Avances en la detección de

anticuerpos anti receptor de

TSH

Revisión Bibliográfica

Autores
Bioq. Morandi, Franco
Bioq. Palavecino, Daniela

1º año de Residencia
Especialidad: Bioquímica Clínica

Tutora
Bioq. Claudia Insúa

Año 2018

Hospital General de Niños Pedro de Elizalde

ÍNDICE
1. Introducción Pág. 3
2. Objetivos Pág. 4
3. Métodos de búsqueda y selección de la información Pág. 5
4. Desarrollo Pág. 6
4.1. Receptor de TSH Pág. 6
4.1.1. Estructura Pág. 6
4.1.2. Expresión tisular Pág. 6
4.2. Autoanticuerpos anti TSH-R Pág. 7
4.2.1. Nomenclatura de los ensayos de anticuerpos antitiroideos Pág. 7
4.3. Impacto de la interacción antígeno-anticuerpo a nivel molecular Pág. 8
4.4. Detección de anticuerpos anti receptor de TSH Pág. 8
4.4.1. Primeros ensayos TRAb Pág. 8
4.4.2. Ensayos TRAb en fase líquida con receptor de TSH soluble en
detergente Pág. 9
4.4.2.1. Ensayos TRAb en fase líquida con pTSH-R y hTSH-R Pág. 9
4.4.3. Ensayos TRAb en fase sólida (segunda generación) Pág. 9
4.4.4. Desarrollo de anticuerpos monoclonales anti hTSH-R Pág.10
4.4.4.1. Desarrollo de ensayos de tercera generación con
anticuerpos monoclonales M22 Pág.11
4.4.5. Desarrollo de un bioensayo que detecta anticuerpos estimulantes
de la tiroides Pág.12
4.4.6. Desarrollo del ensayo Immulite™ TSI Pág.13
4.5. Validación analítica y clínica de los Inmunoensayos disponibles para la
detección de TSI Pág.14
5. Conclusiones Pág.17
6. Resumen Pág.18
7. Bibliografía Pág.19
8. Anexo Pág.20

2
1. INTRODUCCIÓN
Las enfermedades autoinmunes tienen una alta prevalencia en la población, siendo la
enfermedad tiroidea autoinmune (ETA) una de las más comunes.1

La ETA está asociada a la presencia de autoanticuerpos contra varios antígenos tiroideos,

como la peroxidasa tiroidea, la tiroglobulina y el receptor de la hormona estimuladora de la
tiroides (TSH-R).2

Los anticuerpos anti TSH-R (TRAb) son autoanticuerpos heterogéneos capaces de unirse al
receptor de la hormona estimulante de la tiroides, conocida como TSH. Esta interacción
puede simular la acción de la hormona y causar hipertiroidismo o enfermedad de Graves
(EG), o bien, actuar como antagonista, y producir hipotiroidismo.3

La medición de TRAb es una herramienta importante para el diagnóstico etiológico del

hipertiroidismo y para evaluar tanto el riesgo de recidiva luego de la suspensión del
tratamiento con drogas antitiroideas como la probabilidad de ocurrencia de manifestaciones
extra-tiroideas asociadas, entre ellas la orbitopatía de Graves (OG). Además, su dosaje es
fundamental en el embarazo para evaluar el riesgo de hipertiroidismo fetal y neonatal que
es inducido por la transferencia placentaria de los autoanticuerpos maternos.4

La metodología para detectar anticuerpos anti TSH-R ha evolucionado a lo largo de los

años, desde los procedimientos de laboratorio de investigación hasta los métodos de
tercera generación comercialmente disponibles.5

En general, los ensayos para detectar TRAb se pueden dividir en dos categorías. La
primera comprende la capacidad de los anticuerpos para competir con la TSH por la unión
al receptor y se conoce como ensayo de inmunoglobulinas inhibidoras de la unión de TSH
(TBII). Por otro lado, el segundo grupo se trata de bioensayos (BA) que miden la producción
de adenosin monofosfato cíclico (cAMP) en respuesta a la interacción de los
autoanticuerpos del paciente con el TSH-R. Una desventaja que poseen los ensayos TBII
es que no son capaces de distinguir entre anticuerpos estimulantes del receptor (TSI), de
aquellos que son bloqueantes de la actividad. Recientemente se informó sobre un nuevo
ensayo que tiene como objetivo medir sólo anticuerpos anti TSH-R de tipo estimulantes.5

Este trabajo se centra en la descripción de los avances en la detección de anticuerpos anti

TSH-R y exponer acerca de la sensibilidad y eficiencia diagnóstica de una nueva
metodología para la detección de TSI que causan EG.
2. OBJETIVOS
Describir los avances en la detección de anticuerpos anti receptor de TSH.

Describir la sensibilidad y eficiencia diagnóstica de una nueva metodología para la

detección de anticuerpos estimulantes anti receptor de TSH.

4
3. MÉTODOS DE BÚSQUEDA Y SELECCIÓN DE LA
INFORMACIÓN

Se realizó la búsqueda mediante diferentes fuentes de información:

Libros de texto
Buscador de Pubmed y la biblioteca digital Scielo. Los filtros utilizados para estos
motores de búsqueda fueron:
o Disponibilidad: texto completo

Las palabras claves utilizadas fueron: enfermedad de Graves, anticuerpos, enfermedades

tiroideas, receptor de TSH, anticuerpos estimulantes anti receptor de TSH, inmunoensayos,
TBII, bioensayos, TSI - Immulite, TRAb.

La selección de la información se realizó en base a los siguientes criterios:

Publicaciones relacionadas con los objetivos propuestos
Fecha de publicación
Índice de impacto

5
4. DESARROLLO
4.1. Receptor de TSH

4.1.1. Estructura

El receptor de TSH integra la superfamilia de receptores con siete dominios

transmembrana unidos a proteína G.3

La difracción de rayos X de alta resolución del TSH-R humano, unido a fragmentos

Fab de autoanticuerpos monoclonales humanos, revela que los autoanticuerpos
bloqueantes y estimulantes comparten una gran similitud en el tipo de contacto que
hacen con los aminoácidos de la superficie cóncava del dominio rico en leucina del
receptor, en tanto, las secuencias flexibles extracelulares y la región bisagra
permanecen sin resolver. En consecuencia, se ha recurrido a modelos moleculares
del TSH-R, basados en estructuras conocidas de receptores acoplados a proteína G
para predecir cómo la región extracelular del receptor comunica los cambios
conformacionales en los dominios transmembrana.6

La activación de la proteína G por el complejo hormona-receptor resulta en la

estimulación de la producción de cAMP por la adenilato ciclasa y en la hidrólisis de
fosfatidil inositol por las fosfolipasas. La mutagénesis sitio-dirigida ha demostrado
que la estructura tridimensional del receptor es importante para la interacción con la
TSH y/o con los TRAbs.3

4.1.2. Expresión tisular

El TSH-R está presente en la superficie basal de las células foliculares tiroideas y

está íntimamente involucrado en la regulación del crecimiento y la función de los
tirocitos. Además, se encuentra en tejidos extra-tiroideos como fibroblastos, corazón,
riñón, hueso, astrocitos y cerebro humano.6

Krieger y col.7 estudiaron los mecanismos involucrados en la patogénesis de la

orbitopatía de Graves (OG) y observaron que existía una intercomunicación entre el
TSH-R y el receptor del factor de crecimiento símil insulina tipo 1 (IGF1-R) presentes
en fibroblastos y preadipocitos del espacio retroorbital. De esta manera, concluyeron
que la unión de los TRAb al TSH-R podría producir la activación de la vía del IGF1-
R, con la consecuente producción de ácido hialurónico, el cual es el componente
mayoritario en la patogénesis de la OG.

La terapia con anticuerpos monoclonales anti receptor IGF-1 ha mostrado eficacia en

los ensayos clínicos, pero el papel exacto del TSH-R extra-tiroideo en la mediación
de la respuesta inflamatoria, la actividad metabólica y la diferenciación celular en
OG, sigue siendo poco conocido.6

4.2. Autoanticuerpos anti TSH-R

La enfermedad tiroidea autoinmune causa daño celular y altera la función tiroidea por
mecanismos humorales y celulares. Produce daño celular cuando los linfocitos T
sensibilizados o los autoanticuerpos se fijan a las membranas celulares tiroideas
provocando lisis celular y reacciones inflamatorias.3

6
El procesamiento de células dendríticas, la presentación del TSH-R como antígeno y los
eventos subsiguientes a la expansión clonal de las células B dependientes de las células
T, involucran múltiples elementos de respuesta inmunogénica que incluyen la función
defectuosa de las células T reguladoras y los factores de supervivencia de las células B
de memoria. Los autoanticuerpos anti TSH-R producidos se dirigen principalmente contra
el dominio extracelular del receptor, aunque existen reportes de autoanticuerpos no
funcionales neutros que se unen a la región bisagra del mismo. Los modelos de ratón
con EG inducida por inmunización genética con la región extracelular de TSH-R,
denominada subunidad A del TSH-R, replican estrechamente las características clínicas
humanas del hipertiroidismo autoinmune y, especialmente, de la OG.6

Las alteraciones en la función tiroidea se producen por acción de los autoanticuerpos

estimulantes o bloqueantes sobre los receptores de membrana de las células. Tres
autoantígenos principales participan en la ETA: tiroperoxidasa, tiroglobulina y receptor de
TSH. Estos, dan origen a los autoanticuerpos específicos: anticuerpos antitiroperoxidasa,
antitiroglobulina y TRAb.3

En el caso de los TRAb, existen varios tipos de autoanticuerpos determinados por

bioensayos o por ensayos de inhibición. Éstos últimos, no miden actividad biológica
directamente, sino que determinan, a partir de una preparación in vitro del TSH-R, si la
muestra contiene inmunoglobulinas que puedan bloquear la unión de la TSH al receptor.
Los anticuerpos estimulantes del receptor parecen fijarse a la porción N-terminal del
dominio extracelular y mimetizar las acciones de la TSH, induciendo la transducción de la
señal post receptor y la estimulación celular. En contraste, la región C-terminal es más
importante para los anticuerpos bloqueantes del TSH-R que impiden la estimulación por
los TSI o la TSH, provocando hipotiroidismo.3

4.2.1. Nomenclatura de los ensayos de anticuerpos antitiroideos

La nomenclatura utilizada para los autoanticuerpos antitiroideos ha sido muy variada:

LATS (estimulador de tirocitos de acción prolongada), TSI (inmunoglobulinas
estimulantes de la tiroides), TBII (inmunoglobulinas inhibidoras de la unión de TSH),
y TRAb (ensayo de unión al TSH-R). El término TRAb es el recomendado
internacionalmente. Éste término corresponde a las entidades moleculares, es decir,
las inmunoglobulinas, que reaccionan con los autoantígenos específicos reconocidos
por la prueba de laboratorio. Las diferencias entre métodos pueden sesgar la
medición de estas entidades moleculares. Por ejemplo: los métodos pueden detectar
solo IgG o IgG e IgM, TRAb inhibidores de la unión de TSH y/o estimulantes del
receptor de TSH.3

Respecto a los autoanticuerpos producidos contra el TSH-R, la nomenclatura es

confusa en la mayor parte de la literatura disponible. Con el propósito de ser claros,
en esta revisión se define a los autoanticuerpos de acuerdo con los métodos
utilizados para detectarlos. En el caso de inmunoglobulinas del paciente o
anticuerpos monoclonales (MAbs) medidos por inmunoensayos de unión al TSH-R,
los autoanticuerpos detectados se denominan "TRAb". Por otro lado, para las
inmunoglobulinas o MAbs del paciente medidos por bioensayos que detectan cAMP,
el aumento en la producción del mismo se atribuye a las inmunoglobulinas
estimuladoras del receptor denominadas "TSI” (Fig. 1). Aquellas inmunoglobulinas o
MAbs de pacientes que bloquean la estimulación del receptor por la TSH y, por
ende, inhiben la producción cAMP en el bioensayo, se denominan inmunoglobulinas
bloqueantes, inhibitorias o "TBAb".6

7
4.3. Impacto de la interacción antígeno-anticuerpo a nivel molecular

Ciertos problemas específicos han obstaculizado el uso de los ensayos para anticuerpos
antitiroideos y algunos estudios muestran que los resultados varían ampliamente
dependiendo del método utilizado. Estudios a nivel molecular han demostrado que los
autoanticuerpos reaccionan con sus autoantígenos blanco, uniéndose a dominios o
epítopes conformacionales. En consecuencia, los resultados de los ensayos dependen
fundamentalmente de la estructura molecular del antígeno utilizado en el diseño del
mismo. Los pequeños cambios en la estructura de un determinado epítope pueden
resultar en una disminución o pérdida de reconocimiento del autoantígeno por parte del
anticuerpo dirigido hacia ese epítope. Cualquiera sea el auto-antígeno, los anticuerpos
antitiroideos no son entidades moleculares únicas, sino más bien mezclas de
inmunoglobulinas que solamente tienen en común su capacidad de interactuar con la
tiroglobulina, la tiroperoxidasa o el TSH-R.3

Las diferencias en la sensibilidad de los métodos para autoanticuerpos pueden derivar

tanto del diseño del ensayo como del tipo de señal. Las diferencias en especificidad
pueden deberse a la contaminación de la preparación con otros autoantígenos.3

4.4. Detección de anticuerpos anti receptor de TSH

4.4.1. Primeros ensayos TRAb

La TSH y los TRAb se unen a la misma región del receptor, y ésta fue la condición
previa para medir estos anticuerpos cuantitativamente usando un método
competitivo simple, en la cual los TRAb del paciente son capaces de inhibir la unión
de la TSH al receptor. 8

En 1974, Rees Smith y col.8 describieron, por primera vez, un ensayo para la
evaluación de TRAb. Utilizaron tejido particulado de tiroides provenientes de
individuos eutiroideos y de pacientes con EG. Emplearon TSH bovina (bTSH)
marcada con iodo-125 (I-125) para estudiar la interacción de las inmunoglobulinas
de Graves con dichos tejidos. La unión de TSH marcada a las membranas tiroideas
humanas fue inhibida significativamente por las inmunoglobulinas de la gran mayoría
de los pacientes con EG, lo que sugirió que estas inmunoglobulinas contenían
regiones que se unían a sitios similares en el TSH-R (Fig. 2). Por aquel entonces,
estos ensayos de primera generación, mostraron efectos inespecíficos significativos,
así como una baja sensibilidad funcional y diagnóstica.

4.4.2. Ensayos TRAb en fase líquida con receptor de TSH soluble en

detergente

Con el objetivo de disminuir los efectos inespecíficos observados en los ensayos con
tejido particulado tiroideo, en 1982 Shewring y Smith9 describieron una optimización
del ensayo para TRAb, en la cual se utilizaron receptores de TSH solubilizados con
detergente y bTSH marcada con I-125. Dichos autores, se basaron en estudios
preliminares que sugerían que las preparaciones de receptores solubilizados con
detergente eran más adecuadas, debido a que las interferencias en la unión de la
TSH a los receptores del tejido particulado observadas en concentrados normales de
suero, se debían a la interacción con ciertos componentes de la membrana, los
cuales fueron eliminados durante la solubilización.

Además, la interacción entre la TSH marcada y los receptores de TSH solubilizados

con detergente fue más sensible a la inhibición por los TRAb, que los ensayos que
utilizaron membranas tiroideas.9

8
En el trabajo, el suero humano normal y los concentrados de inmunoglobulina de
suero normal no tuvieron efecto sobre la interacción entre la TSH marcada y los
receptores solubilizados, mientras que los concentrados de inmunoglobulina de
sueros de pacientes con EG causaron una marcada inhibición de la unión a la TSH
(Fig. 3). Si bien se logró una mejor especificidad, aún observaron una baja
sensibilidad funcional y diagnóstica.9

4.4.2.1. Ensayos TRAb en fase líquida con TSH-R de origen porcino

(pTSH-R) y recombinante humano (hTSH-R)

El ensayo más utilizado para TRAb en la década del ‘90 ha sido el ensayo que
involucra al pTSH-R solubilizado en detergente.10

Kakinuma y col.10 compararon por primera vez los receptores pTSH-R y hTSH-
R, en base al comportamiento de los ensayos en una serie de pacientes
clínicamente caracterizados con ETA. Estudiaron 227 pacientes con EG, entre
los cuales la mayoría se encontraba bajo tratamiento con drogas antitiroideas.
Dentro del resto de los pacientes, algunos se encontraban en remisión, otros
con recurrencias de la enfermedad y, por último, aquellos que no recibían
medicación alguna. Al obtener los resultados observaron que el 90% de los
pacientes no tratados fueron positivos para TRAb, tanto con el pTSH-R como
con el hTSH-R. De aquellos pacientes que estaban bajo tratamiento, el 60% fue
TRAb positivos con el pTSH-R, y el 67% fue positivo con el hTSH-R.10

Ninguno de los ensayos proporcionó una orientación clínica tanto en la remisión

como en la recaída de la enfermedad. En el primer caso, de los pacientes con
EG en remisión, sólo el 75% y 79% fueron TRAb negativos con los ensayos de
hTSH-R y pTSH-R, respectivamente.10

El estudio de los TRAb en el momento de la recaída fue aún menos informativo:

el 66% de los pacientes en recaída fueron negativos con el pTSH-R, frente al
33% que dio negativo en el ensayo con hTSH-R.10

Finalmente, concluyeron que el hTSH-R podía sustituir claramente al pTSH-R

utilizado como antígeno en el ensayo de inhibición de la unión a TSH dada su
practicidad de obtención. De todas maneras, el uso del hTSH-R no presentó
diferencias significativas respecto al pTSH-R, al menos en términos de
sensibilidad, especificidad y valor predictivo en el ensayo de fase líquida. 10

4.4.3. Ensayos TRAb en fase sólida (segunda generación)

En el año 1999, Costagliola y col.11 , en Bruselas, lograron inmovilizar hTSH-R, lo

que condujo a una nueva generación de ensayos TRAb: los ensayos de fase sólida,
en los cuales utilizaron la línea celular de Leucemia K562 en suspensión,
permitiendo que dichas células expresaran el hTSH-R recombinante en elevadas
cantidades. Luego, seleccionaron un anticuerpo monoclonal de origen murino
(moAb) que reconocía sólo al receptor nativo y no interfería en el sitio de unión de la
TSH ni de los TRAbs. De esta manera, recubrieron tubos de poliestireno con los
moAbs y, posteriormente, inmovilizaron los TSH-R por afinidad a estos anticuerpos.
Así surgió este nuevo ensayo en formato de tubo recubierto (TC) cuya detección de
la señal se realizó por dos metodologías: radioinmunoensayo y quimioluminiscencia,
utilizando bTSH marcada con I-125 y éster de acridinio, respectivamente.

9
La superioridad clínica de estos ensayos en comparación con los ensayos de
convencionales de fase líquida que se usaban hasta ese momento, se demostró con
328 sueros de pacientes con EG y 520 controles diferentes. La unión de la TSH al
receptor se pudo demostrar mediante la adición de bTSH marcada con I-125 o éster
de acridinio, y esta unión se pudo inhibir con sueros de pacientes con EG hasta en
un 95%.11

Posteriormente, se realizó una comparación entre el TC con detección radioactiva, el

TC con detección quimioluminiscente y el ensayo de fase líquida, la cual se llevó a
cabo mediante un ensayo clínico multicéntrico ciego. En el mismo, se evaluaron los
sueros de 328 pacientes con EG (86 no tratados, 116 tratados y 126 en remisión) y
520 controles (compuestos de donantes de sangre sanos y pacientes con
enfermedades autoinmunes no tiroideas). Los resultados dieron una especificidad
del 99,6% con una sensibilidad del 98,8% para ambos ensayos de TC, en
comparación con la especificidad del 99,6% y una sensibilidad del 80,2% para el
ensayo en fase líquida. En los 3 grupos de pacientes con EG, los dos ensayos de TC
fueron significativamente más sensibles a la enfermedad que el ensayo
convencional, sin pérdida de la especificidad en los grupos control.11

Este aumento de la sensibilidad y el formato de tubo recubierto con detección

quimioluminiscente o radioactiva, constituyeron una mejora significativa con respecto
a los ensayos disponibles hasta ese momento.11

4.4.4. Desarrollo de anticuerpos monoclonales anti hTSH-R

Hasta el momento, el trazador utilizado para los ensayos de fase líquida y fase sólida
fue la bTSH, la cual se marcaba con I-125 o éster de acridinio, y de esta manera se
medía la inhibición de su unión al TSH-R debida a la presencia de TRAb.11

Sanders y col.12 reportaron, en el año 2002, el desarrollo de anticuerpos

monoclonales estimulantes de la tiroides. En dicho reporte, describieron la
producción y caracterización de anticuerpos monoclonales (mAbs), conocidos como
M22, obtenidos mediante la inmunización de ratones con un plásmido que contiene
ADNc del hTSH-R.

Según estos autores, los mAbs anti hTSH-R producidos no solo compitieron con la
TSH marcada con I-125 por los sitios de unión en el hTSH-R, sino que, además,
estimularon la producción de cAMP en células tiroideas porcinas aisladas.12

De acuerdo a los ensayos que llevaron a cabo utilizando fragmentos Fab e IgG
completa, vieron que los mAbs se unen a la misma región del TSH-R, ya sea
estimulando o bloqueando la actividad del receptor, lo cual, es inconsistente con las
sugerencias previas de que los TSI se unen a epítopes diferentes de aquellos a los
que se unen los bloqueantes.12

Estos estudios también sugieren que el epítope está formado por el plegamiento
tridimensional de la cadena peptídica del TSH-R, es decir, es de tipo
conformacional.12

Por otro lado, estos mAbs se marcaron con I-125 para llevar a cabo los ensayos de
unión al TSH-R. También se estudiaron sueros de pacientes positivos para TRAb,
que se enfrentaron con el receptor inmovilizado en tubos de plástico, en presencia
de mAbs marcados unidos al receptor. La unión de los mAbs marcados fue inhibida
de manera dependiente de la dosis para cada uno de los sueros. Además, el nivel de

10
inhibición de la unión de mAbs marcados se correlacionó bien con el nivel de
inhibición de unión del trazador a la TSH marcada.12

El desarrollo de estos anticuerpos monoclonales fue un paso en la optimización de

las técnicas de detección de autoanticuerpos anti TSH-R, ya que poseen una relativa
facilidad de manipulación, y pueden reemplazar el uso de bTSH como trazador.12

4.4.4.1. Desarrollo de ensayos de tercera generación con anticuerpos

monoclonales M22

En 2004, Rees Smith y col.13 describieron un nuevo procedimiento para detectar

TRAb, basado en un inmunoensayo (IMA) donde mide la inhibición de la unión
de M22 marcada con biotina al TSH-R inmovilizado. Además, realizaron una
comparación entre éste método y el de segunda generación. En estos ensayos,
se reemplazó la bTSH marcada con biotina y/o I-125, por el anticuerpo
monoclonal M22 desarrollado por el grupo de Sanders.

Los sueros analizados provenían de pacientes con EG, hipotiroidismo

autoinmune y enfermedades tiroideas no autoinmunes varias. Utilizaron sueros
de donadores sanos como control, como también un standard internacional de
referencia de anticuerpos anti TSH-R (90/672).13

Utilizando el patrón mencionado, estos autores observaron que el porcentaje de

inhibición de unión al receptor fue superior para los ensayos con M22 que para
aquellos que utilizan TSH marcada ya sea con biotina o I-125 como trazador,
referidos a la misma concentración de anticuerpos anti TSH-R presentes en el
suero (Fig. 4A). Por ejemplo, 1 UI/L del anticuerpo de referencia 90/672, dio una
inhibición de aproximadamente el 35% en el ensayo basado en M22, en
comparación con aproximadamente el 15% en el ensayo basado en TSH. Por
otro lado, la sensibilidad del método fue inferior a los nuevos ensayos.13

Del grupo control, compuesto por personal clínico, donantes de sangre sanos y
pacientes sin diagnóstico de EG, sólo el 0,65% mostró una inhibición de M22
superior al 10%, lo cual es esperable para esta población. En términos de
especificidad, la inhibición de la unión a M22 no fue afectada por
autoanticuerpos anti tiroperoxidasa o autoanticuerpos anti tiroglobulina. Además,
la presencia de altas concentraciones de TSH y otras hormonas como la
hormona folículo estimulante, la hormona luteinizante o la gonadotrofina
coriónica humana no causaron interferencias en el ensayo.13

La inhibición de la unión de M22 al TSH-R por los sueros de pacientes con EG

se correlacionó fuertemente con la capacidad para inhibir la unión de TSH
observada en métodos de segunda generación (Fig. 4B).13

En líneas generales, este nuevo ensayo basado en la inhibición de la unión de

M22 al TSH-R, presentó ventajas considerables respecto a los ensayos
anteriores, particularmente en términos de detección confiable con niveles más
bajos de anticuerpos.13

Existen métodos automatizados disponibles comercialmente que detectan

inmunoglobulinas que interaccionan directamente con el dominio extracelular del
TSH-R de origen porcino, midiendo la actividad de los TRAb del paciente por
medio del desplazamiento del M22 marcado con rutenio, tal como ocurre, por
ejemplo, en el equipo Cobas elecsys ECLIA (Fig. 5).6

11
4.4.5. Desarrollo de un bioensayo que detecta anticuerpos estimulantes de la
tiroides

Lytton y col.14 en 2010, llevaron a cabo el desarrollo de un nuevo bioensayo que

detecta sólo TSI. Para esto, diseñaron una línea celular (Mc4-CHO-Luc) mediante
bioingeniería que expresara de forma constitutiva un receptor de TSH quimérico
(Mc4). El mismo, se construyó con un gen reportero de luciferasa dependiente de
cAMP, lo cual permitió la cuantificación de TSI, a partir de una reacción
quimioluminiscente acoplada a la activación del TSH-R. Los aminoácidos (aa) 262 a
368 del hTSH-R se reemplazaron con los residuos 262 a 334 del receptor de la
hormona luteinizante de rata. La expresión constitutiva del Mc4 fue controlada por el
promotor/potenciador SV40 y el intrón de la beta globulina. La transcripción del gen
de la luciferasa estuvo bajo el control del promotor de la glicoproteína alfa con
elementos de respuesta de cAMP repetidos en tándem (Fig. 6).

Con el objetivo de evaluar la sensibilidad analítica utilizando sueros de pacientes

que poseían resultados discordantes (TSI-positivo/ TRAb-negativo) o concordantes
(TSI-positivo/TRAb-positivo). Los sueros se diluyeron en suero normal y los niveles
de TSI se compararon con los niveles de la actividad de unión a TRAb,
observándose que los títulos de TSI fueron de 10 a 30 veces más altos que los
títulos de unión a TRAb, lo cual indicó una mayor sensibilidad del bioensayo TSI-
Mc4 en comparación con el ensayo de TRAb en pacientes con EG.14

Con respecto a los ensayos TRAb, se vio, que, con esta metodología, los niveles de
anticuerpos tenían valores similares en pacientes con EG, ya sea estando en
remisión o durante una recaída. En contraste, el bioensayo TSI-Mc4 fue capaz de
distinguir entre estos dos grupos; es decir, niveles elevados de anticuerpos estaban
asociados a recaída, y niveles bajos o límite, se encontraban relacionados con
pacientes en remisión o bajo terapia inmunosupresora. Además, hubo una diferencia
estadísticamente significativa entre los niveles de TSI en pacientes con EG no
tratados, en comparación con los niveles de pacientes sometidos a tratamiento.
Estos últimos se dividieron en 2 grupos distintos: a)un grupo con niveles de TSI
persistentemente altos asociados con manifestaciones extra-tiroideas; y b)un grupo
con TSI negativos o positivos bajos que representan a pacientes con EG sin
compromiso sistémico, que se han convertido en eutiroideos o que se encuentran en
remisión.14

Por otra parte, en comparación con los ensayos TRAb, los niveles de TSI se
asociaron más fuertemente con factores de riesgo individuales de EG, por ejemplo,
tabaquismo, gravedad de la tirotoxicosis y enfermedades autoinmunes asociadas.14

Aunque los mecanismos fisiopatogénicos de la OG no están dilucidados es probable

que los TSI circulantes se unan a las células diana de diversos órganos que
expresan TSH-R, lo que conduciría a la activación e hipertrofia del tejido. Por lo
tanto, los TSI podrían ser biomarcadores sensibles a la gravedad y/o la afectación
sistémica en la EG, posiblemente por contribuir al aumento en la liberación de
citoquinas y el infiltrado de células T autoagresivas desreguladas.14

En conclusión, este nuevo ensayo biológico TSI-Mc4 estandariza la medición de TSI

y podría mejorar sustancialmente el diagnóstico de enfermedades autoinmunes que
involucran autoanticuerpos estimulantes TSH-R como se cree que sucede en la
OG.14

12
4.4.6. Desarrollo del ensayo Immulite™ TSI

El ensayo Immulite™ (TSI) (Siemens Healthcare, Llanberis, Reino Unido) es un

inmunoensayo (IMA) quimioluminiscente automatizado. El constructo, es un TSH-R
quimera, que emplea un par de epítopes recombinantes en un formato puente, en
donde se encuentra el receptor de captura y el receptor de señal (Fig. 7). Este último
se construye a partir del dominio extracelular quimérico (aa 21–261) del TSH-R
donde se fusiona con fosfatasa alcalina secretora en una solución tampón.15

La verdadera innovación del ensayo es el receptor de captura que se caracteriza por

una estructura quimérica del TSH-R en la que la región de unión de los anticuerpos
bloqueantes (261-370 aa) se reemplaza por un segmento (261-329 aa) del receptor
de la hormona luteinizante de rata y del receptor de gonadotrofina coriónica
(receptor LH/hCG). Esto significa que el receptor quimérico de captura tiene
epítopes que son sólo reconocidos por TSI, impidiendo que se unan los anticuerpos
de tipo bloqueantes. Durante la incubación, los TSI se unirán a dicho receptor por
uno de sus brazos y al receptor de señal por el otro brazo. La magnitud de esta
interacción en forma de sándwich será directamente proporcional a la señal
luminiscente generada por la fosfatasa alcalina secretora (SEAP) y su sustrato (Fig.
7).16

El valor de corte, para el diagnóstico de EG, sugerido por el fabricante es de 0.55

UI/L. El ensayo se calibra utilizando el 2º Estándar Internacional (IS) de la OMS para
los anticuerpos estimulantes de la tiroides (NIBSC 08/204).16

En 2016, Tozzoli y col.15 llevaron a cabo un estudio con el objetivo de evaluar la

capacidad de esta nueva prueba (Immulite™) para identificar pacientes que padecen
EG, en comparación con dos métodos IMA para la medición de TRAb sin
discriminación funcional (Elecsys/Cobas - quimioluminiscencia y TRAK humano-
Radioinmunoensayo).

Los autores confirmaron el valor de corte propuesto por el fabricante (0,55 UI/L) para
Immulite™. La sensibilidad clínica del método TSI fue absoluta (100%), ligeramente
superior a las reportadas para IMA y BA, como también obtuvieron una especificidad
diagnóstica similar.15

La correlación entre los ensayos TSI y TRAb fue aceptable, aunque no del todo
buena. Esto se debe probablemente a las diferencias inherentes a la tecnología de
los ensayos, ya que los métodos actuales miden TRAb sin discriminación funcional,
mientras que Immulite™ mide solo TSI.15

El principal problema de los métodos que detectan TRAb son los resultados
positivos en pacientes con hipotiroidismo y tiroiditis crónica. Tal condición también se
presentó en pacientes con tiroiditis autoinmune. Estos pueden ser resultados falsos
positivos, es decir, presencia de TRAb bloqueantes que se unen al dominio N-
terminal del receptor quimérico o resultados positivos verdaderos debido a la
presencia de TSI en pacientes eutiroideos o hipotiroideos. En estudios previos, entre
el 10% y el 20% de los pacientes con tiroiditis autoinmune son TRAb bloqueantes
positivos con los métodos IMA y, a menudo, los TRAb bloqueantes y el TSI
coexisten en los mismos pacientes. Sin embargo, el nuevo método parece ser más
específico que los métodos IMA de segunda y tercera generación, ya que la fracción
de positividad es menor (3.6%).15

13
 En conclusión, el rendimiento diagnóstico del ensayo Immulite™ totalmente
automatizado en pacientes con enfermedad de Graves es al menos comparable al
de los ensayos TRAb actuales, con una tendencia hacia una mejor precisión.15

Como consecuencia, puede adoptarse en la práctica clínica para el diagnóstico

diferencial del hipertiroidismo, para detectar el hipertiroidismo neonatal transitorio y
para evaluar a los pacientes con OG.15

4.5. Validación analítica y clínica de los inmunoensayos disponibles para la

detección de TSI.

Luego de la presentación de las distintas técnicas de medición de TRAb se analizará su

desempeño de forma comparativa en el contexto clínico.

Kemble y col.17 realizaron una comparación de 3 métodos, en base a su rendimiento

analítico y clínico, utilizando 125 muestras de pacientes enviadas para pruebas de TSI.
Dichos métodos fueron el Bioensayo de Thyretain TSI (ThyretainTM), el ensayo de
anticuerpo del receptor de Roche TSH (TRAb) (Roche TRAb) y el inmunoensayo de
Siemens TSI (ImmuliteTM). Con estas técnicas también evaluaron la posible interferencia
causada por la gonadotrofina coriónica humana (hCG) en pacientes embarazadas.

El ensayo de Thyretain (Diagnostic Hybrids, Athens, OH) emplea células de ovario de

hámster chino transfectadas con TSH-R quimérico Mc4 y un gen de luciferasa que
contiene una región promotora sensible al cAMP. Cuando las TSI del paciente se unen al
TSH-R, se produce un aumento del cAMP intracelular, lo que incrementa la actividad de
la luciferasa. De esta manera, la señal detectada es directamente proporcional a la
cantidad de TSI en la muestra y los resultados se expresan en relación a la señal
detectada en muestras de individuos sanos, es decir, como índice de TSI.17

En contraste, el ensayo TRAb de Roche es un inmunoensayo competitivo que utiliza el

anticuerpo monoclonal M22 que se une a TSH-R con alta afinidad, pero no distingue
entre inmunoglobulinas bloqueantes y estimulantes.17

El ensayo TSI de Siemens (ImmuliteTM) utiliza un formato en el que el anticuerpo del

paciente, al interaccionar con el Mc4, forma un puente entre el receptor de captura y el
receptor marcado con una enzima, produciendo luminiscencia cuando se adiciona el
sustrato.17

En este estudio evaluaron las características de rendimiento de estos tres métodos

utilizando material de control de calidad (CC) y muestras de pacientes enviadas para la
medición de TSI por Thyretain.17

Los valores de corte de decisión clínica para la EG de los ensayos de Thyretain, Roche
TRAb e ImmuliteTM fueron ≤1,3 (sin unidades), 1,75 UI/L y 0,55 UI/L, respectivamente.17

En base a los resultados, Kemble y col. observaron una concordancia del 100% entre los
tres métodos para 26 pacientes con un valor de Thyretain > 3,8. Además, observaron
que 21 de estas muestras también tenían concentraciones de TSH no detectables junto
con valores de tiroxina libre (T4L) por encima del intervalo de referencia, lo que indicó
que se trataba de pacientes de diagnóstico o que se encontraban después del inicio del
tratamiento. Las cinco muestras restantes se obtuvieron de pacientes con diagnóstico
establecido de enfermedad de Graves que estaban recibiendo tratamiento con
metimazol.17

14
De los 23 sueros con valores de Thyretain TSI ≤1,3 (corte de diagnóstico) que también
se analizaron con el ensayo Roche TRAb, 20 (86%) concordaron con resultados
menores al punto de corte para ambos métodos, mientras que 3 (13%) muestras fueron
discordantes con los resultados (>1,75 UI/L). Dos de las tres muestras discordantes
procedían de pacientes con diagnóstico de EG que estaban recibiendo tratamiento con
metimazol. La tercera fue de un paciente diagnosticado de tiroiditis no autoinmune.17

De las 57 muestras con resultados de Thyretain TSI ≤1,3 que también se analizaron con
el ensayo Siemens TSI, 48 (84%) concordaron con resultados menores al límite de
Siemens TSI (≤0,55 UI/L), mientras que 9 (15%) muestras fueron discordantes con
resultados >0,55 UI/L. Dichos resultados discordantes se obtuvieron de pacientes con
diagnóstico previo de EG que estaban siendo tratados con metimazol o propiltiouracilo.
Es importante destacar que 6 de estas muestras también se analizaron con el ensayo
Roche TRAb, y solo se demostró que 3 de ellas fueron TSI positivo.17

En conjunto, estos resultados indicaron que el ensayo TSI de Siemens (ImmuliteTM)

exhibe mayor sensibilidad (15%) que los ensayos TRAb de Thyretain y Roche para
pacientes que reciben tratamiento para la enfermedad de Graves y puede brindar
ventajas en el monitoreo de la respuesta al tratamiento y la recaída de la enfermedad.17

De las 38 muestras restantes con valores de Thyretain entre 1,4 y 3,8, 27 generaron
resultados concordantes, mientras que 11 generaron resultados discordantes. La historia
clínica no estaba disponible para muchas de las muestras; sin embargo, en la mayoría de
los casos, la discordancia probablemente podría atribuirse a la presencia de un
anticuerpo de título bajo que generó una señal justo por encima o por debajo de los
límites de diagnóstico para cada ensayo.17

Por otra parte, dado que el ensayo Roche TRAb utiliza un formato de inmunoensayo
competitivo y puede ser susceptible a resultados falsos positivos causados por la
detección de anticuerpos inhibidores anti TSH-R, los investigadores examinaron un grupo
de muestras de pacientes con resultados positivos para Roche TRAb y resultados
negativos con Thyretain y Siemens TSI, donde observaron que solo una de las 81
muestras, para las cuales tenían información clínica, fue positiva.17

Cabe aclarar que, según los resultados obtenidos, los métodos de detección de
autoanticuerpos anti TSH-R se usan con mayor frecuencia de manera semicuantitativa
para determinar si las concentraciones de autoanticuerpos están por encima o por debajo
del límite clínico y si el tratamiento a largo plazo produce cambios bruscos en la
concentración de autoanticuerpos. También es importante tener en cuenta que la
gravedad del hipertiroidismo, como lo indican los síntomas del paciente, no parece estar
correlacionada con la concentración de anti TSH-R obtenida por los ensayos de
Thyretain, Roche TRAb o Siemens TSI. Por ejemplo, un resultado de TSI más alto en un
paciente no reflejó necesariamente un nivel mayor de estimulación de TSH-R en relación
con un paciente diferente con un resultado de TSI más bajo. Los resultados del
seguimiento pueden compararse con los resultados anteriores generados para el mismo
paciente con el mismo método de análisis, pero es engañoso utilizar los resultados
generados para dos pacientes diferentes para hacer afirmaciones sobre la gravedad
relativa de la enfermedad. 17

Asimismo, como los ensayos no están armonizados, tampoco es apropiado comparar los
resultados para el mismo paciente generado en diferentes métodos de análisis. En su
lugar, los resultados deben interpretarse de forma independiente en el contexto del corte
clínico específico del ensayo.17

15
Por último, los investigadores también evaluaron una de las muestras que generó
resultados discrepantes entre los 3 ensayos y que se recolectó de una paciente
embarazada con una concentración sérica de hCG de 31000 UI/L. Evaluaron si la hCG
podría ser una causa de resultados falsos positivos. Su conclusión fue que ninguno de
los métodos en este estudio demostró una reactividad cruzada apreciable con la hCG.
Por lo tanto, los 3 ensayos son apropiados para la medición de los TSI en mujeres
embarazadas.17

En resumen, Kemble y col demostraron que los 3 métodos se desempeñaron igualmente

bien en pacientes con EG manifiesta y no tratada. Además, los 3 métodos comparados
en este estudio fueron aceptables para la cuantificación de anticuerpos TSH-R en
pacientes embarazadas. Sin embargo, el ensayo biológico de Thyretain es más
laborioso, requiere equipo y capacitación especial, mientras que los métodos más
automatizados, incluidos Roche TRAb y Siemens TSI, son igualmente sensibles y
específicos.17

Una limitación logística significativa del ensayo Roche TRAb es el reactivo y la

estabilidad del control de calidad de tres días, lo que requiere un alto volumen de
muestras analizadas por día (aproximadamente 200 pruebas en tres días) y una
calibración diaria, para que el ensayo sea amortizable. Por otro lado, el ensayo TSI de
Siemens proporciona la ventaja del control de calidad extendido y la estabilidad del
reactivo, que es atractivo para laboratorios con un volumen de muestras más bajo.
Además, estos resultados indican que el ensayo TSI de Siemens puede proporcionar una
ventaja analítica para un subconjunto de pacientes, como los que reciben tratamiento con
medicamentos antitiroideos o aquellos con anticuerpos bloqueadores de la TSH-R.17

16
5. CONCLUSIONES
En los últimos años se publicaron numerosos trabajos que describen las diferentes
metodologías desarrolladas para la detección de los anticuerpos antitiroideos. En lo que
respecta a los TRAb, el avance de la tecnología, el entendimiento de la estructura molecular
del receptor y la interacción con sus ligandos, permitieron no sólo mejorar la sensibilidad y
especificidad analítica, sino disminuir los tiempos de análisis.

En esta revisión, se describieron los avances logrados desde el primer ensayo en fase
líquida, en los cuales el TSH-R se obtenía a partir de membranas tiroideas humanas, hasta
aquellos surgidos a partir de la obtención del hTSH-R. El desarrollo de los ensayos de
segunda generación o fase sólida, permitió aumentar la sensibilidad respecto a los de fase
líquida o primera generación, sin perder la especificidad. Por otro lado, los métodos de
tercera generación, que utilizan M22 como trazador, fueron capaces de detectar
concentraciones considerablemente más bajas de autoanticuerpos que aquellos que utilizan
bTSH.

Otra característica observada por los autores, es que la detección no fue afectada por otros
autoanticuerpos ni por hormonas circulantes, por lo que, en líneas generales, el desarrollo
de los anticuerpos monoclonales fue un paso en la optimización de las técnicas de
detección de TRAb, ya que son de fácil manipulación, pudiendo reemplazar el uso de bTSH
como trazador.

En cuanto al bioensayo TSI-Mc4 que detecta producción de cAMP, los trabajos demostraron
que su capacidad para distinguir entre dos grupos de pacientes con EG: aquellos que se
encontraban en recaída con niveles elevados de anticuerpos estimulantes y pacientes que
se encontraban en remisión o bajo tratamiento que tenían títulos bajos o en el límite.

El rendimiento diagnóstico del ensayo Immulite™ totalmente automatizado en pacientes con

EG resultó comparable a los ensayos TRAb actuales, con una tendencia hacia una mejor
precisión, con lo cual podría aplicarse en la práctica clínica para el diagnóstico diferencial
del hipertiroidismo, así como en la evaluación del hipertiroidismo neonatal transitorio y la
OG. Además, exhibió mayor sensibilidad que los ensayos TRAb de Thyretain y Roche para
pacientes en tratamiento de la EG, lo cual podría generar ventajas en el monitoreo de la
respuesta al tratamiento y la recaída de la enfermedad.

17
6. RESUMEN
Las ETA se encuentran asociadas a la presencia de autoanticuerpos contra varios
antígenos tiroideos, como la tiroperoxidasa, tiroglobulina y el receptor TSH-R. Los TRAb son
anticuerpos que pueden simular la acción de TSH y causar hipertiroidismo, como se
observa en la enfermedad de Graves.

La medición de estos anticuerpos es una herramienta importante para el diagnóstico

etiológico del hipertiroidismo, para la evaluación del riesgo de recidiva luego de la
suspensión del tratamiento con drogas antitiroideas y también es fundamental su dosaje en
el embarazo para evaluar el riesgo de hipertiroidismo fetal y neonatal inducido por la
transferencia placentaria de los mismos.

Esta revisión propone describir estos avances de detección, así como también describir la
sensibilidad y eficiencia diagnóstica de una nueva metodología para la detección de los
anticuerpos estimulantes anti-receptor de TSH (TSI).

Dentro de los avances de los ensayos TRAb se encuentran ensayos en fase líquida
(primera generación), ensayos en fase sólida (segunda generación) y los ensayos con
anticuerpos monoclonales (tercera generación) donde estos últimos se pueden dividir en
dos categorías, ensayos que dependen de su capacidad para competir por la unión de TSH
al TSH-R y ensayos que miden la producción de cAMP en respuesta a la exposición del
TSH-R a los TRAb en la muestra.

La incorporación de los anticuerpos monoclonales supuso una mejora sustancial en la

sensibilidad analítica y diagnóstica, y permitió distinguir entre pacientes con EG en recaída y
en remisión.

18
7. BIBLIOGRAFÍA

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19
8. ANEXO
FIGURA 1. Principio de los bioensayos de anticuerpos anti TSH-R

FIGURA 2: Efecto de las inmunoglobulinas de pacientes con EG, enfermedad de

Hashimoto, cáncer de tiroides y controles normales, en la unión de la TSH a las
membranas tiroideas humanas.

20
FIGURA 3: Efectos de los incrementos del suero e inmunoglobulinas en la unión de
TSH marcada al receptor solubilizado porcino. ○ Pool de suero normal ● Pool normal
de inmunoglobulina concentrada con sulfato de amonio ■ Precipitación con PEG ∆
Concentrado de inmunoglobulinas séricas de pacientes con EG precipitadas con
sulfato de amonio.

FIGURA 4A: Efectos del estándar internacional 90/672 en la inhibición de la unión al

TSH-R en diferentes ensayos: M22-Biotina, TSH-Biotina y TSH-I125 con
polietilenglicol (PEG)

21
FIGURA 4B: Comparación entre la bTSH y el M-22 en el ensayo de inhibición en
sueros de pacientes con EG, con y sin tratamiento.

FIGURA 5: Principio del inmunoensayo de unión para anticuerpos anti TSH-R

22
FIGURA 6: Diagrama esquemático del TSH-R quimérico y el gen reportero de la
luciferasa

FIGURA 7: Representación esquemática del ensayo TSI. A) Estructura lineal del

receptor de captura y del receptor señal. B) Principio del ensayo

23