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FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

CARRERA DE MEDICINA HUMANA

“EXTRACCIÓN DE ADN, PCR Y


ELECTROFORESIS”

Miyauchi Contreras, Camila Suan; Morillo Alfaro, Diego Marcelo; Narciso Boza,
Linda Milagros; Ortiz Fermín, Xiomara Janelle.

Docente
Velez Azañero, Armando Jesús Edilberto.

2019
INTRODUCCIÓN Commented [1]: Chicos, quiero aprovechar que tengo
el correo del profesor e intentar enviar el informe para
ver si lo corrige, ¿les parece bien?
El desarrollo de la vida es dependiente de la habilidad de las células para almacenar,
Commented [2]: perfectooo, pero que no se moleste
reparar y traducir la información de los genes (1), ya que estos contienen las xd
características fisiológicas y bioquímicas de todo ser vivo (2). La sustancia que Commented [3]: el miercoles nos dijo que no iba a
compone estos genes se denomina ADN (ácido desoxirribonucleico), esta es una corregir por correo porque sería como darnos
favoritismo y facil le hacian problemas :(
estructura química cuyos elementos fundamentales, los nucleótidos, se organizan
Commented [4]: chicoos quien tiene la caratula
linealmente, originando grandes secuencias de información (2). Asimismo, dichas
subunidades están constituidas por tres componentes: una base nitrogenada, un
grupo fosfato y un azúcar desoxirribosa. Las bases nitrogenadas pueden ser purinas
(adenina y guanina) o pirimidinas (citosina y timina) (3). El establecimiento de esta
estructura se remonta al año 1953 (4), cuando Francis Crick y James Watson
estudiaron la difracción del ADN en rayos X de Rosalind Franklin, cuyo aporte fue
inmenso para el entendimiento de la estructura de doble hélice (3).

La extracción del ADN es, básicamente, la separación de las moléculas de ácido


desoxirribonucleico del resto de material genético, para así poder ser efectivamente
analizado (5). Existe una gran variedad de técnicas para la extracción, las cuales
comparten los mismos objetivos: separar la célula que contiene el ADN del sustrato
en el cual se halla incrustado, luego, lisar la célula para liberar el ADN y otro material
celular, y finalmente, separar el ADN de estos componentes celulares y de cualquier
otro inhibidor que pueda estar presente en la muestra (6). Del mismo modo, la mayoría
de técnicas normalmente siguen los siguientes pasos: apertura de la célula,
eliminación de las proteínas, deshidratación de la muestra mediante uso de alcohol,
centrífuga, repetir los dos últimos pasos, y confirmar la presencia de ADN mediante
electroforesis (7). Una de las técnicas es la de la reacción de la cadena de la
polimerasa, también conocida como PCR. Ésta es una técnica científica que fue
inventada por el bioquímico Kary Mullis en 1985 (8), la cual permite que un pequeño
segmento de ADN cualquiera se multiplique millones de veces y así sea fácil de
detectar (9). El principio de la PCR requiere de un proceso cíclico de tres pasos:
separación de las hélices de ADN a través de calor, unión de los primers a las hélices,
y extensión de primers (método para identificar donde se inicia la transcripción) (10)
Hay que recordar que las ADN polimerasas son enzimas que intervienen en el
proceso de replicación del ADN. Llevan a cabo la síntesis de la nueva cadena de ADN
emparejando los nucleótidos con los nucleótidos complementarios correspondientes
del ADN molde (11).

Hoy en día, la extracción de ADN sirve como punto de inicio en análisis genéticos,
incluso con pequeñas partes de ADN (12),el estudio de la variación genética entre
individuos, poblaciones y especies sirve para explicar patrones y procesos ecológico-
evolutivos abordados por marcadores moleculares (técnicas de PCR y
secuenciación)(13).Los avances generados a la medicina se dieron en
nosotros(Práctica integral-prevenir/tratar determinadas enfermedades -diabetes.
“horóscopos genéticos”), en la medicina forense, saber más de los neandertales (ADN
extraído de fósiles), probar identidad de personaje (Tutankamón), retrato robot
genético (genes determinan características faciales - tecnología actual), prueba de
paternidad (14). En los últimos avances en la medicina se encuentra un caso particular
de un paciente que sufre de síndrome de Hunter, recibiendo medicamento vía
intravenosa, este contiene miles de millones de copias de un gen corrector unido a
herramienta (Zinc Finger Nucleases-tijera molecular) capaz de modificar su ADN (15).
Las nuevas tecnologías utilizadas en laboratorios fueron de gran aporte ya que acortó
el tiempo que se requerían las anteriores como la técnica de PCR que también pudo
ser optimizada por termocicladores y un equipo de electroforesis dando una mayor
precisión y exactitud a los resultados y poder analizar más muestras al mismo tiempo
(16). La electroforesis es útil para realizar una comparación entre las muestras de un
paciente enfermo y uno sano, para así poder identificar los ácidos nucleicos que
causan la infección u obtener un fragmento de ADN y este al ser localizado por el gel
sirve para futuros análisis(17). La técnica de PCR se aplica para buscar mutaciones
en enfermedades hereditarias e identificar mutaciones en determinados genes, como
en el Alzheimer (18) (19).

El objetivo de la práctica fue desarrollar una comprensión básica y saber la


aplicabilidad de la extracción de ADN; PCR y electroforesis; además de reflexionar
sobre la simpleza de la composición del ADN con sencillas técnicas y en adquirir
práctica con estos procesos los cuales son fundamentales para muchas de las
aplicaciones de la biología molecular.

MATERIALES Y MÉTODOS

EXPERIENCIA 1: EXTRACCIÓN DE ADN

Para su realización se utilizó el Kit de extracción Purelink genomic se comenzó con la


obtención de una muestra de sangre(20µl) puesta en un tubo de microcentrífuga que
fue llevada a un proceso de lisis. Para esto primero se le añadió 20 µl de proteinasa
k que sirvió para la degradación de las proteínas en fracciones, añadiendo luego la
RNAsa, que sirvió para degradar el RNA. Teniendo este primer paso cumplido, se
sometió al vórtex por unos 15 segundos, que sirvieron para homogeneizar la muestra,
para luego incubar a temperatura ambiente por 2 minutos. Se añadió 150 µl de buffer
lisis, este buffer fue utilizado para la ruptura de membrana celular y liberación de los
componentes de la célula. Pasó a una nueva homogeneización por 15 segundos, pero
esta vez la incubación fue de 10 min a 55°C. Se le añadió 100µl de etanol que ayudó
en la eliminación de las moléculas de agua y logró la precipitación del ácido nucleico,
para que así la sílice, encontrada en la columna de extracción, pueda atraparlo.
Asimismo, se incubó la lisis a 5 min en temperatura ambiente.

Se continuó con un proceso de purificación, donde la lisis anteriormente obtenida


fue colocada en la columna de extracción, que posteriormente fue centrifugada a 8500
rpm por 1 minuto; luego se descartó el filtrado y se colocó la columna en un tubo de
lavado nuevo. Se le añadió 200µl de buffer de lavado, que se utilizó para eliminar los
elementos más pequeños encontrados aún en el ADN, procediendo a centrifugar, esta
vez a velocidad máxima, y eliminar el filtrado nuevamente. Luego a esto se le fue
añadido un buffer de elución a la columna que, básicamente, cambia la carga del filtro,
para que así el ADN caiga dentro del tubo de lavado, incubandolo por última vez a
temperatura ambiente. Por último, fue centrifugada a máxima velocidad durante 1 min.

EXPERIENCIA 2: AMPLIFICACIÓN DE ADN

Para esta práctica se tuvo la mezcla de PCR ya realizada, esta fue de 25µl, y estuvo
compuesta por 12µl de agua ,7,5 µl de tampón, 1µl de MgCl 2, 1µl de Primers R, 1µl
de Primers F, 1µl de dNTPS, 0,5µl de Taq y 1µl de ADN. Se procedió a una
centrifugación para una óptima homogeneización de componentes; luego los tubos
de microcentrífuga, con la solución del mix de PCR, fueron colocados en un
termociclador, el cual estaba ya programado con las condiciones de amplificación.
Pasando etapas de Desnaturalización, donde estuvo a 94°C por 1 min; Hibridación,
donde estuvo a 52°C por 1 min; Elongación, donde estuvo a 72°C por 30 seg. Estas
etapas fueron repetidas por 29 ciclos más.

EXPERIENCIA 3- LECTURA DEL ADN

Se comenzó preparando gel de agarosa colocándolo al microondas por 1 minuto para


que se licue y posteriormente dejarlo polimerizar en el soporte cubriendo el peine
ligeramente para formar los pocillos; mientras esto ocurría, se extrajo 5µl de cada una
de las nueve muestras de ADN y se mezcló con 3µl de buffer de carga 1 y 1µl de
buffer de carga 2. Una vez hecho esto se procedió a sacar el gel polimerizado y
sumergirlo en el buffer TAE en el polo negativo de la cámara de electroforesis para
que este mire hacia el lado positivo; una vez ahí, se comenzaron a cargar los pocillos
con las mezclas cuidadosamente evitando contaminar el pocillo contiguo. Terminado
esto, se conectaron los cables de los electrodos a la fuente de poder y se seleccionó
el voltaje iniciándose así el proceso de electroforesis. Transcurrido el tiempo (20
minutos) se procedió a desmontar el equipo removiendo el gel de agarosa y
desplazándose al transiluminador para el revelado y se observaron los resultados

RESULTADOS

Mediante el proceso de cuantificación, se evaluaron las muestras de sangre de 12 Commented [5]: se escribe "doce" o así esta bien?
individuos de sexo variado con edades correspondientes a un rango de 17 años a 19 Commented [6]: mejor pon doce jej
años, donde se les extrajo las muestras a cinco hombres y siete mujeres.(Tabla1),
arrojando así los siguientes resultados:
El menor valor presentado fue de 13 µg/ml, y el mayor valor de la concentración de
ADN fue de 51 µg/ml resultando así una variación en las diferentes concentraciones Commented [7]: Por qué el menor fue de 13 y el
mayor fue de 51?
de las muestras de ADN de los diferentes estudiantes.
Commented [8]: este es otro parrafo?

El proceso de extracción de ADN fue hallado gracias al Kit Purelink Genomic debido
a la mayoría de beneficios para las muestras, sin embargo, se pudieron haber
originado unos porcentajes de error debido a que en un punto de la experiencia se
dió una mala manipulación de parte de los estudiantes al momento de realizar el
depósito ,de la muestra final del PCR, en los pocillos correspondientes para la
electroforesis ya que al ser colocadas varias muestras se rebalsaron lo que nos daría
como resultado un incremento en el porcentaje de error habitual.

La mayoría de muestras de ADN fueron íntegras ya que la banda estrecha terminaron


siendo ubicadas cerca al pocillo siendo este el lugar de origen donde fueron colocadas
las muestras.

Luego del proceso de electroforesis donde se hallaron las expresiones genómicas en


las diversas bandas electroforéticas del gen sox 2019 I, se observan las bandas Commented [9]: el profe dijo que teniamos que hablar
de esto
anchas y no tan nítidas pero aun pudiéndose diferenciar las intensidades de color y
que está ubicado a 220 pares de bases(pb) una incidencia dada en todas las muestras Commented [10]: eso lo va a poner camilaa

(figura 1). Commented [11]: xiomaraa entonces ya no agrego el


resultado sino de frente hago la discusion
Commented [12]: solo discusión,porque ya se habla
Cabe resaltar que el resultado de este proceso podría no ser del todo correcto debido de eso en los resultados
a los errores por diversos factores ya sea por una contaminación con los agentes Commented [13]: no es solo la intensidad? no tienen
trabajados, una mala manipulación que ya fue mencionada o incluso el mismo kit y el color xd
porcentaje de error que este tiene. Sumándole a esta lista un factor de tiempo al dejar
las muestras unos 20 min en la cámara dejándolas a un rango de voltios de 75 voltios
a 120 voltios, aumentando así en gran proporción el voltaje ya la temperatura a la que
estas fueron expuestas antes de la electroforesis

Tabla 1: Concentración de ADN en los individuos de distinta edad.


Nombre del Sexo Edad (años) Concentración de
sujeto ADN (µg/ml)

Camila Miyauchi Femenino 17 37,19

Diego Morillo Masculino 17 39,92


Michelle Masculino 18 41,27
Moscoso

Fátima Gómez Femenino 17 42,5

Fabrizzio Curay Masculino 17 27,2

Xiomara Femenino 17 13,4


Gutierrez

Jefferson Vera Masculino 18 28,5

Lisa Luyo Femenino 19 44,0

Jabell Gonzalez Masculino 17 39,3

Emanuel Masculino 19 27,3


Aragón

Fiorella Castillo Femenino 18 51,24

Valeria Femenino 17 15,5

Figura 1: Comparación de expresión de bandas a partir del Gen Sox 2019.

DISCUSIÓN:
Según Cárdenaz (2016) La cantidad de glóbulos blancos son un factor que ocasionan
la variación de las distintas concentraciones de ADN encontradas en las muestras
realizadas, ya que en las células nucleares se encuentra el ADN, en este caso tiene
una relación como con la de los linfocitos encontrados en la muestra de sangre de
cada estudiante.

Cabe resaltar el rol que cumple la extracción del ADN. Kennedy et al. (2014), destaca
que cuando una técnica relativa de cuantificación es usada, los resultados se verán
influenciados por los efectos de la extracción. Por otro lado, Guo et al., postula que la
cantidad de ADN nuclear varía dependiendo del método de extracción utilizado.
Según un estudio acerca de la comparación entre 6 kits comerciales de Becker, et al.
(2016), se suelen preferir los kits de ADN comerciales ya que ofrecen superior
reproductibilidad, control de calidad y potencial para automatización. En el caso de
Purelink Genomic, la extracción se dio mayormente sin errores de reproductibilidad,
lo cual podría indicar que se trata de una marca comercial eficiente. El mínimo
porcentaje de error puede ser atribuido a errores en la manipulación y/o medición de
las muestras.

Pero también esta variación puede ser ocasionada por el manejo de las muestras al
ser traspasadas de un recipiente a otro o a la susceptibilidad de los diversos factores
de contaminación en la que se encuentran, por lo tanto la diferencia de sexo no influye
en las concentraciones de las muestras

Un aspecto muy relevante es la comprobación, mediante la electroforesis en gel de


agarosa, de la integridad del ADN, debido a que un ADN fragmentado dificulta la
amplificación por PCR de muestras con alto peso molecular, perjudicando la
reproducibilidad de las técnicas. Según Alejos Velázquez (2016) cuando el ADN está
íntegro, la banda estrecha se ubica cerca al pozo en que se colocó la mezcla de ADN,
mientras que, si está fragmentado, la banda será de más de un cm de ancho.

En cuanto a la incidencia del gen Sox 1, Guth et al. (2008), explica que esta familia
de proteínas es caracterizada por actuar como importantes reguladores
transcripcionales de varios procesos de desarrollo. Poseen un rol indispensable en la
embriogénesis, neurogénesis y en la formación de órganos y tejidos. Asimismo, Pevni
et al. (1998), destaca que el gen Sox 1 aparece en la etapa embrionaria de inducción
neural, de la cual depende la formación de la placa neural. Según datos de NCBI,
estos genes pertenecen exclusivamente a los Homo Sapiens y son altamente
conservados a través de su evolución, lo cual conduciría a la deducción de que se
trata de un gen que la mayoría de humanos poseen; es por ello que los resultados
arrojaron una coincidencia en todas las muestras.

Es importante mencionar que el tiempo en el que se dejaron las muestras en la


cámara fue de 20 minutos, tiempo no adecuado para la electroforesis, dependiendo
del voltaje usado, en este caso fue de 75 a 120 voltios(V). Un aumento en el voltaje
aumenta la velocidad de migración; sin embargo, los voltajes elevados generan una
cantidad excesiva de calor. Según Juan Luis Zarza (2014) esto altera la viscosidad y
la conductividad eléctrica del medio electroforético, afectando también a la tasa de
migración. Asimismo, los cambios de temperatura pueden causar un cambio en la
conformación de las proteínas, lo que reduce la velocidad de migración y la eficiencia
de la separación electroforética lo que podría indicar la mala visualización que se tiene
de las bandas.

CONCLUSIONES: Commented [14]: ya chicos hora de juntar nuestras


neuronas
Commented [15]: hay que hacen una a dos
conclusiones de cada cosa creo yo: extraccion, pcr y
La cuantificación de la concentración del ADN puede verse alterada por una electroforesis
variedad de factores; entre ellos se hallan la cantidad de glóbulos blancos presentes Commented [16]: ahora las acomodo xD
en cada estudiante que genera una variación de concentraciones, el método de
extracción es muy importante debido a la elección de kit de extracción ya que cada
uno de los diferentes kits tienen diferentes porcentajes de error ,llegando a preferir
por encima a los kits comerciales, como el utilizado en nuestra práctica.

En el PCR, el problema surgió en la última parte, donde se pusieron las muestras


dadas por esta práctica en los pocillos para realizar posteriormente la electroforesis,
teniendo en cuenta de que a pesar de ser el último momento , debemos de
manipular las muestras con cuidado de inicio a fin de la práctica ya que cualquier
error en algún paso genera que no se logren los resultados esperados.

La mayoría de bandas se hallaron integras en la electroforesis, ya que en esta se


pudo identificar las regiones fragmentadas, lo que permitió una amplificación
esperada del PCR.

En la electroforesis las muestras arrojaron cierta cantidad de pares de bases que


coincidieron con el gen Sox 1, ya que este gen pertenece al genoma del Homo
sapiens.

La tasa de migración se vio aumentada debido a un aumento drástico de voltaje y al


tiempo en el que fueron expuestas las muestras.La utilización de gel de agarosa
para la separación de ADN ha demostrado ser una de las técnicas más útiles y
versátiles en la investigación de ciencias biológicas.

El objetivo principal sí se cumplió, ya que además de poder desarrollar una


comprensión básica acerca de estos procesos, se ganó práctica el cual servirá para
futuros experimentos.

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