
pueden comparar miles de genomas bacterianos simult�neamente. [66] La ventaja sobre
los ensayos metagen�micos funcionales es que los estudios metagen�micos de
homolog�a no requieren un sistema de organismo hu�sped para expresar los
metagenomas, por lo que este m�todo puede ahorrar potencialmente el tiempo dedicado
al an�lisis de genomas no funcionales. Esto tambi�n condujo al descubrimiento de
varias prote�nas nuevas y mol�culas peque�as. Por ejemplo, Banik et al. cribado
para detectar clones que contienen genes asociados con la s�ntesis de teicoplanina
y vancomicina antibi�ticos glucop�ptidos y encontramos dos nuevos grupos de genes
biosint�ticos. [69] Adem�s, un examen in silico del Global Ocean Metagenomic Survey
encontr� 20 nuevas ciclasas lantibi�ticas . [70]

Existen desaf�os para los enfoques metagen�micos para descubrir nuevas mol�culas
biol�gicamente activas. Solo el 40% de las actividades enzim�ticas presentes en una
muestra se pueden expresar en E. coli. . [71] Adem�s, la purificaci�n y el
aislamiento de eDNA es esencial pero dif�cil cuando las fuentes de las muestras
obtenidas son poco conocidas. Sin embargo, los esfuerzos de colaboraci�n de
individuos de diversos campos incluyen gen�tica bacteriana , biolog�a molecular ,
gen�mica , bioinform�tica , robots , biolog�a sint�tica y qu�mica.pueden resolver
este problema juntos y conducir potencialmente al descubrimiento de muchas
mol�culas biol�gicamente activas importantes. [66]

Fosforilaci�n de prote�nas
La modificaci�n postraduccional de prote�nas con grupos fosfato ha demostrado ser
un paso regulador clave en todos los sistemas biol�gicos. Eventos de fosforilaci�n,
ya sea fosforilaci�n por prote�nas quinasas o desfosforilaci�n por fosfatasas,
resultan en la activaci�n o desactivaci�n de prote�nas. Estos eventos tienen un
inmenso impacto en la regulaci�n de las v�as fisiol�gicas, lo que hace que la
capacidad de diseccionar y estudiar estas v�as sea integral para comprender los
detalles de los procesos celulares. Existen varios desaf�os, a saber, el gran
tama�o del fosfoproteoma, la naturaleza fugaz de los eventos de fosforilaci�n y las
limitaciones f�sicas relacionadas con las t�cnicas cl�sicas biol�gicas y
bioqu�micas, que han limitado el avance del conocimiento en esta �rea. Una revisi�n
reciente [72] proporciona un examen detallado del impacto de los enfoques qu�micos
recientemente desarrollados para diseccionar y estudiar sistemas biol�gicos tanto
in vitro como in vivo.

Mediante el uso de una serie de clases de moduladores de mol�culas peque�as de

prote�nas quinasas, los bi�logos qu�micos han podido comprender mejor los efectos
de la fosforilaci�n de prote�nas. Por ejemplo, los inhibidores selectivos y no
selectivos de la quinasa, como una clase de compuestos de piridinilimidazol
descritos por Wilson, et al., [73] son inhibidores potentes �tiles en la disecci�n
de las v�as de se�alizaci�n de la quinasa MAP . Estos compuestos de
piridinilimidazol funcionan atacando el bolsillo de uni�n a ATP . Aunque este
enfoque, as� como los enfoques relacionados, [74] [75]con ligeras modificaciones,
ha demostrado su eficacia en varios casos, estos compuestos carecen de la
especificidad adecuada para aplicaciones m�s generales. Otra clase de compuestos,
los inhibidores basados ??en mecanismos, combina un conocimiento detallado del
mecanismo qu�mico de la acci�n de la quinasa con motivos de inhibici�n previamente
utilizados. Por ejemplo, Parang, et al. describe el desarrollo de un "an�logo de
bisustrato" que inhibe la acci�n de la quinasa al unir tanto el bolsillo de uni�n
de ATP conservado como un sitio de reconocimiento de prote�na / p�ptido en la
quinasa espec�fica. [76]Si bien no hay datos publicados in vivo sobre compuestos de
este tipo, los datos estructurales adquiridos de los estudios in vitro han ampliado
la comprensi�n actual de c�mo una cantidad de quinasas importantes reconocen
sustratos objetivo. Muchos grupos de investigaci�n utilizaron an�logos de ATP como
sonda qu�mica para estudiar quinasas e identificar sus sustratos. [77] [78] [79]

El desarrollo de nuevos medios qu�micos para incorporar fosfomim�ticos en las

prote�nas ha proporcionado informaci�n importante sobre los efectos de los eventos
de fosforilaci�n. Hist�ricamente, los eventos de fosforilaci�n se han estudiado
mutando un sitio de fosforilaci�n identificado ( serina , treonina o tirosina ) a
un amino�cido, como la alanina , que no puede fosforilarse. Si bien este enfoque ha
tenido �xito en algunos casos, las mutaciones son permanentes in vivo y pueden
tener efectos potencialmente perjudiciales en el plegamiento y la estabilidad de
las prote�nas. Por lo tanto, los bi�logos qu�micos han desarrollado nuevas formas
de investigar la fosforilaci�n de prote�nas. Mediante la instalaci�n de fosfo-
serina, fosfo-treonina o fosfonato an�logoimitando a las prote�nas nativas, los
investigadores pueden realizar estudios in vivo para investigar los efectos de la
fosforilaci�n al extender la cantidad de tiempo que ocurre un evento de
fosforilaci�n mientras se minimizan los efectos a menudo desfavorables de las
mutaciones. La semis�ntesis de prote�nas, o m�s espec�ficamente la ligadura de
prote�nas expresadas (EPL), ha demostrado ser una t�cnica exitosa para producir
prote�nas sint�ticamente que contienen mol�culas fosfomim�ticas en el extremo C o
el N-terminal. [32] Adem�s, los investigadores se han basado en una t�cnica
establecida en la que uno puede insertar un amino�cido no natural en una secuencia
de p�ptidos cargando ARNt sint�tico que reconoce un cod�n sin sentido con un
amino�cido no natural. [80]Desarrollos recientes indican que esta t�cnica tambi�n
puede emplearse in vivo, aunque, debido a problemas de permeabilidad, estos
experimentos in vivo utilizando mol�culas fosfomim�ticas a�n no han sido posibles.
[81]

Los avances en biolog�a qu�mica tambi�n han mejorado con las t�cnicas cl�sicas de
acci�n de im�genes de quinasas. Por ejemplo, el desarrollo de biosensores
pept�dicos (p�ptidos que contienen mol�culas de fluor�foro incorporadas) permiti�
una mejor resoluci�n temporal en ensayos de uni�n in vitro. [82] Sin embargo, las
limitaciones experimentales impiden que esta t�cnica se use de manera efectiva in
vivo. Una de las t�cnicas m�s �tiles para estudiar la acci�n de la quinasa es la
transferencia de energ�a por resonancia de fluorescencia.(PREOCUPARSE). Para
utilizar FRET para estudios de fosforilaci�n, las prote�nas fluorescentes se
acoplan tanto a un dominio de uni�n a �cido fosfoamino como a un p�ptido que puede
fosforilarse. Tras la fosforilaci�n o desfosforilaci�n de un p�ptido sustrato, se
produce un cambio conformacional que da como resultado un cambio en la
fluorescencia. [83] FRET tambi�n se ha utilizado junto con la microscop�a de
im�genes de por vida fluorescente (FLIM) [84] o anticuerpos conjugados
fluorescentemente y citometr�a de flujo [85] para proporcionar resultados
detallados, espec�ficos y cuantitativos con excelente resoluci�n temporal y
espacial.

Mediante el aumento de los m�todos bioqu�micos cl�sicos, as� como el desarrollo de

nuevas herramientas y t�cnicas, los bi�logos qu�micos han mejorado la precisi�n y
precisi�n en el estudio de la fosforilaci�n de prote�nas.

Enfoques qu�micos de la biolog�a de c�lulas madre

Art�culos principales: c�lulas madre y c�lulas madre inducidas
Los avances en biolog�a de c�lulas madre generalmente han sido impulsados ??por
descubrimientos en biolog�a molecular y gen�tica . Estos han incluido la
optimizaci�n de las condiciones de cultivo para el mantenimiento y la
diferenciaci�n de c�lulas madre pluripotentes y multipotentes y el descifrado de
circuitos de se�alizaci�n que controlan el destino de las c�lulas madre. Sin
embargo, los enfoques qu�micos para la biolog�a de c�lulas madre han recibido
recientemente una mayor atenci�n debido a la identificaci�n de varias mol�culas
peque�as capaces de modular el destino de las c�lulas madre in vitro. [86]Un
enfoque de mol�cula peque�a ofrece ventajas particulares sobre los m�todos
tradicionales, ya que permite un alto grado de control temporal, ya que los
compuestos se pueden agregar o eliminar a voluntad, y la inhibici�n / activaci�n en
t�ndem de m�ltiples objetivos celulares.

Las mol�culas peque�as que modulan el comportamiento de las c�lulas madre se

identifican com�nmente en pantallas de alto rendimiento . Las bibliotecas de
compuestos se seleccionan para la inducci�n de un cambio fenot�pico deseado en
c�lulas madre cultivadas. Esto generalmente se observa mediante la activaci�n o
represi�n de un indicador fluorescente o mediante la detecci�n de marcadores
espec�ficos de la superficie celular por FACS o inmunohistoqu�mica . Los �xitos se
optimizan estructuralmente para la actividad mediante la s�ntesis y el rastreo de
bibliotecas secundarias. Los objetivos celulares de la mol�cula peque�a se pueden
identificar por cromatograf�a de afinidad , espectrometr�a de masas o microarrays
de ADN .

Una marca registrada de las c�lulas madre pluripotentes, como las c�lulas madre
embrionarias (ESC), es la capacidad de autorrenovarse indefinidamente. El uso
convencional de c�lulas alimentadoras y varios factores de crecimiento ex�genos en
el cultivo de ESC presentan un problema porque las condiciones de cultivo altamente
variables resultantes dificultan la expansi�n a largo plazo de los ESC no
diferenciados. [87] Idealmente, se podr�an desarrollar condiciones de cultivo
qu�micamente definidas para mantener los ESC en un estado pluripotente
indefinidamente. Con este objetivo, los laboratorios Schultz y Ding del Instituto
de Investigaci�n Scripps identificaron una mol�cula peque�a que puede preservar la
auto-renovaci�n a largo plazo de los ESC en ausencia de c�lulas alimentadoras y
otros factores de crecimiento ex�genos. [88] Se descubri� que esta nueva mol�cula,
llamada pluripotina, inhibe simult�neamente las v�as inductoras de diferenciaci�n
m�ltiple.

Moduladores de mol�culas peque�as del destino de las c�lulas madre.

La utilidad de las c�lulas madre radica en su capacidad para diferenciarse en todos
los tipos de c�lulas que forman un organismo. La diferenciaci�n se puede lograr in
vitro favoreciendo el desarrollo hacia un tipo de c�lula particular mediante la
adici�n de factores de crecimiento espec�ficos de linaje, pero este proceso es
t�picamente no espec�fico y genera bajos rendimientos del fenotipo deseado.
Alternativamente, inducir la diferenciaci�n por mol�culas peque�as es ventajoso
porque permite el desarrollo de condiciones definidas qu�micamente por completo
para la generaci�n de un tipo de c�lula espec�fico. Se ha identificado una mol�cula
peque�a, el neuropatiazol, que puede dirigir espec�ficamente la diferenciaci�n de
c�lulas madre neurales multipotentes en neuronas . [89]El neuropatiazol es tan
potente que las neuronas se desarrollan incluso en condiciones que normalmente
favorecen la formaci�n de c�lulas gliales , una demostraci�n poderosa de controlar
la diferenciaci�n por medios qu�micos.

Debido a los problemas �ticos que rodean la investigaci�n de ESC, la generaci�n de

c�lulas pluripotentes mediante la reprogramaci�n de las c�lulas som�ticas
existentes en un estado m�s "similar a un tallo" es una alternativa prometedora al
uso de ESC est�ndar. Mediante enfoques gen�ticos, esto se ha logrado recientemente
en la creaci�n de ESC por transferencia nuclear de c�lulas som�ticas [90] y la
generaci�n de c�lulas madre pluripotentes inducidas por transducci�n viral de genes
espec�ficos. [91] Desde una perspectiva terap�utica, la reprogramaci�n por medios
qu�micos ser�a m�s segura que los m�todos gen�ticos porque las c�lulas madre
inducidas estar�an libres de transgenes potencialmente peligrosos . [92]Se han
identificado varios ejemplos de mol�culas peque�as que pueden diferenciar las
c�lulas som�ticas. En un informe, los mioblastos comprometidos con el linaje se
trataron con un compuesto, llamado reversina, y se observ� que revierte a un
fenotipo m�s parecido a un tallo. [93] Se demostr� que estas c�lulas eran capaces
de diferenciarse en osteoblastos y adipocitos en condiciones apropiadas. [94]

Las terapias con c�lulas madre son actualmente el tratamiento m�s prometedor para
muchas enfermedades degenerativas . Los enfoques qu�micos para la biolog�a de
c�lulas madre apoyan el desarrollo de terapias basadas en c�lulas al mejorar el
crecimiento, mantenimiento y diferenciaci�n de c�lulas madre in vitro. Las
mol�culas peque�as que se ha demostrado que modulan el destino de las c�lulas madre
son posibles candidatos terap�uticos y proporcionan una inclinaci�n natural al
desarrollo precl�nico de f�rmacos. Las drogas de mol�cula peque�a podr�an promover
que las c�lulas madre end�genas se diferencien, reemplazando tejidos previamente
da�ados y, por lo tanto, mejorando la capacidad regenerativa del cuerpo . La
investigaci�n adicional de mol�culas que modulan el comportamiento de las c�lulas
madre solo revelar� nuevos objetivos terap�uticos.

Fluorescencia para evaluar la ubicaci�n y funci�n de las prote�nas

Fluor�foros y t�cnicas para etiquetar prote�nas
Los organismos est�n compuestos de c�lulas que, a su vez, est�n compuestas de
macromol�culas, por ejemplo, prote�nas, ribosomas, etc. Estas macromol�culas
interact�an entre s�, cambiando su concentraci�n y sufriendo modificaciones
qu�micas. El objetivo principal de muchos bi�logos es comprender estas
interacciones, utilizando resonancia magn�tica , VSG, electroqu�mica y
fluorescencia, entre otros. Las ventajas de la fluorescencia residen en su alta
sensibilidad, no invasividad, detecci�n segura y capacidad de modular la se�al de
fluorescencia. La fluorescencia se observ� principalmente a partir de peque�os
colorantes org�nicos unidos a anticuerpos contra la prote�na de inter�s. M�s tarde,
los fluor�foros podr�an reconocer directamente org�nulos, �cidos nucleicos e iones
importantes en las c�lulas vivas. En la �ltima d�cada, el descubrimiento deLa
prote�na verde fluorescente (GFP), de Roger Y. Tsien , el sistema h�brido y los
puntos cu�nticos han permitido evaluar la ubicaci�n y la funci�n de la prote�na con
mayor precisi�n. [95] Se utilizan tres tipos principales de fluor�foros: peque�os
colorantes org�nicos, prote�nas fluorescentes verdes y puntos cu�nticos . Los
tintes org�nicos peque�os generalmente tienen menos de 1 kD y se han modificado
para aumentar la fotoestabilidad, mejorar el brillo y reducir el auto-enfriamiento.
Los puntos cu�nticos tienen una longitud de onda muy n�tida, alta capacidad de
absorci�n molar y rendimiento cu�ntico. Tanto los tintes org�nicos como los tintes
cu�nticos no tienen la capacidad de reconocer la prote�na de inter�s sin la ayuda
de anticuerpos, por lo tanto, deben usar inmunomarcaje. Dado que el tama�o del
complejo de direccionamiento de fluor�foro t�picamente excede los 200 kD, podr�a
interferir con el reconocimiento de multiprote�na en los complejos de prote�nas, y
otros m�todos deber�an usarse en paralelo. Una ventaja incluye la diversidad de
propiedades y una limitaci�n es la capacidad de focalizaci�n en c�lulas vivas. Las
prote�nas fluorescentes verdes est�n codificadas gen�ticamente y pueden fusionarse
covalentemente con su prote�na de inter�s. Una t�cnica de marcado gen�tico m�s
desarrollada es el sistema biarsenical de tetraciste�na, que requiere la
modificaci�n de la secuencia objetivo que incluye cuatro ciste�nas, que une las
mol�culas biarsenicales permeables a la membrana, los tintes verde y rojo "FlAsH" y
"ReAsH", con afinidad picomolar. Tanto las prote�nas fluorescentes como la
tetraciste�na biarsenical pueden expresarse en c�lulas vivas, pero presentan
limitaciones importantes en la expresi�n ect�pica y pueden causar p�rdida de
funci�n. Giepmans muestra aplicaciones paralelas de m�todos de focalizaci�n y
fluor�foros usando GFP y tetraciste�na con ReAsH para a-tubulina y �-actina,
respectivamente. Despu�s de la fijaci�n, las c�lulas se inmunomarcaron para la
matriz de Golgi con QD y para la enzima mitocondrial citocromo con Cy5.[95]

Din�mica de prote�nas
Se han utilizado t�cnicas fluorescentes para evaluar una serie de din�micas de
prote�nas que incluyen el seguimiento de prote�nas, los cambios conformacionales,
las interacciones prote�na-prote�na, la s�ntesis y renovaci�n de prote�nas y la
actividad enzim�tica, entre otros.

Tres enfoques generales para medir la redistribuci�n y difusi�n neta de prote�nas

son el seguimiento de una sola part�cula, la espectroscop�a de correlaci�n y los
m�todos de fotomarcaci�n. En el seguimiento de una sola part�cula, la mol�cula
individual debe ser lo suficientemente brillante y escasa como para ser rastreada
de un video a otro. La espectroscop�a de correlaci�n analiza las fluctuaciones de
intensidad resultantes de la migraci�n de objetos fluorescentes dentro y fuera de
un peque�o volumen en el foco de un l�ser. En el fotomarcado, una prote�na
fluorescente puede ser eliminada en un �rea subcelular con el uso de iluminaci�n
local intensa y el destino de la mol�cula marcada puede ser reflejado directamente.
Michalet y sus colegas usaron puntos cu�nticos para el seguimiento de part�culas
individuales usando puntos cu�nticos de biotina en c�lulas HeLa. [96]

Una de las mejores formas de detectar cambios conformacionales en las prote�nas es

intercalar dicha prote�na entre dos fluor�foros. FRET responder� a los cambios
conformacionales internos que resultan de la reorientaci�n del fluor�foro con
respecto al otro. Dumbrepatil intercala un receptor de estr�genos entre una CFP
(prote�na fluorescente cian) y una YFP (prote�na fluorescente amarilla) para
estudiar los cambios conformacionales del receptor al unirse a un ligando. [97]

Se pueden aplicar fluor�foros de diferentes colores para detectar sus respectivos

ant�genos dentro de la c�lula. Si los ant�genos se encuentran lo suficientemente
cerca uno del otro, aparecer�n colocalizados y este fen�meno se conoce como
colocalizaci�n . [98] Se puede utilizar software inform�tico especializado, como
CoLocalizer Pro , para confirmar y caracterizar el grado de colocalizaci�n.

FRET puede detectar la interacci�n din�mica prote�na-prote�na en c�lulas vivas

siempre que los fluor�foros se acerquen lo suficiente. Galperin y col. utiliz� tres
prote�nas fluorescentes para estudiar las interacciones multiproteicas en c�lulas
vivas. [99]

Los sistemas biarsenicales de tetraciste�na se pueden usar para estudiar la

s�ntesis y el recambio de prote�nas, lo que requiere la discriminaci�n de copias
antiguas de copias nuevas. En principio, una prote�na etiquetada con tetraciste�na
se marca con FlAsH por un corto tiempo, dejando prote�nas marcadas en verde. La
s�ntesis de prote�nas se lleva a cabo en presencia de ReAsH, marcando las nuevas
prote�nas como rojas. [100]

Tambi�n se puede usar la fluorescencia para ver la actividad enzim�tica end�gena,

t�picamente mediante el uso de una prote�mica basada en la actividad apagada
(qABP). La uni�n covalente de un qABP al sitio activo de la enzima objetivo
proporcionar� evidencia directa sobre si la enzima es responsable de la se�al tras
la liberaci�n del inhibidor y recuperar la fluorescencia. [101]

La combinaci�n �nica de alta resoluci�n espacial y temporal, compatibilidad no

destructiva con c�lulas y organismos vivos y especificidad molecular aseguran que
las t�cnicas de fluorescencia seguir�n siendo centrales en el an�lisis de redes de
prote�nas y biolog�a de sistemas. [95]

Ver tambi�n
Gen�tica qu�mica
Quimiogen�mica
Referencias
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