TEMA 22. PROLIFERACIÓN CELULAR: REGULACIÓN DEL CICLO CELULAR EN EUCARIOTAS.

El número de células que existe en cada tejido en cada etapa del desarrollo del organismo debe mantenerse. El
proceso por el cual se regula o mantiene este valor se denomina homeostasis; el mantenimiento de la misma
depende de:

■ El control del ciclo celular que determina la proliferación.

▪ Estímulos activadores o señales positivas de la proliferación.
▪ Estímulos negativos de la proliferación o inhibidores del crecimiento.
Debe haber un equilibro constante entre ambos.

■ Mecanismos de muerta celular (fisiológica).

▪ Apoptosis.
▪ Autofagia
▪ Necrosis (no es exactamente fisiológico, ocurre en condiciones extremas).

■ Mecanismos de diferenciación.

Fases del ciclo celular.

El ciclo celular constituye una secuencia de etapas por las que van
pasando las células en las que se alternan frases de crecimiento y
reproducción. Se divide en dos grandes etapas: interfase, que contiene
fase G1, S y G2 y división celular, que consta de la mitosis o cariocinesis
y la citocinesis.

Go: Fase de quiescencia o reposo. La célula puede permanecer un tiempo

indeterminado en dicha situación, hasta que llegan estímulos positivos de
la proliferación, entrando entonces la célula en el ciclo celular con el fin de
llevar a cabo dicha proliferación, duplicando su genoma y dividiéndose.
G1: Es la fase de entrada al ciclo celular. En este momento la célula se
prepara para duplicar su genoma, para ello debe disponer de unos requerimientos básicos como nutrientes,
duplicación de ciertos orgánulos... La célula crece hasta alcanzar un tamaño mínimo, manteniendo su
metabolismo normal, necesario para poder continuar con el proceso de duplicación genética, que desembocará
en la división. De su duración depende la del ciclo celular (suele ser la más duradera), ya que el resto suelen
tener una duración relativamente constante.
En esta fase hay un punto de no retorno, restricción o crítico (R) que, una vez superado, determina la
continuidad irreversible del proceso hasta la siguiente división. Sin embargo, si no se supera, la célula queda en
un estado quiescente, de reposo, denominado G0.
S: Durante esta dase se produce la replicación del ADN, así como la síntesis de las histonas necesarias para
formar la cromatina.
G2: fase preparatoria de la mitosis, la célula continúa creciendo. En ella, se sintetizan las proteínas encargadas
de iniciar y desarrollar los procesos de desorganización de la envoltura nuclear. Además, se condensa
progresivamente la cromatina para formar los cromosomas.
M: mitosis o división celular.

La duración del ciclo celular es variable, depende del grado de desarrollo y del tipo de tejidos, y suele venir
determinado por las etapas G1 y G0. (Embrión 8-60min/clico, adulto 24h/ciclo)

Proliferación celular.

Basada en dos tipos de señales:

• Señal activadora del crecimiento: desde cualquier
factor externo o receptor de membrana extracelular o
intracelular, moléculas implicadas en las cascadas de
señales, así como los factores de transcripción son
considerados señales activadoras del crecimiento. El
estímulo es externo, pero las moléculas que realmente
activan la proliferación al final de la cascada de señales
o del ciclo de las mismas, serán las moléculas que
actúen directamente sobre la estimulación del genoma.
Estas proteínas alteradas pueden dar lugar a
proliferaciones incontroladas sin señal o estímulo
externo (oncoproteínas).
• Señal supresora del crecimiento: tienen la acción contraria a las anteriores, y son estimuladas por factores
externos que son reconocidos por receptores encargados de activar cascadas de señales que inician la acción de
un factor intracelular que pone en marcha a moléculas que activan represores del crecimiento.
 Modelo de los efectos de los protooncogenes y genes
supresores sobre la proliferación celular.

La homeostasis, es decir, el mantenimiento del número de células

depende de la proliferación celular, que es determinada por las
moléculas de control del ciclo celular. Esto depende del equilibro entre
señales activadoras y supresoras. La alteración de dicho equilibrio da
lugar a una proliferación incontrolada, lo que conocemos como cáncer.
Los protooncogenes son fragmentos de DNA que expresan un mRNA
funcional y que codifican para una proteína con función activadora del
crecimiento, de forma controlada. Si este gen sufre alguna alteración,
el producto codificado estará modificado o no se sintetizara
correctamente, lo que desemboca en una activación continua e
incontrolada, o un desequilibrio entre señales estimuladoras y
represoras, dando lugar a un proceso canceroso.

Moléculas reguladoras. (último eslabón de la cadena).

Los factores de transcripción han sido los encargados de regular la síntesis de las moléculas reguladoras que son
los que actúan en última instancia.

Los heterodímeros (proteínas) ciclinas y quinasas (Cdk quinasas dependientes de ciclinas), actúan en ciertos
momentos del ciclo para comprobar que se están dando las condiciones necesarias para pasar a la siguiente fase,
e iniciando la siguiente etapa. La quinasa (CDK) se encarga de catalizar uniéndose con cada ciclina específica
(formando el complejo ciclina / quinasa), de modo que la célula
puede continuar el ciclo celular. Las ciclinas se degradan tras
realizar su función. Las fluctuaciones en los niveles de ciclina
regulan el ciclo celular al afectar a la actividad de la Cdk. (La falta
de regulación del ciclo celular da lugar a tumores, ya que es una
proliferación celular descontrolada).

Así, los complejos ciclinas-quinasas están integrados por los responsables de que la célula pueda avanzar en las
diferentes etapas del ciclo.
~ Las ciclinas son una familia de proteínas de vida media o corta, que se sintetizan de forma específica en cada
etapa del ciclo celular.
~ Las quinasas son una familia de proteínas dependientes de ciclinas, cuyo nivel de síntesis se mantiene
constante. Poseen actividad ser-thr quinasas y catalizan fosforilaciones a nivel de residuos serina o treonina.
Pero esta acción solo la lleva a cabo cuando forma parte del heterodímero con las ciclinas, sino no desarrolla su
mecanismo o función.

La actividad del complejo ciclina-quinasa depende de varios parámetros.

· Tasa de síntesis / degradación de ciclinas: si estas proteínas no están presentes no existe actividad catalítica.
Se podría decir que actúan como la “subunidad reguladora” del heterodímero mientras que las Cdk serían la
“subunidad catalítica”. Dicha tasa de síntesis atiende a mecanismos de regulación transcripcional. La ciclinas se
degradan tras realizar su función.
· Procesos de modificación covalente (fosforilación) que afectan a las quinasas e influyen en su actividad.
· Presencia de inhibidores específicos de los diferentes complejos Cdk-ciclinas, conocidos como CKIs, que cuando
están presentes inhiben la actividad del complejo.

Puntos de control del ciclo celular.

La célula comprueba que todo se esté llevando a cabo correctamente estableciendo unos puntos de control:
Concretamente, cada ciclina regula una fase o situación específica:
D, tránsito en la fase G1 . El complejo D-Cdk4/6 fosforila sustratos que facilitan el tránsito durante esta fase. La
familia de ciclina D es la única cuyo nivel de transcripción depende directamente de factores de crecimiento. Tasa
elevada mantenida mientras estos actúan. El resto de ciclinas se expresan en un momento determinado.
E, paso de G1 a S. Esta comprobación o punto de control, se realiza por ejemplo en el punto R, donde se
determina el tamaño, los nutrientes, el correcto genoma completo para que la célula pase de G 1 a S y comience
la replicación del ADN. La ciclina E-Cdk2 se encarga de fosforilar sustratos que
se encargan de poner en marcha la maquinaria de replicación.
A, paso de S a G2. También se realizan controles en la fase G2, donde se
comprueba que la replicación haya sido correcta (sin mutaciones) y la célula esté
preparada para pasar a la fase M. La ciclina A forma complejo con Cdk1: es
sintetizada al final de la fase S y se mantiene durante toda la G2 asegurándose
de que la célula contenga todo lo necesario para llevar a cabo la división.
B: ciclina B + CDK1→ MPF promotor iniciador de la mitosis. En la fase M se
controla que los cromosomas estén alineados sobre el huso.
Señales y moléculas supresoras. (Último eslabón de la cadena).

Si las vías supresoras funcionan adecuadamente se puede regular el efecto positivo de un oncogen. Si estas
fallan el cáncer se desarrolla. (En la mayoría de los cánceres se encuentran anomalías en dichas vías).

1. Vía supresora del crecimiento mediada por retinoblastoma.

Retinoblastoma es una proteína (descubierta en la retina de niños)
que se puede presentar en dos formas covalentes.
- Hipofosforilada: activa desde el punto de vista de la supresión del
crecimiento, ya que en estas condiciones secuestra a un factor de
transcripción eE2F, que se trata de un regulador positivo de la
transcripción encargado de activar moléculas que regulan
positivamente la proliferación
- Hiperfosforilada: pierde afinidad por E2F que se separa del
inhibidor produciéndose una regulación positiva de la proliferación.
En este caso retinoblastoma se encuentra inactivo desde el punto de
vista de la supresión. Se fosforila cuando se forman en la célula los
complejos ciclina D – Cdk 4/6 que median una regulación positiva
de la regulación. Cuando dichos complejos no se forman, entonces
retinoblastoma permanece desfosforilado y secuestra a E2F.
Pertenecientes a esta misma vía encontramos inhibidores de
complejos ciclina kinasa CKIs capaces de inhibir la actividad del
complejo. El inhibidor p16 es el más relacionado con la supresión del
crecimiento tumoral.

2. Vía supresora del crecimiento mediada por p53.

P53 es una proteína que se denomina la “guardiana del genoma” ya que se encarga de controlar la transición
G1/S, comprobando que el DNA no posee alteraciones y se puede replicar, manteniendo su integridad. Posee una
vida media corta (de minutos).
Si existen daños, estos serán detectados por p53 y se ponen
en marcha las actividades derivadas de estas moléculas
(mecanismos de reparación): entonces su vida media se
alarga, ya que el daño en el genoma provoca una
fosforilación de p53 y conlleva un aumento en su vida media
llevando a cabo una serie de acciones concretas:
- Para el ciclo celular hasta que la situación sea adecuada.
- Pone en marcha los mecanismos de reparación.
- Si la situación es incontrolada y no se pueden solventar los
daños, facilitaría la apoptosis (muerte celular programada).

p-53 en forma de tetrámero activa la expresión de un gen y

la represión de otros, actuando como un factor
transcripcional.
▪ Una alta concentración de p53 activa la expresión de
moléculas que tren consigo la parada del ciclo: p21 se trata de un inhibidor de los complejos ciclina e – Cdk2,
por tanto el ciclo celular se para ya que la célula no va a disponer de las moléculas necesarias para la replicación.
También se secuestra PCNA.
▪ También estimula una alta concentración de GADD, lo que provoca una parada de crecimiento en respuesta a
daños en el DNA. La proteína GADD secuestra a PCNA, inhibiendo la actuación de la DNApolδ.
Además p53 activa las vías de reparación siempre que el daño sea limitado. En esas condiciones la célula
continuará progresando a través de las etapas del ciclo.
TEMA 23. MECANISMOS IMPLICADOS EN PROCESOS DE DIFERENCIACIÓN Y MUERTE CELULAR.

Cuando el daño en el DNA es excesivo, las acciones sobre p21 son iguales y se activan mecanismos de
reparación pero no se consiguen solventar los daños, entonces 53 detiene el ciclo celular, activando la apoptosis
o los mecanismos de muerte programada.
Conecta la regulación del ciclo celular con los mecanismos apoptóticos, mediante la activación de genes
proapoptóticos (aumenta Bax) y reprimiendo la transcripción de proteínas antiapoptóticas (Bal-2), actuando
como factor de transcripción.
P53 es una de las moléculas que aparece dañada o alterada en los procesos cancerosos. El daño en el DNA
persiste pero p53 no recibe estas señales de daños en el genoma, no puede parar el ciclo ni mediar la apoptosis.
Esto supone un descontrol del ciclo celular y de la proliferación, desencadenándose un proceso tumorigénico.

Tipos de muerte celular con repercusiones fisiológicas.

Necrosis: en realidad se trata de una muerte patológica que

carece de connotaciones fisiológicas. Se produce en la célula
como respuesta a agentes ambientales perjudiciales o en
situaciones límites del organismo (hipotermia, isquemia…). En
la necrosis siempre hay una variación en la ósmosis lo que
provoca un la lisis de las células, vertiendo el contenido
citoplasmático al líquido extracelular lo que activa las
respuestas del sistema inmune y trae consigo reacciones
inflamatorias y daños a los tejidos circundantes.

Apoptosis: Mecanismo de muerte celular

programada genéticamente que se produce de
forma fisiológica en el organismo. Permite que
el organismo pueda eliminar células alteradas.
Características: E
- En la etapa final se forman cuerpos
apoptóticos entidades rodeadas de membrana
que contienen componentes intracelulares
(nunca hay vertidos al fluido extracelular, sin
producir daño a los tejidos próximos).
- se altera la estructura de la membrana
plasmática permitiendo que los cuerpos
apoptóticos sean fagocitados por los
macrófagos.
- Se producen mecanismos proteolíticos en los
orgánulos.
- Se producen cambios en la envoltura nuclear,
que se desemsambla. Los cambios a este nivel
suponen la condensación de la cromatina y
fragmentación del DNA.

La apoptosis está mediada por p53, que interviene en la unión entre la regulación del ciclo celular, que ha sido
detenido, y el mecanismo de muerte programada, que se puede explicar en varias etapas:
1. Inducción: depende de distintos tipos de señales según donde se realice el proceso.
2. Ejecución: realizado mediante proteasas pertenecientes a la familia de
las caspasas, que facilitan la proteólisis de diferentes coponentes de la
célula, y las nucleasas, que van a facilitar la fragmentación del DNA.

• Proteasas caspasas.
13 miembros cuya identidad es de cisteín-proteasas. Facilitan la
proteólisis de diferentes componentes celulars, aunque no todos los
miembros están relacionados con la apoptosis. Estas enzimas se sintetizan
en forma inactiva y se activan a través de una casca de mecanismos
proteolíticos. Cuando hay señales que inducen la apoptosis se ponen en
marcha las proteasas iniciadoras, que mediante más mecanismos de
proteólisis activan a las ejecutoras, cuya activación se relaciona con la
dimerización de las iniciadoras. Estas segundas, son las que se encargan
de proteol izar determinadas proteínas diana que influyen en la estructura de la célula, de modo que esta sufre
una pérdida de su morfología y de orgánulos que acompañan al
mecanismo apoptótico.
• Nucleasas.
Se ocupan de la fragmentación del DNA. Cuando la célula entra
en apoptosis se fragmenta a nivel internucleosomas y originan
fragmentos de DNA de 200pb o múltiplos de esta cifra. Mediante
electroforesis se pueden identificar los fragmentos de DNA que
han sufrido la acción de las nucleasas, formándose una escalera
de DNA que no está presente en una célula “normal”, puesto que
su DNA se encuentra íntegro y las nucleasas no están activadas.

Todo ello trae consigo la formación de cuerpos apoptóticos que serán fagocitados por macrófagos.

El desarrollo de la apoptosis se puede llevar a cabo por medio de dos vías con las mismas consecuencias,
dependiendo el camino escogido de las señales de inducción del mecanismo apoptótico.
● Vía extrínseca: señales
extracelulares que interaccionan
con los receptores de muerte de
las membranas celulares. Esas
señal es transmitida al interior
celular mediante una cascada de
señales, llegando a activar las
caspasas iniciadoras que
ejercerán su acción sobre las
ejecutoras que median la
proteólisis de orgánulos. También
se activan las nucleasas y todos
los mecanismos de ejecución de
la apoptosis.
● Vía intrínseca: ocurre cuando
se debe a daños en el DNA,
donde interviene el guardian del
genoma p53. Esta vía implica a la
mitocondria: en este orgánulo
ocurrirá la despolarización de la
membrana mitocondrial, ruptura
y vertido del citocromo C al
citosol… Todo ello activa las
proteínas proteasas-caspasas
(que no tienen por que ser las
mismas que en la otra vía) y
nucleasas.

Autofagia: mecanismo que consiste en la destrucción de orgánulos y moléculas en los lisosomas. Ayuda a
mantener la homeostasis celular, y es un mecanismo que posee dos finalidades.
- tasa permanente o basal de autofagia: permite el recambio de proteínas y orgánulos que ya no necesita la
célula.
- Los componentes resultantes serán
utilizados como fuente de energía
(proteínas lisosomales).

Tipos de autofagia:
1. Microautofagia: es la propia membrana
del lisosoma la que engloba el contenido
a degradar o digerir.
2. Macroautofagia: se forman en el
citosol autofagosomas, entidades
rodeadas de doble membrana que
contienen una parte importante del
contenido celular que se quiere eliminar.
Se fusiona con la membrana del lisosoma
introduciéndose los componentes en este,
de modo que pueden ser degradados por
las proteínas lisosomales.
3. Autofagia mediada por chaperonas: se
eliminan proteínas muy concretas que
son reconocidas por las chaperonas gracias al proceso de ubiquitinación y estas, median su traslado a los
lisosomas.
Oncogenes y cáncer.

Implicación de señales activadoras y supresoras.

Las señales activadoras están codificadas

por protooncogenes. Estos genes son
susceptibles de convertirse en oncogenes si
se ven alterados. Es decir, un
protooncogen es estimulado por diferentes
factores y codifica una proteína activadora
de la proliferación celular. Actúa en
presencia de un estímulo (factor de
crecimiento) que controla positivamente la
proliferación y negativamente la apoptosis.
Un oncogen, es un protooncogen que ha
sido alterado y codifica para proteínas que
sufrirán alguna modificación implicada en su
función, pasando a llamarse oncoproteínas.
Estas regulan positivamente la
proliferanción tanto en presencia como en
ausencia del estímulo, de manera
descontrolada, produciéndose un tumor y
quedando el individuo afectado por el
cáncer.

Las señales supresoras están codificadas

por genes supresores. Estos genes son
susceptibles de convertirse en
oncosupresores si se ven alterados. Son
estimulados por diferentes factores y
codifican una proteína supresora de la
proliferación celular. Actúa en presencia de
un estímulo inhibitorio del crecimiento, que
controla negativamente la proliferación y
positivamente la apoptosis.
Si los genes supresores son alterados se
convierten en oncosupresores y codifican
para proteínas anómalas que pierden su
capacidad para frenar la proliferación,
produciéndose un desarrollo celular
incontrolado que da lugar al cáncer.

Estas modificaciones en los genes suelen ocurrir por mutaciones tipo deleción, que provocan una ausencia de
codificación de la proteína o una anomalía en esta, lo cual inactiva o altera su actividad tanto cuando hay
estímulo como cuando no.
TEMA 24. MÉTODOS DE PURIFICACIÓN Y ANÁLISIS DE ÁCIDOS NUCLEICOS.

Para poder utilizar las técnicas de caracterización que permiten analizar ácidos nucleicos, primero hemos de
realizar un pretratamiento de los mismos, purificándolos y tratándolos con la nucleasa contraria al ácido nucleico
que se quiere obtener.

Extracción y purificación.

Los ácidos nucleicos que queremos analizar se encuentran en un medio biológico, normalmente en un tejido o en
un cultivo celular. Deben extraerse de las células, purificarse y aislarse. Para ello contamos con tres fases:
1. Fase de lisis: ruptura de las membranas celulares
2. Fase de purificación de proteínas: separación de los a.n. del contenido de naturaleza proteica, considerándolo
contaminante pues interfieren en las técnicas aplicadas, por lo que han de ser eliminadas.
3. Fase de concentración o precipitación.

■ 1. Fase de lisis.
Para extraer los ácidos nucleicos a partir de un material biológico, hay que aplicar sistemas de lisis en
condiciones que se evite la actuación de nucleasas que pudieran dañar los a.n. objeto de estudio.

Se realiza en una solución acuosa tamponada que contiene una serie de elementos esenciales:
- Inhibidores de nucleasas (EDTA): agente complejante de iones divalentes necesarios para que las nucleasas
desarrollen su actividad, se trata de una inhibición directa de estas.
- Detergentes iónicos (SDS): interviene en la ruptura de la membrana
- Proteasas (Proteinasa K): si se trata de DNA genómico hay que tener en cuenta que está unido a proteínas que
se deben separar (histonas y no histonas). En un plásmido o en RNA este componente no es tan determinante.

Si se trata de extracciones de RNA, hay que añadir, además, inhibidores específicos de RNasas ya que son
enzimas muy activas y el material se puede degradar muy fácil y rápidamente.
- Clorhidrato de Guanidina: agente desnaturalizante que contribuye a la inactivación de RNasas
- ß-Mercapto etanol: agente reductore que promueve estructuras que no son catalíticamente activas

■ 2. Fase de purificación de proteínas.

El método clásico para eliminar las proteínas interferentes consiste en realizar extracciones sucesivas con
disolventes orgánicos, siendo los más utilizados (mezclados, ya que así es más eficaz):
- fenol
- cloroformo: alcohol isoamílico. Si se utiliza aislado tiene efecto disolvente sobre el mRNA con largas colas de
PoliAs.
El número de extracciones variará según la fuente biológica de partida. En las extracciones se recoge la capa
acuosa (donde se encontrarán los a.n.) y se vuelve a tratar las veces necesarias procediendo a la
desproteinización.

■ 3. Fase de concentración o precipitación.

Precipitación de ácidos nucleicos en una solución acuosa y en frio, en presencia de:
- concentraciones bajas de sales de cationes monovalentes que ayudan a precipitar (NaCl, LiCl, NH 4Cl…)
- alcoholes: etanol, isopropano (desplazan las moléculas de agua)
Así los ácidos nucleicos solubilizados en un medio acuoso se
pueden precipitar. Tras centrifugación, se procede a la
separación del medio acuoso y el pellet se deja secar para
posteriormente cuantificar la cantidad de ácido nucleico
obtenida y valorar su pureza.

Purificación de mRNA a partir de RNA total.

A través de cromatografía de afinidad: columnas rellenas de

una resina unida al ligando (poliuridilato o polidT) de unión
específica a mRNA, en concreto a las colas de PoliAs (en
eucariotas). Solo queda unido el mRNA a estos ligandos en el
interior de la columna, ya que tienen capacidad para
establecer puentes de hidrógeno con las regiones
complementarias. El resto de moléculas de RNA salen eluídas
de la columna.
Cambiando la fuerza iónica del tampón, se eliminan las
uniones por puentes de hidrógeno anteriormente establecidas
obteniendo el mRNA aislado.
Valoración de la cantidad y pureza de ácidos nucleicos.

● Cuantificación.
Doble cadena
La lectura a 260nm (pues es el máximo de absorción para
Cadena sencilla
los ácidos nucleicos, en concreto para las bases
nitrogenadas) mediante métodos espectrofotométricos
permite el cálculo de la concentración de ácidos nucleicos Cadena sencilla
en la muestra.

● Pureza.

La pureza representa el grado de aislamiento de los ácidos nucleicos en relación con la posible presencia de
proteínas en la muestra (o de restos de fenol). Nos asegura que el material con el que vamos a trabajar es
adecuado, pues posee bajo o nulo contenido proteico.

Se mide mediante la relación de densidad óptica entre las lecturas 260nm

(correspondiente a a.n.) y a 280nm (correspondiente al máximo de absorción para
proteínas). Presenta unos valores máximos de 1.8 a 2.0.

Técnicas de análisis de a.n. Electroforesis.

La electroforesis es un método de análisis de ácidos nucleicos que nos permite visualizar los mismos
dependiendo de su tamaño. Está basado en la creación de un campo diferenciado por polos de distinta carga a
ambos lados del gel, el cual actúa como soporte.
Todas las moléculas de DNA están cargadas negativamente en sus grupos fosfatos, por lo que al conectar la
corriente eléctrica migran del polo negativo (donde se encuentran los pocillos) hacia el positivo, quedando los de
menor tamaño más alejados del origen ya que dispersan mejor entre el entramado del gel. Las movilidades
electroforéticas de los fragmentos de DNA son inversamente proporcionales al tamaño.
Los fragmentos de DNA se separan en función de los siguientes parametros:
- Tamaño de cada fragmento (discriminante)
- Conformación del DNA (circular o lineal, o con diferentes grados de superenrollamiento, migran de manera
distinta).
- Concentración del soporte: Tamaño de los poros del gel de agarosa y porcentaje del mismo (bandas más
pequeñas)
- Magnitud de la carga del a.n. e intensidad de la corriente (no discriminante)

Como soportes se utilizan geles de agarosa o poliacrilamida.

- Agarosa: polímero inerte utilizado para separar fragmentos de ADN (pues no interfiere con este) con diferentes
cargas y peso moléculas. Posee inferior resolución que el gen de poliacrilamida, aunque si los fragmentos de DNA
a separar contienen tamaños dispares, se obtendrán buenos resultados.
Esto también depende del tamaño y porcentaje de poros en el gel. En función de la concentración del polímero,
hay huecos por los que pasan las moléculas: la muestra dispersa por el entramado del gel.
- Poliacrilamida: utilizado para proteínas o ácidos nucleicos de gran tamaño. Puede tener toxicidad. La
secuenciación del DNA solo puede realizarse mediante estos geles, pues las moléculas a analizar difieren en muy
pocas bases en sus tamaños (muy parecidos).

Para visualizar el resultado de la electroforesis se utiliza un agente intercalante que se dispone entre las hebras
del DNA (es una agente mutagénico y cancerígeno) conocido como bromuro de etidio. De naturaleza planal, se
intercala entre las pares de bases apilados (forma estructuras helicoidales en el RNA).
Es una sustancia fluorescente cuando se expone a la luz ultravioleta, siendo esta característica la que nos
permite visualizar el DNA (aunque si la [a.n.] es mínima el bromuro de etidio no es eficaz).

Enzimas de restricción.

Son enzimas con actividad endonucleasa que cortan los enlaces fosfodiéster del DNA, a nivel de la doble cadena
y reconociendo en la misma secuencias específicas (secuencias señal de 3 a 10pb y palindrómicas). El hecho de
cortar la hélice en lugares concretos, hace que se generen fragmentos de restricción, con extremos cohesivos.

Esenciales en las técnicas de clonación: hay que

tener en cuenta el mecanismo de actuación de cada
enzima, pues pueden dar lugar a extremos planos o
lineales (al mismo nivel en la doble hélice) o no
lineales (región en forma de monohebra).
Aplicaciones: mapas de restricción, DNA recombinante, técnicas de clonaje, policonectores, polimorfismo en la
longitud de fragmentos de restricción para determinar mutaciones humanas…
TEMA 25. TÉCNICAS DE CARACTERIZACIÓN DE ÁCIDOS NUCLÉICOS.

Secuenciación de ácidos nucléicos. Método de Sanger.

También se denomina método enzimático, método de los

didesoxinucleótidos o método del terminador de la cadena.

La secuenciación siempre se realiza sobre una cadena de DNA.

En ocasiones en que el DNA tiene unas secuencias intrónicas muy

grandes, nos interesará conocer el RNA mensajero maduro libre de
estas secuencias no codificantes. En eucariotas, el mRNA tiene una
cola de PoliAs en su extremo 3’. A partir del mismo, y mediante la
catalización de la reacción por una transcriptasa reversa (DNA
polimerasa RNA dependiente), podemos obtener una molécula de
DNA libre de intrones, es decir, sólo con secuencias codificantes.
El cebador utilizado para que la transcriptasa reversa pueda llevar a cabo la síntesis de DNA es un
oligonucleótido forado a base de desoxitimidilatos (complementarios a la cola de PoliAs) teniendo así la
transcriptasa un extremo sobre el que apoyarse y empezar a sintetizar (dirección 5’-3’) leyendo el molde de
mRNA en dirección 3’ (desde la cola de PoliAs) a 5’ (donde estará la estructura CAP), obteniendo así el llamado
cDNA.

El método de Sanger puede aplicarse sobre dos tipos de DNA:

- cDNA obtenido por transcripción inversa (desde mRNA)
- DNA genómico

En el proceso se utiliza una DNA polimerasa que utiliza copias del DNA problema. Nosotros vamos a detectar el
resultado de la nueva cadena sintetizada, que será complementaria a la molécula de DNA problema que deberá
estar desnaturalizada para que sea posible copiarla.

En la reacción de utilizan didesoxinucleótidos como sustratos, que se diferencian de los desoxinucleótidos en que
carecen del grupo OH en el carbono 3’ de la ribosa.
La DNA polimerasa no discrimina entre ambos tipos de sustratos (didesox y desoxi), por lo qye cuando se
incorpore uno de los primeros, como es lógico, no se podrán forman más enlaces fosfodiéster y no se podrán
añadir más dNTP o ddNTP a la cadena, ya que sin el grupo OH en el carbono 3’ no se puede formar el enlace con
el fosfato en 5’ del siguiente nucleótido, terminándose por tanto la síntesis de la cadena.

Para secuenciar el DNA se establecen 4 reacciones paralelas que deben disponer de:
▪ Muestra de DNA problema desnaturalizada (DNA de cadena sencilla)
▪ DNA polimerasa + cebador complementario al extremo 3’ de la molécula problema, con el fin de proporcionar el
extremo 5’ a la DNA polimerasa, sobre el cual se apoyará para comenzar la síntesis.
▪ dNTPs (sustratos)
Esto se colocará en los cuatro tubos de reacción, y de forma independiente, en cada uno de ellos se añadirá un
sustrato diferente (didesoxinucleótido):
ddATP, ddCTP, ddTTP, ddGTP.
En la reacción que se encuentre el ddNTP
(ddATP), se colocará menos cantidad del
dNTP (dATP) con la misma base, de modo que
esté en concentraciones inferiores a los otros
dNTP (dTTP, dGTP, dCTP) para que finalmente
la concentración de los diferentes nucleótidos
sea equilibrada.
En cada uno de los tubos ontenemos una
mezcla de fragmentos comoplementarios al
DNA problema de diferentes tamaños, que
dependerá de cuando la DNA polimerasa haya
incorporado el ddNTP que no permite realizar
más enlaces fosfodiéster y continuar la
síntesis. Todos los fragmentos del mismo
tubo, por tanto, acabarán en el mismo ddNTP.

Para DNA recombinante se utiliza el fragmento Klenow o fragmento grande de la DNA pol I en E.Coli. La ventaja
de utilizar esta enzima es que tiene actividad correctora de pruebas aunque posee la desventaja de su baja
procesividad, lo que es un problema en caso de fragmentos de DNA muy grandes.
Por ello ha sido sustituída por una polimerasa de mayor procesividad que el fragmento Klenow o la DNApolI.
Estas enzimas obtenidas de bacteriófagos no poseen actividad correctora de pruebas. Entonces para constatar
que no hay errores en la secuencia, el experimento se debe realizar por triplicado.
A continuación procedemos a separar los fragmentos mediante un método electroforético. Se utilizan como
soporte geles de poliacrilamidas desnaturalizates, formados por un polímero de acril y bisacrilamida al que se
añade urea como agente desnaturalizante. La ventaja de este gel es que posee una velocidad de discriminación
muy superior al de agarosa, que en este caso es muy necesaria, pues necesitamos separar fragmentos que se
diferencian en un único nucleótido.
En el gel se realizan 4 carriles para separar cada una de las mezclas obtenidas en los cuatro tubos
independientes, sabiendo cual es el ddNTP del final de la nueva cadena sintetizada en los fragmentos de la
mezcla. La separación de los fragmentos, o la migracón de los mismos, va desde el polo negativo hacia el
positivo.

Es necesario el marcaje que se incorpora en la reacción para poder visualizar posteriormente el resultado de la
electroforesis en el gel: actualmente se marcan los ddNTP con cuatro fluorocromos diferentes. Así el color de
cada banda corresponde el del ddNTP 3’-terminal de ese fragemento. Esto nos permite realizar la separación de
la mezcla de las cuatro reacciones en un mismo capolar. En función del color /fluorocromo determinado por el
detector) sabremos de que ddNTP se trata, el que corresponde al final del fragmneto.

No solo se pueden detectar los cuatro colores al finalizar la separación sino que durante el transcurso de la
electroforesis, el detector puede medir la presencia de las bandas que van pasando por el haz láser y su color. Se
genera un registro informatizado de los 4 perfiles de color que combinados se interpretan como una secuencia.

Esta secuencia irá desde el fragmento de menor tamaño que difunde

con mayor facilidad por el entramado del gel, siendo por tanto el
primero que pasa por el láser y es detectado gracias al color que emite,
hasta el de mayor tamaño, que será el último en detectarse, puesto que
su difusión a través del soporte es más lenta. Por lo tanto, el fragmento
de menor tamaño es a partir del cual se empieza a deducir la
composición de la cadena, y es el correspondiente al extremo 5’ de la
cadena que ha sintetizado la DNApol.

Aplicación:
secuenciación de
moléculas de DNA para
detectar mutaciones
asociadas a patologías
humanas. Además de la
secuenciación hay otros
métodos.
Fundamento de las técnicas de hibridación.

Estas técnicas tratan de identificar (incluso cuantificar) la presencia de ácidos nucléicos en un determinado medio
biológico, mediante el establecimiento de puentes de hidrógeno entre moléculas con complementariedad,
previamente desnaturalizadas.
● Molécula problema: ácido nucleico sobre el que se quiere identificar una secuencia.
● Sonda: ácido nucléico de secuencia conocida: cuando encuentre en el medio biológico su secuencia
complementaria en la molécula problema, establecerá puentes de hidrógeno formando un híbrido (pueden ser
de la misma o distinta naturaleza DNA o RNA). La sonda, por tanto, es una molécula de a.n. de secuencia
conocida y casi siempre de naturaleza DNA.
Tanto la sonda como la molécula problema se encuentran desnaturalizadas.
La sonda debe ir marcada de cierta manera para que la molécula híbrido pueda ser localizada.

■ Factores que influyen en un proceso de hibridación.

▪ Tamaño y grado de complementariedad de la sonda. Cuanto mayor tamaño y grado de complementariedad

respecto a la molécula problema, más específico será el método.
▪ Fuerza iónica del medio: al aumentar la fuerza iónica también lo hace la estabilidad del híbrido, debido a la
neutralización de las cargas negativas de la molécula. Sin embargo, esto también genera mayor facilidad para
que se formen híbridos o uniones inespecíficas, pudiendo la sonda hibridar parcialmente a otras moléculas frente
a las que no tiene una afinidad tan alta.
▪ Una gran concentración de agentes desnaturalizantes provocará una menor estabilidad del híbrido.
Dependiendo del tamaño y el grado de complementariedad, debemos ajusta la F.I. y la [ag.desnaturalizantes]
favoreciendo las asociaciones específicas y, al mismo tiempo, impidiendo o evitando las hibridaciones
inespecíficas.

■ Métodos de marcaje de sondas.

Los métodos de marcaje pueden ser radiactivos, utilizando isótopos, o no radiactivos utilizando moléculas de
dicha naturaleza que se están imponiendo a los primeros.

• Marcaje en 5’ terminal (Polinucleótido Kinasa).

Mediante la acción de la enzima polinucleótido kinasa, la cual cataliza la transferencia del grupo fosfato en
posición γ del ATP hasta el extremo 5’ de una cadena de la molécula sonda, es posible marcar esta. Para ello
tendrá que ir marcado ese grupo fosfato que es transferido.
Para llevar a cabo esta reacción de marcaje no es preciso desnaturalizar la sonda, sin embargo, de forma previa
a la transferencia del grupo P, debe actuar la fosfatasa alcalina, que se encarga de la defosforilación del fosfato
en el carbono 5’ de la ribosa. Así, sobre extremos 5’ con grupo hidroxi (OH) ya se puede añadir el grupo fosfato
marcado, por acción de la PNK.
En este tipo de marcaje, el número de marcas incorporado es muy bajo así que solo se utiliza para
oligonucleótidos (el marcaje puede realizarse mediante el empleo de isótopos radiactivos).
• Marcaje por “random priming” (primado al azar).
Es necesaria la desnaturalización previa de la sonda, pues el método de marcaje se realiza con la intervención de
una DNA polimerasa que sintetiza copias de la cadena molde original. Se utiliza el fragmento Klenow o la
DNApolI de E.Coli, que posee actividad polimerasa (5’-3’) y actividad exonuclasa o correctora de pruebas (3’-5’).
En el medio de reacción se dispone de una mezcla de hexanucleósidos que contiene todas las secuencia posibles,
de modo que alguno ha de ser complementario al extremo 3’ del molde (no es necesario conocer la secuencia).
Se utiliza como cebador para llevar a cabo la síntesis de las nuevas cadenas, pues proporciona el extremo 5’ a la
DNApolI.
La enzima es capaz de sintetizar nuevas cadenas incorporando nucleóticos que han sido marcados, estos dNTP se
encuentran marcados en el grupo fosfato en , pues los otros dos serán eliminados al incorporarse a la
secuencia. Así, la mitad de las cadenas obtenidas estarán marcadas (marcaje de 50%).
• Marcaje por “nick translation” (traslado de la mella).
Empleado en casos muy específicos en los que se necesita una eficacia de marcaje del 100%.
Se parte de la sonda en doble cadena de DNA. Mediante una DNAasa con actividad exonucleolítica al azar, se
eliminan nucleótidos en posiciones internas de ambas cadenas, creando mellas. Posteriormente se utiliza el
fragmento Klenow que incorpora en dichas mellas los nucleótidos marcados, de este modo, el 100% de las
cadenas obtenidas poseerán marcaje.

Es posible sintetizar ribosondas, es decir, sondas con naturaleza RNA.

- Marcaje radiactivo: detección mediante rayos X

- Marcaje con digoxigenina: molécula de naturaleza esteroídica no radiactiva. La detección del híbrido se realiza
mediante una reacción antígeno-anticuerpo. La digoxigenina es detectada mediante el inmunocomplejo formado
por dicha molécula con un anticuerpo anti-digoxigenina, que a su vez está conjugado con una enzima. Si la
digoxigenina está presente, se forma el complejo, y la enzima es capaz de formar productos coloreados, que son
los que se detectan, a partir de sustratos incoloros.
Técnicas de hibridación.

El híbrido detectado y formado en una membrana de nitrocelulosa o

sobre un filtro; en definitiva, sobre un soporte sólido.

El híbrido se forma
en una solución
acuosa.

● Southern-blot. (DNA)
Método de hibridación en filtro dirigifo a la identificación de
moléculas de DNA, en soporte sólido, que permite llevar a
cabo una cuantificación relativa. Es la base de desarrollos de
procedimientos utilizados en muchos laboratorios moleculares.
1º. Habitualmente se aplica a DNA genómico. Estas moléculas poseen un tamaño elevado, por lo que se deben
fragmentar llevando a cabo una digestión con endonucleasas de restricción (enzimas específicas). Si partimos de
cDNA no es necesaria dicha digestión.
2º. Una vez que se dispone de los fragmentos, se separan en geles de agarosa por electroforesis.
3º. Desnaturalización de los fragmentos separados en el propio gel, sometiéndolos a la presencia de una solución
alcalina. Se realiza entonces la transferencia de los fragmentos desnaturalizados a un soporte sólido, membranas
de nylon o nitrocelulosa.
4º. Dicha transferencia se realiza por capilaridad, empleando una solución de fuerza iónica adecuada, se ponen
en contacto el gel y la membrana permitiendo la transferencia.
5º. Fijación entre los componentes de la membrana y los fragmentos de DNA, empleando calor o luz UV.
Posteriormente se realiza la hibridación utilizando una sonda previamente marcada, situándola en una solución
con fuerza iónica y concentración de ag. Desnaturalizantes apropiados, dando lugar a la formación del híbrido
específico sobre el soporte sólido.
Es un método que presenta utilidad en la detección de secuencias específicas contenidas en una determinada
molécula de DNA.
● RFLP: polimorfismo en la longitud de los
fragmentos de restricción
Técnica dirigida a la detección de mutaciones
responsables de enfermedades humanas.
El fundamento se basa en la creación o eliminación
de sitios de restricción para determinadas
endonucleasas específicas, por efecto de mutaciones
en el DNA.
Previamente, tenemos que conocer cuál es la
mutación que estamos buscando que debe coincidir
con el sitio de restricción de alguna endonucleasa.
A partir del DNA de un individuo no afectado, se
realiza una digestión del mismo con enzimas de
restricción consiguiendo fragmentos que se separan
por electroforesis, obteniendo así un patrón.
El mismo DNA de un individuo en el que se sospecha
que existe la mutación, que hace que pierda o
aparezca un sitio de restricción, es tratado con las mismas enzimas
que el anterior (la pérdida de la diana de restricción para la enzima
debe ser muy específica): así se obtiene un patrón diferente (en el
caso de la pérdida con un único fragmento), que puede ser
separado del gel e identificarlo. Esta diferencia en los fragmentos se
aprecia mediante un cambio en el patrón de restricción respecto al
normal.
Ej: gen que codifica para la βglobina: mutación que provoca un
cambio en las propiedades de la proteína dando lugar a una
anomalía conocida como anemia falciforme. El diagnóstico de esta
enfermedad se realiza por RFLP.
La mutacion provoca una pérdida de uno de los sitios de restricción de una enzima específica con 3 dianas en el
gen, que suelen dar lugar a dos fragmentos (1,15kb y pequeño) pero cuando se ha modificado la secuencia da
lugar a un único fragmento de 1,35kb.
● Northern-blot. (RNA)
Se trata de un método de identificación de
moléculas de RNA mediante un proceso de
hibridación. Además se puede realizar una
cuantificación relativa de los niveles de mRNA
específicos. Se trata por tanto de una técnica
equivalente al Southern-blot pero referida a RNA.
Diferencias en el proceso respecto a Southern-blot:
- No se utilizan endonucleasas de restricción (ya
que estas son específicas del DNA).
- No es necesaria la fragmentación.
En la puesta a punto de la técnica es necesario
tener en cuenta la facilidad de degradación de los
RNAs, así como su tendencia a formar estructuras
secundarias.
1º Aislamiento del RNA.
2º. Separación electroforética en geles
desnaturalizantes: Gel de agarosa con agentes
desnaturalizantes incorporados (formamida), de
este modo se impide la formación de estructuras
secundarias. No se pueden aplicar álcalis ya que se
degradaría el RNA.
3º Antes de hacer la transferencia comprobar la
integridad de las moléculas de RNA. Esto se hace
mediante bromuro de etidio, que permite la
visualización de los RNA más abundantes (rRNA, los
de mayor tamaño 28S se ven con el doble de
intensidad que los 18S). Si estuvieran en
degradación no habría bandas nítidas. Dicho agente
no posee tal especificidad para detectar los mRNA.
Por tanto, la integridad de los RNA se realiza a partir
de los rRNAs.

● Dot/Slot-blot. (DNA/RNA)
Es un procedimiento útil para el análisis de DNA y RNA.
Consiste en la fijación de las moléculas objeto de estudio a
membranas de nylon o de nitrocelulosa para, posteriormente,
realizar la identificación de secuencias específicas.
Se diferencia en que No se lleva a cabo una separación
electroforética previa, por lo que esta metodología tiene menos
especificidad que el Southern-blot o el Northern-blot, se
deposita en el sólido directamente la mezcla de a.n. La
posibilidad de obtener hibridación inespecífica es mayor.
Se emplea
fundamentalmente para
realizar un “screening” de un
número elevado de muestras
al mismo tiempo, aunque
posteriormente habrá que
verificar el resultado.
Permite la identificación de
una determinada secuencia
en distintas líneas celulares.

● Run-on. (RNA)
Es una técnica útil para la caracterización de moléculas de RNA.
Los resultados del run-on informan acerca del nivel de síntesis de un determinado mRNA.
Se trata, por tanto, de un ensayo que mide la tasa de transcripción de un gen, a diferencia del Northern-blot que
proporciona información sobre el nivel de un determinado mRNA en un momento dado.

● Chips de DNA
Nos permite investigar de manera simultánea un nº elevado de genes (más de 10.000 o 20.000 secuencias
distintas). Se analizan sobre micromatrices.
- Aplicación a estudios de expresión: conocer que moléc. se expresan en un medio biológico y cuales se expresan
de forma diferencial en otros.
- Secuenciación.
- Polimorfismo genético: variante puntual (2pb) en la secuencia de un
determinado gen que afecta a >1% de la población. Pueden dar lugar a
variantes en la actividad del producto codificado para ese gen.
- Investigación de metilaciones que afectan a promotores, asociados a
silenciamiento del gen.

Se realiza mediante un soporte sólido, vidrio o membrana donde se fijan

secuencias oligonucleotídicas que representan un número muy elevado de
genes que se pueden estudiar de manera simultánea.
Es necesario partir de cDNA, es decir, mediante el mRNA maduro se realiza
una reacción de transcripción reversa donde se incorporan nucleótidos
marcados con fluorocromos.
Estos se incorporan a una matriz donde se encuentran depositadas las
secuencias complementarias (sondas). Varios oligonucleótidos que
representen a cada uno de los genes que estamos estudiando.
Posteriormente se hibridan los fragmentos complementarios y se procede a
la visualización de los híbridos gracias a los fluorocromos.

● Hibridación “in situ” (DNA/RNA)

Persiguen identificar un ácido nucleico en el interior celular. Se utilizan cortes de tejidos sometidos a
tratamientos de desproteinizacion y permeabilización de membrana, de modo que la sonda pueda acceder a las
células, formándose el híbrido en el interior de las mismas.

● PCR. Reacción en Cadena de la Polimerasa.

Desarrollada por Kary Mullis en la década de 1960, supone uno de los mayores avances en investigación
molecular. También se conoce como clonaje acelular.
Consiste en la síntesis enzimática in vitro de un elevado número de copias de una determinada secuencia de
DNA. En un principio, se trata de un método preparativo, así se incrementa la cantidad de material necesario
para la experimentación. Sustituye en gran medida a los procedimientos de clonaje celular.

Interviene una DNApol que sintetiza las copias de la molécula inicia utilizando cebadores que hibridan los
extremos de la secuencia de interés que se pretende amplificar. Los oligonucleótidos flanquean la región objeto
de amplificación.

Si partimos de DNA genómico es necesaria una atapa previa de desnaturalización.

1º Desnaturalización: etapa en la que se debe disponer de los
moldes en forma de cadena sencilla. Se realiza a unos 90ºC y
es una etapa rápida (1 min). El tratamiento con alta
temperatura o con álcalis permite la desnaturalización del
DNA.
2º Hibridación: etapa en la que los cebadores deben unirse a
los extremos de la secuencia de interés, pues son
complementarios a estos. Para ello es necesario conocer la
secuencia que se desea amplificar de forma previa, con el
objetivo de poder diseñar los cebadores (a priori, aunque en
técnicas derivadas se puede solventar este problema). Esto es
un paso esencial para que la DNApol pueda llevar a cabo la
elongación.
La temperatura empleada en esta fase depende de la
secuencia exacta de los cebadores empleados, aunque se
aproxima a los 55ºC. Depende del tamaño del oligonucleótido
y de la secuencia exacta de los mismos (unos 20 nucleótidos).
3º Síntesis o elongación: Se utiliza una DNApol cuya
temperatura óptima de activación son 72ºC. El tiempo

empleado en esta fase varía según el tamaño

de la región o secuencia a amplificar (1-
3min). La enzima debe disponer de: molde,
cebadores, sustratos e iones divalentes
(tampones suplementados con diferentes [Mg 2+] para favorecer la reacción).

En cada ciclo de reacción se produce un incremento exponencial del número de copias. La PCR suele constar de
unos 35-40 ciclos, trabajando en condiciones de saturación.
Los cambios de temperatura deben llevarse a cabo de forma brusca y rápida, ya que si son lentos el riesgo de
que los cebadores llevan a cabo hibridaciones específicas es muy alto. Para ello se utilizan equipos especiales
denominados termocicladores, con sistemas de calefacción y enfriamento.

Además, la DNApolimerasa debe ser termoestable, que aguante las altas temperaturas de la primera fase de
desnaturalización. Al principio del desarrollo de la PCR se utilizaba una enzima en cada ciclo de reaccion,
posteriormente se descubre la Taq DNApol (procedente de Termofillus aquaticus), que carece de actividad
exonucleasa 3’-5’ o actividad correctora de pruebas.
La desventaja es que si esta enzima comete un error, sobre todo durante los primeros ciclos de reacción, este se
arrastra durante los sucesivos ciclos. Esto genera problemas para conocer secuencias completas de DNA y da
lugar a resultados erróneos en la secuenciación por método de Sanger, por lo que es necesario confirmar el
resultado por triplicado.
Más adelante se comienzan a utilizar otras enzimas con tasa de error más reducida VentDNApol (Termococus
litoralis).

La etapa final se prolonga para que la enzima pueda terminar la elongación completa. La finalización de la PCR se
realiza a 4ºC.

La cantidad de material amplificado viene

determinada por la cantidad de material inicial
o de partida. Sin embargo, normalmente no
podemos cuantificarlo, ya que trabajamos a
saturación lo que provoca que alguno de los
reactivos se agote antes que los demás.
El único momento en el que se puede
cuantificar la cantidad de DNA amplificado es
en la fase de amplificación exponencial. Al
llegar a los 40 ciclo ya no se puede cuantificar,
pues el agotamiento de alguno de los reactivos
hace que se obtenga la misma cantidad de
material independientemente de la cantidad de
material de partida.

La DNA polimerasa no sabe donde debe finalizar de sintetizar (un extremo delimitado por cebador, el otro no).
En ocasiones se obtienen cadenas de DNA más largas de lo requerido en los primeros ciclos de reacción. Se van
reduciendo según avanza el número de ciclos.

● RT-PCR. Reacción en Cadena de la Polimerasa acoplada a la transcripción reversa.

Se utiliza para llevar a cabo estudios de expresión.
Permite amplificar por PCR secuencias de cDNA que han sido obtenidas a partir de mRNA. No se puede usar este
ácido ribonucleico puesto que se degrada fácilmente, por lo que gracias a la transcriptasa reversa obtenemos
cDNA libre de secuencias intrónicas.
Muchas enfermedades pueden identificarse de esta forma a partir de los leucocitos infectados. Leucocitos –
mRNA – cDNA – PCR – posterior identificación en un gel de agarosa por electroforesis. Un ejemplo es la leucemia
mieloide crónica, donde ocurre una translocacion cromosómica que da lugar a un gen de fusión.

● PCR cuantitativa a tiempo real.

Si el objetivo es cuantificar el DNA hay que
trabajar a un ciclo que corresponda a la fase
exponencial.
Para ellos se utilizan termocicladores más
sofisticados capaces de detectar la fase de
amplificación exponencial y de darnos los
resultados en un momento de la reacción en el
cual podamos llevar a cabo una cuantificación.
Si ↑↑[DNA]= amp. exp. En un ciclo más bajo.
Si ↓↓[DNA]= amp. exp. En un ciclo más elevado.
Utilización de sondas fluorescentes o ag.
intercalantes para su reconocimiento.

● PCR-RFLP.
Mejora el análisis. En la RFLP la mutación buscada debía coincidir con el sitio de restricción, pero acoplado a PCR
se pueden crear o eliminar sitios de restricción de endonucleasas específicas, diseñando cebadores adecuados
que introduzcan una pequeña variación. El cebador no es complementario por un nucleótido, lo que varía toda la
amplificación y produce una modificación del sitio de restricción. La aplicación de esta metodología ha permitido
el establecimiento de protocolos en los que, de forma sencilla, es posible detectar mutaciones puntuales en
genes relacionados con la aparición de diversas patologías moleculares.
TEMA 26. TECNOLOGÍA DEL DNA RECOMBINANTE: CLONACIÓN DEL DNA.

El término clonar se refiere a la obtención de múltiples copias de DNA “in vivo”, es decir, en una célula
aprovechando su maquinaria enzimática que facilita la replicación. La utilidad primaria sería la obtención de
múltiples copias de un fragmento de DNA en un sistema celular.

Las técnicas de clonaje nos permiten:

- Estudiar la estructura de genes
- Estudiar la funcionalidad de los productos codificados por estos genes
- Análisis y estudios de expresión génica
- Obtener productos concretos útiles en terapéutica
- Generar modelos animales que nos permiten estudiar mecanismos generales de enfermedades.
- Empleo del DNA como molécula medicamentosa: terapia génica.

Dependiendo cual sea nuestro objetico el sistema de clonaje variará, pudiendo emplear tanto células procariotas
(las cuales presentan ciertas limitaciones) o células eucariotas.
•No podemos obtener proteínas propias de eucariotas en células procariotas: Las limitaciones del empleo de
células procariotas residen en no poder realizar estudios de expresión ya que no poseen maquinaria
postranscripcional así que habría que saltarse dicha fase (partiendo de cDNA) y tampoco se puede obtener una
proteína funcional, ya que no tienen maquinaria postranscripcional, así que solo se puede obtener la proteína
nativa. Sin embargo son útiles para clonar u gen con el objetivo de estudiar su estructura.
• Dentro de las células eucariotas se pueden obtener dichas finalidades concretas, y podemos utilizar células
somáticas o germinales, siendo estas segundas las más eficaces. Podemos conseguir incorporar a una dotación
genética extra que se incorpore a todas las células del organismo. De este modo se pueden conseguir animales
transgénicos (Knock-in) o manipulados genéticamente a los que se incorpora un gen para poder estudiar los
mecanismos moleculares de enfermedades humanas. También se puede eliminar o delecionar una secuencia
propia del organismo, y que se extienda a todas las células del organismo (obteniendo animales knock-out).

Etapas y requerimiento
del clonaje.

~ Disposición del DNA

problema que se quiere
clonar: podemos partir de
DNA genómico o cDNA.
~ Vector que nos ayude a
introducir el material
genético en el sistema
elegido. Los vectores son
moléculas de DNA con
capacidad de
autoreplicación, a la cual
unimos nuestro DNA
problema. En el interior de la
célula este aprovecha la
maquinaria replicativa
enzimática de la misma,
pudiendo así duplicarse.
~ Unión del DNA al vector:
inserto (mediante enzimas
de restricción y ligasa)
~ Molécula de DNA
recombinante que se
introduzca en la célula
anfitriona mediante métodos
diversos.
~ Medio adecuado para su
proliferación y desarrollo.
~ Etapa de selección para
reconocer los clones o
poblaciones celulares que
han incorporado el DNA
recombinante.
▪ DNA de partida.
- DNA genómico: digestión con
endonucleasas de restricción para
quedarnos con el fragmento de interés,
que debe ser aislado de la muestra.
- cDNA: mediante la transcriptasa
reversa dependiente de RNA obtenemos
un DNA sin secuencias intrónicas que se
puede amplificar para obtener mayor
número de copias de cDNA. Estos no
son necesarios tratarlos con enzimas de
restricción, pues son fragmentos más
pequeños.

▪ Vector.
- En función del tamaño de la molécula
problema elegimos el vector, que
variará en su complejidad.
· Los plásmidos son moléculas sencillas
muy fáciles de manipular, peso sólo
admiten insertos de un máximo de 10kb
(moléculas de DNA oequeñas). Son DNA
extracromosómicos bacterianos con
capacidad autoreplicativa obtenidos de
bacterias.
· Bacteriófagos: infectan la célula
bacteriana, de ahí su nombre.
· Virus: infectan células eucariotas.
· Cósmidos: vector con características de plásmido y bacteriófagos, obtenidos mediante manipulación y llamadas
quimeras.
· Cromosomas atificiales de fagos (PACs), de bacterias (BACs) o de levaduras (YACs) que admiten insertos de
hasta 1 megabase.
Existen dos tipos de vectores según la finalidad:
- vectores de clonación: obtención de copias de DNA in vivo.
- vectores de expresión: se diferencian en que siempre contienen un promotor potente, es decir, una secuencia
promotora en cuya proximidad se realiza la inserción del DNA problema para el estudio de expresión. Ese
promotor debe ser una secuencia manipulable, para controlar la expresión del gen. Normalmente se utiliza cDNA
para este tipo de estudios.

▪ Unión del DNA al vector.

Una vez elegimos el vector lo unimos al DNA para obtener una molécula de DNA recombinante. Muchos de estos
vectores poseen estructura circular, por lo que hay que linealizarlo mediante enconucleasas de restricción. Para
ellos debemos conocer el mapa de restricción del vector, para poder elegir las endonucleasa con dianas en el
DNA del vector.
Se escoge una enzima con una única diana de restricción (un solo punto de corte) y que además no coincida
con los elementos importantes del vector (como el origen de replicación ya que se destruiría la secuencia origen
perdiendo su capacidad autoreplicativa, así como los genes de resistencia a antibióticos utilizados para la fase de
selección).
Si el vector tiene los sitios de restricción adecuados para unirse al inserto, se usa directamente. Si no tiene los
sitios de restricción adecuados complementarios o que coincidan con los del DNA problema, se introduce en la
secuencia de los vectores un policonector (método indirecto) o sitio de clonaje múltiple: esto es una secuencia
de DNA que contiene dianas para diferentes enzimas de restricción, que es introducida en la proximidad de un
gen marcador que permita llevar a cabo la selección de los clones positivos.
Es necesario que el DNA posea extremos coincidentes o
cohesivos, compatibles con los generados en el vector. El DNA
posee extremos planos, por lo que se adicionan unos
adaptadores o linkers, secuencias oligonucleotídicas que
ayudan a obtener extremos compatibles. Se usan
endonucleasas de restricción que den lugar a extremos planos
o a extremos protuberantes pero estos deben ser cohesivos.
Reacción de ligación que tendrá la consecuencia de obtener el
DNA recombinante (utilizando una DNa-ligasa), es decir, la
asociación buscada entre el inserto y el vector.
Las dificultades de esta etapa son, entre otras, que el vector
puede volverse a cerrar (recirculación del vector), producirse
asociaciones de distinta naturaleza, asociaciones de los
insertos.
 ▪ Métodos de introducción de DNA
recombinante en sistemas
celulares.
El producto de la ligación, DNA
recombinante, debe introducirse en el
sistema que posea una maquinaria de
replicación adecuada. Cuando se
replica la célula también lo hace el DNA
recombinante, obteniendo clones.
- Transfromación: transferencia del
DNA recombinante a células
procariotas.
- Transfección: transferencia del DNA
recombinante a células eucariotas.

De menos a mayor eficiencia, los

métodos para introducir DNA
recombinante son:
- Tratamiento con soluciones de fosfato
cálcico, que es barato y de baja eficacia
y se utiliza en procariotas.
- Tratamiento con Dextrano-DEAE con
polímeros policatiónicos que facilitan la
formación de agregados y la
precipitación del DNA.

Los métodos de mayor eficiencia son

los siguientes:
· Lipofección: hacer llegar el DNA recombinante mediante liposomas, vesículas de naturaleza lipídica en cuyo
interior incorporamos el DNA recombinante. Se fusionan con la membrana de las células anfitrionas haciendo
llegar el DNA recombinante a la células.
· Electroporación: descargas o pulsos eléctricos que forman poros en las membranas celulares por los que se
introduce el DNA recombinante.
· Uso de virus que infectan a células eucariotas, como adenovirus o retrovirus manipulados para eliminar su
capacidad patogénica, siendo de donde viene realmente el nombre transfección.
· Microinyección: es el único método eficaz al 100%, y se basa en la inyección directa del DNA recombinante
en cada una de las células anfitrionas. Requiere el tratamiento de cada célula de forma individual, por lo que es
necesario realizarlo con ayuda de un microscopio electrónico.

~Transfección estable: se integra el DNA genómico incorporándolo en el propio genoma. Para ello son adecuados
los retrovirus, basándonos en su capacidad para infectar a células eucariotas.
~Transfección transitoria: el DNA recombinante no se inserta en el genoma, sino que permanece libre como un
DNA extracromosómico que se va perdiendo en las sucesivas divisiones.

▪ Propagación.
Las células proliferan en un medio adecuado para que se dupliquen, habiendo replicado previamente su genoma.

▪ Detección y selección.
Para diferenciar las poblaciones que han incorporado el DNA recombinante, de las que no lo han hecho o
simplemente han incorporado el vector se utilizan:
- Genes marcadores que suelen encontrarse en el vector (no garantiza que se haya introducido en DNA
recombinante). Estos poseen resistencia a antibióticos, por lo que podemos hacer medios selectivos donde
resistan las células que hayan incorporado el vector.
- Procedimientos de hibridación: Sonda
marcada que reconoce nuestro DNA
recombinante, molécula que estamos
clonando. Para detectar los clones positivos
se pone una membrana de nylon o
nitrocelulosa donde por capilaridad se fijan
dichas moléculas. Esta membrana se lleva
a hibridación para poder seleccionar los
clones positivos.
- Aprovechando la presencia de genes que
cuando se expresan dan lugar a un
producto coloreado, en el vector. (Como los
genes del operón lactosa).
 - Procedimientos inmunoquímicos:
métodos ag-ac que nos permiten
detectar el producto formado.
- En el vector se incorpora un
policonector (con puntos de corte para
diferentes endonucleasas) cerca de la
secuencia del operon lactosa, de modo
que cuando se introduce el DNA
recombinante los genes del operón lac
quedan interrumpidos, lo que nos sirve
para llevar a cabo la selección.

Las estrategias de clonación son útiles

para diferentes fines.

• Obtención de genotecas, librerías o

bancos de DNA.
Conjunto de poblaciones celulares que
contienen la dotación genética completa
de un organismo (genoteca genómica) o
las moléculas que se expresan en in
tejido concreto (genoteca de cDNA). Las
primeras son útiles para el estudio de
estructuras de genes, y se consiguen
mediante el aislamiento del DNA
genómico o cromosómico (que nunca se
puede clonar como una única molécula),
por lo que se utilizan endonucleasas que dan lugar a fragmentos útiles para sintetizar un DNA recombinante y
cada uno de ellos hacerlo llegar a un sistema celular que forma una población celular a partir de las cuales se
obtiene la dotación genómica completa del organismo.
Las genotecas de cDNA son útiles para el estudio de la funcionalidad de los productos que codifican ciertos genes
y para llevar a cabo estudios de expresión. Para ello se deben aislar las secuencias que se están expresando en
un tejido u organismo (mRNA) y convertirlas en cDNA, que será insertado en un vector para obtener una
molécula de DNA recombinante que se introduce en la célula anfitriona, que tras proliferar da lugar a un conjunto
de poblaciones celulares cada una de las cuales posee un cDNA que codifica para los genes que se expresan en
ese tejido.

APLICACIONES DE LOS PROCEDIMIENTOS DE CLONACIÓN.

Antecedentes:
1869 Meisner: Aislamiento del ADN.
1944 Avery: El ADN es el portador de la información genética.
1953 Watson y Crick: Estructura helicoidal del ADN.
1957 Kornber: Polimerasa del ADN.
1962 Arber: Enzimas de restricción.
1966 Nirenberg, Ochoa, Khorana: Código genético.
1972 Boyer,Cohen, Berg: TÉCNICAS DE CLONACIÓN DEL ADN.
1975 Songer, Barrell y Maxam, Gilbert: Métodos de secuenciación.
1981 Palminter y Brinster: Ratones transgénicos.
1990 Blaese, Anderson, Culver: TERAPIA GÉNICA HUMANA.
2003 Watson… SECUENCIACIÓN DEL GENOMA HUMANO

Animales transgénicos.

Son aquellos organismos a los que, mediante manipulación genética, se ha aportado una dotación genética extra
a todas las células del animal, obteniendo un animal transgénico que expresa dicho gen.
También son animales transgénicos, más conocidos como knock-out, aquellos a los que se les ha eliminado una
dotación genética de su propio genoma, en todas las células de ese animal.

Esto es útil para el estudio de mecanismos moleculares de enfermedades humanas así como para obtener
productos codificados por dichos genes.

● Transgénesis clásica.
Se trata de hacer llegar a una célula germinal una molécula de DNA que queremos que forme parte del genoma
de un organismo, de modo que conferirá a la descendencia un nuevo carácter hereditario. Esto se realiza
introduciendo el transgen (fragmento de DNA que contiene el gen de interés) en el núcleo de un óvulo fecundado
que continuará su desarrollo posteriormente.

Las aplicaciones de los procedimientos de clonación en patologías humanas son las siguientes:
- Identificación de la etiología genética
- Diagnóstico de enfermedades
- Obtención de productos terapéuticos a partir de animales transgénicos
- Clonación terapéutica
- Terapia génica: donde nos encontramos la mayor limitación, pues el tratamiento con DNA medicamentoso falla
al no encontrar el vector adecuado que inserte el DNA recombinante en todas las células necesarias.

● Etapas de la transgénesis clásica.

1. Preparación del fragmento de DNA que se desea
introducir
2. Obtención de óvulos fecundados de madres donadoras.
3. Microinyección del ADN en uno de los núcleos del huevo
fecundado, de este modo conseguimos que el transgen se
inserte en el genoma.
4. Reimplantación de los huevos transformados viables en
madres pseudopreñadas receptoras.
5. Análisis de la descendencia para identificar los individuos
que portan el transgen.
6. Cruce de individuos para establecer líneas transgénicas.

Para identificar los animales que poseen el transgen, proceso

también llamado genotipaje, con posterior intención de
cruzarles, se utilizan dos métodos:
- PCR: conociendo una parte de la secuencia del transgen se
crean dos oligonucleótidos específicos de la región concreta de
dicho transgen que se desea amplificar. Se utilizan
oligonucleótidos propios del transgen para amplificarlo
específicamente. Tras llevar a cabo el proceso, mediante un
marcador como bromuro de etidio se trata de identificar la
secuencia del transgen en un gel de agarosa.
- Southern blot: la utilización de una sonda que podemos
marcar y que sea complementaria a la zona de nuestro gen
insertado, es otro modo de localizar que la secuencia ha sido
integrada en el genoma. Para ello el DNA genómico se aísla y
se digiere, separándose en un gel de agarosa para la posterior
transferencia a la membrana donde se llevará a cabo la
hibridación con la sonda que reconoce específicamente el
transgen y se hibrida con ella.

Ejemplo: estudio de la expresión ubicua de la hormona del

crecimiento.
El tratamiento de los óvulos fecundados requiere el uso del cdna
correspondiente a la proteína de estudio con el promotor de un gen
que se exprese de manera ubicua. Todas las secuencias reguladas
por ese gen, se expresarán entonces en todas las células (de forma
ubicua).

Esto aplicado en un
tejido concreto se
aplica para la
obtención de
productos útiles en
terapéutica. En este
caso el cDNA estará
unido a una secuencia promotora de una proteína que solo se
expresa en el tejido que estamos tratando de ese animal. Por
ejemplo, la utilización del promotor de proteínas de glándula
mamaria se usa de modo que en la proteína sintetizada se incluya
el producto que queremos obtener.
cDNA que codifica para la proteína de interés + promotor de una
proteína de glándula mamaria: secreción de la proteína de interés
en un fluido, de modo que se obtienen cantidades apreciables de
la molécula buscada.
Granjas genéticas.
Producción de proteínas humanas de interés terapéutico.
Esto es un gran avance, pues se pueden introducir
modificaciones en la molécula sin afectar a la proteína, de
modo que sea más eficaz. Antes se realizaba a partir de
sangre humana, lo que era un riesgo por posible
contaminación con agentes infecciosos además de
conseguir una menor cantidad de material.

● Ventajas de la utilización de animales

transgénicos para producción de proteínas.
- Coste de producción poco elevado
- Extracción y purificación rápida
- Se elimina el riesgo de contaminación por agentes infecciosos humanos (SIDA, Hepatitis C,…)
- Se pueden producir proteínas cuya estructura implica un procesamiento complejo por modificaciones
postraduccionales: glicosilaciones,…
- Se podría modificar la vida media de las proteínas terapéuticas mediante pequeñas modificaciones que no
afectasen su actividad, pero que retrasasen su eliminación.

• Knock-out: Eliminación de uno o más genes de la dotación genética, a nivel de las células germinales de modo
que afecte a todas las células del organismo cuando éste se desarrolla. En un gen endógeno se inserta un DNA
exógeno que contiene el mismo gen al endógeno (homologo) pero
modificado. El gen endógeno queda entonces inactivado y es sustituido
por el exógeno, este no se expresa o si lo hace origina una proteína no
funcional, debido a la eliminación en el gen endógeno de una o más
secuencias exónicas importantes. La eliminación completa del gen da
lugar a animales knock-out. También se pueden utilizar técnicas de
recombinación homóloga que dan lugar a animales knock-in.
• Animales Knock-in: Aquellos a los que se les ha sustituido uno o más
genes por otro homólogos mutados. En un gen endógeno se inserta un
DNA exógeno que contiene el mismo gen al endógeno (homologo) pero
modificado. El gen endógeno queda entonces inactivado y es sustituido por el exógeno, que cuando se expresa
da lugar a una proteína con modificaciones puntuales. Útil para el estudio de procesos moleculares relacionados
con patologías humanas.

Clonación de animales.
Obtención de organismos genéticamente idénticos.

La clonación de Dolly fue la primera clonación exitosa

donde se utilizaron células de una oveja adulta blanca
donadora de células de la gándula mamaria de las que se
obtuvo el núcleo o material genético, que se introdujeron
en el óvulo de una oveja negra gestante a la que se le
había eliminado por aspiración dicho núcleo.
Cuando se va a realizar la obtención del núcleo, dichas células deben encontrarse en fase Go con dotación 2n, ya
que si no se producirían aberraciones cromosómicas, por lo que se cultivan en ausencia de suero. Las células
obtenidas se implantaron en la oveja carinegra, que cuando dio a luz,
se obtuvo una oveja blanca (pues la dotación genética era de la oveja
blanca).
Dolly que nació el 5 de julio de 1996 era fértil, por lo que el
experimento había salido adecuadamente.

Pero cuando aún era una oveja joven, Dolly comenzó a desarrollar
enfermedades relacionadas con el envejecimiento prematuro. Esto era
debido a que las células donadoras del núcleo procedían de una oveja
que ya tenía seis años, por lo que el DNA de dichas células poseía los
telómeros acortados.

Terapia génica.

Estrategia terapéutica basada en la modificación del repertorio genético de células somáticas mediante la
administración de ácidos nucleicos y destinada a curar enfermedades: paliar el déficit de una proteína o modular
la expresión o activación de una proteína.
Se trata de aprovechar el DNA como molécula medicamentosa: uso de genes intactos para sustituir genes
alterados responsables de enfermedades.
 Los ensayos de la terapia génica están dirigidos a curar
enfermedades genéticas clásicas, tanto monogénicas (aunque
el tratamiento es poco estable) y multigénicas. Así como para
curar enfermedades adquiridas, principalmente a paliar el
cáncer. Aunque hay varias estrategias diseñadas, ninguna ha
tenido un gran éxito.

Para ello se utilizan dos tipos de

estrategias terapéuticas:
- Transferencia génica ex vivo: sacando
del organismo las células que necesitan
ser tratadas, modificarlas y volverlas a
introducir a su lugar de origen.
- Transferencia génica in vivo:
empleando vectores que hagan llegar el
DNA a las células que queremos tratar.
El fin es que, utilizando cualquiera de
estas estrategias, todas las células
alteradas sean correctamente tratadas.
La transferencia génica in vivo exige la necesidad de vectores específicos de un tipo celular y de una eficiencia
del 100%. Se utilizan retrovirus: capaces de asegurar transferencias estables, es decir, la integración del
fragmento de DNA en el genoma de la célula. La desventaja de este tipo de vectores, es que dicha integración es
aleatoria, puede que la molécula de DNA interrumpa la secuencia de un gen que codifique para u producto
importante. El problema de los adenovirus, otro tipo de vectores, es que funcionan de manera transitoria. En
cualquier vector vírico, todas las secuencias necesarias para su replicación y/o patogeneidad son eliminadas y
sustituidas por las secuencias de ADN que se quieren introducir.

Las enfermedades hereditarias monogénicas son las más tratadas y con

mayor éxito en la terapia génica. La primera que se trató y en la que se
obtuvo éxito fue la inmunideficiencia combinada severa (ADA),
mediante el tratamiento ex vivo de células sanguíneas. Posteriormente
se empezaron a tratar las células progenitoras de la médula ósea,
teniendo mayor éxito. (Hipercolesterolemia familiar, fibrosis quística…).

● Terapia génica contra el cáncer.

El tratamiento no pasa por la utilización de una única molécula de DNA. Cuando un tumor se detecta al menos
hay 6 mutaciones que afectan a genes diferentes. En la mayoría de los cánceres el “guardian del genoma” p53 se
encuentra alterado. Se han llevado ensayos clínicos utilizando copias intactas de los genes que codifican para
p53 que puede mediar la apoptosis. Otra estrategia es el uso de genes asesinos suicidas, que se introducen en el
organismo y matan a las células, aunque su desventaja reside en la dificultad de dirigir esta terapia a un gen
concreto.
El término cáncer define un conjunto de enfermedades que agrupa genéricamente a más de 100 tipos de
manifestaciones patológicas. Resulta de la acumulación de varias alteraciones genéticas que se suceden a lo
largo de los años
Las alteraciones genéticas inicialmente afectan la función de proteínas codificadas por proto-oncogenes, genes
supresores, genes reparadores y genes implicados en apoptosis. Alteraciones subsiguientes inducen la capacidad
de las células tumorales de invadir los tejidos adyacentes y de migrar a localizaciones lejanas del tumor primario,
donde anidan y forman tumores secundarios
A nivel celular y tisular, se caracteriza por la aceleración de la mutagénesis y la proliferación celular.
Intervienen varias decenas de genes (proto-oncogenes, genes supresores, genes reparadores, genes reguladores
de la angiogénesis, la motilidad, la adherencia celular, la apoptosis, metaloproteasas, etc.)

• Estrategias de terapia génica para el cáncer

- Impedir la expresión de los oncogenes responsables del
proceso tumoral
- Aumentar la expresión de los genes supresores
(p53)
- Aumentar la inmunogenicidad tumoral
- Destruir las células tumorales introduciéndoles genes
“asesino-suicidas”
- Impedir el desarrollo de los vasos sanguíneos que
permiten el crecimiento tumoral
- Terapias combinadas

Las limitaciones de la terapia génica residen en la

transferencia poco eficiente y con efectos secundarios
indeseables de los vectores, la expresión poco intensa y
limitada en el tiempo de los genes, y la dificultades del
protocolo (pocos pacientes, falta de paralelismo…)

La respuesta a un determinado tratamiento farmacológico

depende de la variabilidad de cada individuo, es decir,
ciertas variaciones genéticas (polimorfismos) influyen en
la efectividad y en los efectos secundarios de los
fármacos administrados.
TEMA 27 y 28. TÉCNICAS DE SEPARACIÓN, IDENTIFICACIÓN Y PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS.

El estudio o caracterización de una proteína tiene como fin

conocer la secuencia, el tamaño, la masa molecular y los aspectos
relativos a su función.

Para ello, primero se ha de purificar desde el medio biológico de

partida: esto se realiza mediante una precipitación fraccionada
o centrifugación diferencial, basado en la separación de
proteínas en base a los orgánulos en que se encuentran. Cada vez
se centrifuga a una velocidad mayor para ir precipitando las
fracciones celulares dependiendo de su densidad. Las de mayor
densidad precipitarán primero, y a velocidades mayores lo harán
las de menor densidad.

Las proteínas se pueden purificar aprovechando las características de las mismas y aplicando técnicas basadas
en su solubilidad, carga, tamaño o afinidad por ciertos ligandos.

▪ En función de sus características de solubilidad se pueden llevar a cabo precipitaciones salinas, que ayudan a
purificar la proteína en base a la diferente solubilidad de las mismas en relación a las diferentes concentraciones
de sales (altas) del medio. No todas las proteínas precipitan a la misma [sal] (se usa sulfato amónico).

▪ Diálisis: técnica basada en el diferente tamaño de las proteínas. Utiliza

membranas porosas o sacos de diálisis con un tamaño de poro determinado. Si
se coloca en el interior la muestra a separar, las moléculas más pequeñas
podrán atravesar los poros saliendo al exterior ya que son de menor tamaño.
Este método no es muy discriminativo pero nos ayuda tras la utilización de una
precipitación salina, a eliminar dichas sales o iones y separarlas de las
proteínas.

▪ Cromatografía de filtración
en gel o de exclusión
molecular: se utilizan columnas rellenas de una resina
(sefadex) formando bolitas realizadas a base de polímeros. Cada
una de estas bolitas presenta un entramado con huecos en el
interior de un determinado tamaño, formados por dicho
polímero. Las proteínas más pequeñas pueden atravesar el
polímero, sin embargo las más grandes no pueden pasar a
través de las bolitas, sino en los huecos que estas dejan en la
columna. Las moléculas más pequeñas tienen un mayor camino
por recorrer que las moléculas grandes, por lo que eluyen las
últimas, siendo las primeras que salen de la columna aquellas
proteínas de mayor tamaño.

▪ Cromatografía de intercambio iónico, basada en la diferente carga de las

proteínas. Se utiliza una sustancia polimérica (resina, agarosa o celulosa) unida a
ligandos con carga (grupos carboximetilo -, o grupos dietilaminoetilo+). Además, el
tampón utilizado poseerá un determinado pH. En estas condiciones de pH las
moléculas a separar poseerá una carga u otra.
- Columna de intercambio catiónico: cargas negativas en la columna, quedando
retenidas las moléculas con carga positiva.
- Columna de intercambio aniónico: cargas positivas en la columna, quedando
retenidos las negativas.
Al pH determinado, unas proteínas presentarán carga + y otras negativa. Así
podemos elegir un pH a la que nuestra proteína buscada quede retenida en la
columna. Posteriormente, la molécula que ha quedado retenida puede ser eluída
cambiando la fuerza iónica del medio.

▪ Cromatografía de afinidad. Método en columna que está rellena de una proteína unida
a ligandos específicos de la molécula a separar. Quedan retenidas las proteínas que sean
específicas del ligando que hay en el interior, mientras que las otras son eluidas.
Adicionando un tampón que aumente la [ligando] se eluyen posteriormente dichas
proteínas. También es usada para aislar el mRNA desde el RNA total.

▪ HPLC. Basándonos en la afinidad de las proteínas por disolventes más o menos polares,
se utiliza esta técnica de separación, donde la fase estacionaria y la móvil poseen distinta
polaridad.
Las proteínas se pueden separar e identificar mediante métodos electroforéticos, tras llevar a cabo la
purificación. Además los procedimientos pueden ser empleados para comprobar el éxito de la purificación y se
puede llevar a cabo la caracterización de las proteínas por la determinación de su peso molecular.

● Electroforesis en gel.
La particularidad de esta técnica es que se realiza
verticalmente, lo que no solo nos ayuda a separar
las proteínas en función de su carga sino también
de su masa molecular.
Se utilizan geles de poliacrilamida en condiciones
desnaturalizantes o no desnaturalizantes, basados
en la mezcla de acril y bisacrilamida, dando lugar
cuando se gelifica a un entramado con huecos en el interior del gel. Las proteínas migrarán en función de su
tamaño, siendo las de menor tamaño las que difundan antes a través del gel. La migración se produce también
en función de su carga.

Si queremos que esta separación se lleva a cabo exclusivamente por diferencias de tamaño, se ha de reducir la
diferencia de carga entre las proteínas de la muestra. Para ello es necesario que la electroforesis se realice en
condiciones desnaturalizantes, que igualen la carga de las proteínas a separar. Se utiliza la SDS-PAGE, o la
electroforesis en geles de poliacrilamidad con SDS (siendo este un agente desnaturalizante, debido a su carácter
aniónico que elimina las asociaciones no covalentes entre proteínas, es decir, las diferentes cadenas
polipeptídicas que forman parte de las proteínas uniéndose a ellas y confiriéndolas carácter aniónico,
minimizando la diferencia de carga entre ellas, de modo que la separación depende exclusivamente de la masa
molecular de las mismas).
Si la proteína posee puentes disulfuro, se eliminan los mismos para la completa
desnaturalización de las proteínas con un tratamiento con β-mercaptoetanol y ditiotreitol
(agentes reductores).

La movilidad electroforética de estas moléculas es inversamente proporcional al logaritmo

de su masa. La visualización de las proteínas se realiza mediante tinción con azul de
coomasie. Se determina la masa molecular de las proteínas, comparándolas con una
mezcla de proteínas patrón de masas moleculares conocidas, e interpolando la movilidad
electroforética de nuestra proteína en la recta de calibrado del patrón.

● Isoelectroenfoque.
Método realizado en función del punto isoeléctrico de las
proteínas a separar.
Se realiza mediante soporte en papel, que suele ser acetato de
celulosa. En éste se crea un gradiente de pH, sometiéndo a
polianfolitos (moléculas pequeñas con cargas diversas) a
electroforesis. Posteriormente se lleva a cabo la separación
electroforética de las proteínas que van avanzando por el
soporte hasta que quedan retenidas en el pinto en el que el pH
coincide con el punto isoeléctrico de la misma. El punto
isoeléctrico es la situación en que la carga neta de la molécula
es 0.

● Electroforesis bidimensional.
Método basado en la combinación de los dos anteriores. Se lleva a cabo el
desarrollo mediante dos direcciones. La primera dirección es horizontal,
utilizando el isoelectroenfoque y quedando las proteínas separadas en función
del punto isoeléctrico en el soporte de acetato de celulosa. El resultado se
transfiere a un gel, que se encuentra en posición vertical, y es sometido a
electroforesis separándose las proteínas en función de su tamaño.
Esta técnica posee una capacidad de resolución mucho mayor, ya que se
separan moléculas atendiendo a su tamaño que anteriormente han sido
separadas dependiendo de su punto isoeléctrico.

■ Resolución cuantitativa de un protocolo de purificación para una proteína.

Los métodos anteriores son utilizados cuando nos planteamos un protocolo de purificación y caracterización.
Se parte de un medio biológico que se debe homogeneizar para proceder a su centrifugación diferencial y
fraccionamiento subcelular. Una vez obtenidas las proteínas, se someten a una precipitación salina donde la
molécula buscada precipita a una [(NH4)2SO4] concreta. Diálisis para eliminar las sales en exceso y separación
en columna para obtener nuestra proteína. Análisis electroforético para separar e identificar la proteína.
Parámetros: nº total proteínas ↓ rendimiento o actividad ↓ pureza ↑ actividad específica ↑
Se debe llegar a un equilibrio entre el rendimiento, que irá disminuyendo y no será del 100% y la pureza, que irá
aumentando, alcanzando una situación en que el extracto sea lo más puro posible sin sacrificar el rendimiento.
● Ultracentrifugación.
Es una técnica útil para separar biomoléculas y para determinar sus masas
moleculares. El procedimiento se basa en separar moléculas en función de su
coeficiente de sedimentación, incluso llegando a obtener la Mm.

Existen variantes de esta técnica como la centrifugación zonas o en

gradiente de densidad. Se separa la muestra en diferentes tubos de
centrífuga donde previamente se ha llevado a cabo un gradiente de densidad
utilizando sacarosa que será mayor en la parte inferior (20%) que en la
superior (5%). Se deposita la muestra en los tubos y se centrifuga a gran
velocidad, separándose en
función del coeficiente de
sedimentación, quedando
cada biomolécula en una zona
del tubo. Se recogen las
fracciones separadas en el
tubo desde la parte inferior de
este y se obtiene el resultado.

● Técnicas basadas en las reacciones antígeno-

anticuerpo para la detección de proteínas, siendo de
gran utilidad en el diagnóstico clínico pues nos
permite identificar proteínas concretas. La más
utilizada es el ELISA directo e indirecto. Los
anticuerpos estarán conjugados a enzimas que en
presencia de sustrato específico llevan a cabo
reacciones que dan lugar a productos coloreados
mediante los cuales se identifica la presencia o no de
la proteína específica para ese anticuerpo.

● Western blot.
Técnica paralela a Southern (DNA) y Northern (RNA) blot. Todas ellas están basadas en la separación
electroforética y el posterior análisis e identificación.
El western blot se lleva a cabo en geles de
poliacrilamida-SDS o desnaturalizantes,
transfiriendo el resultado de la electroforesis a una
membrana de nylon o de acetato de celulosa. La
presencia e identificación de proteínas se detectará
por el producto coloreado que forman las enzimas
conjugadas al anticuerpo que interacciona con
dichas proteínas. También se realiza la detección
por generación de quimioluminiscencia.

Utilidad de los marcadores fluorescentes para

visualizar proteínas en las células, es decir, en su entorno biológico.
Otras técnicas utilizadas son la espectrometría de masas, que nos
permite caracterizar a las proteínas con mucha precisión (saber su Mm),
o la cristalografía de rayos X y la resonancia magnética nuclear, que
proporcionan
la estructura
de la
molécula
estudiada.
TEMA 29. TÉCNICAS PARA LA DETERMINACIÓN DE LA ESTRUCTURA PROTEICA.

Para conseguir determinar la estructura proteica, se debe conocer en primer lugar la estructura primaria de la
proteína, es decir, su secuencia aminoacídica.
Gracias a las técnicas de genómica esto se ha facilitado mucho, y a partir de la secuencia de DNA que codifica
para la proteína se puede predecir la secuencia de aminoácidos de la proteína.

Sin embargo, sigue siendo necesario conocer o secuenciar la totalidad o parte de la proteína.

1º. Saber si nuestra proteína problema está integrada por una o varias cadenas polipeptídicas. En el segundo de
los casos, será necesario separarlas (pues el procedimiento está referido a proteína con una sola cadena
polipeptídica), para lo cual se emplean técnicas como el SDS-PAGE partiendo de una molécula ya purificada.
Une vez separadas las cadenas proteícas, se procede a analizar la secuencia de aminoácidos de cada una de
ellas. Es necesario conocer:

● La proporción y los aminoácidos de la cadena: la determinación de la composición de aminoácidos del

péptido se realiza mediante tratamientos muy fuertes con HCl 6M a 110ºC y en un tiempo prolongado (24h). En
estas condiciones se eliminan los enlaces peptídicos separando los aminoácidos de la cadena, y posteriormente
identificándolos mediante una cromatografía de
intercambio iónico o HPLC. Obteniendo una serie de
fracciones eluidas que comparamos con patrones
conocidos. Por comparación del cromatograma con un
patrón conocido se puede saber la composición en
aminoácidos.

Las sustancias que reaccionan con los aminoácidos y nos

sirven para cuantificarlos, reconocen los grupos amino y
reaccionan con los mismos dando lugar a productos
coloreados o identificables. Estas sustancias son la
ninhidrina que da un color azul a los aminoácidos (o
amarillo si es prolina), que se determinaran
electrofotométricamente para saber su cuantificación.
También fluorescamida.

● El orden en el que se encuentran los aa:

El primer paso es identificar el aminoácido N-terminal. El método más eficaz es el método de degradación de
Edman, que no degrada la proteína al completo, aunque existen otros reactivos por los cuales se puede
identificar qué aminoácido se encuentra en el extremo aminoterminal. Esto es posible por que dichos reactivos
(como fluorodinitrobenceno y cloruro de Dabsilo) forman compuestos derivados de estos aminoácidos que se
pueden identificar, aunque la desventaja es que se degrada la proteína así que solo pueden utilizarse una vez, no
de manera secuencial.
El método utilizado es el método de degradación de Edman. Consiste en usar
fenilisotiocianato, que reacciona con el aminoácido N-terminal dando lugar a un
producto intermediario que forma un derivado cíclico, identificable por HPLC y a la
cadena oligonucleotódica acortada en un aminoácido, siendo otro el que pasa a
ocupar el extremo amino terminal.
Esto se puede aplicar de manera secuencial hasta llegar a conocer la secuencia
completa, aunque sólo se puede usar sobre un máximo de oligonucleótidos de
50aa.

Por ello, antes de realizar este proceso, se lleva a cabo la ruptura de la proteína
mediante Bromuro cianógeno. Las proteínas se fragmentan de modo específico
en péptidos más pequeños para facilitar su análisis. El CNBr corta la cadena
polipeptídica únicamente en el lado carboxilo de los residuos de Meth.
Se emplean diferentes reactivos químicos y enzimáticos que de forma específica
fragmentan la cadena original (utilidad similar a las endonucleasas de restricción). La tripsina es otro reactivo
utilizado que escinde la molécula en el lado carboxilo de Lis o Arginina. Las moléculas resultantes se llevan a
degradación de Edman. → Mediante solapamiento se puede reconstruir la secuencia de la molécula original.

Para identificar si la molécula posee puentes disulfuro (una vez secuenciada, conocidos sus aminoácidos y su
orden), se utiliza una electroforesis diagonal. Primero, en una dirección, las proteínas son separadas en
función de su carga y masa. El resultado se trata con ácido perfórmico en vapor, que reacciona escindiendo los
puentes disulfuro dando lugar a la formación de ácido cisteíco. Estas proteínas aumentan su carga negativa ya
que como resultado de la reaccion se generan radicales aniónicos. Se realiza la electroforesis en una secunda
dirección, quedando las proteínas localizadas en una diagonal. Si embargo, la que tenían puentes disulfuro han
variado su carga y las características que han llevado a cabo su primera separación electroforética, por lo que
quedan fuera de la diagonal.