1.10306.

0500

Proteínas (según el método de Bradford)

Art. 1.10306.0500 Proteínas (según el método de Bradford)
Solución reactiva para aprox. 200 determinaciones

Consejos de seguridad
La solución reactiva contiene ácido fosfórico y metanol. Tener en cuenta las correspondientes reglas
de precaución para la manipulación de estos productos químicos. En el laboratorio llevar siempre
gafas protectoras y guantes apropiados. En caso de salpicaduras sobre la piel o indumentaria, lavar
inmediatamente con agua abundante.

Intervalos de medida
Intervalo de medida 1: 0,1 - 1,4 mg/ml
Intervalo de medida 2: 0,01 - 0,1 mg/ml (micro)

Método de determinación
El método de determinación del contenido de proteínas totales se basa en la propiedad del colorante
Coomassie® azul brillante G-250 de unirse a proteínas, desplazándose su máximo de absorción de 465 nm a
595 nm1, 8. La absorción de la solución de la muestra a 595 nm sirve como magnitud de medición para la
concentración de proteínas. El colorante posee afinidad con los aminoácidos básicos y aromáticos. Se estu-
diaron intensamente la dependencia respecto al tipo de proteínas y las posibles interacciones con diferentes
reactivos (véase también apartado “interferencias”)1-5.

Contenido del envase, almacenamiento y estabilidad

Un frasco contiene 500 ml de la solución reactiva lista para el uso. Es suficiente según el protocolo indicado
para aprox. 200 determinaciones de proteínas.
Almacenando en el refrigerador entre + 2 y + 8 °C la solución se puede utilizar como mínimo durante 2 años.
A temperatura ambiente la utilizabilidad mínima es de aprox. 12 meses.

Preparación de las muestras

Las soluciones de las muestras turbias se centrifugan o se filtran. En el caso de elevadas concentracio-
nes de proteínas debe diluirse la solución de la muestra de tal manera que ella se encuentre dentro de uno
de los dos intervalos de medida.

Cantidad estimada de proteína en la muestra

(mg/ml)
0,01 - 0,1 Intervalo de medida 2
0,1 - 1,4 Intervalo de medida 1
> 1,4 Dilución

Preparación de las soluciones patrón

La calibración puede realizarse en principio con cualquier preparado de proteínas homogéneo y lo más puro
posible. Como sustancia de referencia se utiliza frecuentemente albúmina de suero bovino (BSA), a pesar de
que esta proteína no es recomendable para el calibrado del ensayo de Bradford. La albúmina de suero bovino,
en comparación con la mayoría de las otras proteínas, conduce a un intensidad de color aproximadamente el
doble en el ensayo estándar10. Con ello se infravalora sistemáticamente el verdadero contenido de proteínas
en las muestras. Más adecuado, pero menos difundido, es el empleo de inmunoglobulina G bovina para el
calibrado.
Para preparar las soluciones patrón se disuelven en un matraz aforado de la forma más exacta posible
100 mg de albúmina de suero bovino (art. 112018) en 10 ml de agua bidestilada. Esta solución primaria I
(10 mg/ml) puede continuar diluyéndose por etapas:

Intervalo de medida 1 (0,1 - 1,4 mg/ml)

Soluciones patrón (mg/ml) 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4
Solución primaria de proteínas I (ml) 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20 1,40
(10 mg/ml)
Agua bidestilada (ml) 9,80 9,60 9,40 9,20 9,00 8,80 8,60

Intervalo de medida 2 (0,01 - 0,1 mg/ml)

Soluciones patrón (mg/ml) 0,01 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1
Solución primaria de proteínas II (ml) 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
(0,1 mg/ml)
Agua bidestilada (ml) 0,9 0,8 0,6 0,4 0,2 -

La solución primaria de proteínas II: en un matraz aforado de 10 ml se completa 1,0 ml de la solución patrón
1,0 mg/ml con agua bidestilada hasta completar 10 ml.

Técnica de las determinaciones

La mejor manera de realizar las mediciones es en cubetas de uso único de plástico o en cubetas de vidrio
(espesor de capa 1 cm) a 595 nm. En ningún caso deberían utilizarse cubetas de cuarzo, porque el colorante
se adhiere extremadamente a esta superficie. La compensación del cero del fotómetro puede realizarse fren-
te a aire o a agua.
Esquema de pipeteo para el test en cubetas Muestra o resp. Valor en blanco
Intervalo de medida 1 (0,1 - 1,4 mg/ml) solución patrón de los reactivos
Solución de la muestra / solución patrón 0,05 ml -
Agua bidestilada (o resp. tampón de muestras) - 0,05 ml
Solución reactiva de Bradford 2,5 ml 2,5 ml
Mezclar bien y tras 2 minutos medir las extinciones a 595 nm.

Esquema de pipeteo para el test en cubetas Muestra o resp. Valor en blanco

Intervalo de medida 2 (0,01 - 0,1 mg/ml) solución patrón de los reactivos
Solución de la muestra / solución patrón 0,25 ml -
Agua bidestilada (o resp. tampón de muestras) - 0,25 ml
Solución reactiva de Bradford 2,5 ml 2,5 ml
Mezclar bien y tras 2 minutos medir las extinciones a 595 nm.

El test se puede realizar también sobre placas de microtítulo6. Para ellos se modifican los volúmenes emplea-
dos y el intervalo de medida. La precisión y la reproducibilidad al emplear placas de microtítulo, debido al error
de pipeteo relativamente mayor, de acuerdo con experiencia son peores que cuando se emplea el test en
cubetas usual.

Esquema de pipeteo para placas Muestra o resp. Valor en blanco

de microtítulo solución patrón de los reactivos
Intervalo de medida 1 (0,1 - 1,4 mg/ml)
Solución de la muestra / solución patrón 10 µl -
Agua bidestilada (o resp. tampón de muestras) - 10 µl
Solución reactiva de Bradford 200 µl 200 µl
Mezclar bien y tras 2 minutos medir las extinciones a 595 nm.

Evaluación
Para establecer una curva de calibrado se substrae la extinción del valor en blanco de los reactivos de las
extinciones del patrón. La diferencia de extinción E se aplica frente a la correspondiente concentración
patrón de proteínas.
ESolución patrón = ESolución patrón - EValor en blanco o resp. EMuestra = EMuestra - EValor en blanco
La curva de calibrado raramente transcurre linealmente a lo largo de todo el intervalo de concentración. Por
lo tanto el contenido de proteínas de muestras desconocidas se determina gráficamente o por cálculo median-
te regresión lineal.
Observación: Si se diluyó la muestra antes de la medición, el resultado debe multiplicarse todavía por el
correspondiente factor de dilución f.

Interferencias
El ensayo de proteínas de Bradford es interferido por la presencia de diferentes reactivos, que pueden realizar
interacciones con el colorante o las proteínas8. De la siguiente tabla se puede leer a partir de qué concentra-
ciones de diferentes reactivos hay que contar con interferencias en el test. En el caso de combinación de
varios de estos reactivos en una solución pueden presentarse interacciones adicionales, que podrían influir
igualmente en forma negativa en el test. Se recomienda por lo tanto en caso de duda preparar todas las
soluciones patrón y valores en blanco con las mismas soluciones tampón que es utilizaron también en las
soluciones de las muestras.
Tabla 1: Concentraciones de diferentes reactivos que de acuerdo con experiencia producen interferencias en
el test:
Sales inorgánicase Disolventes orgánicos
Amonio sulfato > 1M Acetona -*
KCl > 1M Etanol -*
MgCl2 > 1M Metanol -*
Na-azida > 0,5 % Fenol > 5%
NaCl > 5M
Sustancias tampón
NaSCN > 3M
Acetata > 0,5 M
Detergentes Ácido bórico -*
Brij
®
> 0,5 % Barbital -*
Desoxycolato > 0,1 % BES > 2,5 M
SDS > 0,1 % CHAPS >1%
®
Triton X-100 > 0,1 % CHAPSO >1%
®
Tween 20 > 0,5 % Citrato > 50 mM
Fosfato >1M
Ácidos nucleicos, etc. Glicina > 0,1 M
Adensosina > 1 mM HEPES > 0,1 M
ATP > 1mM MES > 0,7 M
DNA > 1 mg/ml MOPS > 0,2 M
RNA > 0,3 mg/ml PIPES > 0,5 M
TM
rRNA > 0,25 mg/ml Resolytes > 0,5 %
tRNA > 0,4 mg/ml Tricinas -*
Timidina > 1 mM Tris >2M
Otros reactivos NAD > 1 mM
DTT >1M Péptidos < 3000 D -*
EDTA > 0,1 M Peptona -*
Glicerina (99 %) -* Pirofosfatos > 0,2 M
Glutatión -* Sodio hidróxido > 0,25 M
Guanidinio cloruro -* Urea >6M
Mercaptoetanol >1M

* Bajo las condiciones usuales no se observó ninguna interferencia en el test.

Informaciones para pedido de los reactivos

Art. Denominación Tamaño del envase

110306 Proteínas 500 ml
(según el método de Bradford)
Solución reactiva
para aprox. 200 determinaciones
112018 Albúmina fracción V 25 g, 100 g

Ofrecemos una segunda solución reactiva lista para el uso para determinación de proteínas:

Art. Denominación Tamaño del envase

110307 Proteínas 500 ml
(según el método de Biuret)
Solución reactiva
para aprox. 250 determinaciones

Bibliografía
1. Bradford, M. M.; Anal. Biochem. 72, 248–254 (1976)
2. Sedmak, J. J., & Grossberg, S. E.; Anal. Biochem. 79, 544–552 (1977)
3. Spector, T.; Anal. Biochem. 86, 142–146 (1978)
4. Pierce, J., Suelter, C. H.; Anal. Biochem. 81, 478-480 (1977)
5. Bearden jr., J. C.; Biochim. Biophys. Acta 533, 525–529 (1977)
6. Redinbaugh, M. G., & Campbell, W. H.; Anal. Biochem. 72, 144–147 (1985)
7. Simpson, I. A., & Sonne, O.; Anal. Biochem. 119, 424 ff. (1982)
8. Compton, S. J., & Jones, C. J.; Anal. Biochem. 151, 369–374 (1985)
9. Nocka, K., et al.; Genes & Development 3, 816 ff. (1989)
10. Tal, M., et al.; J. Biol. Chem. 260, 9976-9980 (1980)
11. Davies, E. M.; Amer. Biotech Lab. 28–37 (1988) (Review, Protein Assays)

Status: Noviembre 2013

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